Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Een Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment met Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons
Summary August 6th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Het gepresenteerde protocol beschrijft een methode voor een neuriet ontgroeiingstest en neurotoxiciteitsbeoordeling van kleine moleculen.
Transcript
Het gepresenteerde protocol beschrijft neurite uitgroeitest die zeer relevant is voor de menselijke biologie en neurotoxiciteit beoordeling van een kleine molecule verbindingen. Een hoog translationeel potentieel en fysiologische relevantie van menselijke neurale voorlopercellen als het primaire menselijke celmodel bieden een aanzienlijk voordeel bij de neuriet-ontgroeigerelateerde drug discovery screening en neurotoxiciteit beoordeling. Gebruik te maken van de gepresenteerde protocol, menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel en menselijke embryonale stamcel-afgeleide neuronen kunnen ook worden gebruikt als alternatieve celbronnen voor de neuriet uitgroeitest en neurotoxiciteit beoordeling.
Begin met het verzamelen van de media met drijvende neurosferen en het overbrengen van het naar een 50 milliliter conische buis. Centrifuge de buis op 300 tot 400 keer g gedurende drie minuten. Dan voorzichtig aspirate de supernatant.
en resuspend de bollen in 500 microliters van ontdooide celdissociatie reagens. Broed de bollen vijf tot 15 minuten in op 37 graden Celsius. Voeg vervolgens vijf tot 10 milliliter voorverwarmde kweekmedia toe en centrifuge de buis op 300 tot 400 keer g gedurende vijf minuten om de neurosferen te besmeuren.
Aspirate de supernatant en voeg twee milliliter van culturele media pipetting op en neer met een 1000 microliter pipet tot de neurosferen vormen een enkele cel suspensie. Na het tellen van de cellen, voeg twee tot 3 miljoen cellen aan een T25 fles in 10 milliliter van cultuur media. Vervang de helft van de cultuurmedia om de drie dagen.
Gebruik commercieel verkrijgbaar cryopreservatiemedium om de cellen te bevriezen. Breng de neurosferen naar een 50 milliliter buis en laat de bollen te vestigen op de bodem. Gebruik een 200 of 1000 microliter pipet tip om de grote neurosferen over te dragen aan een nieuwe 50 milliliter buis voor het passeren.
Centrifugeren de resterende neurosferen op 300 tot 400 keer g gedurende drie minuten en verwijder voorzichtig de supernatant. Resuspend tot duizend bollen in een milliliter cryopreservatie reagens en breng het naar een cryo buis. Bewaar de buis 's nachts op min 80 graden Celsius, dan verplaatsen naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
Als u neuronale uitgroei wilt meten, opent u de afbeelding in Fiji en selecteert u Analyseren, Hulpmiddelen en ROI Manager. Klik met de rechtermuisknop op het vijfde pictogram in de gereedschapsbalk Rechtdoor en schakel over naar Freehand Line. Dubbelklik eventueel op hetzelfde pictogram om de lijnbreedte in 10 te wijzigen.
Dan traceren de langste neuriet begin in de buurt van het cellichaam en zich uitstrekt tot de tip. Druk op Control en T vervolgens F om de meting toe te voegen aan de ROI Manager en het gemeten neuron te markeren. Selecteer alle getallen in de ROI.
Klik op Meten en kopieer en plak de metingen in een spreadsheet. Als u de fluorescentieintensiteit van gelabelde cellen wilt meten, klikt u op het vierde pictogram in de werkbalk Vrije handselecties en tekent u de vorm van de cel. Klik op Metingen analyseren en instellen.
Zorg er vervolgens voor dat Gebied, Gemiddelde grijze waarde, Min max grijswaarde en geïntegreerde dichtheid zijn geselecteerd. Klik op Analyseren en meten. Selecteer het gebied naast de cel als achtergrond.
En klik dan op analyseren en meten. Selecteer alle meetgegevens en kopieer, plak deze in een spreadsheet. Om de plaat te coaten voeg je 30 microliters poly-L-lysine toe in elke put van een 384-put plaat en incubbateer de plaat een uur lang bij kamertemperatuur.
Was het twee keer met PBS en laat het ongeveer 30 minuten drogen. Voeg 30 microliter laminine toe aan elke put en broed de plaat vervolgens twee uur lang uit op 37 graden Celsius. Herhaal de wasbeurten met PBS en ga verder met het plating van de cellen.
Voeg 20.000 eencellige neurosferen in 25 microliter differentiatiemedia toe aan elke put van de 384-put plaat en broed de plaat vijf dagen lang uit op 37 graden Celsius. Hight precisie pipetting vaardigheden zijn nodig voor het plating van het exacte aantal neurosferen dat is allemaal gescheiden in enkele cellen. Daarom wordt het onderscheiden van de neurosferen in neuronen aanbevolen om meer reproduceerbare resultaten te bereiken.
Voeg na de incubatie vijf microliter teststof aan elke put toe met zes keer de gewenste concentratie. En de cellen nog 24 uur uitbroeden. Om de cel levensvatbaarheid essay uit te voeren, voeg 30 microliter van luminescent reagens aan elke put.
En laat de plaat twee minuten op een shaker staan. Centrifugeren de plaat op 300 tot 400 keer g gedurende 30 seconden, dan incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten, het beschermen tegen licht. Meet na de incubatie de luminescentie op een microplatelezer.
De menselijke neurale voorloper cel-afgeleide neuronen werden gebruikt om het effect van HDAC-remmers te onderzoeken als kleine molecuul epigene verbindingen voor de uitbreiding van neurites en de daaropvolgende neurogene vermogen van kleine molecule verbindingen. De neurotoxiciteit van de HDAC-remmers werd ook beoordeeld na het differentiëren van de neurale voorlopercellen in 384-putplaten, waaruit het potentieel bleek om het protocol voor een hoger aantal verbindingen te schalen. In een andere studie werd de meting van de neuronale celfluorescentieintensiteit gebruikt om de overvloed van histone H4 lysine vijf acetylatie te kwantificeren als een histonmarker na de behandeling van de neuronen met epigenetische modifierverbindingen.
Bovendien is dit protocol gebruikt om een pre-synaptisch eiwit, synaptophysine, te visualiseren om te controleren op mogelijke synaptogene effecten van kleine moleculen. Met behulp van de gepresenteerde methode kunnen neurites nummer, intensiteit, lengte en breedte, samen met synaptische kenmerken, waaronder pre- en postsynaptische eiwitmodificaties betrouwbaar worden gemeten.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
CH
DE