Summary
Målet med dette arbejde er at udvikle en metode til reproducerbart isolere kardiomyocytter fra det voksne hjerte og måle DNA-indhold og kerner.
Abstract
Den voksne pattedyr hjerte er sammensat af forskellige celletyper, herunder kardiomyocytter, endotelceller og fibroblaster. Da det er vanskeligt at pålideligt identificere kerner af kardiomyocytter på histologiske sektioner, mange grupper er afhængige af at isolere levedygtige kardiomyocytter før fiksering til at udføre immunostaining. Men disse levende kardiomyocyt isolation teknikker kræver optimering for at maksimere udbyttet, levedygtighed og kvalitet af prøverne, med iboende udsving fra prøve til prøve trods maksimal optimering. Her rapporterer vi en reproducerbar protokol, der involverer fiksering før enzymatisk fordøjelse af hjertet, hvilket fører til maksimalt udbytte og samtidig bevare in vivo morfologi af de enkelte kardiomyocytter. Vi udviklede endvidere en automatiseret analyseplatform til at bestemme antallet af kerner og DNA-indhold pr. kerne for individuelle kardiomyocytter. Efter at have afsløret brysthulen, hjertet blev arresteret i diastole af perfusion med 60 mM KCl i PBS. Dernæst blev hjertet fastsat i 4% paraformaldehyd (PFA) opløsning, og derefter fordøjet med 60 mg/ml kollagenaseopløsning. Efter fordøjelser blev cellertalt ved trituration, og kardiomyocytfraktionen blev beriget via differentialcentrifugering. Isolerede kardiomyocytter blev plettet for Troponin T og α-actinin for at vurdere renheden af den opnåede population. Desuden udviklede vi en billedanalyseplatform til bestemmelse af cardiomyocyte-kernestatus og ploidystatus efter DAPI-farvning. Billedbaserede ploidy vurderinger førte til konsekvente og reproducerbare resultater. Således, med denne protokol, er det muligt at bevare indfødte morfologi af individuelle kardiomyocytter at tillade immunoktokemi og DNA-indhold analyse samtidig opnå maksimalt udbytte.
Introduction
Hjertesygdom har været den hyppigste dødsårsag i de fleste vestlige lande i mange årtier1,2. Selv om mange forbedringer i behandlingen af hjerte-kar-sygdomme har forbedret overlevelse, der er i øjeblikket ingen behandlinger, der kan erstatte tabte kardiomyocytter. Derfor har undersøgelser relateret til kardiomyocytfunktion, spredning, apoptose og hypertrofi været og er fortsat et vigtigt fokusområde for det videnskabelige samfund. Da det voksne pattedyr hjerte har en meget begrænset regenerativ kapacitet, med en anslået cardiomyocyte fornyelsesrate på mindre end 1% om året, er det afgørende vigtigt at pålideligt identificere cardiomyocyte proliferative begivenheder3,4. De fleste strategier, der måler proliferativ begivenheder er afhængige enten på farvning for indarbejdet DNA nukleotid analoger til at vurdere tidligere eller nuværende spredning, eller pletten for nukleare markører for aktiv spredning5. Det er især vigtigt at identificere kardiomyocyt proliferative hændelser, da det samlede antal proliferative kardiomyocytter er sålavt 3,6. For eksempel, baseret på en 1% fornyelse sats af endogene kardiomyocytter om året, kan man forvente at finde mellem 25 og 50 kardiomyocytter, der skal proliferative på et givet tidspunkt i den voksne mus hjerte7,8. Eventuelle unøjagtigheder i identifikationen af cardiomyocyte kerner kan føre til falske positive resultater. Derfor er det afgørende at pålideligt identificere cardiomyocyte kerner, som har vist sig vanskeligt og upålidelige fra histologiske afsnit9. Identifikation af kardiomyocytter er langt mere præcis fra enkelte celler end fra vævssektioner, da det kan være vanskeligt at skelne kardiomyocytter fra andre celletyper, selv når du bruger markører som α-actinin, selv om PCM1 kan være en pålidelig markør for cardiomyocytekerner i histologiske afsnit10.
Nuværende protokoller er afhængige af at isolere levende kardiomyocytter før fiksering, som er kendt for at forårsage død på mindst 30% af kardiomyocytter, og kan føre til utilsigtet udvælgelse af specifikke populationer af kardiomyocytes11. Desuden er disse protokoller notorisk vanskelige at optimere for at give reproducerbare resultater. Selv optimeret isolation teknikker kan typisk producere ikke mere end 65% levende, stang-formede kardiomyocytter med varierendeudbytter 12.
For at løse disse problemer, vi udviklet en protokol, der giver forskerne mulighed for at isolere faste kardiomyocytter. Da prøverne er fastsat før isolation, er udbyttet maksimeret, og in vivo morfologi er velbevaret. Desuden, med denne protokol er det muligt at isolere kardiomyocytter fra kliniske prøver, som typisk fastsættes umiddelbart efter indkøb. Endvidere, at identificere nygenererede kardiomyocytter, er det vigtigt at måle kernen og ploidy status af de enkelte kardiomyocytter, da kun diploid cardiomyocytes typisk antages at være nydannede. Flowcytometri kan ikke skelne mellem flerkerner og polyploidi og er en relativt tids- og ressourcekrævende protokol. Manuel disposition og måling af kerner i billeder er meget lav-gennemløb og tilbøjelige til menneskelige bias. Automatiseret kvantificering af billeder af faste, isolerede DAPI-farvede kardiomyocytter løser begge disse problemer. Billeddannelsesbaseret bestemmelse af nukleation og ploidyfordelinger kan opnås med et minimum af tid og reagenser ved hjælp af basisudstyr.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health retningslinjer og godkendt af University of Minnesota Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Fremstilling af opløsninger og kirurgisk udstyr
- Før isolering steriliseres det kirurgiske udstyr ved hjælp af 70% ethanolopløsning.
- Der tilsættes 2,24 g KCl til 500 ml fosfatbuffer (PBS) for at opnå en endelig koncentration på 60 mM. Opbevar KCl-PBS-opløsningen ved stuetemperatur. Brug 3 ml KCl-PBS-opløsning pr. mus.
- Fortyndes 32% paraformaldehyd (PFA) opløsning med PBS i at opnå endelig koncentration på 4% PFA. Forbered 10 ml 4% PFA i PBS pr. mus. Fortyndet PFA-opløsning kan opbevares ved 4 °C i 2-3 uger i en glasbeholder.
BEMÆRK: Forberedt 4% PFA-opløsning kan opbevares ved -20 °C i længere tid. - Forbered 1 ml kollagenopløsning pr. mus ved at tilsætte 60 mg kollagenase, type 2 pr. 1 ml PBS.
2. Perfusion og fiksering af hjertet
- Bedøve dyret ved hjælp af 2-5% isofluran med en ilt strømningshastighed på 1 L / min. Bekræft anæstesi ved at bekræfte manglende bevægelse og lavere vejrtrækning.
BEMÆRK: Indsprøjtning heparin (100-500 U/kg) før dødshjælp kan øge cellekvaliteten og udbyttet ved at forebygge blodpropper, hvilket giver mulighed for mere effektiv perfusion af hjertet med fiksativ. - Aflive dyret efter godkendte metoder.
BEMÆRK: Vi fulgte American Veterinary Medical Association retningslinjer for dødshjælp af dyr, og opnåede lokale IACUC godkendelse til aktiv dødshjælp. - Placer aflivede dyr i liggende stilling, og tape ned udvidede lemmer.
- Skær gennem brystet for at udsætte hjertet ved hjælp af stump-end saks. Skær faldende aorta og ringere caval vene.
- Se hjertet ved at indsprøjte 3 ml KCl-PBS-opløsning gennem venstre hjertekammer med en strømningshastighed på 3 ml/min. ved hjælp af en peristaltisk pumpe fastgjort til et infusionssæt med en 23 G sommerfuglenål (26 G for nyfødte). Sørg for ikke at gennembore gennem skillevæggen.
BEMÆRK: Brug alternativt en nål fastgjort til en sprøjte til at injicere opløsninger. - Se hjertet ved at injicere 10 ml 4% PFA-opløsning i 10 min. ved hjælp af en peristaltisk pumpe med en hastighed på 1 ml/min.
- Fjern hele hjertet med en saks. Efter fjernelse af hjertet, er det muligt at isolere en bestemt region af hjertet ved incising. Aner hjertet eller et segment af det i et 1,5 ml mikrocentrifugerør, der indeholder 1 ml 4% PFA-opløsning. Inkuber hjertet på rocker ved stuetemperatur med vuggende hastighed mellem 20-30 rpm i 1 time.
3. Isolering af faste kardiomyocytter
- Anstændig hjertet i en petriskål indeholdende PBS-opløsning. Klem hjertet for at slippe af med eventuelle PFA resterende i hjertekamrene, og vask i PBS.
- Sæt det faste hjerte i et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende kollagenaseopløsning (60 mg/ml). Rørret på rocker (20-30 omdr./min.) anbringes ved 37 °C til inkubation natten over.
BEMÆRK: Forlæng inkubationstiden op til 1 uge, og genopfyld kollagenopløsningen hver anden dag for at reducere den mulige variation i udbyttet, hvis hjerter forventes at være fibrotiske, hvilket kan kræve længere tid af kollagenasefordring for at fordøje ekstracellulær kollagen. - Sæt kollagenopløsning og hjertet i en 35 mm petriskål. Dissocier hjertet i 1 mm stykker ved hjælp af sniver eller saks.
- Brug en overførselpipette til yderligere at triturere det dissocierede væv i 2 min. Hvis vævspartiklerne stadig er i skålen, skal du bruge en overførselspipette med smallere åbning og fortsætte triturationen. Fortsæt, indtil størstedelen af vævet er nedbrudt.
BEMÆRK: Overtrituration får individuelle kardiomyocytter til at bryde. Sørg for ikke at over triturate ved at kontrollere regelmæssigt under et mikroskop. - Anbet en 200-600 μm nylon mesh over åbningen af 15 ml centrifugerør.
BEMÆRK: For hypertrofide kardiomyocytter anbefales det at bruge 400 μm nylonnet i stedet for 200 μm. - Der tilsættes 5 ml PBS til petriskålen, der indeholder dissocierede celler, og opløsningen filtreres gennem nylonmasker, herunder vævspartikler. Nylonmasken vaskes ved at passere yderligere 4 ml PBS.
- Centrifuge den filtrerede opløsning ved 10-100 x g i 1 min.
BEMÆRK: 100 x g centrifugering vil ikke give 100% ren kardiomyocytpopulation, og nogle ikke-kardiomyocytceller vil sandsynligvis blive inkluderet. - Kassér supernatant, medmindre man ønsker at plette / evaluere ikke-cardiomyocytes hjerteceller samt. Opsprænning af pellet i 10 ml PBS før farvning.
4. Farvning kardiomyocytter
- Cellerne opsamles ved centrifugering ved 100 x g i 1 min. og der tilsættes 5 ml permeabiliseringsopløsning (f.eks. 0,5 % Triton X-100 i PBS). Inkuber i 20 min ved stuetemperatur på rocker.
BEMÆRK: Ved trin 4.1, 4.2 og 4.4 anvendes 15 ml centrifugerør, da det er lettere at fjerne supernatanten uden at forstyrre cellepellet sammenlignet med 1,5 ml mikrocentrifugerør. - Cellerne opsamres ved centrifugering ved 100 x g i 1 min. og der tilsættes 5 ml blokerende buffer (f.eks. 3% kvægserumalbumin [BSA] i PBS) og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur på en rocker.
- Cellerne opsamls ved centrifugering ved 100 x g i 1 min. og der tilsættes 1 ml primær antistofopløsning (i PBS) med det relevante fortyndingsforhold. Opløsningen overføres til 1,5 ml mikrocentrifugerør og inkuberes kardiomyocytter i primærantistofopløsning under optimerede forhold (f.eks. 4 °C natten over).
- Cardiomyocytes overføres med primær antistofopløsning til et 15 ml centrifugerør, og der tilsættes 9 ml PBS. Inkuber kardiomyocytterne i 10 minutter ved stuetemperatur på en rocker.
- Cellerne opsamls ved centrifugering ved 100 x g i 1 min. og der tilsættes 10 ml PBS. Inkuber kardiomyocytterne i 10 minutter ved stuetemperatur på en rocker. Gentag dette trin igen.
- Cellerne opsamls ved centrifugering ved 100 x g i 1 min. og den sekundære antistofopløsning, der indeholder DAPI. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur på en rocker, efterfulgt af at gentage trin 4,5 to gange for at vaske kardiomyocytter.
- Placer cellerne enten på dækslips eller mikroskop-kompatible plader og fortsæt med billeddannelse.
BEMÆRK: Billeder inkluderet i manuskriptet blev taget med 10x og 40x mål. Lasere blev anvendt var: 405 nm for DAPI, 561 nm for Alpha actinin og 640 nm for Edu.
5. Opsætning af billedbehandlingssoftware
BEMÆRK: Følg med disse trin ved hjælp af supplerende fil 1-SoftwareScreenshots.pdf.
- Download Fiji distribution af ImageJ.
- Åbn Fiji. Klik på Hjælp > Opdater... > Administrer opdateringswebsteder. Tjek "IJPB-plugins" og "Biomedgroup" opdatering websteder for at hente afhængigheder plugins Ellipse Split og Morpholibj.
- Klik på Luk. Fiji bør begynde at downloade afhængigheder. Genstart Fiji, når du er færdig.
- Download Rstudio og åbn den.
- Kopier install.packages(c("ggplot2", "autothresholdr", "dplyr", "purrr", "jsonlite", "shiny")) i R-konsollens kommandolinje, og tryk på Enter. Skriv "y" som svar på alle prompter for at installere alle R-afhængigheder (Skærmbillede 1 i supplerende fil 1).
6. Billed kvantificering
- Åbn Fiji, og træk "AnalyzeNucleation.py" (leveret som en supplerende kodefil) til Fijis statuslinje. Dette åbner et scriptredigeringsvindue. Klik på Kør i nederste venstre hjørne for at starte det (Skærmbillede 2 i supplerende fil 1).
- En dialogboks vil poppe op(Supplerende Fil 1:Screenshot 3), beder om placeringen af output data bibliotek. Alle analysedata, tal og andre data, der bruges af denne software, gemmes i denne mappe. En anden, større dialogboks vil poppe op, viser alle billedanalyseindstillinger(supplerende fil 1:Skærmbillede 4).
- Vælg placeringen af den mappe, der indeholder billeder, der skal analyseres.
- Angiv billedfilnavnformatet ved hjælp af regulære udtryk. Angiv billedfilnavnformatet, der angiver, hvilke dele af filnavnet der svarer til række, kolonne, kanal og (eventuelt) websted i klammeparenteser ved hjælp af regulære udtryk. Sæt ikke mellemrum i selerne. Surround variable dele af filnavnformatet i klammeparenteser {}. Den måde, filer gemmes på, afhænger af billedbehandlingssoftwaren, og dette trin henter relevante oplysninger fra billedfilnavnet.
BEMÆRK: Formatstrengen
r" Plade 1-(? P[A-Za-z]+)(? P [0-9]+)-(? P [A-Za-z]+).tif"
beskriver et filnavn, der starter med "Plade 1-", efterfulgt af et eller flere alfabetiske bogstaver, der angiver rækken, efterfulgt af et eller flere cifre, der angiver kolonnen, efterfulgt af "-", efterfulgt af et eller flere bogstaver, der angiver kanalen, efterfulgt af ".tif". Bogstaverne i vinkelparenteserne som "<>" er variabelnavne og kopieres automatisk til dataene, når de indsamles. Et af variabelnavnene skal være "" - Angiv navnet på kanaler, hvor den nukleare plet er synlig, og hvor kardiomyocytterne er synlige. Disse navne skal være nøjagtigt, som de er i den del, der matches af variablen "
" i filnavnene i regulære udtryk. - Angiv, hvordan billederne skal grupperes ved hjælp af kommaseparerede variabelnavne. Alle billederne i en given gruppe åbnes og analyseres i et parti. For eksempel, hvis billederne er opdelt i sæt for hver brønd, og der er en brønd for hver unik kombination af række og kolonne, så skriv "række, kolonne" i dette felt.
BEMÆRK: Disse grupperingsvariabler skal være et undersæt af de variabler, der bruges i formatstrengen. Brug ikke "kanal" som en grupperingsvariabel, dette vil adskille tilsvarende kanalbilleder fra hinanden. - Angiv, om billederne er syet sammen i ét brøndbillede eller er adskilte for hvert websted. I det første tilfælde bør webstedet ikke angives i filnavnformatstrengen.
- Vælg, hvilken tærskelmetode der skal bruges til at adskille kerner fra baggrunden. Alle Fijis standardtærskelmetoder er tilgængelige. Test forskellige tærskelmetoder for at finde ud af, hvad der fungerer bedst for billedsættet. I dette eksempel skal du vælge metoden Otsu.
- Angiv, om tærsklen skal genberegnes for hvert webstedsbillede, eller om den samme tærskel skal bruges for hvert billede i gruppen. Angiv, om kardiomyocytbillederne er lysefelt eller bruger en fluorescerende markør.
- Angiv metoden med tærskel for kardiomyocyt. Hvis der blev valgt brightfield i det forrige trin, anvendes denne tærskelmetode på kantfiltrede brightfield-billeder. Angiv, om tærsklen skal genberegnes for hvert webstedsbillede, eller om den samme tærskel skal bruges for hvert billede i gruppen.
- Angiv antallet af rækker med webstedsbilleder, der dækker hver brønd. Angiv antallet af kolonner med webstedsbilleder, der dækker hver brønd. Angiv det mindste område med kerner i pixel. Brug en generøst lav minimumsstørrelse, en højere og mere præcis tærskel vil blive beregnet i analysetrinnet. Angiv det mindste område af kardiomyocytter.
- Klik på OK efter valg af de ønskede indstillinger.
- Billeder, der ligner dem, der findes i figur 3 og Figur 4, vises på skærmen, der viser de forskellige faser i analysepipelinen. Undersøg disse billeder for at sikre, at tærskelværdier og segmentering sker korrekt.
- Den valgte resultatmappe skal nu fyldes med analysedata (Supplerende fil 1: Skærmbillede 5). Andre filer end analysedata kan sikkert gemmes i denne mappe, så længe deres navne ikke begynder med "cm_", "nuclei_" eller "nucleilink_".
7. Dataanalyse
BEMÆRK: De csv-filer, der produceres, kan analyseres manuelt. Hver analyseret billede delmængde producerer en tredobbelt af csv filer med navnet "kerner (metadata).csv", "nucleilink(metadata).csv" og "cardiomyocytes(metadata),csv", hvor (metadata) erstattes med en sekvens af navneværdipar i formularen "_(name)=(værdi)", hvor (navn) og (værdi) er sekvenser af alfanumeriske tegn, der er afledt af strenge, der er matchet i det regulære udtryk, der er givet tidligere. (Hvis række- og kolonne blev angivet i filnavnene, vil strenge som "_row=F" og "_column=8" f.eks. Den unavngivne kolonne længst til venstre for hver kerne- og kernefil er et kerne-id-nummer. Den "Min" kolonne af nucleilink fil er id af cardiomyocyte, der indeholdt nævnte kerne helt eller 0 på anden måde. Den "Max" kolonne af kernen er ID af den højest nummererede cardiomyocyte, der indeholdt nævnte kerne delvist, eller 0 på anden måde. Kolonnen "Middel" i filen cardiomyocytes er kardiomyocyt-id-nummeret.
- Åbn "AnalyzeMultinucleatedServer.R" i Rstudio (angivet som supplerende kodefil).
- Øverst i denne fil er en variabel med navnet "folderName". Ved siden af er der en filepat. Her skal du skrive stien til den outputdatamappe, der er valgt i sidste trin, uden den endeligeskråstreg (supplerende fil 1: Skærmbillede 6).
- I øverste venstre hjørne af scriptredigeringsvinduet skal der være en grøn pil med navnet Kør app. Klik på denne pil. Det kan tage lidt tid, før dataene indlæses, og at appen dukker op.
- I første omgang vil der være tre gatinggrafer synlige, en for at angive den mindste gyldige tærskel for nukleart område, en for at angive den mindste gyldige nukleare gennemsnitsintensitetstærskel og en for at angive den maksimale gyldige minimumferets diameter for kardiomyocytter. Brug skyderne til at indstille disse tærskler(Supplerende fil 1:Skærmbillede 7).
BEMÆRK: I hver af disse grafer skal der være en stor, bred top svarende til gyldige kerner eller kardiomyocytter, flankeret af brede haler, der repræsenterer snavs eller fejlagtige segmenterede kardiomyocytter. Brug tærsklerne til at skære en hale af hver af toppene af. - Rul ned. Klik på knappen Anvend valgte tærskler (nederst i supplerende fil 1:Skærmbillede 7).
- Klik på knappen Afbild intensitetsfordeling. Dette vil gøre plot af den nukleare intensitet fordeling af både hele prøven og separate delplots for hver gruppering variabel.
BEMÆRK: Hvisog grupperingsvariabler f.eks.Supplementary File 1 Hvis belysnings- og farvningsforholdene var konstante på tværs af de forskellige dele af prøven, skulle disse områder alle tydeligt vise to intensitetstoppe, en lysdæmper, højere for diploidkerner og en lysere, kortere for tetraploide kerner. - Intrasample variation vil resultere i dette mønster ikke er synlig i hele prøven plot, og der er stor variation i placeringen af diploid og tetraploid toppe efter række, kolonne, eller anden gruppering variabel. I sidstnævnte tilfælde skal du rulle ned i afkrydsningsfeltet Normaliser separat efter gruppe for at tage højde for denne variation (Supplerende fil 1: Skærmbillede 9).
- Klik på knappen Beregn Ploidy (Supplerende fil 1:Skærmbillede 9). Klik på knappen Plot anslået ploidy distribution. Der vises grafer i de tomme vinduer til højre. I den normaliserede graf med hele prøven skal totopmønsteret være synligt, hvis det ikke var før.
- Vælg tærskler for at isolere diploid og tetraploid toppe fra både hinanden og outliers ved hjælp af skydere(Supplerende Fil 1:Screenshot 9). Rul ned. Klik på knappen Beregn Ploidy og Nucleation (Supplerende fil 1:Skærmbillede 10).
- Klik på knappen Afbild og Gem i mappen Resultater. Plottet, der er gemt i den valgte resultatmappe, vises også i dette interaktive vindue(Supplerende fil 1:Skærmbillede 10).
Representative Results
Kardiomyocytter blev isoleret i henhold til den protokol, der er beskrevet ovenfor. Ved hjælp af denne metode får vi typisk ensartet enestående kardiomyocytter, der er relativt rene uden at forurene ikke-kardiomyocytceller (Figur 1A). Kardiomyocytter er let identificeres under lyse felt mikroskopi på grund af deres karakteristiske størrelse og birefringence. Denne teknik er nem at implementere og giver ensartede resultater fra forskellige isolationer med sammenlignelige kardiomyocytudbytter og -kvalitet (Figur 1B). Isolerede kardiomyocytter kan opbevares ved 4 °C i flere uger før videre brug.
Kardiomyocytter, der blev isoleret i henhold til ovenstående protokol kan bruges til forskellige downstream applikationer, såsom måling cardiomyocyte størrelse, cardiomyocyte ploidy og immunocytokemi. Som et repræsentativt resultat, viser vi, at kardiomyocytter isoleret i henhold til denne protokol kan farves ved hjælp af antistoffer og fluorromrom-konjugerede azider for klik kemi til at opdage lokalisering af specifikke proteiner eller til at opdage cardiomyocyte DNA replikation, henholdsvis. For eksempel, vi farves kardiomyocytter med antistoffer anerkender α-actinin at vise den karakteristiske z-line farvning mønster af sarcomeres (Figur 2A). I et separat eksperiment administrerede vi thymidin analogen 5-Ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) til mus, før de isolerede faste kardiomyocytter. Efter kardiomyocyt isolation, vi farves for indarbejdet EdU ved hjælp af standard protokoller13, og var i stand til at opdage kardiomyocytter, der havde gennemgået S fase i enten mononukleerede, binukleerede og trinucleated cardiomyocytes (Figur 2B).
For yderligere at udvide nytten af isolationsmetoden udviklede vi en rørledning, der gør det muligt at kvantificere kardiomyocyt ploidy baseret på integreret DNA-farvning. For at kunne måle ploidy status af celler eller kerner, vi havde brug for at segmentere kerner og kardiomyocytter. Figur 3 viser en repræsentation af den strategi, vi brugte til at identificere individuelle kerner. For det første er det oprindelige billede DNA-farves billede (Figur 3A) tærskel baseret på intensitet (Figur 3B). Her brugte vi DAPI til at plette for DNA, men ethvert andet nukleart farvestof, der viser en lineær korrelation med DNA-indhold ville arbejde. Programmet giver mulighed for nogen af Fijis intensitet tærskelmetoder, der skal vælges, men i dette eksempel Otsu's metode blev brugt. Nukleare masker, der rører billedets kant eller er mindre end den angivne minimumgrænse for pixelområde, er udelukket. Derefter, ellipser er egnet til de nukleare masker, segmentering individuelle kerner. Figur 3C viser disse ellipser overlejret på det oprindelige billede. Dernæst udfyldes hullerne i maskerne, og billedets pixel opdeles derefter i områder, baseret på hvilke ellipse de er mest proksimale til (Figur 3D). Grænserne for disse områder bruges derefter til at trække linjer gennem nukleare klynger, efterbehandling den nukleare segmentering proces (figur 3E).
Det næste skridt indebærer påvisning af kardiomyocytter. For kardiomyocyte billeder, der er opnået baseret på fluorescerende farvede celler (Figur 4A), processen er meget lig den for kerner. Billedet er tærskel baseret på en intensitetsværdi beregnet ved hjælp af den valgte tærskelmetode, i dette tilfælde trekantsmetoden. Identificerede kardiomyocytmasker, der rører ved billedets grænse eller er under en vis størrelse, udelades, og huller udfyldes i maskerne for at give korrekt segmenteret kardiomyocytter (Figur 4B). Fordi kardiomyocytter har en mere uregelmæssig form end kerner, intet forsøg er gjort for at segmentere cardiomyocyte klynger. I stedet er disse klynger udelukket baseret på deres høje minimum Feret's diameter under analysetrinnet. Segmentering fra lyse feltbilleder fortsætter lidt anderledes. Først behandles det oprindelige lyse feltbillede (Figur 4C) med et Sobel-kantfilter. Dette filter beregner den absolutte værdi af forløbet for hver pixel i billedet. Pixel i områder med hurtige ændringer modtager høje værdier, og pixel i jævne områder af billedet får lave værdier. Dette kantfiltrede billede er derefter tærskel for intensitet ved hjælp af trianglemetoden, hvilket resulterer i maskerede kardiomyocytter (Figur 4D). Disse meget uregelmæssige masker glattes derefter og forbindes sammen via morfologisk lukning ved hjælp af en cirkel med en radius på 2 pixel, som udfylder alle hvide områder i billedet, hvor cirklen ikke kan passe uden at overlappe et sort område (Figur 4E). Endelig er huller i maskerne fyldt, regioner, der rører grænsen er udelukket, og små partikler fjernes, efterbehandling cardiomyocyte segmentering proces (Figur 4F).
Ved hjælp af den skitserede segmenteringsstrategi kan vi derefter bestemme nukleationsstatus for individuelle kardiomyocytter. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, vi bestemmes kernen status cardiomyocytes isoleret fra hjerter af udavlede CD-1 mus på tidlige postnatal tid-point. Hjerter af nyfødte mus (første dag i livet) viste, at størstedelen af kardiomyocytter på dette punkt er mononukleerede (Figur 5: neonatal). Denne høje frekvens af mononukleerede kardiomyocytter er meget lavere hos unge mus (2 uger gamle), hvor mononukleerede kardiomyocytter udgør omkring 25% af den samlede kardiomyocytepopulation (Figur 5: unge). Endelig kan vi måle ploidy status af individuelle kerner i cardiomyocytes, og afgøre, om de er diploid eller tetraploid. Disse resultater viser højere hyppighed af tetraploide kerner hos unge mus (Figur 6).
Figur 1: Effektiviteten af isolation af kardiomyocyt efter fiksering. (A)Repræsentativt billede af isolerede kardiomyocytter, der er plettet med DAPI for at vise kerner. (DAPI (blå), Brightfield (grå)) (B)Udbytte af kardiomyocyter isoleret fra forskellige mus ved 3 måneders alderen. Skalabarer = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Immunocytokemi af isolerede kardiomyocytter. aA) Repræsentativt billede af kardiomyocytter, der er α i α-actinin (rød) og DAPI (blå)). (B) Cardiomyocytes farves for indarbejdet EdU (rød) og DAPI (blå). Repræsentative kardiomyocytter, der er mononukleerede (venstre), binukleerede (i midten) og trinucleated (højre) og EdU-positive vises. Skalabarer = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Strategi for nuklear segmentering. (A) Originalt DAPI-kanalbillede. (B) Tærskelbillede (i dette eksempel blev Otsu's metode anvendt). (C) Masker, der blev identificeret fra de tærskelbilleder overlejret på den oprindelige DAPI farvede billede. DD) Voronoi tessellation baseret på nukleare masker. (E) Endelig segmenteret kerner, med split klynger fremhævet. Skalabarer = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Strategi for segmentering af kardiomyocyt. (A)Original fluorescerende Troponin jeg farves cardiomyocyte billede. BB) Billede med trekantsgrænse, efter at der er udfyldning af huller, bortset fra små genstande og genstande, der rører ved kanten. (C) Originalt lyst felt kardiomyocyte billede (D) Kant-filtreret og trekant-tærskel kardiomyocyte billede (E) Kant-filtreret billede efter morfologisk lukning med en radius på to pixels (F) Samme billede efter påfyldning huller og eksklusive små objekter og dem, der rører kanten. Skalabarer = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Klassificering af kardiomyocytter baseret på antallet af kerner. Neonatal hjerter (1 dage gamle) indeholder mere mononukleerede kardiomyocytter end unge hjerter (14 dage gamle). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Fordeling af dna-indhold af kardiomyocyt pr. kerne. Hos nyfødte (venstre), 13,5% af mononukleerede CM kerner er tetraploid og 11,9% af binukleerede CM kerner er tetraploid. Hos unge (til højre) er 33,9 % af de mononukleerede CM-kerner tetraploide, og 31,2 % af de binukleerede CM-kerner er tetraploide. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil 1: Software screenshots. Klik her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).
Supplerende sag 2: AnalyzeNucleation.py. Klik her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).
Supplerende fil 3: AnalyzeMultinucleatedServer.r. Klik her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).
Discussion
Da kardiomyocytter ikke kan opretholdes i kulturen, er det vigtigt at isolere primære kardiomyocytter for at kunne studere deres arkitektur og funktion11. Derfor har kardiomyocyte isolation teknikker været meget udbredt i hjertefeltet. Hvis målet er at bestemme funktionelle aspekter af kardiomyocytter, er det vigtigt at isolere levedygtige kardiomyocytter. Disse levende kardiomyocytter kan også bruges til at udføre immunstaining på isolerede kardiomyocytter. Men optimering af teknikken til at isolere levende kardiomyocytter er teknisk udfordrende, og selv de bedste teknikker typisk kun give 60-65% levende stang-formede cardiomyocytes, og de resterende kardiomyocytter er alle balled op og døende eller døde11,12. Her udviklede vi en teknik, der vil gøre det muligt for forskere først at fastsætte hjertet, og derefter isolere kardiomyocytter effektivt. Denne nye protokol giver mulighed for langt højere udbytter af stang-formede kardiomyocytter i forhold til tidligere offentliggjorte protokoller. Desuden udviklede vi en billedanalyseplatform til at kategorisere kardiomyocytter automatisk baseret på kernedannelse og ploidy. Med disse nye metoder, grupper kan plette kardiomyocytter for forskellige proteiner, og studere cardiomyocyte ploidy og nucleation status som surrogater for den regenerative potentiale i hjertet.
Den protokol, der er beskrevet her, er forholdsvis ligetil og kan udføres uden avanceret udstyr. Mængden af kollagen og inkubationstid for fordøjelsen kan variere afhængigt af kollagensen parti, og virksomheden giver det. Vi brugte kollagenase type 2, da dette er mest udbredt til at fordøje hjertet for at opnå levende kardiomyocytter. Baseret på vores observationer, besluttede vi, at natten inkubation med 60 mg/ml kollagenase type 2 er optimal for næsten alle musehjerter uanset niveauet af fibrose. Vi har aldrig haft et problem med overdigestion som intracellulære proteiner er faste og ikke så tilgængelige som ekstracellulær kollagen. Men hvis hjertet ikke er fordøjet ordentligt, mere energisk trituration kan være nødvendig, hvilket forårsager celle fragmentering på grund af forskydning stress. Således er det afgørende at sikre, at hjertet er fordøjet ordentligt, før du går videre til trituration. Stivhed i hjertet kan testes ved at klemme med pincet til at vurdere graden af fordøjelsen. Efter inkubation med kollagenase, bør hjerter være mindre stiv og let at rive fra hinanden. Andre typer af kollagenase kan også anvendes. En tidligere rapport brugte en kombination af collagenases B og D14.
Desuden mener vi, at denne protokol kan bruges til at vurdere det samlede antal kardiomyocytter i hjertet15. Men hvis målet er at opnå og kvantificere alle kardiomyocytter fra hjertet, er det vigtigt at inkubere hjerter i længere tid i kollagenvæskeopløsningen (f.eks. 3-7 dage), hvor kollagenaseopløsningen skal genopfyldes en gang om dagen. Dette vil minimere uoverensstemmelser i isolation effektivitet ved at fjerne virkningen af graden af trituration på cardiomyocyte udbytte.
Brugen af DNA-indhold til at måle ploidy er ikke ny, og har været anvendt i flow cytometri i årtier. For nylig blev det vist, at mikroskopi ligeledes kan bruges til at estimere DNA-indhold pr. kerne16. Her har vi gennemført denne strategi for at måle ploidy af cardiomyocyte kerner, som et surrogat for nydannede kardiomyocytter. Dogmet inden for hjerteregenerering er, at kun mononukleerede, diploid kardiomyocytter kan gennemgå cytokinese og give anledning til nye kardiomyocytter. Da det er meget udfordrende at måle nye kardiomyocyte dannelse in vivo, isolere kardiomyocytter, der er blevet jaget efter administration af en DNA nukleotid analog og bestemme niveauet af monokernede, diploid cardiomyocytes er blevet brugt som en tilnærmelse af hjertets evne til at generere nye kardiomyocytes17. Her giver vi en makro til ImageJ, der giver nem kvantificering af cardiomyocyte ploidy. Der skal i det mindste måles 500 kerner for at opnå et nøjagtigt skøn over placeringen af G1-toppen. Hvis der sørges for, at farvning og billeddannelse betingelser er konsistente på tværs af alle brønde af den afbildede plade, kun 500 kerner på tværs af hele prøven skal afbildes, ellers skal der være 500 kerner pr billede gruppe18,19. Begrænsninger af billeddannelse-baseret måling af kerner og ploidy omfatter vanskeligheder med at skelne kerner fra klæbende celler fra faktiske cardiomyocyte kerner, når du bruger to-dimensionelle billeder. Sådanne klæbende celler kan resultere i overvurdering af mængden af flerkernede celler og mindske nøjagtigheden af målinger af tetraploide kardiomyocytkernepopulationen. En mulig strategi for at løse dette problem ville være at bruge kardiomyocyt nukleare markør PCM16,20. Men vi har haft problemer med at opnå pålidelige PCM1 farvning på korrekt faste celler eller væv.
En anden potentiel begrænsning er, at nogle nukleare plet billeder kan have betydelig baggrund cytoplasmic farvning, forhindrer korrekt tærskelring ved hjælp af Fijis indbyggede metoder uden omfattende forbehandling. Desuden reducerer den uregelmæssige bidrag af denne baggrund fluorescens i ploidy skøn deres nøjagtighed. Hvis cellerne ikke efterlades i DNA-farvningsopløsning i tilstrækkelig tid, vil fluorescerende farvestof desuden ikke binde sig til mætning i kernerne, og antagelsen om et lineært forhold mellem nuklear integreret intensitet og DNA-indhold vil ikke længere være nøjagtig.
Det skal bemærkes, at softwaren ikke kan segmentere cardiomyocyte klynger og i stedet fjerner dem fra analyse. Derfor er det af afgørende betydning at frø kardiomyocytter med en relativt lav tæthed (f.eks. 1000 celler/cm2). Yderligere, softwaren kan ikke skelne mellem to kardiomyocytter linet op end-to-end og lange, ental kardiomyocytter. Disse typer af klynger kan fejlagtigt puste multinucleation skøn.
Selv om den beskrevne metode ikke giver mulighed for at opnå levedygtige kardiomyocytter og derfor ikke kan bruges til at måle dynamiske cellulære processer, hvis målet er at udføre immunstaining, mener vi, at den beskrevne metode er bedre end eksisterende protokoller med højere udbytter af kardiomyocytter og bedre kvalitet med hensyn til morfologi og protein lokalisering. Endelig kan den beskrevne metode anvendes til at isolere kardiomyocytter fra kliniske prøver14,21. Vi mener, at den beskrevne metode kan hjælpe forskellige forskere til at opnå høj kvalitet cardiomyocytes og måle nukleation og ploidy som surrogater for nye cardiomyocyte dannelse.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
JHvB er støttet af tilskud fra NIH, Regenerative Medicine Minnesota, og en individuel Biomedical Research Award fra The Hartwell Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 wells plate for imaging | Corning | 3340 | We use these plates as they are suitable for imaging, although glass bottom plates would be better for confocal imaging |
| Alpha actinin | Novus Biologicals | NBP1-32462 | This antibody is used as a marker of cardiomyocyte sarcomeres |
| Blunt scissors | Fine Scissor Tools | 14072-10 | We prefer blunt scissors as the possibility of tearing heart tissue is lower when exposing the heart |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
| CD-1 mice | Charles river | 22 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
| Collagenase 2 | Worthington | LS004177 | For the purpose of this protocol, the batch to batch differences are minimal and don't affect overall yield and quality of the isolation |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165-10G | For edu staining |
| Cy5 Picolyl Azide | Click Chemistry Tools | 1177-25 | Azide used for edu staining |
| Cytation3 | BioTek | - | Used for automated imaging for DNA analysis |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | DAPI used for DNA staining. Stocks were dissolved in distilled water. |
| donkey anti-mouse IgG-Alexa568 | Life Technologies | A10037 | Secondary antibody used to detect alpha actinin staining within cardiomyocytes |
| Forceps | ROBOZ | RS-5137 | We use these curved, blunt forceps, although straight forceps could also be used |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144212 | To set pH of Tris-HCl buffer to pH 8.5 |
| ImageJ | imagej.net/Fiji/Downloads | - | Used for analyzing images |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 255564-100G | For edu staining |
| Needle for infusion | TERUMO | SV*23BLK | We use winged infusion sets throughout the protocol as it is easy to manipulate the position of the needle with these sets during injection |
| Nikon A1R HD25 | Nikon | - | Used to take confocal images of alpha actinin staining |
| Nylon mesh 200 micron | Elko filtering | 03-200/54 | Mesh used for filtering regular cardiomyocytes (not hypertrophied) |
| Nylon mesh 400 micron | Elko filtering | 06-400/38 | Mesh used for filtering hypertrophied adult cardiomyocytes |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | Corning | 21-040-CV | This can also be prepared in the lab. Although sterility is important in this experiment, we think it is sufficient to prepare PBS and filtering it |
| Potassium chloride, Granular | Mallinckrodt | 6858 | Granular potassium chloride was preffered by us as it forms less aggregates when stored in room temperature |
| R | r-project.org | - | Used for data analysis of the measurements obtained from images |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | Used to buffer EdU staining reaction |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135 (10), e146 (2017).
- Heidenreich, P. A., et al. Forecasting the future of cardiovascular disease in the United States: a policy statement from the American Heart Association. Circulation. 123 (8), 933-944 (2011).
- Eschenhagen, T., et al. Cardiomyocyte Regeneration: A Consensus Statement. Circulation. 136 (7), 680-686 (2017).
- Tzahor, E., Poss, K. D. Cardiac regeneration strategies: Staying young at heart. Science. 356 (6342), 1035-1039 (2017).
- Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).
- Richardson, G. D. Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
- Bergmann, O., et al. Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover. Experimental Cell Research. 317 (2), 188-194 (2011).
- O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Shaklee, J., et al. Development of a Click-Chemistry Reagent Compatible with Mass Cytometry. Scientific Reports. 8 (1), 6657 (2018).
- Mollova, M., et al. Cardiomyocyte proliferation contributes to heart growth in young humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1446-1451 (2013).
- Naqvi, N., et al. A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number. Cell. 157 (4), 795-807 (2014).
- Roukos, V., Pegoraro, G., Voss, T. C., Misteli, T. Cell cycle staging of individual cells by fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10 (2), 334-348 (2015).
- Patterson, M., et al. Frequency of mononuclear diploid cardiomyocytes underlies natural variation in heart regeneration. Nature Genetics. 49 (9), 1346-1353 (2017).
- Gomes, C. J., Harman, M. W., Centuori, S. M., Wolgemuth, C. W., Martinez, J. D. Measuring DNA content in live cells by fluorescence microscopy. Cell Division. 13, 6 (2018).
- Woo, L. A., et al. High-content phenotypic assay for proliferation of human iPSC-derived cardiomyocytes identifies L-type calcium channels as targets. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 127, 204-214 (2018).
- Morikawa, Y., Heallen, T., Leach, J., Xiao, Y., Martin, J. F. Dystrophin-glycoprotein complex sequesters Yap to inhibit cardiomyocyte proliferation. Nature. 547 (7662), 227-231 (2017).
- Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
