Summary
I gränssnittet mellan organiska och vattenhaltiga lösningsmedel samlas skräddarsydda amphifila elastinliknande proteiner till komplexa supramolekylära strukturer som blåsor, fibrer och coacervater som utlöses av miljöparametrar. De beskrivna monteringsprotokollen ger proteinmembranbaserade fack (PMBCs) med avstämbara egenskaper, vilket möjliggör inkapsling av olika laster.
Abstract
Skräddarsydda proteinhaltiga byggstenar är mångsidiga kandidater för montering av supramolekylära strukturer som minimala celler, drug delivery-fordon och enzymställningar. På grund av deras biokompatibilitet och tunabilitet på genetisk nivå är Elastin-liknande proteiner (ELP) idealiska byggstenar för biotekniska och biomedicinska tillämpningar. Ändå är montering av proteinbaserade supramolekylära strukturer med distinkta fysiokemiska egenskaper och god inkapsling potential fortfarande utmanande.
Här erbjuder vi två effektiva protokoll för guidad självmontering av amfifila ELPs i supramolekylära proteinarkitekturer som sfäriska coacervates, fibrer och stabila blåsor. De presenterade monteringsprotokollen genererar PROTEINMembranbaserade fack (PMBCs) baserade på ELPs med anpassningsbara fysikaliska kemiska egenskaper. PMBC:er demonstrerar fasseparationsbeteende och avslöjar metodberoende membranfusion och kan kapsla in kemiskt olika fluorescerande lastmolekyler. De resulterande PMBCs har en hög applikationspotential som en läkemedelsformulering och leveransplattform, artificiell cell och uppdelade reaktionsutrymme.
Introduction
Monteringen av supramolekylära strukturer för biotekniska tillämpningar blir allt viktigare1,,2,,3,,4,,5. För montering av funktionella arkitekturer som coacervates, blåsor och fibrer med önskade fysikaliska kemiska egenskaper är det viktigt att förstå och kontrollera komponenternas fysikaliska och konformationsegenskaper. På grund av den molekylära precisionen hos molekyler som finns i naturen, byggstenar för supramolekylära strukturer alltmer baserade på lipider, nukleinsyror eller proteiner. Jämfört med syntetiska polymerer möjliggör proteinhaltiga byggstenar exakt kontroll över framväxande supramolekylära strukturer6 på genetisk nivå. Den primära aminosyran (aa) sekvensen av de enskilda proteinbyggstenarna kodar i sig informationen för deras monteringspotential från den molekylära upp till makroskopisk nivå samt den tredimensionella formen och de fysiska egenskaperna hos den supramolekylära strukturen7.
Rapporterade metoder för montering av olika supramolekylära strukturer involverar ofta amfifila proteiner såsom temperaturkänsliga elastinliknande proteiner (ELP)5,8,9, rekombinant oleosin10och artificiella proteinamfifiler11. Temperaturutlösta metoder har lett till montering av micelles4,10,12Fibrer13Ark14och blåsor9,15,16. Metoder som involverar organiska lösningsmedel har använts för bildning av dynamiska proteinbaserade blåsor8,11,14. Hittills har tillämpade protokoll för vesikelbildning ofta saknar monteringskontroll över mikrometerstora församlingar16,17eller har begränsad monteringsavkastning5. Dessutom har vissa rapporterade ELP-baserade vesicles försämrat inkapslingspotential12eller begränsad stabilitet över tiden9. Att ta itu med dessa nackdelar, de presenterade protokollen möjliggör självmontering av mikrometer och sub mikrometer storlek supramolekylära strukturer med distinkta physiochemical egenskaper, god inkapsling potential och lång tid stabilitet. Skräddarsydda amphiphilic ELPs montera i supramolekylära strukturer, som spänner över allt från sfäriska coacervates och högt beställda vridna fiber buntar till unilamellar blåsor beroende på tillämpad protokoll och tillhörande miljöförhållanden. Stora vesikulära proteinmembranbaserade fack (PMBC) avslöjar alla huvudsakliga fenotyper såsom membranfusion och fasseparationsbeteende som är analogt med liposomer. PMBC:er kapslar effektivt in kemiskt olika fluorescerande lastmolekyler som kan övervakas med hjälp av enkel epifluorescensmikroskopi. De repetitiva ELP-domäner som används i denna studie är attraktiva byggstenar för proteinbaserade supramolekylära arkitekturer18. ELP pentapeptid upprepa enheten (VPGVG) är känd för att tolerera olika aa förutom proline på fjärde plats (valine, V), samtidigt som dess strukturella och funktionella egenskaper19. Utformningen av amphifila ELPs som innehåller särskiljande hydrofila och hydrofoba domäner realiserades genom att aa gästrester (X) infogas i VPGXG upprepa med distinkt hydrofobiskhet, polaritet och laddning20. Amfifila ELP-domäner utrustade med hydrofoba fenylalanin (F) eller isoleucin (I) medan den hydrofila domänen innehöll laddad glutaminsyra (E) eller arginin (R) som gästrester. En förteckning över stödberättigande amphifila ELP-konstruktioner och motsvarande aa-sekvenser finns i den kompletterande informationen och hänvisningarna8,21. Alla byggstenar utrustade antingen med små fluorescerande färgämnen eller fluorescerande proteiner för visualisering via fluorescensmikroskopi. mEGFP och andra fluorescerande proteiner var N-terminally smält till hydrofila domäner elp amfifiler . Organiska färgämnen konjugerades via koppar-fri stam främjas alkyne-azide cycloaddition (SPAAC) till en co-translationally införts onaturliga aminosyra (UAA). Det medöversättningsmässiga införlivandet av UAApara-azidophenylalanine (pAzF)22tillstånd att ändra N-terminalen av den hydrofila ELP-domänen. På detta sätt den gröna fluorescerande färgämne BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) eller någon liten fluorescerande molekyl med en ansträngd cyklooctyne kan användas som fluorescerande sond. Framgångsrik införlivande av UAA pAzF och cycloaddition av färgen via SPAAC kan enkelt bekräftas via LC-MS/MS på grund av effektiv jonisering av motsvarande tryptiska peptider8. Detta lilla organiska färgämne applicerades för att bredda lösningsmedelsvalet för monteringsprotokoll, eftersom fluorescerande proteiner är oförenliga med de flesta organiska lösningsmedel. De två mest effektiva monteringsprotokollen för supramolekylära strukturer som utvecklats i vårt labb beskrivs nedan. THF svullnad metoden är endast kompatibel med organiska färgämne modifierade amfifil ELP. Däremot är 1-butanol (BuOH) extruderingsmetod kompatibel med många proteiner som fluorescerande sond t.ex. Dessutom fungerar inkapsling av små molekyler och vesikulärt fusionsbeteende bäst genom att använda BuOH-extruderingsmetoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utformning och kloning av amphifila elastinliknande proteiner
- Klona och designa konstruktionerna enligt beskrivningen någon annanstans8,20. Plasmider finns tillgängliga på begäran.
2. Proteinuttryck, rening och beredning
- Uttryck för F20E20-mEGFP och F20E20-mCherry
- Inokulera huvuduttryckskulturen från över en natt före kultur till en OD600 av 0,3. Inkubera vid 37 °C, 200 rpm i sterilt 400 ml LB-medium kompletterat med tillarbetad antibiotika i en 2 L-kolv.
- Förbered IPTG-stamlösning (1 M) för induktion av uttryckskulturen i ultrarent vatten.
- När OD600 0,5–0,8 uppnås, tillsätt IPTG i uttryckskulturen till en slutlig koncentration på 1 mM och minska inkubationstemperaturen till 20 °C. Tillåt uttryck vid 20 °C i ca 20 timmar vid 200 varv/min.
- Uttryck för amfifil ELP som innehåller UAA pAzF
- Inokulera huvuduttryckskulturen från natten E. coli pre-kultur som innehåller de två plasmiderna pEVOL pAzF och t.ex. pET28-NMBL-(TAG)R40F20-his till en OD600 av 0,3 (se kompletterande information för aminosyrasekvenser). Inkubera vid 37 °C, 200 rpm i sterilt 400 ml LB-medium kompletterat med kanamycin och kloramfenikol i en 2 L-kolv.
- Förbered 100 mM pAzF-stamlösning i ultrarent vatten. För 10 ml pAzF-stamlösning, väg 206,2 mg pAzF och återsuspend den i 8 ml ultrapure vatten. För att lösa upp pAzF höja pH-värdet på lösningen med 3 M NaOH och blanda kraftigt. När pAzF löses, sänk försiktigt pH-värdet till 10,5 och tillsätt ultrarent vatten till en slutlig volym på 10 ml. Använd ett sterilt filter (0,22 μm) och aliquot lösningen i 2 ml reaktionsrör.
- Förbered 1 M IPTG-stamlösning i ultrarent vatten och 20% arabinose stamlösning i ultrapure vatten.
- När OD600 0,5–0,8 uppnås, tillsätt pAzF till uttryckskulturen till en slutlig koncentration på 2 mM. Inkubera kultur i 10 min, 37 °C, 200 rpm för att möjliggöra pAzF-upptag.
- Inducera uttryck för målprotein och uttryck för den nödvändiga tRNA/t-RNA-synthetasen genom samtidig tillsats av IPTG (1 mM) och arabinose (2%) och minska inkubationstemperaturen till 20 °C.
- Tillåt uttryck vid 20 °C i ca 20 timmar vid 200 varv/min. Skördeuttryckskultur genom centrifugering vid 4 °C, 4000 x g,40 min.
- Celllys och proteinrening
- Resuspend E. coli pelleten i lysis buffert (10 ml per liter kultur; 50 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 4 M urea, 0,25% Triton X-100) som innehåller lysozym (0,1 mg/mL) och PMSF (0,1 mM). Inkubera i 30 min på is och frysa och tina två gånger efteråt genom att doppa provet i flytande kväve.
- Sonicate suspensionen (30%, 15 gånger, 30 s: 10 s paus) och rensa lysate via centrifugering (4 °C, 10.000 x g för 40 min).
- Rena proteinet med hjälp av affinitetkromatografi (t.ex. på en 1 ml-nickelkolonn med hjälp av ett FPLC-system anslutet till en fraktionerad samlare; se Tabell över material). Manövrera proteinet med elueringsbuffert (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 4 M urea, 250–500 mM imidazol) och förvara den vid 4 °C tills vidare bearbetning.
- Analysera reningseffektiviteten via SDS-PAGE.
3. Färgmodifiering av ELPs via SPAAC
- Uppskattar koncentrationen av ELP-lösningen grovt. En280 absorption för koncentration utvärdering är inte värdefullt eftersom pAzF-R40F20 sekvens saknar aminosyror absorberas i UV-området. Därför kan en tidigare frystorkad och viktad ELP-amfifil användas som referens för SDS PAGE-bandjämförelse. Genom jämförelse av den summerade grå värdeintensiteten hos SDS PAGE-band från ELP-lösningar med kända koncentrationer och ditt prov kan den grova koncentrationen av ditt prov uppskattas.
- Tillsätt 1 μl fluorescerande färgämne BDP-FL-PEG4-DBCO (10 mM-stamlösning; 20 μM slutlig koncentration) till 500 μl ELP-lösning (~20 μM). Inkubera reaktionen i ca 10 h vid 15 °C, medan du skakar och skyddas från ljus.
- För vidare användning, dialysera reaktionen för att avlägsna överdriven BDP.
- Jämvikt ett dialysmembran (t.ex. 12 kDa cutoff) i ultrarent vatten i 10 min. Skär dialysmembranet i rätt storlek som ska placeras ovanpå öppningen av ett reaktionsrör som innehåller den klickade ELP-lösningen. För att fixa dialysmembranet i öppningen, placera ett reaktionsrörslock med stansad kärna på öppningen, vilket stänger röret.
- Placera reaktionsröret upp och ner i den valda bufferten. Byt ut bufferten (2–5 L) två gånger efter dialys i minst 3 timmar varje gång. Ta bort eventuella luftbubblor som fastnat mellan dialysmembranet och bufferten för att säkerställa framgångsrik dialys.
4. THF svullnad protokoll
- Dialyze homogen ELP-lösning mot fosfat eller tris buffert (10 mM) med stabil pH 7.5 för att avlägsna salter och återstående föreningar från his-tag rening.
- Förbered lyofilatorn och kyl ner till starttemperatur för frystorkning.
- Aliquot den dialyserade proteinlösningen i 1,5 ml-reaktionsrör (50–500 μl per rör) och chockfrys i flytande kväve. För att undvika oönskad blandning av olika proteinlösningar under frystorkning kan lock med ett litet hål läggas ovanpå reaktionsröret för att försegla det delvis.
- Ta ut de frysta proteinproverna ur det flytande kvävet och placera dem omedelbart i lyofilatorn för att börja frysa ut. Frystorkning är klar när provet är helt torrt (ca 24–48 timmar). Ventilera därefter lyofilat amfifiliserade ELPs med torra N2, stäng sedan omedelbart reaktionsrörets lock för att undvika kontakt med luftfukt.
- Tillsätt ren THF till de frystorkade proverna (ELP, 5–10 μM) och placera lösningen i en vattenbadsmilektor som innehåller isvatten i 15 minuter för att möjliggöra svullnad av ELP i THF.
- Värm en termocyklar till 30–60 °C för blåsbildning eller upp till 90 °C för fiberbildning och förbered nya reaktionsrör som innehåller antingen ultrarent vatten eller buffert (50 mM NaH2PO4/Na2HPO4,50 mM NaCl, pH 5–13). Sfäriska coacervates monteras huvudsakligen vid 20 °C inom pH 9–13. Vesikelbildningen gynnas vid 50–60 °C mellan pH 7 och 9. Fiberbildning induceras huvudsakligen över 60 °C mellan pH 5 och 12.
- Efter ultraljudsbehandling steg, placera ELP / THF lösning samt den beredda ultrapure vatten eller buffert lösning i thermocycler och värma upp till önskad temperatur i 5 min. När temperaturen uppnås bör den förvärmda ELP/THF-lösningen stratifieras noggrant ovanpå den förvärmda ultrapurevatten- eller buffertlösningen. En tydlig separation av de två faserna med ett distinkt gränssnitt bör vara synlig.
- Placera blandningen i thermocycler igen och inkubera i 20 min för att möjliggöra vesikel eller fiberbildning vid gränssnittet. Låt proverna svalna till rumstemperatur i 10 minuter före analys via fluorescensmikroskopi eller dialys.
- Dialyzelösning som innehåller de supramolekylära strukturerna mot ultrarent vatten eller buffert (50 mM NaH2PO4/Na2HPO4,50 mM NaCl, pH 7–10).
5. BuOH extrudering protokoll
- Förbered en 1–50 μM ELP-lösning i ultrarent vatten eller buffert (50 mM PB pH 7,5, 100 mM NaCl, kan innehålla upp till 4 M urea). Koncentrationen av den amfifila ELP F20R20-mEGFP- och F20R20-mCherry-lösningen kan bestämmas med hjälp av molarutdöendekoefficienterna (F20R20-mEGFP A280 = 22015 M-1 cm-1 och F20R20-mCherry A280 = 34380 M-1 cm-1) (se kompletterande information för aa-sekvenser).
- Tillsätt 10–20 % (v/v) 1-butanol och blanda omedelbart lösningen genom att pipettera upp och ner eller dra upp den genom en spruta flera gånger. En vanlig 100 μL pipett eller Hamilton spruta utrustad med en 0,25 x 25 mm nål kan appliceras. Lösningens grumlighet under blandning bör öka, vilket indikerar vesikelbildning. 1-oktanol 5%–15% (v/v) kan också användas för vesikelextrudering istället för 1-butanol.
- För att uppnå en smal storleksfördelning, extrudera blåsor med hjälp av en mini extruder genom ett membran med en porstorlek på 1 μm vid rumstemperatur. Membranstorleken som används för extrudering bestämmer den övre storleken cutoff av blåsorna.
- Dialysera blåsorna enligt beskrivningen ovan (steg 3.3) för att avlägsna resterande 1-butanol.
6. Färga inkapsling med BuOH extrudering protokoll
- Blanda ca 40 μL ELP-lösning i 10 mM Tris-HCl, pH 8 med 1 μL Dextran Texas Red (0,0025 mg/ml slutlig koncentration).
- Tillsätt 10 μl BuOH till lösningen och extrudera 5–10 gånger genom en spruta utrustad med en 0,25 x 25 mm nål.
7. Analys av supramolekylära strukturer med fluorescensmikroskopi
- Placera en förstärkningsring på en glasrutschbana och tryck fast den självhäftande sidan på glaset.
- Tillsätt 5 μl av provet på insidan av förstärkningsringen och placera en täckslip ovanpå.
- Försegla provet med nagellack vid kanterna på täckslipen för att undvika avdunstning av provet under analysen.
- Utför fluorescensmikroskopi enligt tidigare beskrivna8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollutveckling för vesikelproduktion
Figur 1 beskriver de två olika vesikelberedningsmetoderna. THF svullnad metoden på vänster sida består av tre på varandra följande steg och resulterar i olika supramolekylära församlingar av ELP beroende på temperaturen. I figur 1A epifluorescensmikroskopi bilder visar blåsor monterade från BDP-R20F20 och fibrillary strukturer monterade från BDP-R40F20. BuOH-metoden, illustrerad på höger sida leder uteslutande till bildandet av ELP-blåsor, vilket ger ungefär två storleksordningar fler blåsor jämfört med THF svullnad metoden. Den schematiska illustrationen visar förberedelseprocessen av BuOH-blåsor. För vesikelberedning i figur 1B blandades BDP-R40F20 med 10-15% (v/v) BuOH och blåsor beretts via strängsprång av blandningen.
Styra supramolekylär självmontering i olika strukturer
Figur 2 visar en schematisk illustration och epifluorescensbilder av olika supramolekylära strukturer som monterats från BDP-R40F20 via THF-svullnadsprotokollet. I detta fall lyophilized BDP-R40F20 användes för de olika sammansättning protokoll. PH-värdet på bufferten och temperaturen på monteringsprocessen justerades för att bilda antingen koacervates, fibriller eller blåsor. De koacervater som avbildas i figur 2A är 1–2 μm i diameter och monterades från BDP-R40F20 vid 20 °C och pH 13. Justering av monteringstemperaturen till 90 °C resulterar i bildandet av nanofiberbuntar (figur 2B) vid pH 4–13 som provats med BDP-R40F20. Stabila blåsor kan monteras från ELP vid en temperatur av 50 °C och pH 7 (figur 2C). Små misstag vid ett av de avgörande stegen i monteringsprotokollet kan leda till bildandet av aggregat som avbildas i figur 2D.
Inkapsling av olika laster
Figur 3 visar inkapslingen av olika lastar i vesikellummen hos vesiklar som monterats från F20R20-mEGFP via BuOH-extruderingsmetoden. För inkapslingen av det positivt laddade färgämnet Atto Rho13 i figur 3Ablandades färgämnet med vattenhaltig ELP-lösning före tillsats av (15% v/v) BuOH och sprutextrudering av blandningen. De konfokalmikroskopibilderna visar de blåsor som bildas från F20R20-mEGFP i den gröna kanalen, det röda färgämnet AttoRho13 i den röda kanalen och den resulterande sammanslagna kanalen visar den framgångsrika inkapslingen inuti vesiclelummen.
Polysackarid Dextran Red 3000 var framgångsrikt inkapslade med buOH extrudering metod som beskrivs ovan. Bilder som spelats in i grön kanal visar de blåsor som bildas från F20R20-mEGFP medan röd kanal visar polysackarid last. Sammanslagen grön och röd bild i figur 3B bekräftar den framgångsrika Dextran Red 3000 inkapsling i vesicle lumen.
Kompatibilitet mellan membrankomponenter och fasseparering av blandade BuOH-blåsor före/efter extrudering
Figur 4 visar fas separation och fusion beteende ELP amfifiler vid blandning av enda PMBC byggstenar kontra monterade PMBC populationer. Blandning av amfifil ELP-byggstenar (F20R20-mEGFP och F20R20-mCherry) före PMBC-montering leder till homogent fördelade molekyler inom det monterade PMBC-membranet. Den homogena fördelningen av fluorofores och tillhörande ELP-amfifiler är uppenbar när de slår samman den röda och gröna kanalen i respektive fluorescensbilder. Genom att blanda vesikelpopulationer som monterats från antingen F20R20-mEGFP eller F20R20-mCherry syns tydligt synliga membranfläckar av röd eller grön fluorescens omedelbart efter blandning. Detta indikerar att PMBC fusion händelser av olika märkta PMBCs inträffar och att dessa smältmembran och deras beståndsdelar förblir fas åtskilda i minst 20 min. En liknande fas beteende är känd från lipidflottar, inom lipidmembran23.
Figur 1: Illustration av THF svullnad metod och BuOH extrudering metod för guidad självmontering av amfifil ELPs i supramolekylära strukturer såsom blåsor eller fibrer. Schematiska arbetsflöde och representativa epifluorescensbilder av (A) THF-svullnadsmetoden med BDP-R20F20 och BDP-R40F20 vilket resulterar i olika supramolekylära strukturer beroende på temperatur och pH och (B) BuOH-extruderingsmetoden som uteslutande ger blåsor från BDP-R40F20 (skalstång 2 μm). Denna siffra har ändrats från Schreiber et al. 20198. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Genom att tillämpa THF-svullnadsmetoden BDP-R40F20 självmonterar i olika supramolekylära strukturer. De miljöförhållanden som används under monteringsprotokollet (t.ex. temperatur eller pH) bestämmer den dominerande supramolekylära strukturen som bildas. Representativa supramolekylära strukturer vid respektive förhållanden under monteringen övervakades via epifluorescensmikroskopi och sträcker sig från (A) coacervates och (B) fibriller till (C) stabila blåsor. (D) Fel i monteringen av definierade strukturer under THF-bulvprotokollet leder till bildandet av ospecifika aggregat (skalstång 2 μm). Denna siffra har ändrats från och med8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Olika laster kan kapslas in i ELP-blåsor med buoh-extruderingsmetoden. (A)visar representativa konfokala bilder av F20R20-mEGFP-blåsor med inkapslade positivt laddade färgämnen AttoRho13 och (B) inkapsling av polysackarid dextran röd (skala bar 5 μm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Membrankomponentkompatibilitet och fusionsbeteende hos vesikelmembran som monterats från F20R20 via BuOH extruderingsmetod. (A)Blandning av fluorescerande F20R20-mEGFP och F20R20-mCherry proteinlösning före sprut-extrudering leder till PMBC-membran med homogent distribuerade amfifila proteiner synliga i grön kanal (vänster bild), röd kanal (mellanbild) och sammanslagen kanal (höger bild). (B)PMBCs monteras från antingen F20R20-mEGFP eller F20R20-mCherry och blandas därefter via spruta extrudering leda till separerade ELP amfifil fläckar inom PMBC membran. De separerade ELP-amphifilerna i membranet är synliga efter PMBC-fusion i minst 20 minuter i grön kanal (vänster bild), röd kanal (mellanbild) och den sammanslagna kanalen (höger bild). Skalstänger motsvarar 5 μm. Denna siffra har ändrats från Schreiber et al. 20198. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett fel efter de beskrivna protokollen för montering av definierade supramolekylära strukturer leder huvudsakligen antingen till bildandet av ospecifika aggregat (figur 2,IV) eller till homogent distribuerade ELP-amphifiler. Kritiska steg i protokollet diskuteras nedan:
För hög uttrycksutbyte av amfifil ELP är en relativt låg temperatur på 20°C optimal. För framgångsrik affinitet baserad rening av amfifil ELP en urea koncentration av 4 M i lysis bufferten har visat sig bäst lösliga amfifil ELP och öka proteinavkastningen i lösliga eluering fraktionen. Om lägre ureakoncentrationer i lysbufferten önskas måste affinitetsrening testas för de enskilda konstruktionerna. 2 M urea fungerade också för vissa konstruktioner, särskilt för dem där His-tag var smält till hydrofil domän och därför fortfarande kunna binda harts. En ytterligare rening steg efter His-tag rening via storlek uteslutning kromatografi kan öka vesikelutbyte samt.
Vid tillämpning av THF-svullnad protokollet måste amfifil ELP märkas med en fluorescerande organiska färgämne för visualisering. Viktigt för BDP-märkningen av den amfifila ELP (se kompletterande information för aminosyrasekvenser som innehåller UAA pAzF) via SPAAC är frånvaron av reduktant såsom TCEP, DTT eller β-mercaptoetanol i alla reningsbuffertar. Detta är nödvändigt för att undvika den väl rapporterade azide till amin minskning av pAzF före SPAAC reaktion24.
Den exakta reaktionen stoichiometry av färgämne till amfifil ELP (t.ex. pAzF-R40F20) är inte avgörande eftersom det inte är nödvändigt att märka varenda ELP-molekyl för enkel vesicle visualisering via epifluorescensmikroskopi. Korrelationen mellan ett referens-SDS gelband och motsvarande viktat frystorkat prov är därför endast nödvändig en gång för varje proteinkonstruktion. Men om nära 100% märkning avkastning önskas ett förhållande av 1:1 motsvarigheter färgämne till ELP molekyler är tillräcklig. Mycket liknande amfifil ELPs analyserades i vårt labb för att vara helt märkt vid en equimolar tillägg av BDP (data ännu inte publicerats).
För vesikelberedning med thf-svullnadsmetoden är de mest kritiska stegen svullnad av lyofiliiserad amfifil ELP och efterföljande stratifiering av denna lösning ovanpå vattenbuffertfasen. Därför bör den nyligen frystorkade amfifila ELP vara så vattenfri som möjligt, vilket kan uppnås genom ventilation av lyofilis med torr kvävegas och omedelbar stängning av reaktionsrörets lock. Om möjligt bör septum förseglade torra THF användas för att öka vesikelutbytet, men THF p.a. (>99,5%) utan septum fungerar också. Stratifieringssteget vid svullnad bör amfifil ELP i torr THF utföras mycket noggrant. Framgångsrik stratifiering av de två temperaturkontrollerade lösningarna leder till en tydligt synlig fasgräns mellan organisk och vattenfas. Det inledande stratifieringssteget bör utföras långsamt även om förhöjda temperaturer leder till termisk inducerad blandning av dessa faser. Framväxande grumlighet av lösningen beror på ljusspridning av bildade blåsor, fibrer eller coacervates. I kontrollprover som saknar proteinet, visas ingen grumlighet även om små strukturer (upp till 200 nm) rapporteras för THF vatten-gränssnitt25. THF stratifiering steg är den mest kritiska och misslyckande benägna steg av svullnad protokollet. Efter inkubationen kliver de supramolecular strukturerar kan dialyzed mot buffra eller ultrapure bevattnar. Företrädesvis bör samma vattenlösning användas som tillämpades för inledande montering för att bibehålla osmolariteten och förhindra svullnad eller krympning av de monterade blåsorna. Efter dialys är blåsorna, fibrerna och koacervaterna vanligtvis stabila i minst en vecka. Beroende på miljöparametrarna under monteringen ofta en liten andel av andra supramolekylära strukturer förutom huvudstrukturen är närvarande om THF svullnad metoden tillämpas8. Den beskrivna THF-metoden ökar vesikelmonteringsutbytesutbytet med en storleksordning medan BuOH-extruderingen förbättrar avkastningen med tre storleksordningar jämfört med vår tidigare publicerade in vitro-metod5.
BuOH-extruderingsmetoden tillämpas för att erhålla uteslutande stabila vesikulära strukturer med hög reproducerbarhet, kringgående fibrer och sfäriska coacervates. Denna metod är mindre felbenägen och kompatibel med fluorescerande proteiner. Därför F20R20-mEGFP eller F20R20-mCherry kan tillämpas samt BDP-R40F20 eller BDP-E20F20. Det enda kritiska steget är den snabba blandningen av vattenproteinlösningen efter tillsats av 10%–20% v/v BuOH. Koncentrationen F20R20-mEGFP eller F20R20-mCherry bör vara runt 1–15 μM. Genom att applicera BuOH extruderingsmetod vesiklar kan monteras i ultrapure vatten eller buffert som innehåller upp till 5 M NaCl eller 4 M urea och pH från 5 till 8. Extruderade PMBCs i 20% v /v BuOH kan lagras i minst 6 månader vid 4 ° C samtidigt som deras vesikulär struktur. För att begränsa vesikelstorleksfördelningen kan de extruderas med hjälp av en miniextruder genom ett membran med 0,2-1 μm porstorlek. Denna porextrudering kan göras direkt efter BuOH utöver den amfifila ELP eller efter vesikelmontering. Om PMBC:erna är för koncentrerade för bildbehandling kan monterade blåsor i BuOH spädas genom snabb blandning med vattenbuffert som innehåller 10–20 % mot BuOH.
Den största begränsningen av BuOH extrudering metod är att PMBC dialys mot vattenhaltiga buffertar ofta resulterar i dålig vesikel avkastning. Vidare kan förekomsten av kvarvarande BuOH inom membranutrymmet inte uteslutas eftersom enkla fettsyror kunde införlivas i PMBC-membranet21. Därför kan PMBC membran i viss mån bestå av protein och alkanol moieties.
Inkapsling av kemiskt olika lastmolekyler fungerar bäst med buoh-extruderingsmetoden. Vidare ökar DMSO som lösningsmedel för stamlösningen av det färgämne som ska fångas färgämnet effektiviteten. För att känslig last ska inkapslas kan 5%–10% v/v 1-oktanol användas för PMBC-montering och har visat sig vara bättre kompatibla, jämfört med BuOH, med funktionella inkapslade enzymer som DNA-ligase eller TEV proteas21,26. På grund av den kortare kedjelängden av n-butanol kan den dock dialyseras mot vattenbuffert i motsats till 1-oktanol, som inte kan genomsyra det applicerade dialysmembranet. En annan metodbegränsning är att de tillämpade temperaturer och pH-värden som behövs för att kontrollera den önskade suprastrukturbildningen kan påverka enzymaktiviteten. I framtida arbete bör affinitetsrening eller storleksreningsrening fastställas för att separera icke-inkapslade kontra inkapslade molekyler utan försämrad vesikelmembranintegritet.
I motsats till film rehydrering metoder16,17 häri beskrivna protokoll möjliggör montering av blåsor storlekar större än 600 nm. Detta möjliggör övervakning av fusionshändelser i realtid genom enkel epifluorescensmikroskopi och observation av membranfasseparation8. Jämfört med temperatur utlöste vesikulär montering av amfifil ELP9 protokollen beskrivs här ger PMBC med en lång tid stabilitet på upp till 6 månader. Den största nackdelen är dock behovet av organiskt lösningsmedel för strukturbildning. Även om BuOH till fullo bevarar integriteten och funktionen hos fluorescerande proteiner27 (data som inte visas), kan aktiviteten hos inkapslade enzymer begränsas av kvarvarande organiska lösningsmedel och måste testas individuellt. Katalytiska reaktioner med DNA- ligase, TEV-proteas och lipas har dock framgångsrikt utförts inom blåsornas luminala utrymme, monterade med 1-oktanol eller BuOH-extrudering26,,21. Dessutom, även om THF dialys efter montering är mycket oproblematisk och vesikel integritet bevaras, BuOH avlägsnande resulterar ofta i förlust av vesicle integritet på grund av okända skäl.
De beskrivna protokollen gör det möjligt för forskare att montera mikrometer och sub mikrometer storlek supramolekylära strukturer med distinkta fysikaliska kemiska egenskaper, goda inkapsling egenskaper, och lång tid stabilitet. Dessa supramolekylära strukturer kan tillämpas för utformningen av minimala celler26 eller artificiell cellforskning21, enzyminkapsling, eller läkemedelsformulering. De presenterade funktionella PMBCs är ytterligare lovande kandidater för drug delivery, eftersom deras byggstenar inte ärimmunogena 28, uppvisar dynamisk fusion beteende, och möjliggöra olika last inkapsling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna tackar BMBF för ekonomiskt stöd och Center for Biological Systems Analysis (ZBSA) för att tillhandahålla forskningsanläggningen. Vi är tacksamma mot P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, Kalifornien, USA för att tillhandahålla plasmid pEVOL-pAzF. Vi tackar personalen vid Life Imaging Center (LIC) i Center for Biological Systems Analysis (ZBSA) av Albert-Ludwigs-University Freiburg för hjälp med sina confocal mikroskopi resurser, och utmärkt stöd i bildinspelning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 µm and 0.2 µm Steril Filter | VWR | ||
| 1,4-Dithiothreitol | Merck | ||
| 1-butanol. >99.5% p.a. | Roth | ||
| 2log DNA ladder | NEB | ||
| 2-Mercaptoethanol | Roth | ||
| 50 mL Falcon tubes | VWR | ||
| 79249 Alkyne Mega Stokes dye | Sigma Aldrich | ||
| Acetic acid glacial | VWR | ||
| Acetonitrile, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | ||
| Ampicillin sodium-salt, 99% | Roth | ||
| BDP-FL-PEG4-DBCO | Jena Bioscience | ||
| Biofuge | Heraeus | ||
| Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) | Thermo Scientific | ||
| Brillant Blue G250 (Coomassie) | Roth | ||
| BspQI | NEB | ||
| Camera DS Qi1 | Nikon | ||
| Centrifuge 5417r | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5810r | Eppendorf | ||
| CF-400-Cu square mesh copper grid | EMS | ||
| Chloramphenicol | Roth | ||
| CompactStar CS 4 | VWR | ||
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral | Life Technologies | ||
| Digital sonifier | Branson | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Applichem | ||
| Dnase I | Applichem | ||
| EarI | NEB | ||
| EcoRI-HF | NEB | ||
| Environmental shaker incubator ES-20 | Biosan | ||
| Ethanol absolute | Roth | ||
| Ethidium bromide solution | Roth | ||
| Filter supports | Avanti | ||
| Glass plates | Bio-Rad | ||
| Glycerol Proteomics Grade | Amresco | ||
| Glycin | Applichem | ||
| H4-Azido-Phe-OH | Bachhem | ||
| Heat plate MR HeiTec | Heidolph | ||
| HindIII | NEB | ||
| HisTrap FF crude column | GE Life Sciences | Nickel column | |
| Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. | Merck | ||
| Illuminator ix 20 | INTAS | ||
| Illuminator LAS-4000 | Fujifilm | ||
| Imidazole | Merck | ||
| Immersions oil for microscopy | Merck | ||
| Incubators shakers Unimax 1010 | Heidolph | ||
| Inkubator 1000 | Heidolph | ||
| IPTG, >99% | Roth | ||
| Kanamycinsulfate | Roth | ||
| L(+)-Arabinose | Roth | ||
| Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE | Sartorius | ||
| LB-Medium | Roth | ||
| Lyophilizer Alpha 2-4 LSC | Christ | ||
| Lysozyme, 20000 U/mg | Roth | ||
| Microscope CM 100 | Philips | ||
| Microscope Eclipse TS 100 | Nikon | ||
| Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) | VWR | ||
| Microscopy slides | VWR | ||
| Microwave | Studio | ||
| Mini-Extruder Set | Avanti Polar Lipids | ||
| NaCl, >99.5%, p.a. | Roth | ||
| Natriumhydroxid pellets | Roth | ||
| Ni-NTA Agarose, PerfectPro | 5 Prime | ||
| Nucleopore Track-Etch Membrane | Avanti | ||
| PH meter 766 calimatic | Knick | ||
| Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) | Roth | ||
| Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | ||
| PowerPac basic | BioRad | ||
| Propanol-2-ol | Emplura | ||
| Protein ladder 10-250 kDa | NEB | ||
| Recirculating cooler F12 | Julabo | ||
| Reinforcement rings | Herma | ||
| SacI HF | NEB | ||
| SDS Pellets | Roth | ||
| Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 | VWR | ||
| Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate | VWR | ||
| T4 DNA Ligase | NEB | ||
| TEMED | Roth | ||
| TexasRed Dextran-Conjugate | MolecularProbes | ||
| Thermomix comfort | Eppendorf | ||
| THF, >99.5% p.a. | Acros | ||
| Triton X 100 | Roth | ||
| Trypton/Pepton from Casein | Roth | ||
| Ultrasonic cleaner | VWR | ||
| Urea p.a. | Roth | ||
| Vacuum pump 2.5 | Vacuubrand | ||
| XbaI | NEB | ||
| XhoI | NEB | ||
| ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) | Roth |
References
- Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems. Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).
- Jang, Y., Champion, J. A. Self-Assembled Materials Made from Functional Recombinant Proteins. Accounts of Chemical Research. 49 (10), 2188-2198 (2016).
- Timmermans, S. B. P. E., van Hest, J. C. M. Self-assembled nanoreactors based on peptides and proteins. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 35, 26-35 (2018).
- Dreher, M. R., et al. Temperature Triggered Self-Assembly of Polypeptides into Multivalent Spherical Micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (2), 687-694 (2008).
- Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
- Matsuurua, K. Rational design of self-assembled proteins and peptides for nano- and micro-sized architectures. RSC Advances. 4 (6), 2942-2953 (2013).
- Rocklin, G. J., et al. Global analysis of protein folding using massively parallel design, synthesis, and testing. Science. 357 (6347), 168-175 (2017).
- Schreiber, A., Stühn, L. G., Huber, M. C., Geissinger, S. E., Rao, A., Schiller, S. M. Self-Assembly Toolbox of Tailored Supramolecular Architectures Based on an Amphiphilic Protein Library. Small. 15 (30), 1900163 (2019).
- Jang, Y., Hsieh, M. -C., Dautel, D., Guo, S., Grover, M. A., Champion, J. A. Understanding the Coacervate-to-Vesicle Transition of Globular Fusion Proteins to Engineer Protein Vesicle Size and Membrane Heterogeneity. Biomacromolecules. 20 (9), 3494-3503 (2019).
- Vargo, K. B., Sood, N., Moeller, T. D., Heiney, P. A., Hammer, D. A. Spherical micelles assembled from variants of recombinant oleosin. Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (38), 11292-11300 (2014).
- Bellomo, E. G., Wyrsta, M. D., Pakstis, L., Pochan, D. J., Deming, T. J. Stimuli-responsive polypeptide vesicles by conformation-specific assembly. Nature Materials. 3 (4), 244-248 (2004).
- Martín, L., Castro, E., Ribeiro, A., Alonso, M., Rodríguez-Cabello, J. C. Temperature-Triggered Self-Assembly of Elastin-Like Block Co-Recombinamers:The Controlled Formation of Micelles and Vesicles in an Aqueous Medium. Biomacromolecules. 13 (2), 293-298 (2012).
- Li, Y., Rodriguez-Cabello, J. C., Aparicio, C. Intrafibrillar Mineralization of Self-Assembled Elastin-Like Recombinamer Fibrils. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2017).
- Vargo, K. B., Parthasarathy, R., Hammer, D. A. Self-assembly of tunable protein suprastructures from recombinant oleosin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (29), 11657-11662 (2012).
- Park, W. M., Champion, J. A. Thermally Triggered Self-Assembly of Folded Proteins into Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 136 (52), 17906-17909 (2014).
- Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).
- Vogele, K., et al. In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth. Journal of Visualized Experiments. (148), e59831 (2019).
- Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2015).
- Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
- Huber, M. C., Schreiber, A., Wild, W., Benz, K., Schiller, S. M. Introducing a combinatorial DNA-toolbox platform constituting defined protein-based biohybrid-materials. Biomaterials. 35 (31), 8767-8779 (2014).
- Schreiber, A., Huber, M. C., Schiller, S. M. Prebiotic Protocell Model Based on Dynamic Protein Membranes Accommodating Anabolic Reactions. Langmuir. 35 (29), 9593-9610 (2019).
- Chin, J. W., Santoro, S. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of p-Azido-l-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
- Sonnino, S., Prinetti, A. Membrane domains and the "lipid raft" concept. Current Medicinal Chemistry. 20 (1), 4-21 (2013).
- Bräse, S., Gil, C., Knepper, K., Zimmermann, V. Organische Azide - explodierende Vielfalt bei einer einzigartigen Substanzklasse. Angewandte Chemie. 117 (33), 5320-5374 (2005).
- Li, Z., et al. Large-Scale Structures in Tetrahydrofuran–Water Mixture with a Trace Amount of Antioxidant Butylhydroxytoluene (BHT). The Journal of Physical Chemistry B. 115 (24), 7887-7895 (2011).
- Huber, M. C., Schreiber, A., Schiller, S. M. Minimalist Protocell Design: A Molecular System Based Solely on Proteins that Form Dynamic Vesicular Membranes Embedding Enzymatic Functions. ChemBioChem. 20 (20), 2618-2632 (2019).
- Raghunathan, G., et al. A comparative study on the stability and structure of two different green fluorescent proteins in organic co-solvent systems. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 18 (2), 342-349 (2013).
- Sallach, R. E., et al. Long-term biostability of self-assembling protein polymers in the absence of covalent crosslinking. Biomaterials. 31 (4), 779-791 (2010).
