Summary
ここでは、マウスにおける大腸誘導ピンチ生検を誘導し、創傷閉鎖をリアルタイムで追跡する手順の詳細な説明を提供する。さらに、創傷床の組織学的、免疫組織化学的および分子的分析のための組織の調製方法が提供される。
Abstract
急性傷害反応および創傷治癒過程で起こる組織および細胞変化を理解することは、消化管(GI)管の疾患を研究する際に最も重要である。マウスコロニーピンチ生検モデルは、これらのプロセスを定義するのに有用なツールです。さらに、腸の発光含有量(例えば、微生物)と結腸間の相互作用を研究することができる。しかし、創傷の誘導と信頼性の高い方法で時間をかけて創傷閉鎖を追跡する能力は困難な場合があります。さらに、組織の準備と向きは、組織学的および分子的変化を最適に問い合わすために標準化された方法で行わなければならない。ここでは、生検による傷害と繰り返し大腸内視鏡検査による創傷閉鎖のモニタリングを説明する詳細な方法を提示する。創傷サイズの一貫した再現性の測定、分子分析のために創傷床を収集する能力、組織の切断時に創傷床を視覚化する機能を保証するアプローチが記載されています。これらの技術を正常に実行する能力は、急性傷害応答、創傷治癒および結腸内の発光宿主相互作用の研究を可能にする。
Introduction
消化管(GI)は、その多くの機能、宿主細胞型(例えば上皮、免疫、間質など)、および数兆個の微生物を与えられた複雑な器官系である。この複雑さに照らして、消化管の疾患は、多くの場合、これらの要因の相互作用を伴う。例えば、炎症性腸疾患(IBD)は、消化管における炎症および寛解のサイクルに関連しており、炎症性細胞の活性化、ジスビオシス、および上皮修復1、2、3、4、5、6、7を含む。IBDおよびGI管の他の炎症性状態を研究するための適切なモデルシステムを有することは、疾患の病因を解明するために重要である。遺伝子組み換えマウスを含むIBDの病態を研究するためにいくつかのモデルが存在し、げっ歯類におけるデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)などの化学物質の使用8,9,10.これらのモデルの制限には、炎症の誘導を正確に制御できないことと、創傷治癒の評価における困難が含まれる。IBD病因の側面を模倣する別の方法は、治療法の開発に有用であることが証明できる。
マウスにおける大腸誘導ピンチ生検は、炎症反応の病因、創傷治癒、ならびに結腸における宿主と微生物の相互作用を研究するのに有用なモデルシステムを提供する。このアプローチは、2009年に実験的なツールとして初めて使用され、腸内の急性炎症反応および創傷治癒を研究するための有用性を実証した。その後の研究では、腸内微生物叢と同様に異なるシグナル伝達経路の役割を評価するためにこの技術を利用し、大腸創傷治癒11、12、13、14、15、16、17、18。最近では、このモデルを用いて、大腸損傷に対する急性応答におけるスフィンゴシン-1-リン酸シグナル伝達と細菌の重要性を調べた。有用であるが、マウスで大腸誘導ピンチ生検を行い、その後の組織の変化を評価することは技術的に困難であり得る。例えば、腸の穿穿は傷害の誘発時に起こり得、連続大腸内視鏡検査を通して創傷床の一貫した測定を保障することは困難であり得る。さらに、組織学的または免疫組織化学的分析のために創傷床を視覚化するために大腸組織を適切に配向させることは困難であり得る。これらの方法18、20に関するいくつかの情報が存在するが、これらの技術の正確なステップワイズの記述は、視覚補助は、このモデルの信頼性と広範な有用性を強化することを約束するであろう。ここでは、マウスで大腸誘導ピンチ生検を行い、時間の経過とともに創傷閉鎖を追跡し、創傷床の組織学的および分子的分析を可能にする組織を準備するための詳細な方法を提示する。これらの技術を実行するための標準的な方法を作成すると、このモデルの使用を拡大して、GIの炎症および創傷修復にとって潜在的に重要である未調査のメディエーターを研究することができます。
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Protocol
ここで説明するすべての手順は、ワイルコーネル医学の施設動物のケアと使用委員会によって承認されました。「ここで説明するすべての手順は、ワイル・コーネル医学とストーニーブルック大学の制度的動物ケアと使用委員会によって承認されました。
1. 大腸内視鏡検査と創傷誘導
- まず、1.9mmの硬質ボア内視鏡をシースに挿入して内視鏡の部品を事前に組み立てる(図1A-B)。提供されたチューブを使用してエアポンプを取り付け(大腸浸潤を提供する)、作業チャネルの隣の鞘の左側にあるガスバルブに(図1C)。
注:ここで説明するレンズは0°ですが、この目的のために30°レンズを使用することもできます。 - 作業チャネルが開いた位置にあることを確認し、作業チャネルを介して3 Fr生検鉗子を挿入し、シースの端まで(シースから突出しないことを保証しながら)(図1C)。組み立てた内視鏡を、メーカーの指示に従って光源とビデオイメージングデバイスに取り付けます。
- 誘導室で酸素を5%イオブルランでマウスを麻酔します。次に、腹側に加熱システム(低体温症を防ぐため)を含む内視鏡的ステージングプラットフォームにマウスを移動し、酸素を含む2%のイソフルランを持つ鼻コーンを使用して麻酔下で維持します。麻酔下で乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を加えます。後ろ足を軽くつまんで反射をテストすることで、マウスが完全に麻酔状態になっていることを確認します。
注: マウスの任意の株またはいずれかの性別は、この技術で使用することができます。しかし、マウスは少なくとも8週齢であるため、処置に十分な大きさであることが好ましい。- 麻酔下で乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を加えます。
- 後ろ足を軽くつまんで反射をテストすることで、マウスが完全に麻酔状態になっていることを確認します。
- 3 mL の注射器に、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を付けたラットガベージ針を充填します。針をマウスのアヌスに約1cm挿入し、PBSを軽く注入して便材を取り除きます。いくつかの便ペレットは、注入されたPBSと一緒にマウスを出る必要があります。
注:PBSの過剰なボリュームの点込は、内腔の発泡形成を引き起こす可能性があり、ルーメンの表示をあいまいにする可能性があります。 - 組み立てた内視鏡0.5cmをマウスのアヌスに挿入します。鉗子の完全な'顎'(ヒンジを含む)がシースの端を越えるまで(ビデオモニターで観察される)まで、直腸の内腔に生検鉗子を進める(補足ビデオ1)。顎が東西方向に開くように鉗子を90°回す(補足ビデオ1)。
- 生検するには、鉗子を開いて約1cm進め、鉗子を閉じ、1つの滑らかな動きで鉗子を閉じたままにして鉗子を素早く引き戻す(補足ビデオ1)。
- 生検を行う際には、結腸を完全に膨らませないようにしてください。したがって、このステップ中はガスバルブの右側を開いたままにしておきます。鉗子を開くと結腸がこの位置にあるときに粘膜を損傷する危険性があることに留意すべきである。
2. 創傷床の可視化と測定
- 大腸内視鏡記録装置に取り付けられたフットペダルを押して、生検直後にビデオ録画を開始します。内視鏡に空気を強制し、したがって、結腸に空気を強制するために、完全に開口部をカバーするためにガスバルブの右側に人差し指をしっかりと押し付けることによって、完全に結腸をインスッフル。
注:このプロトコルは、空気の流れが手動で制御されるエアポンプの使用を記述していますが、制御された空気供給を備えた蠕動ポンプも使用することができます。 - 鉗子をシースから戻し、閉じた位置にいる間に直腸内腔に進める(補足ビデオ1)。顎の基部が視野の上端に揃えられるまで、直腸壁にフォースを直腸壁のすぐ上に置きます(図2&補足ビデオ1)。創傷の明確なビューが観察されるまで、結腸を完全に拡大し続けます。
注意:内視鏡のレンズと病変の間の一貫した距離を確保するために、検査中のすべてのマウスのベースまで鉗子の顎のみを明らかにするのに十分なまで鉗子を伸ばすために注意してください(図2、白い矢印)。 - 同じ日に複数のマウスで生検を行う場合は、前のマウスの生検組織を鉗子から取り除き(提供されたクリーニングブラシを使用して)、レンズシースを70%エタノールで拭き取って、次のマウスに傷を誘発する前に洗浄します。
注:このプロトコルは、マウスごとに単一の生検を行うことを説明していますが、完全な生検を後続の生検で確実に得るために、以前の生検から採取した組織を鉗子から取り除く限り、単一のマウスで複数の生検を行うことができます。 - マウスを他のマウスのケージボイドに入れ、タオルの上に置いて、処置を完了した後に麻酔から回復するまで気道を明確に保ちます。マウスを監視して、活性を取り戻すことによって示されるように麻酔から回復することを確認します。
注:2人が創傷を誘発し、0日目に創傷床を視覚化する必要があります(1人は内視鏡を操作し、もう1人は生検鉗子を操作します)が、その後の日に創傷を視覚化するために必要なのは1人だけです(以下に説明するように)。 - 創傷の誘導を除いて、上記のセクション1.1-1.4で説明したように、その後の創傷測定のためのマウスおよび大腸内視鏡検査の調製のための同じ手順に従ってください(通常、2日目、4および6後生検)。
- 内視鏡を挿入した後、これらの時点でビデオモニター上の創傷床を見つけ、生検鉗子を(閉じた位置で)創傷床のすぐ上に進め、結腸を収縮させ、ビデオ録画を開始する(セクション2.1および2.2に記載されている)。
注:生検後6日以上は創傷床を見つけるのが難しい場合があります。 - これらの日のルーメンに鉗子を0日目と同じ距離に進め、内視鏡のレンズと病変の間の一貫した距離を日単位で確保します。レンズと病変の間の一貫した距離を確保することは、時間の経過とともに測定の精度を高める。
注:1人の個人は、これらの日に測定を行うことができます(内視鏡は右手で操作され、生検鉗子は左手で進みます)。 - すべての測定が完了したら、ビデオ編集ソフトウェアでシリアル大腸内視鏡検査のビデオ録画を開き、ビデオから静止画を作成できるようにします。
- 創傷床が容易に視覚化できる時点を示すフレームにビデオを進め、閉じた鉗子は創傷床の上にあり、直腸壁に対して、壁は緊張している。このフレームのスナップショットを作成し、ファイル名をコーディングして、傷のベッドの測定が盲目に行われるようにします。
- NIH ImageJでコード化されたファイル名で画像を開き、創傷ベッドのサイズを定量化します。[ 分析 ]タブで、[ 測定を設定] を選択し、[ 面積 ]ボックスをオンにします。
- メイン メニュー バーから [フリーハンド選択 ] ツールを選択し、巻き上げの周囲を描画します ( 図 2を参照)。[ 分析 ]タブで [測定] を選択すると、その測定値の値が [結果 ]ウィンドウに自動的に入力されます。
- すべての画像の測定を完了した後、結果ウィンドウの「ファイル」タブで「名前を付けて保存」を選択し、スプレッドシートファイルに拡張子を変更して、結果をスプレッドシートにエクスポートします。
- 創傷の誘導後の日(2日目、4日目、6日目)の創傷のサイズを、スプレッドシートの0日目(創傷直後)のサイズに対して計算します。これを実現するには、毎日の創傷のサイズを 0 日目の創傷のサイズで割り、その値をパーセンテージに変換します。
注:この大腸鏡観察法を用いた通常の条件下では、創傷の最大閉鎖は、最初の2日後(サイズが75%減少)、4日目と6日目(〜80%と〜95%のサイズの減少)でより緩やかに閉塞することが観察される。
分子分析用創傷床の採取
- 生検後の選択された日に、CO2 窒息に続いて子宮頸部脱臼(または同等の技術)を使用してマウスを安楽死させる。
- 体腔を露出させるために皮膚および腹筋を開くことによって結腸の遠位領域を収穫する。結腸の下に閉じたはさみを置き、下の腸間から離すためにそっと持ち上げ、その中点とアヌスで結腸を切ってマウスから取り除きます。
- 氷冷1x PBSで満たされた20 mLシリンジに取り付けられたラットのガベージ針を使用して、フェース含有量をフラッシュし、その後、濾紙にコロンを置きます。
- フィルターペーパーで結腸を縦方向に切り開き、腸間膜側が濾紙に対して下向きであることを確認します。組織がまだ濾紙上にある間にスクイーズピペットを使用して粘膜に0.2%メチレンブルーを塗布し、余分なメチレンブルーを排出します。解剖顕微鏡下で結腸を見て、創傷のベッドを見つける(図3A)。
- 4インチマイクロアイリスハサミを使用して、創傷床の縁の周りに切り取り(図3A、破線円)は、筋肉層に切断しないように注意し(筋肉が望まなければ)、解剖された創傷床をスナップ凍結または所望の保存方法のために細かい点ピンセットを使用してチューブに移す。
注:この方法で収集された組織の量は、RNA-seqまたは同等の分析のためにRNAを抽出するのに十分です。
4. 組織学的分析のための組織の調製
- マウスを安楽死させ、ステップ3.1-3.2に記載されているように結腸を収穫する。
- フィルターペーパーで結腸を縦方向に切り開き、腸間膜側が濾紙に対して下向きであることを確認します。スクイーズピペットを使用して4%パラホルムアルデヒド(または選択した固定)を穏やかに塗布し、パラフィルムで組織を覆います。密閉容器に4~6時間平らにしておきます。
- 組織を70%エタノールに移して貯蔵する。組織を処理する準備ができたら、パラフィルムを取り除き、組織がまだ濾紙上にある間にスクイーズピペットを使用して粘膜に0.2%メチレンブルーを適用します。その後、余分なメチレンブルーを排出します。
- 解剖顕微鏡下で結腸を見て、創傷のベッドを見つける(図3A)。#10刃のメスを使用して、創傷床の中央を直接切断し、結腸の残りの部分を直線で切断し続け、結腸を半分、長さ方向に切断した(図3A、黒線)。
- 結腸を処理し、次いでパラフィン埋め込み(切断後に残っている片面または両側)をメス(二分前に創傷床の中心であった側)がパラフィンで下向きになるようにする。切削セクションに進み、目的の汚れまたはメーカーの染色を行います。
- もし、ステップ3.1で説明したように結腸を収穫し、フィルター紙で縦方向に開き、腸間膜側がフィルター紙に対して下向きであることを保障する。
- ステップ4.5に記載されているように、収穫したばかりの結腸内の創傷床を二分し、メスで切断された側が組織凍結培地で半分充填されたベースモールドで下に置かれるよう結腸(切断後に残る片側または両側)を埋め込む。
- 細かいピンセットで組織を固定し、ドライアイスの上に金属板の上にベースモールドを置き、凍結媒体を硬化させます。培地の底部が凍結したら(そして組織が所定の位置に保持される)、組織を放出し、凍結媒体で基型の残りの容積を満たし、ドライアイスに戻す。
- 凍結培地の全容が凍結した後、切断するまで-80°Cの冷凍庫に移す。
- パラフィンまたは凍結したセクションの場合は、H&Eによって追加のセクションを切断し、染色して、創傷床がセクション上で捕獲されたことを確認してから、特定の染色を研究する。 図3B は、創傷床が明確に観察できるセクションの例を示す。
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Representative Results
生検を行うために必要な小さな項目(レンズ、シース、生検鉗子)は、これらの成分の適切な組み立ての指標と共に 図1 に示されている。 図2 は、創傷床のサイズおよび創傷の閉鎖率を正確に定量するために、創傷床の許容可能な図の代表的な画像を示す。創傷床のex vivoビューの例は、創傷床の周囲の指標(分子解析のために切除する領域を示す)と、切断時に創傷床の可視化を可能にするために組織を切断する場所を含む 図3A に示されている。 図3B は、創傷床が明確に観察できるH&E染色部の代表的な画像を示す。 補足ビデオ1 は、マウスの結腸の内側から生検手順のビューを提供します。
図1:生検に必要な項目(A)レンズ(a)、シース(b)、生検鉗子(c)の画像。(B)外装にレンズを挿入する。(C)鞘の働くチャネルを通して鉗子の挿入(固体矢印)。破線の矢印は、エアポンプの取り付けの正しい位置を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:生検後の創傷床の大腸鏡像。静止画は、生検直後(0日目)と2日目、4日目、6日後に大腸内視鏡検査のビデオ録画から作成されました。青い線は、各時点での創傷ベッドのエッジを示します。矢印は、レンズから直腸壁までの適切な距離を確保するために、レンズから直腸壁への鉗子の延長の正しい長さを示し、時間の経過とともに創傷床の一貫した測定を確実にする。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:創傷床のEx vivoと切り離された画像。(A)生検の2日後にマウスから結腸を採取し、0.2%メチレンブルーで染色し、解剖顕微鏡下で画像化した。破線の円は、傷のベッドの縁を示します。黒い線は、断面のために埋め込む前に創傷床/結腸を二分する適切な場所を示す。(B) 創傷床のH&E染色された部分の代表的な画像。アスタリスクは創傷床を示し、矢印は負傷した領域の境界を示す創傷床に隣接する無傷の納骨堂を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足ビデオ1:生検手順と創傷床画像。こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
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Discussion
このモデルで創傷閉鎖率を効果的に評価しようとする際には、一貫した正確な生検と創傷サイズの測定を確実にすることが最も重要です。したがって、手順が正しく実行されていることを確信するために、いくつかの措置を講じる必要があります。第一に、生検の深さは浅すぎたり深すぎたりしてはならない。浅すぎると、創傷閉鎖を評価するのに十分な窓がありません。 図 2 は、0 日目の最適な生検の深さとサイズを示しています。創傷床の周りの粘膜と創傷床の下に残っている組織との明確な区別に注意してください(図2)。生検が深すぎると、穿穿が起こり、貴重なマウスが生じる可能性があります。0日目の生検後に、マウスの腹部がひどく膨らんだ場合、穿穿が起こり、マウスを評価に使用できず安楽死させるべきです。同じ個人がさらに一貫性を確保するために、特定の研究のための生検を行う場合に役立ちます.第二に、直腸で生検を行うことは重要であり、より近位領域では行わない。直腸が結腸の近位領域よりも厚いことを考えると、穿穿刺の可能性が著しく減少する。外装の外側に0.5cmの外にマークを付け、内視鏡は、生検鉗子が直腸を越えて伸びないようにするために、その点まで挿入する必要があります。第三に、生検中と創傷床の可視化の両方に適切な量の浸透を有することが不可欠である。生検の間、結腸が過度に歪んでいる場合、大腸壁はあまりにも緊張し、生検に十分な量の粘膜が存在しなくてすむ。したがって、内視鏡を操作する個々の個体が、結腸への空気の流れを最小限に抑えるために、ガスバルブの開いた端に対して人差し指を押さないことが示唆される。ただし、傷の大きさを測定する目的で創傷ベッドを視覚化する場合は、反対のアプローチを使用する必要があります。創傷が見つかったら、人差し指をガスバルブの開いた端にしっかりと押し付けて結腸を完全に差し込み、所望のビューが得られるまでそこに保持する。大腸壁は、この目的のために可能な限り緊張する必要があります。注意すべきは、結腸の完全な省略は、創傷床の一貫した横の眺めを確保するためにも重要である。最後に、レンズと創傷の間の距離を一貫して維持し、同じマウスの複数の大腸内視鏡検査で正確な測定を可能にすることが重要です。近い距離は人工的に創傷床がそれよりも大きく見えるようにし、より遠い距離は、それが小さく見えるようにします。従って、距離を維持するためのガイドとして生検鉗子を使用することは非常に有用である。
このモデルを使用する際に考慮すべき主な考慮事項に加えて、この手順を効果的に実行する能力にも影響を与える可能性があることに注意すべき点が多くあります。例えば、大腸内視鏡検査を行う際に大腸内腔が明確であることを確認すべきである。PBSでフラッシュすることで便の材料をクリアするが、追加の材料は、内視鏡を挿入した後、直腸に降下することができます。さらに、生検直後に創傷床を可視化すると、血液が野原を覆い隠す可能性がある。したがって、直腸から内視鏡を取り除き、結腸をPBSで洗い流して、その結腸を透明にして、内視鏡を再挿入して創傷床を可視化する必要がある。場合によっては、血液やその他の発光含有量がレンズに付着し、フィールドを隠すことができます。このような場合、内視鏡はマウスから取り外し、レンズはイメージングを続行する前にブラシを使用して拭く必要があります。
大腸内視鏡ガイド付きピンチ生検モデルの出現に先立ち、研究者は大腸創傷治癒を調査するモデルシステムが限られていた。一つのアプローチは、DSS 8のような大腸損傷の化学誘導物質への曝露からの回復を評価することであった。しかし、このアプローチでは、誘発される傷害の程度や結腸全体の傷害の位置を正確に制御することはできません。さらに、リアルタイムでの粘膜治癒の正確な測定は、これらの化学モデルでは困難な場合があります。有用であるが、生検モデルにも制限がある。例えば、オペレータは遠位結腸での創傷を行うことに限定される。この制限は、小腸潰瘍の研究を防ぎます, 重要な臨床問題.さらに、この技術はIBD病態のいくつかの側面を再現するが、この疾患の真のモデルとは考えられない。技術的な考慮事項として、マウス全体で一貫した創傷サイズを誘導したり、貴重な創傷を発生させたり、創傷治癒プロセスの後期段階で創傷床を見つけたりすることは困難です。これらの点を考慮に入れると、貴重なサンプルの損失を考慮して、追加のマウスで研究を開始することをお勧めします。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この作品は、クローン病大腸炎財団(D.C.M)とニューヨーククローン財団(D.C.MとA.J.D.)からの助成金によって支えられました。著者らは、この記事のビデオ伴奏の作成に協力してくれたカルメン・フェラーラ氏に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biopsy forceps, 3 Fr | Karl Storz | 61071ZJ | |
| Coloview Tower system | Karl Storz | contact company | |
| Examination sheath, 9 Fr, Kit | Karl Storz | 61029DK | |
| Hopkins telescope, 0', 1.9 mm x 10 cm | Karl Storz | 64301AA | |
| isofluorane | Covetrus | 2905 | |
| methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| micro iris scissors | Integra | 18-1619 | |
| NIH ImageJ | NIH | N/A | software available for free download from: https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Pawfly MA-60 aquarium pump | Amazon | N/A | |
| scalpal with #10 blade | Hill-Rom | 372610 |
References
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