Summary
Qui, forniamo una descrizione dettagliata della procedura per indurre biopsie di pizzico guidate dal colonscopico nei topi e tracciare la chiusura delle ferite in tempo reale. Inoltre, vengono forniti metodi per la preparazione di tessuti per analisi istologiche, immunoistochimiche e molecolari del letto della ferita.
Abstract
Comprendere i cambiamenti tissutali e cellulari che si verificano nella risposta alle lesioni acute e durante il processo di guarigione delle ferite è di fondamentale importanza quando si studiano le malattie del tratto gastrointestinale (IG). Il modello di biopsia a pizzico colonico murino è uno strumento utile per definire questi processi. Inoltre, è possibile studiare l'interazione tra il contenuto luminale intestinale (ad esempio, microbi) e il colon. Tuttavia, l'induzione della ferita e la capacità di tracciare la chiusura della ferita nel tempo in modo affidabile possono essere impegnative. Inoltre, la preparazione e l'orientamento dei tessuti devono essere effettuati in modo standardizzato per interrogare in modo ottimale i cambiamenti istologici e molecolari. Qui presentiamo un metodo dettagliato che descrive le lesioni indotte dalla biopsia e il monitoraggio della chiusura delle ferite attraverso colonscopie ripetute. Viene descritto un approccio che garantisce misurazioni coerenti e riproducibili delle dimensioni della ferita, la capacità di raccogliere il letto della ferita per analisi molecolari e visualizzare il letto della ferita al momento della sessatura dei tessuti. La capacità di eseguire con successo queste tecniche consente studi sulla risposta acuta alle lesioni, sulla guarigione delle ferite e sulle interazioni luminare-ospite all'interno del colon.
Introduction
Il tratto gastrointestinale (GI) è un sistema di organi complesso date le sue molteplici funzioni, i tipi di cellule ospiti (ad esempio epiteliale, immunitario, stromale, ecc.) e trilioni di microbi. Alla luce di questa complessità, le malattie del tratto gastrointestinale spesso comportano l'interazione di tutti questi fattori. Ad esempio, le malattie infiammatorie intestinali (IBD) sono associate a cicli di infiammazione e remissione nel tratto gastrointestinale, che comportano l'attivazione di cellule infiammatorie, disbiosi e riparazione epiteliale1,2,3,4,5,6,7. Avere sistemi modello appropriati per studiare l'IBD e altre condizioni infiammatorie del tratto GASTROINTESTINAL è fondamentale per chiarire la patogenesi della malattia. Esistono diversi modelli per studiare la patogenesi IBD, compresi i topi geneticamente modificati e l'uso di sostanze chimiche come il solfato di sodio di dextran (DSS)nei roditori 8,9,10. Le limitazioni di questi modelli includono l'incapacità di controllare con precisione l'induzione dell'infiammazione e le difficoltà nel valutare la guarigione delle ferite. Metodi alternativi per imitare aspetti della patogenesi IBD potrebbero rivelarsi utili per lo sviluppo di terapie.
Le biopsie di pizzico guidate dal colonscopico nei topi offrono un utile sistema modello per studiare la patogenesi della risposta infiammatoria, la guarigione delle ferite e le interazioni ospite-microbo nel colon. Questo approccio è stato utilizzato per la prima volta come strumento sperimentale nel 2009, che ha dimostrato la sua utilità per lo studio della risposta infiammatoria acuta e della guarigione delle feritenell'intestino 11. Studi successivi hanno utilizzato questa tecnica per valutare i ruoli delle diverse vie di segnalazione così come il microbiota intestinale, nella guarigione delle ferite coloniche11,12,13,14,15,16,17,18. Più recentemente, il nostro gruppo ha utilizzato questo modello per studiare l'importanza della segnalazione della sfingosina-1-fosfato e dei batteri nella risposta acuta alla lesionecolonica 19. Sebbene utile, effettuare biopsie di pizzico guidate dal colonscopico nei topi e valutare i successivi cambiamenti tissutali può essere tecnicamente impegnativo. Ad esempio, la perforazione dell'intestino può verificarsi all'induzione di lesioni e garantire misurazioni coerenti del letto della ferita attraverso colonscopie seriali può essere difficile. Inoltre, orientare correttamente il tessuto colon per visualizzare il letto della ferita per analisi istologiche o immunoistochimiche può essere impegnativo. Sebbene esistano alcune informazioni su questi metodi18,20, una descrizione precisa di queste tecniche insieme agli ausili visivi promette di migliorare l'affidabilità e l'utilità più ampia di questo modello. Qui presentiamo un metodo dettagliato per effettuare biopsie di pizzico guidate colonscopiche nei topi, tracciare la chiusura delle ferite nel tempo e preparare il tessuto per consentire analisi istologiche e molecolari del letto della ferita. La creazione di un metodo standard per eseguire queste tecniche può espandere l'uso di questo modello per studiare mediatori precedentemente non investiti che sono potenzialmente importanti per l'infiammazione dell'IG e la riparazione delle ferite.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure qui descritte sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali di Weill Cornell Medicine. A: "Tutte le procedure qui descritte sono state approvate dagli Institutional Animal Care and Use Committees di Weill Cornell Medicine e Stony Brook University.
1. Colonscopia e induzione della ferita
- Preassemblare i componenti dell'endoscopio inserendo prima l'endoscopio a foro rigido da 1,9 mm nella tona (Figura 1A-B). Collegare la pompa dell'aria (per fornire l'insufflazione colonica) utilizzando i tubi forniti, alla valvola del gas sul lato sinistro della chiave accanto al canale dilavoro (figura 1C).
NOTA: Sebbene l'obiettivo qui descritto sia di 0°, a questo scopo può essere utilizzata anche una lente a 30°. - Assicurarsi che il canale di lavoro sia in posizione aperta e inserire le forcepsi della biopsia 3 Fr attraverso il canale di lavoro e avanzare fino alla fine della torcia (assicurandosi che non spedi dalla torcia)(Figura 1C). Collegare l'endoscopio assemblato alla sorgente luminosa e al dispositivo di imaging video per le istruzioni del produttore.
- Anestetizzare il topo con il 5% di isoflurane con ossigeno in una camera di induzione. Quindi spostare il mouse su una piattaforma di stadiazione endoscopica contenente un sistema di riscaldamento (per prevenire l'ipotermia) sul lato ventrale e mantenere in anestesia utilizzando un cono nasale con isoflurane al 2% con ossigeno. Aggiungere un unguento veterinario agli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia. Assicurarsi che il mouse sia completamente anestetizzato pizzicando delicatamente il piede posteriore per verificare la ricerca di un riflesso.
NOTA: Qualsiasi ceppo o sesso di topi può essere utilizzato con questa tecnica; tuttavia, è preferibile che i topi abbiano almeno 8 settimane di età, quindi sono abbastanza grandi per la procedura.- Aggiungere un unguento veterinario agli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
- Assicurarsi che il mouse sia completamente anestetizzato pizzicando delicatamente il piede posteriore per verificare la ricerca di un riflesso.
- Riempire una siringa da 3 ml con un ago di gavage per topo attaccato con soluzione salina tamponata da fosfati a temperatura ambiente (PBS). Inserire l'ago di circa 1 cm nell'ano del mouse e infondere delicatamente PBS per cancellare il materiale fecale. Diversi pellet fecali dovrebbero uscire dal mouse insieme al PBS che è stato infuso.
NOTA: L'instillazione di un volume eccessivo di PBS può provocare la formazione di schiuma nel lume che potrebbe oscurare la visione del lume. - Inserire l'endoscopio assemblato di 0,5 cm nell'ano del mouse. Far avanzare la biopsia nel lume del retto fino a quando le 'mascelle' complete (compresa la cerniera) delle forcep sono oltre la fine della toria (come osservato sul monitor video)(Video supplementare 1). Ruotare i forcep di 90° in modo che le mascelle si apra in un orientamentoest-ovest ( Video supplementare 1).
- Per la biopsia, aprire le forcep e avanzare di circa 1 cm, chiudere le forcep e in un movimento liscio tirare rapidamente indietro sulle forcep lasciandole chiuse(Video supplementare 1).
- Evitare di insufflare completamente il colon quando si esegue la biopsia. Pertanto, lasciare aperto il lato destro della valvola del gas durante questa fase; anche se va notato che all'apertura delle forcep c'è il rischio di danneggiare la mucosa quando il colon è in questa posizione.
2. Visualizzare e misurare il letto della ferita
- Avviare la registrazione video immediatamente dopo la biopsia premendo il pedale collegato al dispositivo di registrazione del colonscopio. Insuffare completamente il colon premendo saldamente un indice contro il lato destro della valvola a gas per coprire completamente l'apertura al fine di forzare l'aria nell'endoscopio e quindi nel colon.
NOTA: Sebbene questo protocollo descriva l'uso di una pompa d'aria in cui il flusso d'aria è controllato manualmente, è anche possibile utilizzare una pompa peristaltica con un alimentatore d'aria controllato. - Far avanzare le forcep fuori dalla tona e nel lume rettale mentre si è in posizione chiusa (Video supplementare 1). Posizionare le forcep contro la parete rettale immediatamente sopra la ferita fino a quando la base delle ganasce non è allineata con il bordo superiore del campo di visualizzazione (Figura 2 e Video supplementare 1). Continuare a insufflare completamente il colon fino a quando non si può osservare una visione chiara della ferita.
NOTA: Si deve fare attenzione ad estendere le forcep abbastanza lontano da rivelare solo le mascelle delle forcep fino alla base per ogni mouse esaminato al fine di garantire una distanza costante tra la lente dell'endoscopio e la lesione(Figura 2, freccia bianca). - Se si educono biopsie su più topi lo stesso giorno, rimuovere il tessuto biopsied del mouse precedente dalle flessioni (utilizzando il pennello per la pulizia fornito) e pulire la torcia dell'obiettivo con il 70% di etanolo per pulirlo prima di indurre una ferita nel topo successivo.
NOTA: Sebbene questo protocollo descriva l'esecuzione di una singola biopsia per topo, è possibile eseguire più biopsie su un singolo topo a condizione che il tessuto prelevato dalla biopsia precedente venga rimosso dalle forcep al fine di garantire che una biopsia completa possa essere assunta su biopsie successive. - Posizionare il mouse in una gabbia priva di altri topi e sopra un asciugamano per mantenere le vie aeree chiare fino a quando non si riprende dall'anestesia dopo aver completato la procedura. Monitorare il mouse per assicurarsi che si riprenda dall'anestesia come indicato riacquistando l'attività.
NOTA: Due persone sono tenute a indurre la ferita e visualizzare il letto della ferita il giorno 0 (una che opera l'endoscopio e l'altra che opera le flesse della biopsia) ma è necessario un solo individuo per visualizzare le ferite nei giorni successivi (come descritto di seguito). - Seguire la stessa procedura per la preparazione del topo e della colonscopia per successive misurazioni della ferita (in genere giorni 2, 4 e 6 dopo la biopsia), come descritto sopra nelle sezioni 1.1-1.4, ad eccezione dell'induzione della ferita.
- Individuare il letto della ferita sul monitor video in questi punti del tempo dopo aver inserito l'endoscopio e far avanzare le forcep della biopsia (in posizione chiusa) immediatamente sopra il letto della ferita, insuffare il colon e avviare la registrazione video, come descritto nelle sezioni 2.1 e 2.2(Figura 2).
NOTA: Può essere difficile localizzare il letto della ferita più di 6 giorni dopo la biopsia. - Far avanzare le forcep nel lume in questi giorni successivi alla stessa distanza del giorno 0 per garantire una distanza costante tra la lente dell'endoscopio e la lesione tra i giorni. Garantire una distanza costante tra l'obiettivo e la lesione migliorerà l'accuratezza delle misurazioni nel tempo.
NOTA: Un individuo può effettuare misurazioni in questi giorni (l'endoscopio è azionato con la mano destra e le forcep della biopsia sono avanzate con la mano sinistra). - Una volta completate tutte le misurazioni, aprire le registrazioni video delle colonscopie seriali nel software di editing video che consente la creazione di scatti fermi dal video.
- Far avanzare il video su un fotogramma che mostra un punto nel tempo in cui il letto della ferita può essere facilmente visualizzato, le forcep chiuse sono sopra il letto della ferita e contro la parete rettale e il muro è teso. Scatta un'istantanea di questo telaio e codifica il nome del file per assicurarti che le misurazioni dei letti delle ferite vengano eseguite in modo accecato.
- Apri le immagini con nomi di file codificati in NIH ImageJ per quantificare le dimensioni del letto della ferita. Nella scheda Analizza selezionare Imposta misure e selezionare la casella Area.
- Selezionate lo strumento Selezioni a mano libera dalla barra dei menu principale e disegnate un perimetro attorno alla ferita (vedere figura 2). Nella scheda Analizza selezionare Misura e il valore di tale misurazione verrà popolato automaticamente nella finestra Risultati.
- Esportare i risultati in un foglio di calcolo dopo aver completato le misurazioni per tutte le immagini, selezionando Salva con nome nella scheda File all'interno della finestra Risultati e modificando l'estensione in modo che diventi un file di foglio di calcolo.
- Calcola la dimensione della ferita nei giorni successivi all'induzione della ferita (cioè i giorni 2, 4 e 6) rispetto alle dimensioni del giorno 0 (immediatamente dopo il mento) in un foglio di calcolo. Eseguire questa operazione dividendo la dimensione della ferita ogni giorno per la dimensione della ferita il giorno 0 e convertendo tale valore in una percentuale.
NOTA: In condizioni normali utilizzando questo metodo di visione colonscopica, la più grande chiusura della ferita si osserva dopo i primi 2 giorni (~75% di riduzione delle dimensioni) con chiusura più graduale nei giorni 4 e 6 (~80% e ~95% di riduzione delle dimensioni, rispettivamente).
3. Raccolta del letto della ferita per l'analisi molecolare
- Eutanasia del topo utilizzando asfissia di CO2 seguita da lussazione cervicale (o tecnica equivalente) il giorno selezionato dopo la biopsia.
- Raccogliere la regione distale del colon aprendo la pelle e il muscolo addominale per esporre la cavità corporea. Posizionare le forbici chiuse sotto i due punti e sollevarle delicatamente per rilasciarlo dal mesentere sottostante e quindi tagliare i due punti nel punto centrale e nell'ano per rimuoverlo dal mouse.
- Lavare il contenuto fecale utilizzando un ago di gavage per topi attaccato a una siringa da 20 ml riempita con PBS 1x ghiacciato, quindi posare i due punti su carta da filtro.
- Tagliare i due punti longitudinalmente sulla carta da filtro assicurando che il lato mesenterico sia a faccia in giù contro la carta filtrante. Applicare lo 0,2% di blu di metilene sulla mucosa utilizzando una pipetta di compressione mentre il tessuto è ancora sulla carta filtrante e quindi drenare il blu di metilene in eccesso. Visualizzare i due punti al microscopio di sezionamento e individuare il letto della ferita (Figura 3A).
- Utilizzando forbici micro iris da 4 pollici, tagliare intorno al bordo del letto della ferita(Figura 3A,cerchio tratteggiato) facendo attenzione a non tagliare nello strato muscolare (a meno che il muscolo non sia desiderato) e trasferire il letto della ferita sezionato su un tubo utilizzando pinzette a punta fine per il congelamento a scatto o il metodo di conservazione desiderato.
NOTA: La quantità di tessuto raccolto in questo modo è sufficiente per estrarre l'RNA per l'RNA-seq o l'analisi equivalente.
4. Preparazione dei tessuti per l'analisi istologica
- Eutanasia del topo e raccogliere il colon come descritto nel passaggio 3.1-3.2.
- Tagliare i due punti longitudinalmente sulla carta da filtro assicurando che il lato mesenterico sia a faccia in giù contro la carta filtrante. Applicare delicatamente la paraformaldeide al 4% (o fissante di scelta) utilizzando una pipetta di compressione e coprire il tessuto con parafilm. Lasciare piatto in un contenitore sigillato per 4-6 ore.
- Trasferire i tessuti al 70% di etanolo per lo stoccaggio. Quando sei pronto per elaborare i tessuti, rimuovere il parafilm e applicare lo 0,2% di blu di metilene sulla mucosa usando una pipetta di compressione mentre il tessuto è ancora su carta da filtro. Quindi scolare il blu di metilene in eccesso.
- Visualizzare i due punti al microscopio di sezionamento e individuare il letto della ferita (Figura 3A). Usando un bisturi con una lama #10, tagliato direttamente attraverso il centro del letto della ferita e continuare a tagliare attraverso il resto del colon in linea retta, in modo che il colon sia stato tagliato a metà, per quanto riguarda lalunghezza (Figura 3A,linea nera).
- Elaborare i due punti e quindi incorporare la paraffina (uno o entrambi i lati che rimangono dopo il taglio) in modo che il lato tagliato dal bisturi (il lato che era il centro del letto della ferita prima della bisezione) sia a faccia in giù nella paraffina. Procedere al taglio delle sezioni e alla colorazione per le macchie o i maker desiderati.
- Se sono necessarie criosezioni per una determinata colorazione, raccogliere i due punti come descritto al passaggio 3.1 e aprirli longitudinalmente su carta filtrante, assicurando che il lato mesenterico sia a faccia in giù contro la carta filtrante.
- Bisect il letto della ferita all'interno del colon appena raccolto come descritto nel passaggio 4.5 e incorporare il colon (uno o entrambi i lati che rimangono dopo il taglio) in modo che il lato che è stato tagliato dal bisturi sia a faccia in giù in uno stampo di base mezzo riempito con mezzo di congelamento dei tessuti.
- Fissare il tessuto in posizione con pinzette fini e posizionare lo stampo di base su una piastra metallica sopra il ghiaccio secco per indurire il mezzo di congelamento. Una volta che la parte inferiore del mezzo è congelata (e il tessuto è tenuto in posizione), rilasciare il tessuto e riempire il volume rimanente dello stampo di base con mezzo di congelamento e riposizionare sul ghiaccio secco.
- Dopo che l'intero volume del mezzo di congelamento è stato congelato, trasferire in un congelatore a -80 °C fino alla sessatura.
- Per sezioni di paraffina o congelate, tagliare e macchiare sezioni aggiuntive da H&E per assicurarsi che il letto della ferita sia stato catturato nella sezione prima di procedere alla colorazione specifica dello studio. La figura 3B mostra un esempio di sezione in cui il letto della ferita può essere chiaramente osservato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I piccoli oggetti (lente, fante, forcep di biopsia) necessari per eseguire le biopsie sono mostrati nella figura 1 insieme agli indicatori di un corretto assemblaggio di questi componenti. La figura 2 mostra immagini rappresentative di viste accettabili del letto della ferita al fine di quantificare con precisione le dimensioni del letto della ferita e il tasso di chiusura della ferita. Un esempio di vista ex vivo del letto della ferita è mostrato nella figura 3A comprensiva di indicatori del perimetro del letto della ferita (indicando la regione ad accisa per l'analisi molecolare) e dove tagliare il tessuto al fine di consentire la visualizzazione del letto della ferita al momento della sessatura. La figura 3B mostra un'immagine rappresentativa di una sezione macchiata di H&E in cui il letto della ferita può essere chiaramente osservato. Il video supplementare 1 fornisce una vista della procedura di biopsia dall'interno dei due punti del mouse.
Figura 1: Elementi necessari per effettuare le biopsie. (A) Immagine della lente (a), della tona (b) e delle forcep di biopsia (e). (B) Inserimento della lente nella tona. (C) Inserimento di forcep attraverso il canale di lavoro della tona (freccia solida). La freccia tratteggiata indica la posizione corretta per il fissaggio della pompa dell'aria. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini colonscopiche del letto della ferita dopo la biopsia. Immagini fisse sono state create da registrazioni video di colonscopie subito dopo la biopsia (Giorno 0) e 2, 4 e 6 giorni dopo. Le linee blu indicano i bordi dei letti avvolti in ogni punto del tempo. La freccia indica la corretta lunghezza di estensione delle forcep nel lume per garantire la giusta distanza dalla lente alla parete rettale, al fine di garantire misurazioni coerenti del letto della ferita nel tempo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagini ex vivo e se se seleate del letto della ferita. (A) Un colon è stato raccolto da un topo 2 giorni dopo la biopsia, macchiato di blu di metilene dello 0,2% e immaginato al microscopio sezionato. Il cerchio tratteggiato indica i bordi del letto della ferita. La linea nera indica la posizione corretta per migliorare il letto/colon della ferita prima dell'incorporamento per il sessatura. (B) Immagine rappresentativa di una sezione macchiata di H&E di un letto avvolto. Gli asterischi indicano che il letto della ferita e le frecce indicano cripte intatte adiacenti al letto della ferita che indicano i confini della regione ferita. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video supplementare 1: Procedura di biopsia e imaging del letto delle ferite. Clicca qui per scaricare questo video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Garantire biopsie coerenti e accurate e misurazioni delle dimensioni della ferita sono di fondamentale importanza quando si tenta di valutare efficacemente il tasso di chiusura delle ferite in questo modello. Pertanto, si dovrebbero adottare diverse misure per essere sicuri che le procedure siano state eseguite correttamente. In primo luogo, la profondità della biopsia non deve essere troppo bassa o profonda. Se troppo superficiale, non ci sarà una finestra sufficiente per valutare la chiusura della ferita. La figura 2 mostra una profondità e dimensioni ottimali della biopsia il giorno 0. Si noti la chiara distinzione tra la mucosa attorno al letto della ferita e il tessuto che rimane sotto il letto della ferita (Figura 2). Se la biopsia è troppo profonda, può verificarsi una perforazione che si traduce in un topo non prezioso. Dopo l'insufflazione dopo la biopsia del giorno 0, se l'addome del topo viene gravemente disteso, si è verificata una perforazione e il topo non può essere utilizzato per la valutazione e deve essere eutanasiato. È utile se lo stesso individuo esegue le biopsie per un dato studio per garantire ulteriormente la coerenza. In secondo luogo, è fondamentale eseguire la biopsia nel retto e non in una regione più prossimale. Dato che il retto è più spesso delle regioni prossimali del colon, c'è una probabilità marcatamente ridotta di perforazione. All'esterno della fante deve essere fatto un segno a 0,5 cm dall'estremità e l'endoscopio deve essere inserito solo fino a quel momento per garantire che le forcep della biopsia non si estendano oltre il retto. In terzo luogo, avere la giusta quantità di insufflazione sia durante la biopsia che per visualizzare il letto della ferita è essenziale. Durante la biopsia, se il colon è troppo disteso, la parete colonica sarà troppo tesa e non ci sarà una quantità sufficiente di mucosa per la biopsia. Pertanto, si suggerisce che l'individuo che opera l'endoscopio non premere il dito indice contro l'estremità aperta della valvola del gas, al fine di consentire un flusso d'aria minimo nei due punti. Tuttavia, l'approccio opposto dovrebbe essere usato quando si visualizzano i letti delle ferite allo scopo di misurare le dimensioni della ferita. Una volta posizionata la ferita, insuffare completamente il colon premendo saldamente il dito indice contro l'estremità aperta della valvola del gas e tenerlo lì fino a ottenere una vista desiderata. La parete colonica dovrebbe essere il più tesa possibile a questo scopo. Da notare, l'insufflazione completa del colon è importante anche per garantire una vista laterale coerente del letto della ferita. Infine, è fondamentale garantire che sia mantenuta una distanza costante tra la lente e la ferita per consentire misurazioni accurate su più colonscopie negli stessi topi. Una distanza più ravvicinata farà apparire artificialmente il letto della ferita più grande di quanto non sia e una distanza più lontana lo farà apparire più piccolo. Pertanto, l'uso delle forcep di biopsia come guida per mantenere la distanza è molto utile.
Oltre alle considerazioni principali da tenere in considerazione quando si utilizza questo modello, ci sono più punti minori di cui essere consapevoli che possono anche influire sulla capacità di eseguire questa procedura in modo efficace. Ad esempio, si dovrebbe essere certi che il lume colon sia chiaro quando si eseguono colonscopie. Sebbene il materiale fecale venga cancellato con il lavaggio con PBS, materiale aggiuntivo può scendere nel retto dopo aver inserito l'endoscopio. Inoltre, quando si visualizza il letto della ferita immediatamente dopo la biopsia, il sangue può oscurare il campo. Pertanto, a volte è necessario rimuovere l'endoscopio dal retto, sciacquare il colon con PBS per cancellare il sangue luminare e reinserire l'endoscopio per visualizzare il letto della ferita. In alcuni casi, il sangue e altri contenuti luminali possono aderire alla lente, oscurando il campo. In questi casi, l'endoscopio deve essere rimosso dal mouse e l'obiettivo deve essere cancellato utilizzando il pennello prima di continuare l'imaging.
Prima dell'avvento del modello di biopsia a pizzico guidato dal colonscopico, i ricercatori avevano sistemi modello limitati per indagare la guarigione delle ferite coloniche. Un approccio è stato quello di valutare il recupero dall'esposizione a induttori chimici di lesioni coloniche come DSS8. Tuttavia, questo approccio non consente un controllo preciso dell'entità della lesione indotta né dell'ubicazione della lesione in tutto il colon. Inoltre, misurazioni precise della guarigione delle mucose in tempo reale possono essere impegnative con questi modelli chimici. Sebbene utile, anche il modello di biopsia ha dei limiti. Ad esempio, gli operatori si limitano a effettuare il mento nel colon distale. Questa limitazione impedisce studi di piccola ulcerazione intestinale, un importante problema clinico. Inoltre, sebbene questa tecnica ricapitola alcuni aspetti della patogenesi IBD, non può essere considerata un vero modello di questa malattia. Di considerazione tecnica, può essere difficile indurre dimensioni coerenti delle ferite tra i topi, generare ferite valutabili o localizzare i letti delle ferite nelle fasi successive del processo di guarigione delle ferite. Quando si prendono in considerazione questi punti, è consigliabile iniziare gli studi con topi aggiuntivi per tenere conto della perdita di campioni non valutabili.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Crohn's and Colitis Foundation (D.C.M) e della New York Crohn's Foundation (D.C.M. e A.J.D.). Gli autori ringraziano la Signora Carmen Ferrara per l'assistenza nella creazione del video accompagnamento a questo articolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biopsy forceps, 3 Fr | Karl Storz | 61071ZJ | |
| Coloview Tower system | Karl Storz | contact company | |
| Examination sheath, 9 Fr, Kit | Karl Storz | 61029DK | |
| Hopkins telescope, 0', 1.9 mm x 10 cm | Karl Storz | 64301AA | |
| isofluorane | Covetrus | 2905 | |
| methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| micro iris scissors | Integra | 18-1619 | |
| NIH ImageJ | NIH | N/A | software available for free download from: https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Pawfly MA-60 aquarium pump | Amazon | N/A | |
| scalpal with #10 blade | Hill-Rom | 372610 |
References
- Boal Carvalho, P., Cotter, J. Mucosal Healing in Ulcerative Colitis: A Comprehensive Review. Drugs. 77 (2), 159-173 (2017).
- Chen, M. L., Sundrud, M. S. Cytokine Networks and T-Cell Subsets in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (5), 1157-1167 (2016).
- Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
- Halfvarson, J., et al. Dynamics of the human gut microbiome in inflammatory bowel disease. Nature Microbiology. 2, 17004 (2017).
- Johansson, M. E., et al. Bacteria penetrate the normally impenetrable inner colon mucus layer in both murine colitis models and patients with ulcerative colitis. Gut. 63 (2), 281-291 (2014).
- Luissint, A. C., Parkos, C. A., Nusrat, A. Inflammation and the Intestinal Barrier: Leukocyte-Epithelial Cell Interactions, Cell Junction Remodeling, and Mucosal Repair. Gastroenterology. 151 (4), 616-632 (2016).
- Pineton de Chambrun, G., Blanc, G., Peyrin-Biroulet, L. Current evidence supporting mucosal healing and deep remission as important treatment goals for inflammatory bowel disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 10 (8), 915-927 (2016).
- Fung, K. Y., Putoczki, T. In Vivo Models of Inflammatory Bowel Disease and Colitis-Associated Cancer. Methods in Molecular Biology. 1725, 3-13 (2018).
- Jurjus, A. R., Khoury, N. N., Reimund, J. M. Animal models of inflammatory bowel disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (2), 81-92 (2004).
- Mizoguchi, A., Takeuchi, T., Himuro, H., Okada, T., Mizoguchi, E. Genetically engineered mouse models for studying inflammatory bowel disease. Journal of Pathology. 238 (2), 205-219 (2016).
- Seno, H., et al. Efficient colonic mucosal wound repair requires Trem2 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (1), 256-261 (2009).
- Alam, A., et al. The microenvironment of injured murine gut elicits a local pro-restitutive microbiota. Nature Microbiology. 1, 15021 (2016).
- Alam, A., et al. Redox signaling regulates commensal-mediated mucosal homeostasis and restitution and requires formyl peptide receptor 1. Mucosal Immunology. 7 (3), 645-655 (2014).
- Kuhn, K. A., Manieri, N. A., Liu, T. C., Stappenbeck, T. S. IL-6 stimulates intestinal epithelial proliferation and repair after injury. PLoS One. 9 (12), 114195 (2014).
- Leoni, G., et al. Annexin A1, formyl peptide receptor, and NOX1 orchestrate epithelial repair. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 443-454 (2013).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Neurath, M. F., et al. Assessment of tumor development and wound healing using endoscopic techniques in mice. Gastroenterology. 139 (6), 1837-1843 (2010).
- Montrose, D. C., et al. Colonoscopic-Guided Pinch Biopsies in Mice as a Useful Model for Evaluating the Roles of Host and Luminal Factors in Colonic Inflammation. American Journal of Pathology. 188 (12), 2811-2825 (2018).
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. Journal of Visualized Experiments. (90), (2014).
