Summary
Het gepresenteerde protocol beschrijft een methode voor een neuriet ontgroeiingstest en neurotoxiciteitsbeoordeling van kleine moleculen.
Abstract
Neurite uitgroei test en neurotoxiciteit beoordeling zijn twee belangrijke studies die kunnen worden uitgevoerd met behulp van de gepresenteerde methode hierin. Dit protocol biedt betrouwbare analyse van neuronale morfologie samen met kwantitatieve metingen van wijzigingen op neurietlengte en synaptische eiwitlokalisatie en overvloed bij behandeling met kleine moleculeverbindingen. Naast de toepassing van de gepresenteerde methode in neurite uitgroei studies, neurotoxiciteit beoordeling kan worden uitgevoerd om te beoordelen, onderscheiden en rangschikken commerciële chemische verbindingen op basis van hun potentiële ontwikkelingsneurotoxiciteit effect.
Hoewel cellijnen tegenwoordig op grote schaal worden gebruikt in samengestelde screeningtesten in de neurowetenschappen, verschillen ze vaak genetisch en fenotypisch van hun weefseloorsprong. Primaire cellen, aan de andere kant, behouden belangrijke markers en functies waargenomen in vivo. Daarom, als gevolg van de vertaling potentieel en fysiologische relevantie die deze cellen kunnen bieden neurite uitgroei test en neurotoxiciteit beoordeling kan aanzienlijk profiteren van het gebruik van menselijke neurale voorloper cellen (hNPC's) als de primaire menselijke cel model.
De gepresenteerde methode hierin kan worden gebruikt om te screenen op het vermogen van verbindingen om neuriet ontgroeiing en neurotoxiciteit te induceren door gebruik te maken van de menselijke neurale voorloper cel-afgeleide neuronen, een cel model nauw vertegenwoordigen menselijke biologie."
Introduction
Neurite groei is een proces fundamenteel voor de vorming van het neuronale netwerk en zenuwregeneratie1,2. Na een blessure speelt neurite ontgroeiing een belangrijke rol in de regeneratie van het zenuwstelsel. Neurite uitgroei is ook een belangrijk element van de extracellulaire signalering in het induceren van neuronale regeneratieve activiteiten om de resultaten voor neurodegeneratieve aandoeningen en neuronale letsel3,4,5,6te verbeteren .
Door het handhaven van hun differentiatie potentieel in de productie van verschillende neurale afstammingen, menselijke neurale voorloper cellen (hNPC's) kan een modelsysteem voor studies van het centrale zenuwstelsel (CNS) functie en ontwikkeling7,8,9. Een hoog translationeel potentieel en fysiologische relevantie van hNPC's als primair menselijk celmodel bieden een aanzienlijk voordeel bij neurite ontgroeigerelateerde drug discovery screenings. Het onderhoud en de schaling van de primaire celmodellen voor hoogdoorvoertesten kan echter tijdrovend en arbeidsintensief zijn10,11,12,13.
Naast de toepassing van de gepresenteerde methode in neurite uitgroei studies, neurotoxiciteit beoordeling is een andere toepassing met behulp van de hNPC-afgeleide neuronen. Er zijn duizenden commerciële chemische verbindingen die ofwel niet worden onderzocht of met slecht begrepen neurotoxiciteit potentieel. Daarom is er meer betrouwbare en effectieve screeningsexperimenten om verbindingen te beoordelen, te onderscheiden en te rangschikken op basis van hun potentieel om ontwikkelingsneurotoxiciteit uit te lokken in hoge vraag14. De toename van prevalentie en incidentie van neurologische aandoeningen, samen met de overvloed aan niet-geteste verbindingen in het milieu vereist de ontwikkeling van meer betrouwbare en efficiënte experimenten om gevaarlijke milieuverbindingen te identificeren die neurotoxiciteit kunnen opleveren15.
De gepresenteerde methode hierin kan worden gebruikt om te screenen op het vermogen van verbindingen om neuriet ontgroeiing en neurotoxiciteit te induceren door gebruik te maken van de menselijke neurale voorloper cel-afgeleide neuronen, een cel model nauw vertegenwoordigen menselijke biologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethics Statement: Foetale exemplaren werden ontvangen van de Birth Defects Research Laboratory aan de Universiteit van Washington in Seattle door middel van een weefseldistributie programma ondersteund door het National Institute of Health (NIH). Het Birth Defects Research Laboratory verkregen passende schriftelijke geïnformeerde toestemming van de ouders en de aanschaf van weefsels werd gecontroleerd door de Institutional Review Board van de Universiteit van Washington. Al het werk werd uitgevoerd met goedkeuring door de Human Subject Research Office aan de Universiteit van Miami8.
1. Isolatie en cultuur van menselijke neurale voorlopercellen (hNPC's)
- Plaats het hersenweefsel in een petrischaaltje van 100 mm en verwijder de hersenvliezen voorzichtig met tangen.
- Breng het hersenweefsel over naar een conische buis van 50 mL en was het twee keer met 20 mL PBS door de buis voorzichtig om te keren.
- Het hersenweefsel in een nieuwe conische buis van 50 mL uitbroeden door het weefsel onder te dompelen in celdissociatieoplossing (zie Tabel van Materialen)en DNase I (10 U/mL) gedurende 10 min bij 37 °C.
- Voeg 5 mL neuronale celkweekmedium (zie Tabel van Materialen)toe aan het hersenweefsel dat buis bevat en dissociaal de neurosferen door 20 tot 30 keer te tritureren via een 1000 μL pipettip om een eencellige suspensie te maken.
- Filter de celsuspensie door een celzeef van 70 μm om celclusters te verwijderen.
- Zaad de eencellige suspensie in een geventileerde T-25 kolf voorzien van 5-10 mL neuronale celkweekmedium aangevuld met componenten die zijn beschreven in tabel 1.
- Steriliseer de heparineoplossing door middel van een filter van 0,2 μm. Het B-27 supplement zonder vitamine A is een serumvrij supplement voor de teelt van neurale voorlopers en stamcellen, zonder differentiatie te veroorzaken.
OPMERKING: Menselijke neurale voorlopercellen (hNPC's) worden geïsoleerd van menselijke foetale hersenen verzameld van geaborteerde foetus. Na 7-10 dagen in de cultuur vormen neurale stamcellen (NSC's) vrij zwevende neurosfeerkolonies, terwijl andere celtypen in suspensie blijven als enkele cellen of hechten aan de bodem van de kolf. De geïsoleerde hNPC's kunnen worden gekweekt als neurosferen in suspensie gedurende enkele maanden8,16,17.
- Steriliseer de heparineoplossing door middel van een filter van 0,2 μm. Het B-27 supplement zonder vitamine A is een serumvrij supplement voor de teelt van neurale voorlopers en stamcellen, zonder differentiatie te veroorzaken.
| Bedrag | Component |
| 100 μL | EFG (20 ng/mL) |
| 100 μL | FGF (10 ng/mL) |
| 2 mL | B-27, Minus vitamine A (50X) |
| 1 mL | L-alanyl-L-glutamine (100X) (zie tabel met materialen) |
| 4 μL | Heparine (2 μg/mL) |
| 96,8 mL | Neuronale celkweekmedium (zie tabel met materialen) |
Tabel 1. Componenten die nodig zijn voor het maken van 100 mL van cultuur media
2. Doorgeeft de hNPC's
- Verzamel de media met de drijvende bollen, grote en kleine neurosferen, en breng ze naar een 50 mL conische buis.
OPMERKING: Om onbekende redenen is de timing voor het splitsen van de neurosferen variabel van 7 dagen tot 30 dagen. Echter, over het algemeen, neurosferen moeten worden doorgegangerd wanneer ze een diameter van meer dan 700-900 μm bereiken. Dit is wanneer het centrum van de neurosfeer begint te donkerder, die wordt beschouwd als een teken van een hoog percentage van de cel dood18. - Draai de neurosferen naar beneden door centrifugatie op 300-400 x g gedurende 3 min.
- Breng het supernatant voorzichtig aan en dompel de bollen vervolgens onder in 500 μL ontdooid celdissociatiereagens (zie Tabel met materialen).
- Maak aliquots van celdissociatie reagens door het toevoegen van 500 μL per 1,5 mL microbuisjes en op te slaan bij -20 °C. Om enzymactiviteit te voorkomen, ontdooit u het reagens van de celdissociatie door 5 minuten in een water/kraalbad van 37 °C te worden gehouden.
- Afhankelijk van de dichtheid en grootte van de bollen, broeden de ondergedompelde bollen op 37 °C voor 5-15 min.
- Voeg 5-10 mL voorverwarmde kweekmedia toe aan de neurosferen met een kegelbuis van 50 mL en centrifuge met 300-400 x g gedurende 5 minuten om de neurosferen te besmeuren.
- Aspirate de supernatant en zachtjes pipette op en neer, met behulp van een 1000 μL pipet, in 2 mL van de cultuur media totdat alle neurosferen zijn in een enkele cel suspensie.
LET OP: De dissociatie wordt zichtbaar voor het blote oog. Vóór dissociatie zijn de neurosferen in de vorm van sferen. Na het onderdompelen in dissociatie reagens en door pipetting op en neer, zullen ze worden enkele cellen.- Tel de cellen en plaat de enkele cellen, 2 tot 3 miljoen cellen per T-25 kolf in 10 mL van de cultuur media.
- Voer de cellen om de 3 dagen door het vervangen van de helft van de cultuur media.
- Beslecht neurosferen door de kolf te leunen zodat deze in de onderste hoek staat. Houd de kolf in de positie voor ongeveer 1-2 min tot de neurosferen sediment. Dan aspirate de helft van de media zachtjes door het invoegen van de serologische pipet in de media boven de vaste neurosferen. Gescheiden cellen kunnen na 2 tot 3 dagen in cultuur19worden samengevoegd tot het vormen van bollen.
3. Bevriezing van de HPC's
- Bereid het celvriezenmedium voor door DMSO toe te voegen aan de kweekmedia aan een uiteindelijke concentratie van 10% (v/v) of gebruik commercieel verkrijgbaar cryopreservatiemedium voor gevoelige celtypen (zie Tabel van materialen).
- Sorteer grote bollen door de media over te brengen in een 50 mL conische buis en laat de bollen zich vestigen door de zwaartekracht. Verwijder en breng vervolgens de grote neurosferen over in een nieuwe 50 mL conische buis voor passage met behulp van een 200 of 1000 μL pipet tip.
OPMERKING: Neurosferen met een diameter groter dan 900 μm worden als groot beschouwd en de neurosferen met een diameter kleiner dan 500 μm worden als klein beschouwd. - Draai de resterende neurosferen naar beneden door centrifugatie op 300-400 x g gedurende 3 min. Verwijder voorzichtig de supernatant.
- Resuspend tot 100 bollen in 1 mL van cryopreservation reagens en breng het over naar een cryotube.
- Bewaar 's nachts bij -80 °C in een celvriescontainer (zie Tabel van materialen)en verplaats het de volgende dag naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
OPMERKING: Het is beter om kleine tot middelgrote neurosferen (lager dan 900 μm in diameter) te bevriezen en te voorkomen dat grote neurosferen (groter dan 900 μm in diameter) of enkele cellen bevriezen. Om celschade tijdens het ontdooien van het monster te verminderen, houdt u de cellen dicht door de ontdooide neurosferen in een kleine T25-kolf te zaaien.
4. Differentiatie en behandeling van hPC's
OPMERKING: Om differentiatie te veroorzaken, worden neurosferen uitgesplitst in enkele cellen, geteld en vervolgens 5 dagen op gecoate platen gezaaid. Vervolgens worden gedifferentieerde cellen gedurende 24 uur behandeld met testverbindingen vóór immunostaining en fluorescentiekwantificering.
- Coating
- Voeg 200 μL poly-L-lysine (PLL) per put van 4-well glazen kamerplaten (140 μL per put van 8-well kamer dia's).
- Incubeer voor 1 uur bij kamertemperatuur (RT).
- Was 3x met PBS.
- Laat het drogen op RT (voor ongeveer 30 min).
- Voeg 150 μL laminine (50 μg/mL) per put van 4-well glazen kamerdia's (120 μL per put van 8-well kamer dia's) toe.
- Incubeer voor 2 uur bij 37 °C.
- Was 3x met PBS.
LET OP: Gecoate kamerdia's kunnen gedurende 1 maand bij 4 °C worden opgeslagen.
- Plating van de cellen
- Telling en plaat 80.000 eencellige neurosferen (neurosferen in een enkele cel suspensie) per put van 4-well kamer dia's (70.000 cellen per put van 8-well kamer dia).
- Voeg 500 μL differentiatiemedia per put van 4-well kamerdia (250 μL media per put van 8-well kamerdia's) toe.
- Om de differentiatiemedia eerst te maken, voegt u de volgende componenten in tabel 2 toe aan een steriele wegwerpcontainer om de neurale inducerende media (NIM) te maken.
- Voeg de volgende ingrediënten toe in tabel 3 tot 48,5 mL NIM die in de vorige stap is gemaakt om de differentiatiemedia te maken.
- 5 dagen lang uitbroeden bij 37 °C.
- Behandel de cellen na 5 dagen 24 uur door de helft van de media in elke put te vervangen door verse media vermengd met de gewenste concentratie van testverbindingen, inclusief de juiste controles.
| Bedrag | Component |
| 49 mL | DMEM/F-12 |
| 0,5 mL | N2 supplement (100X) |
| 0,5 mL | MEM niet-essentiële aminozuren (100X) |
| 2 μL | Heparine (2 μg/mL) (Stock Conc. is 50 mg/mL) |
Tabel 2. Onderdelen die nodig zijn voor het maken van 50 mL NIM
| Bedrag | Component |
| 1 mL | B-27 (50x) |
| 500 μL | Antibioticum-antimycoticum (100X) |
| 5 μL | Retinoïnezuur (0,1 μM) |
| 50 μL | GDNF (10 μg/mL) |
| 50 μL | BDNF (10 μg/mL) |
| 5 μL | Ascorbinezuur (0,2 μg/mL) (Stock Conc. is 2 mg/mL) OPMERKING: Aanbevolen om vers te worden gemaakt. |
| 48,5 mL | Nim |
Tabel 3. Componenten die nodig zijn voor het maken van 50 mL van differentiatie media
5. Immunocytochemie (ICC)
LET OP: Cellen zijn vastgesteld met 4% formaldehyde. Permeabilisatie en blokkering wordt vervolgens uitgevoerd om de penetratie te verbeteren en niet-specifieke binding van antilichamen te voorkomen. Cellen worden vervolgens 's nachts geïncubeerd met primaire antilichamen. Vervolgens worden cellen geïncubeerd met fluorescerende secundaire antilichamen. Ten slotte, na het gebruik van DAPI om de kern te bevlekken, worden kamerplaten gemonteerd.
- Fixatie
- Voorzichtig aspirate de media in elke put.
- Voeg 500 μL van 4% formaldehyde per put van 4-well kamerdia's toe (250 μL per put van 8-well kamerdia's).
- Incubeer voor 15 minuten bij RT.
- Was voorzichtig 2x met 500 μL PBS.
LET OP: Na fixatie, door 1 mL PBS in elke put achter te laten, kunnen kweekdia's maximaal 3 maanden bij 4 °C worden opgeslagen.
- Celpermeabilisatie en blokkering
- Voeg de volgende componenten in tabel 4 toe aan een steriele wegwerpcontainer om de buffer van het antilichaam (Ab) te maken.
- Meng de volgende ingrediënten in tabel 5 met de Ab-buffer die in de vorige stap is gemaakt om de celpermeabilisatie en blokkeringsoplossing te maken.
- Voeg 500 μL per put van 4-well kamer dia's en incubbateren voor 1 uur op RT.
LET OP: De ab-buffer kan worden opgeslagen bij 4 °C.
| Bedrag | Component |
| 1,75 g | NaCl (150 mM) |
| 1,2 g | TrisBase (50 mM) |
| 2 g | BSA 1% |
| 3,6 g | L-lysine (100 mM) |
| 8 g | Natrium Azide (4%) |
| 200 mL | Gedestilleerd water. OPMERKING: Los in eerste instantie de vereiste componenten op in 150 mL water en pas deze aan tot 200 mL. |
Tabel 4. Componenten die nodig zijn voor het maken van 200 mL antilichaam buffer
| Bedrag | Component |
| 600 μL | 20% Geitenserum |
| 6 μL | 0,2% Triton-X100 |
| 2394 μL | Antilichaambuffer. OPMERKING: Los in eerste instantie de vereiste componenten op in 2 mL Ab-buffer en pas deze vervolgens aan op pH 7.4. Voeg vervolgens meer Ab-buffer toe om aan te passen aan het uiteindelijke volume van 3 mL en filter steriliseren. |
Tabel 5. Componenten die nodig zijn voor het maken van 3 mL celpermeabilisatie en blokkeringsoplossing
- Kleuring
- Was 2x met 500 μL PBS.
- Voeg het verdunde primaire antilichaam, anti-β-tubuline III (1:200) toe en broeder 's nachts bij 4 °C (200 μL per put van 4-well kamerglijbanen). Verdun het primaire antilichaam in PBS.
- Was 2x met PBS.
- Voeg de verdunde, in PBS, fluorescerend gelabeld secundair antilichaam, Alexa Fluor 488 (1:500), en incubate voor 2 uur op RT op een plaats beschermd tegen licht (250 μL per put van 4-well kamer dia's)
- Was 2x met PBS.
- Voeg de verdunde, in PBS, DAPI (300 nM concentratie) en incubeer gedurende 5 min op RT op een plaats beschermd tegen licht (300 μL per put van 4-well kamer dia's).
- Was 3x met PBS.
- Monteer de kamerglijbanen met de volgende instructies.
- Haal de kamerglijbaan uit elkaar door de afscheidende lipjes te breken en de pakking en de basis te verwijderen.
- Voeg één druppel van de montageoplossing (zie Tabel van Materialen)per put van 4-well kamerdia's toe. Gebruik vervolgens een afdekplaat om de hele dia te bedekken.
- Plaats met behulp van een pincet en onder een hoek één kant van de afdek slip tegen de glijbaan terwijl u contact maakt met de buitenste rand van de vloeistofdruppel.
- Tip de afdekking voorzichtig op de montageoplossing bij het op zijn plaats laten zakken. Vermijd het creëren van bubbels. Neem een pipet tip en druk het naar beneden op de cover slip. De bubbels zullen naar de zijkant bewegen.
LET OP: Bubble vorming is onvermijdelijk op keer. Als het gebeurt, beeld om hen heen, zolang er een paar. - Volg de aanwijzingen van de fabrikant voor het genezen van de tijd. Vermijd het gebruik van niet-insloopoplossingen vanwege de moeilijkheid bij het hanteren tijdens de beeldvorming. Anders is het gebruik van een geschikte coverslip kit aan de randen nodig om te voorkomen dat de coverslip glijden tijdens de beeldvorming.
- Om de coverslip te verzegelen, gebruik je nagellak en maak je een kleine lijn aan de rand van de afdekslip. Laat de nagellak ongeveer 2 min drogen.
6. Beeldverwerving, neurietuitgroei en fluorescentieintensiteit kwantificering
OPMERKING: Gebruik na kleuring een confocale microscoop met een doelstelling van 20x en een afbeeldingsgrootte van 1024 x 1024 pixels om de beelden van de behandelde cellen te verkrijgen. Neem foto's ten minste van twee velden per biologische repliceren per aandoening. Gebruik vervolgens Fiji image analysis software (ImageJ 1.51u) voor de kwantificering van de neurite lengte. Kortom, meet de lengte van de langste neuriet voor elk neuron en na het gemiddelde van de waarden per behandeling, gebruik student t-test voor onafhankelijke groepen om de middelen tussen experimentele groepen en controlegroep te vergelijken.
LET OP: Verschillende commerciële (Imaris, Volocity, Amira) en open source (ImajeJ, CellProfiler, Vaa3D, BioImageXD, Icy, KNIME) beeldverwerkingsprogramma's zijn beschikbaar. Onder deze programma's is ImageJ het instrument geworden bij uitstek voor biologische beeldanalyse20,21. De ImageJ portal op https://imagej.net/Introduction is een nuttige bron van informatie die een grondige beschrijving van de fundamentele en ingebouwde functies ImageJ's, waaronder beeldverwerking, colocalisatie, deconvolutie, registratie, segmentatie, tracking, en visualisatie.
- Neuronale uitgroei met Fiji beeldanalyse software meten
- Zoals geïllustreerd in figuur 1,opent u de afbeelding door deze te slepen en te laten vallen op Fiji-software of door Bestand te selecteren | Open.
- Selecteer Analyseren | Hulpmiddelen | ROI manager, en klik dan met de rechtermuisknop Straight op de5e pictogram in de werkbalk Straight en overschakelen naar de vrije hand lijn. Dubbelklik eventueel op hetzelfde pictogram om de lijnbreedte in 10 te veranderen en traceer vervolgens de langste neurite, die begint in de buurt van het cellichaam en zich uitstrekt tot het puntje van de neurite.
- Druk op Ctrl + T en vervolgens F om de meting toe te voegen aan de ROI Manager en het gemeten neuron te markeren. Selecteer alle getallen in de ROI,klik op Meten,selecteer alle berekende lengtes en kopieer/plak in een spreadsheet.
- Het meten van fluorescentieintensiteit van gelabelde cellen met Fiji image analysis software
- Zoals geïllustreerd in figuur 2, na het openen van de afbeelding, klik op de 4e pictogram in de werkbalkth Freehand selecties. Teken de vorm van de cel.
- Selecteer Analyseren | Metingen instellen en selecteren voor de volgende waarden: Gebied, Geïntegreerde dichtheid, Gemiddelde grijze waarde | Analyseren | Meten (er wordt een pop-upvak geopend met een stapel waarden).
- Selecteer een gebied naast de cel als achtergrond (grootte is niet belangrijk) en selecteer vervolgens Analyseren | Meten. Selecteer alle gemeten gegevens en kopieer/plak in een spreadsheet.
OPMERKING: Integrated Density (IntDen) is het item dat wordt gebruikt voor het bepalen van de fluorescerende intensiteiten. In deze studie wordt fluorescerende intensiteit van het doelmolecuul gemeten om in eerste instantie de verdeling ervan in de cel te analyseren en vervolgens de overvloed van het doelmolecuul onder verschillende behandelingen te kwantificeren. Bijgevolg zal de effectiviteit van behandelingen worden gemeten en vergeleken met controle.
7. Neurotoxiciteitsbeoordeling
OPMERKING: Cytotoxiciteit van testverbindingen wordt geëvalueerd in 384-putplaten (zie tabel van materialen) met behulp van een luminescente cel levensvatbaarheidstest (zie Tabel van materialen). De hNPC's worden volgens dezelfde methode bereid, met uitzondering van kleine wijzigingen, beschreven in de sectie "Differentiatie en behandeling van hNPC's". Vervolgens wordt een lichtgevend signaal gegenereerd door luminescente cel levensvatbaarheidstest gemeten met behulp van een microplate-lezer. Het lichtgevende signaal is evenredig aan de cellulaire ATP-concentratie die zelf direct evenredig is met het aantal levensvatbare cellen dat in elke put aanwezig is.
- Coating
- Voeg 30 μL poly-L-lysine (PLL) per put van 384-put plaat toe.
- Incubeer voor 1 uur bij RT.
- Was 2x met PBS.
- Laat het drogen op RT (voor ongeveer 30 min).
- Voeg 30 μL laminine (50 μg/mL) per put van 384-put plaat toe.
- Incubeer voor 2 uur bij 37 °C.
- Was 2x met PBS.
LET OP: Gecoate 384-put platen kunnen worden opgeslagen op 4 °C voor 1 maand.
- Plating van de cellen
- Telling en plaat 20.000 eencellige neurosferen per put van 384-put plaat in 25 μL van differentiatiemedia.
- 5 dagen lang uitbroeden bij 37 °C.
- Behandel de cellen na 5 dagen 24 uur door testverbindingen die met 6x de uiteindelijke gewenste concentratie in 5 μL-volume zijn bereid (om het uiteindelijke volume van 30 μL per put te maken).
- Cel levensvatbaarheid test
- Voeg 30 μL luminescente cel levensvatbaarheid reagens per put van 384-well plaat.
OPMERKING: Voeg een volume van luminescente cel levensvatbaarheid reagens gelijk aan het volume aanwezig in elke put. Ontdooi de luminescente cel levensvatbaarheid reagens en equilibrate rt voorafgaand aan het gebruik. - Schud 2 minuten op een plaatshaker (om cellyse te mengen en te induceren).
- Draai het mengsel naar beneden door centrifugatie op 300-400 x g voor 30 s.
- Incubeer de 384-put plaat gedurende 10 minuten bij RT op een plaats beschermd tegen licht (om het lichtgevende signaal te stabiliseren).
- Neem luminescentie op met een microplatelezer.
OPMERKING: Gebruik de juiste controles voor de levensvatbaarheidstest, waaronder Velcade (bij een uiteindelijke concentratie van 10 μM) als positief en HBSS met DMSO (met uiteindelijke concentratie van 0,1% of 0,2%) als negatieve controle.
- Voeg 30 μL luminescente cel levensvatbaarheid reagens per put van 384-well plaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocol gepresenteerd in het manuscript is met succes gebruikt in twee onlangs gepubliceerde artikelen22,23. Figuur 3 toont het gebruik van hNPC's afgeleide neuronen bij het onderzoeken van het effect van HDAC-remmers als epigenetische verbindingen op de uitbreiding van neurites als een marker voor neurite uitgroei en de daaropvolgende neurogene vermogen van kleine molecule verbindingen.
Bovendien wordt in figuur 4 de neurotoxiciteit van geteste verbindingen (HDAC-remmers) ook beoordeeld door tegelijkertijd de hNPC's te differentiëren in 384-well platen, waarbij het potentieel van het gepresenteerde celmodel (hNPC's) voor neurotoxiciteitsbeoordeling en het vermogen om op te schalen om neurotoxiciteit te testen op een hoger aantal verbindingen, wordt weergegeven.
In een ander artikel door Sartor et al. (Figuur 5), meting van de neuronale cel fluorescentie intensiteit om de overvloed van H4K5ac kwantificeren, als een histone merk, na de behandeling van de neuronen onderscheiden van hNPC's met epigenetische modifier verbindingen wordt met succes aangetoond23. Bovendien, zoals geïllustreerd in figuur 6, in een ongepubliceerd werk, het protocol is gebruikt om een presynaptisch eiwit, synaptophysine, visualiseren om te controleren op de mogelijke synaptogeen effect van kleine molecuul verbindingen.
Figuur 1: Stapsgewijze workflow ter illustratie van een aanpak voor het meten van neuronale uitgroei met Fiji-beeldanalysesoftware. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Stapsgewijze workflow ter illustratie van een aanpak voor het kwantificeren van de fluorescentieintensiteit van neuronale cellen met fiji-beeldanalysesoftware. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Neurite uitgroeitest met kleine molecuul epigenetische verbindingen.
(A) Representatieve fluorescerende beelden (20x vergroting) voor de behandeling van neuronen die afkomstig zijn van hNPC's met hydroxamische hdac-remmers. Menselijke neurale voorlopercellen worden gedurende 5 dagen gedifferentieerd; vervolgens behandeld voor 24 uur met 0,1% DMSO (als controle), en Trichostatin A, JNJ26481585, SB939 en PCI24781 (als testverbindingen). Vervolgens wordt immunostaining uitgevoerd met neuronaal-specifieke β-tubuline III-antilichaam (groen) om neuronale processen te visualiseren en neurotische lengtes en DAPI (blauw) te kwantificeren om celkernen te visualiseren. (B) Statistische analyse van de lengte van de neuriet in verschillende groepen. Zoals afgebeeld, kunnen alle testverbindingen neurite uitgroei veroorzaken. Kwantitatieve analyse van de lengte van de neuriet wordt gedaan met behulp van ImageJ-software. Foutbalken vertegenwoordigen SEM; p < 0,001, **** p < 0,0001. Dit cijfer is gewijzigd van Bagheri et al.22. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Neurotoxiciteitsbeoordeling met behulp van luminescente cel levensvatbaarheidstest.
hNPC's worden gezaaid en gedifferentieerd naar neuronen in de 384-put plaat volgens dezelfde methode die wordt gebruikt voor neurite uitgroei test. Daarna wordt het effect van testverbindingen op de levensvatbaarheid van cellen na 24 uur blootstelling gemeten. Zoals aangetoond, is er geen significante toxiciteit bij behandelingen. One-way ANOVA wordt gebruikt voor data-analyse en een p-waarde < 0,05 wordt als statistisch significant beschouwd. Dit cijfer is gewijzigd van Bagheri et al.22. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: RGFP966 verhoogt H4K5ac in neuronen onderscheiden van menselijke neurale voorlopercellen.
(A) Representatieve immunofluorescentievlekken van β tubuline, DAPI en H4K5ac na behandeling met DMSO, RGFP966 of RGFP966 + JQ1 in neuronen die van hPC's zijn afgeleid. (B) Kwantificering van fluorescentieintensiteit van H4K5ac na behandeling met DMSO, RGFP966 of RGFP966 + JQ1. Foutbalken vertegenwoordigen SEM; p < 0,0001. Dit cijfer is gewijzigd van Sartor et al.23. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Representatieve immunofluorescentie kleuring van Synaptophysine (rood) om synaptische terminals te visualiseren, β tubulin (groen) om neuronale processen te visualiseren, en DAPI (blauw) om celkernen te visualiseren na behandeling met DMSO (als controle), en SB939 (als testcompound) in neuronen die afkomstig zijn van hPC's. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol is een van de weinige gepubliceerde papers beschrijven van de test voor neurite lengte bij behandeling met testverbindingen. Verder beschrijven we hoe hNPC's te gebruiken voor een neurite uitgroeitest en neurotoxiciteitsbeoordeling. Door gebruik te maken van deze neuriet ontgroeiingstest en neurotoxiciteitsbeoordeling op door hNPC's afgeleide neuronen, wordt het neurogene potentieel van een categorie epigenetische kleinemoleculaire verbindingen, HDAC-remmers, inducerende neurotische uitgroei aangetoond22. Bovendien, in een ander papier gepresenteerd door Sartor et al., dit protocol wordt gebruikt om de fluorescentie intensiteit van H4K5ac, een histon eiwit, kwantificeren bij behandeling met verschillende epigenetische modifier verbindingen23.
Cognitieve functie is gebaseerd op de juiste bedrading en functionele verbindingen binnen neuronale circuits. Gedetailleerde en consistente kwantificering van verschillende aspecten van neuronale morfologie als een fenotypische screening benadering is essentieel om betrouwbaar inzicht te krijgen in de onderliggende trajecten die leiden tot hersenaandoeningen, variërend van neuroontwikkeling tot psychiatrische stoornissen. Fenotypische screening wordt beschouwd als een bijzonder effectieve aanpak bij het verkennen van kleine molecule verbindingen als vermeende drug kandidaten om een cellulair fenotype moduleren. In deze benadering worden in plaats van slechts één doel te ondervragen, alle componenten en trajecten van de cel onderzocht24.
Neuronale morfologie met inbegrip van vorm, structuur, en connectiviteit worden beschouwd als belangrijke kenmerken van neuronale functie. Genetische verstoringen die de morfologie van neuronen of synaptische eiwitlokalisatie en -niveau veranderen, kunnen met name bijdragen aan de analyse van ziekteverwekkende mutaties. Daarom zijn betrouwbare methoden nodig om de impact van perturbagen op neuronale morfologie25te beoordelen.
De hNPC's, worden geïsoleerd van de embryonale zoogdier hersenen, die vervolgens worden gekweekt in vitro in de aanwezigheid van mitogenen. Deze cellen zijn opgebouwd uit neurosferen die worden gekenmerkt als zwevende cellulaire aggregaten bestaande uit neurale voorlopercellen en radiale gliacellen. De hNPC's bieden een wenselijk modelsysteem voor de functie en ontwikkeling van het zenuwstelsel door hun differentiatiepotentieel te behouden bij het produceren van verschillende neurale afstammingen7,8,9. Neurite getal, intensiteit, lengte en breedte samen met synaptische kenmerken, waaronder pre- en post-synaptische eiwitten wijzigingen behoren tot neurite en synaptische veranderingen die betrouwbaar en efficiënt kunnen worden gemeten met behulp van de gepresenteerde methode hierin.
Als gevolg van een toename van de prevalentie van neurologische aandoeningen zoals attention deficit hyperactivity disorder en autisme, blijft het neurotoxiciteitspotentieel van milieuchemicaliën bij kinderen een publieke zorg15,26. Daarom wordt ook de bruikbaarheid van door hNPC's afgeleide neuronen voor betrouwbare en efficiënte neurotoxiciteitsbeoordeling onderzocht. Zoals in figuur 4is aangetoond, kunnen hNPC's worden aangepast en opgeschaald voor neurotoxiciteitsbeoordeling in 384-putplaten.
Neurotoxiciteit beoordeling als een toepassing voor de geïntroduceerde cel model is haalbaar door ofwel differentiëren van de neurosferen in neuronen voor beplating in 384-well platen of het onderscheiden van de cellen, terwijl de neurosferen zijn verguld in 384-well platen als enkele cellen. In de laatste benadering zijn hoge precisie pipettingvaardigheden vereist voor het plating van het exacte aantal neurosferen dat in enkele cellen is uitgesplitst en ook voor de volgende behandelingsprocedures met differentiatie-inducerende medium. Gezien de benodigde pipettingvaardigheden wordt differentiatie vóór beplating aanbevolen om meer reproduceerbare resultaten te bereiken. Bovendien kan bulkcelsoring door fluorescentie geactiveerde celsorden (FACS) ook mogelijk worden gebruikt om het vereiste aantal cellen dat de behoefte aan hoge precisie pipettingvaardigheden omzeilt, nauwkeurig te scheiden.
Het wordt aangeraden om te beginnen met de neuriet uitgroei test door neurotoxiciteit beoordeling om te voorkomen dat herhaalde neuriet uitgroei testen met verschillende doses van dezelfde verbinding te bereiken voor niet-toxische concentratie. Daarom, het combineren van een neurotoxiciteit beoordeling door gebruik te maken van de luminescente cel levensvatbaarheid test tegen een dosis-respons curve van testverbindingen zal resulteren in het vinden van de juiste dosering met minimale inspanning. De luminescente cel levensvatbaarheid test is een zeer gevoelige methode om het aantal levensvatbare cellen in een celcultuur te bepalen. De methode werkt op kwantificering van de ATP aanwezig in de cultuur als een indicator van cellulaire metabolisme. De add, mix, en meet formaat van de test biedt een eenvoudige en snelle aanpak om te controleren op cel levensvatbaarheid en cytotoxiciteit van testverbindingen.
Er zijn enkele beperkingen aan het gepresenteerde protocol als volgt. Vanwege beschikbaarheid en inherente variabiliteit is het gebruik van fysiologisch relevante primaire cellen beperkt25. hNPC's hebben een langzame proliferatiesnelheid, wat het gebruik ervan zou kunnen beperken. Handmatige grootschalige analyse van fluorescerende beelden van neuronen is tijdrovend en gevoelig voor experimenter bias. hNPC's kunnen worden beschouwd als jonge neurale cellen, niet vertegenwoordigen leeftijdsgebonden epigenetische wijzigingen accumuleren in cellen gedurende het hele leven van een persoon. Aangezien neurodegeneratieve aandoeningen optreden bij oudere personen, kunnen hNPC's onvoldoende fysiologische relevantie hebben om een geschikt model te zijn voor late beginomstandigheden.
Hoewel diermodellen en cellijnen waardevol zijn geweest bij het ontcijferen van moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan ziekten, hebben zij beperkingen aangetoond bij het vertalen van bevindingen in menselijke therapieën27,28,29,30. Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) en menselijke embryonale stamcellen (hIC's) naast hNCC's worden beschouwd als betere in vitro celmodellen, waarbij de menselijke fysiologie wordt samengevat. Daarom kunnen hiPSC's- en hIC's- afgeleide neuronen mogelijk ook worden gebruikt als twee alternatieve celbronnen voor neurite uitgroeitest en neurotoxiciteitsbeoordeling, waarbij gebruik wordt gemaakt van het protocol dat hierin1,31wordt gepresenteerd .
Tot slot, een hoog translationeel potentieel en fysiologische relevantie van hNPC's als primaire menselijke cel model biedt een waardevol beroep in neuriet ontgroei-gerelateerde drug discovery screenings en neurotoxiciteit beoordeling opwegen tegen de eerder genoemde beperkingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs geven aan geen potentiële belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door NIMAD onderzoeksbeurs (940714) toegekend aan MAF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | 17504001 | |
| B27 - minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1°C/minute cell freezing in a -80°C freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
| Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
| Heparin | Calbiochem | 375095 | |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
| Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
References
- Sherman, S. P., Bang, A. G. High-throughput screen for compounds that modulate neurite growth of human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
- Al-Ali, H., Beckerman, S. R., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. In vitro models of axon regeneration. Experimental Neurology. 287, 423-434 (2017).
- Kudo, T., et al. Induction of neurite outgrowth in PC12 cells treated with temperature-controlled repeated thermal stimulation. PloS One. 10 (4), 0124024 (2015).
- Higgins, S., Lee, J. S., Ha, L., Lim, J. Y. Inducing neurite outgrowth by mechanical cell stretch. BioResearch Open Access. 2 (3), 212-216 (2013).
- Muramatsu, R., Ueno, M., Yamashita, T. Intrinsic regenerative mechanisms of central nervous system neurons. Bioscience Trends. 3 (5), (2009).
- Read, D. E., Herbert, K. R., Gorman, A. M. Heat shock enhances NGF-induced neurite elongation which is not mediated by Hsp25 in PC12 cells. Brain Research. 1221, 14-23 (2008).
- Finan, G. M., et al. Bioactive Compound Screen for Pharmacological Enhancers of Apolipoprotein E in Primary Human Astrocytes. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1526-1538 (2016).
- Magistri, M., et al. A comparative transcriptomic analysis of astrocytes differentiation from human neural progenitor cells. European Journal of Neuroscience. 44 (10), 2858-2870 (2016).
- Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Research. 993 (1-2), 18-29 (2003).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Neurobehavioural effects of developmental toxicity. The Lancet Neurology. 13 (3), 330-338 (2014).
- Finkbeiner, S., Frumkin, M., Kassner, P. D. Cell-based screening: extracting meaning from complex data. Neuron. 86 (1), 160-174 (2015).
- An, W. F., Tolliday, N. Cell-based assays for high-throughput screening. Molecular Biotechnology. 45 (2), 180-186 (2010).
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507 (2011).
- Ryan, K. R., et al. Neurite outgrowth in human induced pluripotent stem cell-derived neurons as a high-throughput screen for developmental neurotoxicity or neurotoxicity. Neurotoxicology. 53, 271-281 (2016).
- Magistri, M., Velmeshev, D., Makhmutova, M., Faghihi, M. A. Transcriptomics profiling of Alzheimer's disease reveal neurovascular defects, altered amyloid-β homeostasis, and deregulated expression of long noncoding RNAs. Journal of Alzheimer's Disease. 48 (3), 647-665 (2015).
- Darbinyan, A., Kaminski, R., White, M. K., Darbinian, N., Khalili, K. Isolation and propagation of primary human and rodent embryonic neural progenitor cells and cortical neurons. Neuronal Cell Culture. , 45-54 (2013).
- Gil-Perotín, S., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone: a review of the neurosphere assay. The Anatomical Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).
- Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 6 (1), 2 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676 (2012).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43 (1), 25-30 (2007).
- Bagheri, A., et al. HDAC Inhibitors Induce BDNF Expression and Promote Neurite Outgrowth in Human Neural Progenitor Cells-Derived Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1109 (2019).
- Sartor, G. C., et al. Enhancement of BDNF expression and memory by HDAC inhibition requires BET bromodomain reader proteins. Journal of Neuroscience. 39 (4), 612-626 (2019).
- Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319 (2009).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. Journal of Neuroscience Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Developmental neurotoxicity of industrial chemicals. The Lancet. 368 (9553), 2167-2178 (2006).
- Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature reviews Drug Discovery. 7 (8), 659 (2008).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
- Pan, C., Kumar, C., Bohl, S., Klingmueller, U., Mann, M. Comparative proteomic phenotyping of cell lines and primary cells to assess preservation of cell type-specific functions. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (3), 443-450 (2009).
- Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. Journal of Proteome Research. 5 (4), 862-878 (2006).
- Yeo, Y., et al. Human Embryonic Stem Cell-Derived Neural Lineages as In Vitro Models for Screening the Neuroprotective Properties of Lignosus rhinocerus (Cooke) Ryvarden. BioMed Research International. 2019, (2019).
