Summary
כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של ההליך כדי לגרום ביופסיות צביטה מונחה קולונוסקופית בעכברים ולעקוב אחר סגירת פצע בזמן אמת. בנוסף, מסופקות שיטות להכנת רקמות לניתוחים היסטולוגיים, אימונוהיסטוכימיים ומולקולריים של מיטת הפצע.
Abstract
הבנת הרקמה והשינויים התאיים המתרחשים בתגובה לפציעה חריפה כמו גם במהלך תהליך ריפוי הפצע היא בעלת חשיבות עליונה בעת לימוד מחלות של מערכת העיכול (GI) בדרכי. מודל הביופסיה של קמצוץ המעי הגס מורין הוא כלי שימושי להגדרת תהליכים אלה. בנוסף, ניתן ללמוד את יחסי הגומלין בין תכולת המעיים הזוהר (למשל, מיקרובים) לבין המעי הגס. עם זאת, אינדוקציה פצע ואת היכולת לעקוב אחר סגירת פצע לאורך זמן באופן אמין יכול להיות מאתגר. יתר על כן, הכנת רקמות והתמצאות חייב להתבצע בצורה מתוקננת כדי לחקור בצורה אופטימלית שינויים היסטולוגיים ומולקולריים. כאן, אנו מציגים שיטה מפורטת המתארת פגיעה הנגרמת על ידי ביופסיה וניטור של סגירת פצעים באמצעות קולונוסקופיה חוזרת. מתוארת גישה המבטיחה מדידות עקביות וניתנות לשחזור של גודל הפצע, היכולת לאסוף את מיטת הפצע לניתוחים מולקולריים, כמו גם לדמיין את מיטת הפצע עם חתך של רקמות. היכולת לבצע בהצלחה טכניקות אלה מאפשרת מחקרים של תגובת פציעה חריפה, ריפוי פצעים ואינטראקציות מארח זוהר בתוך המעי הגס.
Introduction
מערכת העיכול (GI) היא מערכת איברים מורכבת בהתחשב בפונקציות המרובות שלה, סוגי תאים מארחים (למשל אפיתל, חיסוני, סטרומה וכו ') כמו גם טריליוני חיידקים. לאור מורכבות זו, מחלות של GI בדרכי לעתים קרובות לערב את יחסי הגומלין של כל הגורמים האלה. לדוגמה, מחלות מעי דלקתיות (IBD) קשורות למחזורים של דלקת והפוגה במערכת העיכול, הכוללת הפעלה של תאים דלקתיים, dysbiosis, ותיקון אפיתל1,2,3,4,5,6,7. לאחר מערכות מודל מתאים ללמוד מחלות מעי דלקתיות ומצבים דלקתיים אחרים של מערכת העיכול היא קריטית עבור הבהרות הפתוגנזה של המחלה. קיימים מספר מודלים לחקר פתוגנזה IBD כולל עכברים מהונדסים גנטית ושימוש בכימיקלים כגון דקסטרן נתרן גופרתי (DSS) במכרסמים8,9,10. מגבלות של מודלים אלה כוללות חוסר יכולת לשלוט במדויק על אינדוקציה של דלקת, כמו גם קשיים בהערכת ריפוי פצעים. שיטות חלופיות לחקות היבטים של פתוגנזה IBD יכול להוכיח שימושי לפיתוח טיפולים.
ביופסיות צביטה מונחות קולונוסקופיות בעכברים מציעות מערכת מודל שימושית לחקר הפתוגנזה של התגובה הדלקתית, ריפוי פצעים, כמו גם אינטראקציות מארח-חיידקים במעי הגס. גישה זו שימשה לראשונה ככלי ניסיוני בשנת 2009, אשר הדגים את התועלת שלה לחקר התגובה הדלקתית החריפה וריפוי פצעים במעיים11. מחקרים מאוחרים יותר השתמשו בטכניקה זו כדי להעריך את התפקידים של מסלולי איתות שונים, כמו גם את microbiota הבטן, בריפוי פצע המעי הגס11,12,13,14,15,16,17,18. לאחרונה, הקבוצה שלנו השתמשה במודל זה כדי לחקור את החשיבות של איתות sphingosine-1-פוספט וחיידקים בתגובה חריפה לפגיעה המעי הגס19. למרות שימושי, ביצוע ביופסיות צביטה מונחה קולונוסקופית בעכברים והערכת שינויים ברקמות הבאים יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית. לדוגמה, ניקוב המעי יכול להתרחש עם אינדוקציה של פציעה ולהבטיח מדידות עקביות של מיטת הפצע באמצעות קולונוסקופיה סדרתית יכול להיות קשה. בנוסף, התמצאות נכונה של רקמת המעי הגס כדי לדמיין את מיטת הפצע לניתוחים היסטולוגיים או אימונוהיסטוכימיים יכולה להיות מאתגרת. למרות שחלק מהמידע קיים לגבי שיטות אלה18,20, תיאור מדויק מבחינת צעדים של טכניקות אלה לאורך עזרים חזותיים מבטיח לשפר את האמינות ואת התועלת הרחבה יותר של מודל זה. כאן, אנו מציגים שיטה מפורטת לביצוע ביופסיות צביטה מונחות קולונוסקופיה בעכברים, לעקוב אחר סגירת פצעים לאורך זמן ולהכין את הרקמה כדי לאפשר ניתוחים היסטולוגיים ומולקולריים של מיטת הפצע. יצירת שיטה סטנדרטית לביצוע טכניקות אלה יכולה להרחיב את השימוש במודל זה כדי ללמוד מתווכים שלא נחקרו בעבר שעשויים להיות חשובים לדלקת GI ותיקון פצעים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים המתוארים כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש ברפואת וייל קורנל." אל: "כל ההליכים המתוארים כאן אושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים של וייל קורנל רפואה ואוניברסיטת סטוני ברוק.
1. קולונוסקופיה אינדוקציה פצע
- הרכב מראש את רכיבי האנדוסקופ על-ידי החדרת האנדוסקופ הנוקשה בקוטר 1.9 מ"מ למעטפת (איור 1A-B). חבר את משאבת האוויר (כדי לספק אי ספיקת המעי הגס) באמצעות הצינור המסופק, לשסתום הגז בצד שמאל של הנדן ליד ערוץ העבודה(איור 1C).
הערה: למרות העדשה המתוארת כאן היא 0°, עדשה 30° יכול לשמש גם למטרה זו. - ודא כי ערוץ העבודה נמצא במצב פתוח והכנס 3 מלקחיים ביופסיה Fr דרך ערוץ העבודה ולקדם אותו עד סוף הנדן (תוך הבטחה כי זה לא לבלוט מתוך הנדן) (איור 1C). חבר את האנדוסקופ שהורכב למקור האור ולהתקן הדמיית הווידאו לפי הוראות היצרן.
- המשך את העכבר עם 5% isoflurane עם חמצן בתא אינדוקציה. לאחר מכן הזז את העכבר לפלטפורמת היערכות אנדוסקופית המכילה מערכת חימום (כדי למנוע היפותרמיה) בצד הגחוני שלה ולשמור תחת הרדמה באמצעות חרוט האף עם 2% isoflurane עם חמצן. הוסף משחה וטרינר לעיניים כדי למנוע יובש בזמן בהרדמה. ודא שהעכבר מורדם לחלוטין על-ידי צביטה עדינה של כף הרגל האחורית כדי לבדוק רפלקס.
הערה: כל זן או מין של עכברים ניתן להשתמש עם טכניקה זו; עם זאת, עדיף כי עכברים הם לפחות 8 שבועות של גיל ולכן הם גדולים מספיק עבור ההליך.- הוסף משחה וטרינר לעיניים כדי למנוע יובש בזמן בהרדמה.
- ודא שהעכבר מורדם לחלוטין על-ידי צביטה עדינה של כף הרגל האחורית כדי לבדוק רפלקס.
- מלא מזרק 3 מ"ל עם מחט gavage עכברוש מצורף עם תמיסת מלח בטמפרטורת החדר פוספט אגירה (PBS). הכנס מחט כ 1 ס"מ לתוך פי הטבעת של העכבר בעדינות להחדיר PBS כדי לנקות חומר צואה. כמה כדורי צואה צריך לצאת העכבר יחד עם PBS כי היה חדורים.
הערה: החדרת נפח מופרז של PBS יכול לגרום היווצרות קצף לומן אשר יכול לטשטש את הצפייה של לומן. - הכנס את האנדוסקופ המורכב 0.5 ס"מ לתוך פי הטבעת של העכבר. לקדם את מלקחיים ביופסיה לתוך לומן של פי הטבעת עד מלא "לסתות" (כולל ציר) של המלקחיים הם מעבר לקצה הנדן (כפי שנצפה על צג הווידאו)(וידאו משלים 1). סובבו את המלקחיים ב-90° כך שהלסתות ייפתחו בכיוון מזרח-מערב(וידאו משלים 1).
- לביופסיה, פתחו את המלקחיים והתקדמו כ-1 ס"מ, סגרו את המלקחיים ובתנועה חלקה אחת משכו במהירות את המלקחיים תוךהשארתם סגורים (וידאו משלים 1).
- יש להימנע מאי ספיקה מלאה של המעי הגס בעת ביצוע הביופסיה. לכן, להשאיר את הצד הימני של שסתום הגז פתוח במהלך שלב זה; אם כי יש לציין כי עם פתיחת המלקחיים קיים סיכון של פגיעה ברירית כאשר המעי הגס נמצא במצב זה.
2. הדמיה ומדידה של מיטת הפצע
- ליזום הקלטת וידאו מיד לאחר ביופסיה על ידי לחיצה על דוושת כף הרגל המחוברת להתקן ההקלטה קולונוסקופ. באופן מלא להספיק המעי הגס על ידי לחיצה בחוזקה על אצבע המורה נגד הצד הימני של שסתום הגז כדי לכסות לחלוטין את הפתח על מנת לאלץ את האוויר לתוך אנדוסקופ ובכך לתוך המעי הגס.
הערה: למרות שפרוטוקול זה מתאר את השימוש במשאבת אוויר שבה זרימת האוויר נשלטת באופן ידני, ניתן להשתמש גם במשאבה פריסטלטית עם אספקת אוויר מבוקרת. - לקדם את המלקחיים בחזרה מתוך הנדן, ולתוך לומן רקטלי בעוד במצב סגור (וידאו משלים 1). מניחים את המלקחיים על הקיר רקטלי מיד מעל הפצע עד בסיס הלסתות מיושר עם הקצה העליון של שדה הצפייה (איור 2 & וידאו משלים 1). ממשיכים בהסתעפות מלאה של המעי הגס עד שניתן יהיה להבחין בתצוגה ברורה של הפצע.
הערה: יש להקפיד להרחיב את המלקחיים מספיק רחוק כדי לחשוף רק את לסתות המלקחיים עד לבסיס עבור כל עכבר שנבדק על מנת להבטיח מרחק עקבי בין העדשה של האנדוסקופ לבין הנגע(איור 2, חץ לבן). - אם מבצעים ביופסיות על עכברים מרובים באותו יום, להסיר את הרקמה הביופסית של העכבר הקודם מן המלקחיים (באמצעות מברשת ניקוי בתנאי) ולנגב את נדן העדשה עם 70% אתנול כדי לנקות אותו לפני גרימת פצע בעכבר הבא.
הערה: למרות שפרוטוקול זה מתאר ביצוע ביופסיה אחת לכל עכבר, ביופסיות מרובות יכולות להתבצע על עכבר אחד בתנאי שהרקמה שנלקחה מהביופסיה הקודמת מוסרת מהמלקחיים על מנת להבטיח שניתן יהיה לבצע ביופסיה מלאה על ביופסיות עוקבות. - מניחים את העכבר לתוך חלל כלוב של עכברים אחרים על גבי מגבת כדי לשמור על דרכי הנשימה ברור עד שהוא מתאושש מן ההרדמה לאחר השלמת ההליך. לפקח על העכבר כדי להבטיח כי הוא מתאושש מן ההרדמה כפי שצוין על ידי החזרת הפעילות.
הערה: שני אנשים נדרשים לגרום לפצע ולדמיין את מיטת הפצע ביום 0 (אחד מפעיל את האנדוסקופ והשני מפעיל את מלקחיים ביופסיה) אבל רק אדם אחד נדרש כדי לדמיין פצעים בימים הבאים (כמתואר להלן). - בצע את אותו הליך להכנת העכבר ואת הקולונוסקופיה למדידות הפצע הבאים (בדרך כלל ימים 2, 4 ו 6 בעקבות ביופסיה), כמתואר לעיל בסעיפים 1.1-1.4, למעט אינדוקציה של הפצע.
- אתר את מיטת הפצע על צג הווידאו בנקודות זמן אלה לאחר החדרת האנדוסקופ, וקדם את מלקחיים ביופסיה (במצב סגור) כדי מיד מעל מיטת הפצע, להספיק המעי הגס וליזום הקלטת וידאו, כמתואר בסעיפים 2.1 ו 2.2 (איור 2).
הערה: זה יכול להיות קשה לאתר את מיטת הפצע יותר מ 6 ימים לאחר ביופסיה. - לקדם את המלקחיים לתוך לומן בימים הבאים לאותו מרחק כמו ביום 0 כדי להבטיח מרחק עקבי בין העדשה של אנדוסקופ ואת הנגע על פני ימים. הבטחת מרחק עקבי בין העדשה לנגע תשפר את דיוק המדידות לאורך זמן.
הערה: אדם אחד יכול לבצע מדידות בימים אלה (אנדוסקופ מופעל ביד ימין ואת מלקחיים ביופסיה מתקדמים עם יד שמאל). - לאחר השלמת כל המדידות, פתח את הקלטות הווידאו של הקולונוסקופיה הסדרתית בתוכנה לעריכת וידאו המאפשרת יצירת צילומי סטילס מווידאו.
- קדם את הסרטון למסגרת המציגה נקודת זמן שבה ניתן לדמיין בקלות את מיטת הפצע, המלקחיים הסגורים נמצאים מעל מיטת הפצע ועל הקיר רקטלי והקיר מתוח. צלם תמונה של מסגרת זו וקוד את שם הקובץ כדי להבטיח כי המדידות של מיטות הפצע מתבצעות באופן עיוור.
- פתח את התמונות עם שמות קבצים מקודדים NIH ImageJ כדי לכמת את גודל מיטת הפצע. תחת הכרטיסיה ניתוח, בחר הגדר מידות וסמן את התיבה אזור.
- בחרו בכלי בחירות ביד חופשית מתוך שורת התפריטים הראשית וציירו היקף מסביב לפצע (ראו איור 2). תחת הכרטיסיה ניתוח בחר מדידה והערך של מדידה זו יאוכלס באופן אוטומטי בחלון תוצאות.
- יצא את התוצאות לגיליון אלקטרוני לאחר השלמת המידות עבור כל התמונות, על-ידי בחירה באפשרות שמירה בשם תחת הכרטיסיה קובץ בחלון התוצאות ושינוי הסיומת כדי להפוך לקובץ גיליון אלקטרוני.
- לחשב את גודל הפצע בימים שלאחר אינדוקציה של הפצע (כלומר ימים 2, 4 ו 6) יחסית לגודל ביום 0 (מיד לאחר הפציעה) בגיליון אלקטרוני. השלם זאת על ידי חלוקת גודל הפצע בכל יום לפי גודל הפצע ביום 0 והמרת ערך זה לאחוז.
הערה: בתנאים רגילים באמצעות שיטה זו של צפייה קולונוסקופית, הסגירה הגדולה ביותר של הפצע נצפתה לאחר 2 הימים הראשונים (~ 75% ירידה בגודל) עם סגירה הדרגתית יותר בימים 4 ו -6 (~ 80% ו ~ 95% ירידה בגודל, בהתאמה).
3. אוסף מיטת הפצע לניתוח מולקולרי
- המתת חסד לעכבר באמצעות חנק CO2 ואחריו נקע בצוואר הרחם (או טכניקה שוות ערך) ביום שנבחר לאחר הביופסיה.
- לקצור את האזור הדיסטלי של המעי הגס על ידי פתיחת העור ושריר הבטן כדי לחשוף את חלל הגוף. מניחים מספריים סגורים מתחת למעי הגס בעדינות להרים כדי לשחרר אותו מן mesentery הבסיסית ולאחר מכן לחתוך את המעי הגס בנקודת האמצע שלה פי הטבעת כדי להסיר אותו מן העכבר.
- לשטוף תוכן צואה באמצעות מחט gavage חולדה מחובר מזרק 20 מ"ל מלא קרח קר 1x PBS ואז להניח את המעי הגס על נייר מסנן.
- חותכים לפתוח את המעי הגס longitudinally על נייר מסנן להבטיח כי הצד mesenteric הוא עם הפנים כלפי מטה נגד נייר המסנן. החל 0.2% כחול מתילן על הרירית באמצעות פילט לסחוט בעוד רקמה היא עדיין על נייר המסנן ולאחר מכן לנקז את עודף מתילן כחול. צפו במעי הגס מתחת למיקרוסקופ מנתח ואתרו את מיטת הפצע (איור 3A).
- בעזרת מספריים זעירים בגודל 4 אינץ', חותכים סביב קצה מיטת הפצע(איור 3A, עיגולמקווקו) נזהרים שלא לחתוך לשכבת השריר (אלא אם כן השריר רצוי) ומעבירים את מיטת הפצע המנותחת לצינור באמצעות פינצטה בנקודה עדינה לשיטת ההקפאה או האחסון הרצויה.
הערה: כמות הרקמה שנאספה באופן זה מספיקה לחילוץ RNA עבור RNA-seq או ניתוח שווה ערך.
4. הכנת רקמות לניתוח היסטולוגי
- המתת עכבר ולקצור את המעי הגס כמתואר בשלב 3.1-3.2.
- חותכים לפתוח את המעי הגס longitudinally על נייר מסנן להבטיח כי הצד mesenteric הוא עם הפנים כלפי מטה נגד נייר המסנן. יש למרוח בעדינות 4% paraformaldehyde (או לתקן לפי בחירה) באמצעות פילט סחיטה ולכסות את הרקמה בפרפילם. השאירו שטוח במיכל אטום במשך 4-6 שעות.
- להעביר רקמות 70% אתנול לאחסון. כאשר מוכן לעבד את הרקמות, להסיר parafilm ולהחיל 0.2% כחול מתילן על הרירית באמצעות פילט לסחוט בעוד הרקמה היא עדיין על נייר סינון. ואז לנקז את עודף מתילן כחול.
- צפו במעי הגס מתחת למיקרוסקופ מנתח ואתרו את מיטת הפצע (איור 3A). באמצעות אזמל עם להב #10, חותכים ישירות דרך מרכז מיטת הפצע וממשיכים לחתוך דרך שאר המעי הגס בקו ישר, כך שהמעי הגס נחתך לשניים, מבחינתאורך (איור 3A, קו שחור).
- לעבד את המעי הגס ולאחר מכן להטביע פרפין (אחד או שני הצדדים שנותרו לאחר חיתוך) כך הצד שנחתך על ידי אזמל (הצד שהיה מרכז מיטת הפצע לפני bisection) הוא עם הפנים כלפי מטה בפרפין. המשך למקטעי חיתוך וכתמים עבור כתמים רצויים או יצרנים.
- אם cryosections נדרשים כתמים נתון, לקצור את המעי הגס כמתואר בשלב 3.1 ולפתוח longitudinally על נייר מסנן, להבטיח כי הצד mesenteric הוא עם הפנים כלפי מטה נגד נייר המסנן.
- חותכים את מיטת הפצע בתוך המעי הגס שנקטפו טרי כמתואר בשלב 4.5 ומטביעים את המעי הגס (אחד הצדדים או שני הצדדים שנותרו לאחר החיתוך) כך שהצד שנחתך על ידי האזמל הוא עם הפנים כלפי מטה בתבנית בסיס חצי מלאה במדיום מקפיא רקמות.
- אבטחו את הרקמה במקום עם פינצטה עדינה והניחו את תבנית הבסיס על צלחת מתכת על גבי קרח יבש כדי להקשיח את המדיום המקפיא. לאחר החלק התחתון של המדיום קפוא (ואת הרקמה מוחזק במקום), לשחרר את הרקמה ולמלא את הנפח הנותר של תבנית הבסיס עם מדיום מקפיא ומניחים בחזרה על קרח יבש.
- לאחר שכל נפח מדיום ההקפאה קפוא, מעבירים למקפיא של -80 מעלות צלזיוס עד לחיתוך.
- עבור פרפין או קטעים קפואים, לחתוך ולהכתים קטעים נוספים על ידי H&E כדי להבטיח כי מיטת הפצע נתפסה על החלק לפני שתמשיך מכתים ספציפיים למחקר. איור 3B מציג דוגמה למקטע שבו ניתן לראות בבירור את מיטת הפצע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפריטים הקטנים (עדשה, נדן, מלקחיים ביופסיים) הדרושים לביצוע ביופסיות מוצגים באיור 1 יחד עם אינדיקטורים להרכבה נכונה של רכיבים אלה. איור 2 מציג תמונות מייצגות של תצוגות מקובלות של מיטת הפצע כדי לכמת במדויק את גודל מיטת הפצע ואת שיעור הסגירה של הפצע. דוגמה לתצוגה אקס ויוו של מיטת הפצע מוצגת באיור 3A וכוללת אינדיקטורים להיקף מיטת הפצע (המציינים את האזור לכרות לניתוח מולקולרי) והיכן לחתוך את הרקמה כדי לאפשר הדמיה של מיטת הפצע בעת החיתוך. איור 3B מציג תמונה מייצגת של קטע מוכתם ב- H&E שבו ניתן לראות בבירור את מיטת הפצע. וידאו משלים 1 מספק תצוגה של הליך הביופסיה מתוך המעי הגס של העכבר.
איור 1: פריטים הדרושים לביצוע ביופסיות. (A)תמונה של עדשה (א), נדן (b) ומלקחיים ביופסיה (ג). (B)הכנסת העדשה לתוך הנדן. (C) הכנסת מלקחיים דרך ערוץ העבודה של הנדן (חץ מלא). חץ מקווקו מציין מיקום נכון לחיבור של משאבת אוויר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונות קולונוסקופיות של מיטת הפצע לאחר הביופסיה. תמונות סטילס נוצרו מהקלטות וידאו של קולונוסקופיה מיד לאחר הביופסיה (יום 0) ו-2, 4 ו-6 ימים לאחר מכן. קווים כחולים מציינים את קצות מיטות הפצע בכל נקודת זמן. החץ מציין את אורך ההרחבה הנכון של המלקחיים לתוך הלומן כדי להבטיח מרחק ראוי מהעדשה לקיר רקטלי, על מנת להבטיח מדידות עקביות של מיטת הפצע לאורך זמן. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אקס ויוו ותמונות חתוכו של מיטת הפצע. המעיהגס נקצר מעכבר יומיים לאחר הביופסיה, הוכתם ב-0.2% מתילן כחול ונראה תחת מיקרוסקופ מנתח. העיגול המקווקו מציין את שולי מיטת הפצע. הקו השחור מציין את המיקום הנכון כדי לנתח את מיטת הפצע / המעי הגס לפני ההטבעה עבור חתך. (B)תמונה מייצגת של קטע מוכתם H&E של מיטת פצע. כוכביות מצביעות על מיטת פצעים וחצים מצביעים על קריפטות שלמות הצמודות למיטת הפצע המציינות את גבולות האזור הפצוע. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו משלים 1: הליך ביופסיה והדמיה מיטת פצע. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הבטחת ביופסיות עקביות ומדויקות, כמו גם מדידות של גודל הפצע הם בעלי חשיבות עליונה בעת ניסיון להעריך ביעילות את קצב סגירת הפצע במודל זה. לכן, יש לנקוט מספר צעדים כדי להיות בטוחים כי ההליכים מתבצעים כראוי. ראשית, עומק הביופסיה לא חייב להיות רדוד מדי או עמוק מדי. אם רדוד מדי, לא יהיה חלון מספיק כדי להעריך סגירת פצע. איור 2 מדגים עומק וגודל ביופסיה אופטימליים ביום 0. שימו לב להבחנה הברורה בין הרירית סביב מיטת הפצע לבין הרקמה שנותרה מתחת למיטת הפצע(איור 2). אם הביופסיה עמוקה מדי, ניקוב יכול להתרחש ובכך לגרום לעכבר בלתי ניתן להערכה. לאחר אי ספיקה לאחר ביופסיה ביום 0, אם הבטן של העכבר הופכת נפוחה קשות, ניקוב התרחש והעכבר לא יכול לשמש להערכה ויש להרדים אותו. זה מועיל אם אותו אדם מבצע את הביופסיות למחקר נתון כדי להבטיח עוד יותר עקביות. שנית, זה קריטי לבצע את הביופסיה בפי הטבעת ולא באזור קרוב יותר. בהתחשב בכך פי הטבעת הוא עבה יותר מאשר אזורים פרוקסימליים יותר של המעי הגס, יש סיכוי מופחת במידה ניכרת של ניקוב. סימן צריך להיעשות בצד החיצוני של הנדן 0.5 ס"מ מהסוף ואת אנדוסקופ צריך להיות מוכנס רק עד לנקודה זו כדי להבטיח כי מלקחיים ביופסיה לא להאריך מעבר פי הטבעת. שלישית, לאחר הכמות הנכונה של זלוף הן במהלך הביופסיה והן עבור הדמיה של מיטת הפצע הוא חיוני. במהלך הביופסיה, אם המעי הגס נפוח מדי הקיר המעי הגס יהיה מתוח מדי ולא תהיה כמות מספקת של רירית לביופסיה. לכן, מוצע כי האדם המפעיל את האנדוסקופ לא ללחוץ את האצבע המורה שלהם על הקצה הפתוח של שסתום הגז, על מנת לאפשר זרימת אוויר מינימלית לתוך המעי הגס. עם זאת, יש להשתמש בגישה ההפוכה בעת הדמיית מיטות פצעים לצורך מדידת גודל הפצע. לאחר הפצע ממוקם, להשלים את המעי הגס באופן מלא על ידי לחיצה על האצבע המורה בחוזקה נגד הקצה הפתוח של שסתום הגז ולהחזיק אותו שם עד תצוגה הרצויה מתקבלת. הקיר המעי הגס צריך להיות מתוח ככל האפשר למטרה זו. שימו לב, זלוף מלא של המעי הגס חשוב גם להבטחת תצוגות רוחביות עקביות של מיטת הפצע. לבסוף, זה קריטי כדי להבטיח כי מרחק עקבי נשמר בין העדשה לבין הפצע כדי לאפשר מדידות מדויקות על פני קולונוסקופיות מרובות באותם עכברים. מרחק קרוב יותר יגרום באופן מלאכותי למיטת הפצע להיראות גדולה יותר ממה שהיא ובמרחק רחוק יותר יגרום לה להיראות קטנה יותר. לכן, באמצעות מלקחיים ביופסיה כמדריך לשמירה על מרחק הוא מאוד מועיל.
בנוסף לשיקולים העיקריים שיש לקחת בחשבון בעת שימוש במודל זה, יש נקודות קלות יותר להיות מודעים לכך יכול גם להשפיע על היכולת לבצע הליך זה ביעילות. לדוגמה, יש לוודא כי לומן המעי הגס ברור בעת ביצוע קולונוסקופיה. למרות שחומר צואה מנוקה על ידי ריקון עם PBS, חומר נוסף יכול לרדת לתוך פי הטבעת לאחר החדרת האנדוסקופ. יתר על כן, כאשר לדמיין את מיטת הפצע מיד לאחר ביופסיה, הדם יכול לטשטש את השדה. לכן, לפעמים יש צורך להסיר את אנדוסקופ מפי הטבעת, לשטוף את המעי הגס עם PBS כדי לנקות את הדם הזוהר ולהחזיר את אנדוסקופ לדמיין את מיטת הפצע. במקרים מסוימים, דם ותכולת זוהר אחרים יכולים להידבק לעדשה, לטשטש את השדה. במקרים אלה, יש להסיר את האנדוסקופ מהעכבר ואת העדשה יש למחוק באמצעות המברשת לפני המשך ההדמיה.
לפני הופעתו של מודל ביופסיה קמצוץ מונחה קולונוסקופיה, החוקרים היו מערכות מודל מוגבל לחקור ריפוי פצע קולוני. גישה אחת הייתה להעריך את ההתאוששות מחשיפה לגורם כימי של פגיעה קולוניאלית כגון DSS8. עם זאת, גישה זו אינה מאפשרת שליטה מדויקת על היקף הפגיעה הנגרמת ולא על מיקום הפציעה ברחבי המעי הגס. יתר על כן, מדידות מדויקות של ריפוי ריר בזמן אמת יכול להיות מאתגר עם מודלים כימיים אלה. למרות שימושי, מודל הביופסיה יש גם מגבלות. לדוגמה, מפעילים מוגבלים לביצוע פצעים במעי הגס דיסטלי. מגבלה זו מונעת מחקרים של כיב מעיים קטן, נושא קליני חשוב. בנוסף, למרות טכניקה זו מסכמת היבטים מסוימים של פתוגנזה IBD, זה לא יכול להיחשב מודל אמיתי של מחלה זו. מתוך שיקול טכני, זה יכול להיות מאתגר לגרום לגדלים עקביים של פצעים על פני עכברים, ליצור פצעים ניתנים לפינוי, או לאתר מיטות פצעים בשלבים המאוחרים יותר של תהליך ריפוי הפצע. כאשר לוקחים נקודות אלה בחשבון, מומלץ להתחיל מחקרים עם עכברים נוספים כדי להסביר את אובדן דגימות unevaluable.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרוהן וקרן קוליטיס (D.C.M) וקרן קרוהן של ניו יורק (D.C.M. ו- A.J.D.). המחברים מודים לגברת כרמן פרארה על הסיוע ביצירת הליווי של הוידאו למאמר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biopsy forceps, 3 Fr | Karl Storz | 61071ZJ | |
| Coloview Tower system | Karl Storz | contact company | |
| Examination sheath, 9 Fr, Kit | Karl Storz | 61029DK | |
| Hopkins telescope, 0', 1.9 mm x 10 cm | Karl Storz | 64301AA | |
| isofluorane | Covetrus | 2905 | |
| methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| micro iris scissors | Integra | 18-1619 | |
| NIH ImageJ | NIH | N/A | software available for free download from: https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Pawfly MA-60 aquarium pump | Amazon | N/A | |
| scalpal with #10 blade | Hill-Rom | 372610 |
References
- Boal Carvalho, P., Cotter, J. Mucosal Healing in Ulcerative Colitis: A Comprehensive Review. Drugs. 77 (2), 159-173 (2017).
- Chen, M. L., Sundrud, M. S. Cytokine Networks and T-Cell Subsets in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (5), 1157-1167 (2016).
- Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
- Halfvarson, J., et al. Dynamics of the human gut microbiome in inflammatory bowel disease. Nature Microbiology. 2, 17004 (2017).
- Johansson, M. E., et al. Bacteria penetrate the normally impenetrable inner colon mucus layer in both murine colitis models and patients with ulcerative colitis. Gut. 63 (2), 281-291 (2014).
- Luissint, A. C., Parkos, C. A., Nusrat, A. Inflammation and the Intestinal Barrier: Leukocyte-Epithelial Cell Interactions, Cell Junction Remodeling, and Mucosal Repair. Gastroenterology. 151 (4), 616-632 (2016).
- Pineton de Chambrun, G., Blanc, G., Peyrin-Biroulet, L. Current evidence supporting mucosal healing and deep remission as important treatment goals for inflammatory bowel disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 10 (8), 915-927 (2016).
- Fung, K. Y., Putoczki, T. In Vivo Models of Inflammatory Bowel Disease and Colitis-Associated Cancer. Methods in Molecular Biology. 1725, 3-13 (2018).
- Jurjus, A. R., Khoury, N. N., Reimund, J. M. Animal models of inflammatory bowel disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (2), 81-92 (2004).
- Mizoguchi, A., Takeuchi, T., Himuro, H., Okada, T., Mizoguchi, E. Genetically engineered mouse models for studying inflammatory bowel disease. Journal of Pathology. 238 (2), 205-219 (2016).
- Seno, H., et al. Efficient colonic mucosal wound repair requires Trem2 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (1), 256-261 (2009).
- Alam, A., et al. The microenvironment of injured murine gut elicits a local pro-restitutive microbiota. Nature Microbiology. 1, 15021 (2016).
- Alam, A., et al. Redox signaling regulates commensal-mediated mucosal homeostasis and restitution and requires formyl peptide receptor 1. Mucosal Immunology. 7 (3), 645-655 (2014).
- Kuhn, K. A., Manieri, N. A., Liu, T. C., Stappenbeck, T. S. IL-6 stimulates intestinal epithelial proliferation and repair after injury. PLoS One. 9 (12), 114195 (2014).
- Leoni, G., et al. Annexin A1, formyl peptide receptor, and NOX1 orchestrate epithelial repair. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 443-454 (2013).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Neurath, M. F., et al. Assessment of tumor development and wound healing using endoscopic techniques in mice. Gastroenterology. 139 (6), 1837-1843 (2010).
- Montrose, D. C., et al. Colonoscopic-Guided Pinch Biopsies in Mice as a Useful Model for Evaluating the Roles of Host and Luminal Factors in Colonic Inflammation. American Journal of Pathology. 188 (12), 2811-2825 (2018).
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. Journal of Visualized Experiments. (90), (2014).
