Summary
Мы описываем модель гетеротопической трансплантации брюшного сердца у крыс, подразумевающую модификации современных стратегий, которые приводят к упрощению хирургического подхода. Кроме того, мы описываем новую модель отторжения путем инъекций в ухо жизненно важных клеток сердечной мышцы, что позволяет дальнейшей трансплантации иммунологических анализов у крыс.
Abstract
Гетеротопная трансплантация сердца у крыс является широко используемой моделью для различных иммунологических исследований на протяжении более 50 лет. С момента первого описания в 1964 году было сообщено о нескольких изменениях. После 30 лет проведения гетеротопной трансплантации сердца у крыс, мы разработали упрощенный хирургический подход, который можно легко преподавать и выполнять без дальнейшей хирургической подготовки или фона.
После вскрытия восходящей аорты и легочной артерии и перевязки верхних и нижних кавалерийских и легочных вен донорское сердце собирается и впоследствии проникает ледяным сольственным раствором, дополненным гепарином. После зажима и нарезки брюшных сосудов реципиента, восходящая аорта и легочная артерия анастомозируются реципиенту брюшной аорты и нижней полой вены, соответственно, используя непрерывные ходовые швы.
В зависимости от различных комбинаций доноров-реципиентов, эта модель позволяет анализировать острый или хронический отказ аллотрансплантатов. Иммунологическое значение этой модели еще больше усиливается новым подходом инъекций в ухо жизненно важных клеток сердечной мышцы и последующим анализом дренажной лимфатической ткани шейки матки.
Introduction
Гетеротопическая трансплантация сердца является часто используемой экспериментальной моделью для различных исследований, касающихся толерантности к трансплантации, острого и хронического отторжения аллотрансплантата, травмы ишемии-реперфузии, машинной перфузии или ремоделирования сердца. Среди других преимуществ, функция трансплантата может контролироваться неинвазивно пальпации и трансплантата отказ не приводит к жизненному нарушению получателя в отличие от других органов, таких как почки или печень.
В 1964 году Abbott et al. первоначально описали гетеротопическую трансплантацию брюшного сердца у крыс1. Позже, в 1966 году, сквозная техника для анастомос была описана Tomita et al.2. Основы для используемой в настоящее время модели были сообщены Ono и Lindsey в 19693. В течение последних десятилетий, несколько изменений были опубликованы для создания различных типов выгруженных, частично загруженных или загруженных левожелудочковых сердечных трансплантатов, включая комбинированные гетеротопические трансплантации сердца и легких4,5,6. Для иммунологического анализа чаще всего проводится необъемная трансплантация интафтрансплантатий сердца. В этом случае кровоток ретроградно поступает в восходящую аорту донора, а затем и на коронарные артерии. Венозный дренаж происходит вдоль коронарной синусовой синуса в правое предсердие и желудочек(рисунок 1A-B). Таким образом, левый желудочек исключается из кровотока, кроме незначительного количества крови из тебесианских вен. Это также делает его полезной моделью для изучения патофизиологических механизмов во время левого желудочковой терапии вспомогательного устройства7.
Гетеротопическая трансплантация сердца была выполнена в различных видах, включая мышей, кроликов, свиней и даже был использован в качестве одно- или бивентрикулярного устройства помощи у людей8,9,10,11. Крыса по-прежнему представляет собой популярное экспериментальное животное для трансплантации моделей, тем более, что трансплантат выживаемости для различных комбинаций штамма крыс были четко определены в прошлом и большое количество иммунологических реагентов доступны12,13. В отличие от мышей, крысы больше сделать хирургии и доступ к лимфатической ткани для иммунологического анализа более осуществимым12. Кроме того, внедрение коммерческих технологий клонирования у крыс в последние годы, скорее всего, приведет к повторяющейся заинтересованности в экспериментальных крысных моделях14.
В целом, гетеротопные сердечные трансплантаты могут быть прикреплены к сосудам-получателю либо путем выполнения шейного или брюшного анастомоза. Тем не менее, несколько исследований показывают, что бедренный анастомоз облегчает улучшение мониторинга за счет лучшего доступа для ручной пальпации или трансфеморальной эхокардиографии и, таким образом, позволяет более точное обнаружение трансплантата отказа15,16.
Было показано, что нет никакой разницы в отношении времени операции, частота осложнений, результат и время выживания трансплантата между обеими методами анастомоз17. Очевидно, что наличие достаточного количества дренажных лимфатических узлов должно быть упомянуто в качестве преимущества анастомоза шейки матки; однако требуется более длительные периоды обучения. В отличие от этого, анастомоз брюшной полости менее сложен и одинаково ценен для иммунологических исследований, особенно в сочетании с результатами нового метода инъекции в ухо аллогенных клеток сердечной мышцы и последующей лимфаденэктомии шейки матки. Сочетание обеих моделей предлагает широкий спектр постинтервенционных иммунологических анализов.
Следующий протокол относится к операции в парах хирургов, с тем чтобы уменьшить время ишемии. Тем не менее, все эксперименты могут быть выполнены одним человеком. Настройка инструментов и материалов для выделения сердца и имплантации отображается на рисунке 2A-B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все опыты животных были выполнены в соответствии с руководящими принципами местного Совета по этике животных обзор региональных властей по защите прав потребителей и безопасности пищевых продуктов Нижней Саксонии (LAVES, Ольденбург, Германия) с утверждением iDs 12/0768 и 17/2472.
1. Эмплантация сердца и перфузия
ПРИМЕЧАНИЕ: Как доноры трансплантата, женщины или самцы крыс в возрасте 7-22 недель были использованы.
- Анестезия донорской крысы путем вдыхания изофлуран (индукция на 5% и обслуживание на 3% с потоком O2 1 л/мин). Вводят 5 мг карпрофена подкожно на кг массы тела при периоперационной обезболивании и проверяйте отсутствие упорный рефлекс вывода.
- Нанесите глазную смазку и удалите брюшной и грудной мех с помощью механического клипера.
- Поместите донора в положение на спине, зафиксировать конечности у основания оперативного стола эластичными полосами и стерилизовать кожу 70% этанолом или другой достаточной альтернативой.
- Инцежизг кожи в продольном направлении и после применения местной анестезии (например, лидокаин 0,2%) выполнить среднюю лапаротомию с помощью ножниц.
- Вставьте втягивающие, мобилизуем кишечник влево от донора и разоблачите нижнюю полу вены стерилизованные ватные тампоны.
- Для антикоагуляции вводят 500 М.У. гепарина, растворенного в 1 мл ледяного изотонического соливого раствора внутривенно путем прокола нижней вены. Остановить кровотечение в месте прокола легким сжатием с ватным тампоном после опрокидки иглы(рисунок 3A).
- Нарезка диафрагмы и выполнять боковую торакотомию с обеих сторон донора.
- Прикрепите мобилизованную вентральную стенку грудной клетки к оперативному столу.
- Удалите перикард и нерва, тупой подготовки с помощью двух микро-иглы держателей.
- Выполните трансрежур створ брюшной полости для того, чтобы выманить донора и разгрузить сердце.
- Вставьте тупую ветвь зонда, направленную ножницами в трансерс перикардиальной синусик, и разделите восходящую аорту и легочную артерию как можно более дистальную под световой каудальной тягой сердца с мокрым компрессом(рисунок 3B).
- Поместите один 5-0 лигатуры вокруг начальника и нижней полына и легочных вен и затянуть его как дорсальный насколько это возможно (Рисунок 3C).
- Разорвать ткани в дорсаль к лигатуре и извлечь сердце(Рисунок 3D).
- Perfuse explanted сердце с 18 G канюли из внутривенного катетера через восходящую аорту и легочной артерии с 30 мл ледяного льда, изотон солей раствор дополняется 1000 I.U. гепарина и поместить сердце в 15 мл трубки заполнены солистиного раствора на льду (Рисунок 3E-F).
2. Имплантация сердца
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве получателей, 10-14 недель женщины или самцы крыс ы были использованы. Доноры и реципиенты были примерно взвешены.
- Выполните анестезию крысы-реципиента, также используя изофлуранинга (индукция на 5% и обслуживание на 1,5-2% с O2 потока 1 л / мин). Вводят 5 мг карпрофена подкожно на кг массы тела при периоперационной обезболивании и проверяйте отсутствие упорный рефлекс вывода.
- Нанесите глазную смазку, удалите мех живота, зафиксируйте конечности и стерилизуйте кожу аналогично донорской подготовке. Для оптимального послеоперационного результата выполняйте операцию на нагревательном коврике для предотвращения внутриоперационного переохлаждения.
- После продольного разреза кожи нанесите местную анестезию, например лидокаин (0,2%), на брюшную фасцию. Откройте брюшную полость средней лапаротомией и вставьте вставки вставлений.
- Мобилизуйте кишечник на левую верхнюю сторону получателя и поместите его в теплый, смачиваемый компресс.
- После мобилизации двенадцатиперстной кишки и проксимальной геджуны, соответственно, используя хирургический микроскоп (или увеличительные очки) с 5-7-кратным увеличением, разоблачить брюшную аорту и нижнюю полу вены тупой подготовкой с ватными тампонами. Не отделяйте брюшные сосуды.
- Поднимите брюшной сосуды с помощью двух микро держателей иглы, не повреждая поясничные вены и положение Кули сосудистого зажима(рисунок 4A).
- Проколбрюгии брюшные сосуды с 30-45 "арочные 27 G канюли (Рисунок 4B).
- Увеличайте место прокола с помощью ножниц Potts для создания продольного разреза, который соответствует размеру просвета сосудов-доноров(рисунок 4C-D) и наполнить сосуды-получатели сосудами с сольным раствором для того, чтобы удалить сгустки и предотвратить послеоперационный тромбоз.
- Поместите трансплантат в situs и зафиксировать донора восходящей аорты к получателю брюшной аорты двумя простыми прерванными стежками (8-0 монофилат, не отрессорбируемый шов) в черепном и каудальном углу продольного разреза(рисунок 4E).
- Анастомоз восходящей аорты донора с брюшной аортой реципиента бегом 8-0 монофиломент шов в два этапа: во-первых, место трансплантата справа от сосудов получателя и выполнить первую половину анастомоза(рисунок 4E). Затем поместите трансплантат слева от сосудов-получателей и выполните вторую половину анастомоза(рисунок 4F).
- Зафиксировать донорскую легочную артерию на нижнюю полу вены по аналогии с аортальным анастомозом (8-0 монофиментата, неотносимое шов). Шов первой половины венозного анастомоза с внутрилюминной стороны судна(рисунок 4G-H).
- Промыть анастомозы с сольнием непосредственно перед затягиванием узлов, чтобы предотвратить периферической эмболии.
- Поместите гемостатической марли вокруг обоих анастомоза и тщательно отпустите сосудистический зажим Кули, чтобы реперфузия трансплантата может начаться. Обработка кровотечения вдоль анастомоза путем легкого сжатия со стерилизованные ватные тампоны.
ПРИМЕЧАНИЕ: трансплантат должен начать избиение примерно через 60 с. - Замените кишечник меандром, как мода. Убедитесь, что Есть нет malrotations мезентерического радика для предотвращения кишечного некроза или механической обструкции.
- Закройте мышцы живота/ фасции и кожи отдельно с помощью непрерывного 3-0 полифилата работает швы.
3. Послеоперационный уход
- Для послеоперационной обезболивания, поставить получателей с дополнительной подкожной инъекции 5 мг карпрофена на кг веса тела в первый послеоперационный день (POD). Кроме того, добавьте 1 г метамизола к 500 мл питьевой воды до третьего POD.
- Начните мониторинг функции пересадки сердца путем ежедневного пальпации брюшной полости на третьем POD.
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае отказа трансплантата до третьего POD, хирургическая, а не иммунологическая недостаточность должна быть рассмотрена. Однако это, конечно, зависит от выбранной комбинации штамма и соответствующей иммунологической модели (например, гиперострый отторжение после предварительной иммунизации). - После отторжения трансплантата, экстракт тканей, как слив ретроперитонеальных лимфатических узлов черепа анастомозов, селезенки, крови, тимуса и трансплантата для дальнейшего иммунологического анализа с помощью потока цитометрии или иммуногистохимии.
4. Ферментативное пищеварение сердца и подкожная инъекция клеток сердца в ухе
- Выполните эндплантацию сердца и перфузию по аналогии с гетеротопной трансплантацией сердца (см. шаг 1).
- Измельчите сердце в 3 мм х 3 мм блоков с помощью стерильных скальпеля или стерильных ножниц и инкубировать его в течение 30 минут при 37 градусов по Цельсию в культуре среды, содержащей 0,5 мг / мл коллагеназа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать культурную среду, содержащую пенициллин, стрептомицин и глутамин без сыворотки плода теленка (FCS), особенно как FCS подавляет пищеварение коллагеназы. - Добавьте переваренную ткань в крупнопокорное сито, удалив культурную среду и фарш тщательно, чтобы получить приостановку жизненно важных клеток сердечной мышцы, в основном мертвых одиночных клеток сердца и оставшихся кровяных клеток. Дважды вымойте клеточную подвеску стерильным изотоническим сольникным раствором.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки центрифугирования: 10 мин, 200 х г, 20 градусов по Цельсию - Фильтр подвески с помощью 40 мкм ячейки ситечко и собирать жизненно важные клетки congeries путем промывки ячейки ситечко с 5-10 мл изотонического сочного раствора.
- После центрифугации, повторно приостановить клетки сердечной мышцы в солевой раствор растворенный в концентрации 5x105 клеток /мл и обратить раствор клетки в шприц 1 мл.
- Выполните анестезию по аналогии с протоколом, описанным для реципиента наркоза (см. шаг 2) для гетеротопической трансплантации сердца.
- Поместите получателя в боковое положение и зафиксировать ухо пальцем с помощью двусторонней ленты(рисунок 5А).
- Впрысните 20 кл. раствора сердечной мышцы (содержащий 1 х 104 клетки) через 27 G cannula s.c. близко к зрительным сосудам капилляра в ухо получателя(рисунок 5B).
- После определенного периода наблюдения (в зависимости от выбранной комбинации штамма и силы отторжения), извлекайте дренажные лимфатические узлы шейки матки и выполняйте дальнейшие анализы, такие как цитометрия потока или сокультуры(рисунок 5C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, гистологический анализ пинна может быть выполнен для определения проникновения клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В прошлом на основе модели рассматривались различные иммунологические вопросы, которые были проверены в рабочей группе более чем 500 трансплантациями с выживаемостью более 95%13,,18,,19,,20,,21,,22,,23,,24. Общее время работы (включая трансплантацию и имплантацию) обычно не превышало 60 минут, в то время как комбинированное время холодной и теплой ишемии составляло около 30 минут. Применяемые комбинации штаммов были в основном основаны на фоновом режиме Льюиса (Лью). Сингенные трансплантаты просуществовали до 100 дней без признаков трансплантата, но значительного веса и уменьшения размера при пересадке эксплантации. Совсем недавно мы провели гетеротопную трансплантацию сердца в двух различных комбинациях донора-реципиента, имитирующих быструю и длительную модель отторжения: Lew.1a и Lew wt, приводящие к быстрому отторжению (среднее время выживания 7,4 дня) и Lew.1u-7B lew.1a, что приводит к более длительному отказу (среднее время выживания 42,5 дня) (Рисунок 6). Макроскопически отклоненные трансплантаты показали тромбоз, сопровождаемый яростным обесцвечиванием и отеком, в то время как неотклоненные трансплантаты показывают явную атрофию, скорее всего, как следствие разгруженного левого желудочка. Кроме того, мы составили криостатные участки пересаженных сердец для обнаружения инфильтрации клеток с помощью щелочного фосфатазы-антиалкалинового фосфатазы (АПААП) метода окрашивания. Одиночные кадры с 50-кратное увеличение были объединены в одно композитное изображение, что дает обзор полного трансплантата и распределения проникающих ячеек. Гистологический анализ показал повышенное проникновение (например, CD4,TCR, или NKR-P1A/B)иммунных клеток в аллогенных трансплантатов, в то время как сингенные трансплантаты были в значительной степени свободны от инфильтрации клеток(Рисунок 7A-C).
Лицевая лимфаденэктомия и повторная стимуляция анализов дренажных клеток лимфатических узлов после инъекций в ухе клеток сердечной мышцы в вышеупомянутых комбинациях деформации выявили различные штамм-специфические иммунные реакции на аллогенную сердечную ткань и позволили провести дальнейшие иммунологические анализы, такие как профилирование цитокинов(рисунок 8A-C).
Рисунок 1: Схематическое представление сквозных анастомозов и в результате кровотока через сердце. После анастомозирования донора восходящей аорты сквозной к получателю брюшной аорты и аналогично легочной артерии к реципиенту нижней полости вены(A),кровоток поступает в коронарные артерии через восходящую аорту. Венозный дренаж происходит через синус коронарий в правое предсердие и желудочек и через легочную артерию в реципиент нижней полы вены(B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Необходимые хирургические инструменты и материалы. (A) Explantation: 1: эластичная полоса конечностей, 2: ретракторы, 3: 5-0 лигатура, 4: зонд остроконечные ножницы, 5-6: микро держатели иглы, 7: ножницы, 8: хирургические щипцы, 9: микро щипцы, 10: смазка для глаз, 11: компрессы, 12: ватные носки, 13: (B) Имплантация: 1: резинка конечностей, 2: ретракторы, 5-6: микро держатели иглы, 7: ножницы, 8: щипцы, 9: микро щипцы, 10: глазная смазка, 11: компрессы, 12: ватные тампоны, 15: микро ножницы, 16: микро щипцы, 17: Ножницы поттса, 18: держатель иглы, 19: арочные каннулы, 20: Кули сосудистое зажим, 21: 81: швы монофиламента, 22: гемостатический марлю, 23: 3-0 полифилатные швы, 24: Петри блюдо, 25: Карпрофен (5 мг/мл), 26: местная анестезия (лидокаин 0,2%), 27: солевой раствор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Экзплантация сердца. После гепаринизации(A),торакотомия выполняется и восходящая аорта и легочная артерия разорваны как дистальные насколько это возможно (B). С одной лигатуры легочной и обех кавалерийских вен окклюзии (C) и сердце удаляется из грудной полости (D). (E) показывает сердце до и (F) после перфузии с 30 мл соленового раствора, содержащего гепарин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Имплантация сердца. После обустройства брюшных сосудов и размещения сосудистого зажима Кули(А)сосуды канитулируют(B)и продольный разрез выполняется с помощью ножниц Potts(C-D). Донор восходящей аорты фиксируется с одним узлом каждый в черепном и каудальном углу разреза абтимоциста брюшной аорты(E) и анастомоз выполняется непрерывно работает швы (E-F). Обратите внимание, что трансплантат помещается на правой стороне сосудов для первой половины анастомоза(E)и на левую сторону сосудов для второй половины анастомоза(F) и последующего венозного анастомоза. Первая половина венозного анастомоза выполняется внутрилюмительным швом(G). После окончания второй половины венозного анастомоза, трансплантат готов к реперфузии(H). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Инъекция в ухо аллогенных клеток сердечной мышцы. После фиксации уха получателя на пальце с помощью двусторонней лентой (A) аллогенные жизненно важные клетки сердечной мышцы вводятся подкожно близко к зрительным капиллярным сосудам(B). После периода наблюдения слива шейных лимфатических узлов(яп.)извлекаются (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Выживание сердца в различных сингенных и аллогенных комбинациях донора-реципиента. Анализ Kaplan-Meier показывает выживание сингенных (n'10 модель быстрого отторжения; n'5 длительной модели отторжения) и аллогенных трансплантатов (n'11 модель быстрого отторжения; n'14 длительной модели отторжения). В длительной модели отказа шесть из 14 получателей достигли конца периода наблюдения (60 дней) без отказа трансплантата, что привело к длительному выживанию трансплантата в этой группе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Гистологический анализ сингенных и аллогеновых сердечных трансплантатов. (A-B) показать инфильтрацию CD4и клеток с помощью метода окрашивания APAAP в сингенных трансплантата (A) и аллогенный трансплантат при отторжении (B). (C) представляет увеличение инфильтрации клеток в аллогенных трансплантатов по сравнению с сингенных трансплантатов (выступающей в качестве эталонной группы) для различных подмножеств иммунных клеток. Классификация, применяемая для количественной инфильтрации клеток, была изменена с Хиршбургера и др.25:0 - инфильтрация, сравнимая с сингенными трансплантатами; 0,5 - небольшое увеличение окрашенных клеток в изолированных участках тканей; 1 - увеличение сингулярных окрашенных клеток по всей секции тканей; 1.5 - увеличение окрашенных клеточных кластеров, равномерно распределенных по всей секции тканей; 2 - сильный; 2.5 - очень сильный; 3 - сильнейшее увеличение окрашенных клеточных кластеров по всей секции тканей. Гистологические участки трансплантатов были проанализированы с помощью 50-x увеличения. В анализ было включено пять трансплантатов на одну группу (сингенные и аллогенные соответственно). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 8: Анализ дренажных клеток лимфатических узлов после инъекции в ухо аллогенных клеток сердечной мышцы. Специфическая рестимуляция (с 2 х 105 спленоцитов соответствующего донорского штамма) 2 х 105 лимфоцитов, собранных из либо слива шейных или мезентерических лимфатических узлов (LN) быстрого отказа Лью Вт и длительное отклонение Lew.1a получателей показали значительно сократилось распространение слива лимфатических узлов клеток в Lew.1a получателей (A), в то время как пролиферативная способность в целом по-прежнему наблюдаемых после неспецифической стимуляции с CD3/CD28 антитела (B). Удивительно, но профилирование цитокинов выявило увеличение воспалительных цитокинов в лимфатических узлах длительного отторжения реципиентов(C). Результаты представлены как средние - SEM не менее 4 животных на группу. Значение указывается с значением : для p-значений 0,05 и для p-значений 0,0001. (Эта цифра была изменена с Beetz et al.24). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ранее описанный метод гетеротопной сердечной трансплантации у крыс в основном основан на описании Оно и Линдси в 19693. С тех пор было введено несколько модификаций в различных видах, что привело к широкому разнообразию этой модели. Объединяя некоторые из этих модификаций и вводя наш собственный опыт в результате более чем 30 лет выполнения гетеротопических пересадки сердца в лаборатории, мы создали практический хирургический подход, который не требует длительных периодов обучения или хирургического фона. В следующем мы обсудим общие ограничения этой модели и подчеркнеем критические шаги протокола. Кроме того, мы подчеркнем преимущества сочетания гетеротопной трансплантации сердца с новым методом инъекции в ухо клеток сердечной мышцы.
Анестезия и общие осложнения
Хотя было сообщено, что изофлуран анестезии превосходит инъекционную анестезию в отношении раннего выживания после гетеротопической трансплантации сердца, интраоперационная респираторная депрессия по-прежнему представляет собой один из наиболее распространенных осложнений и, таким образом, требует тщательного управления наркозом26. Вместо серийной трансплантации эксплантации и имплантации, соответственно, мы советуем начать подготовку реципиента и брюшной сосуды сразу после торакотомии донорского животного, в частности, потому, что время работы менее одного часа связано с лучшим результатом в отношении трансплантата и выживаемости реципиента26,27. Помимо уже упомянутых осложнений, таких как переохлаждение из-за длительного времени работы и отсутствующих нагревательных ковриков, а также кишечный некроз или обструкция путем нефизиологического размещения кишечника, парез из препятствий конечностей представляет собой еще одно осложнение, которое можно предотвратить путем травматического сосудистого зажима и тщательного промывки анастомозов, чтобы избежать эмболиипериферального 28,29.
Лигатура легочных и кавалерийских вен и осложнений кровотечения
Для того, чтобы уменьшить время теплой ишемии, мы используем одну лигатуру для кавалерийских и всех четырех легочных вен. В качестве возможного осложнения в результате слишком проксимального / вентральное размещение лигатуры, нарушение венозного обратного потока в результате окклюзии синусовой коронарии должен быть упомянут. В случае сильного кровотечения после удаления зажима Кули и видимого избиения трансплантата, лигатура должна быть немедленно проверена на недостаточность. Мы наблюдали этот тип осложнения, особенно если вскрытие легочных вен было выполнено слишком близко к лигатуре при удалении трансплантата из грудной полости. В противном случае, сильное кровотечение в основном вызвано недостаточностью сосудистых анастомозов. Кроме того, коронарная артерия, идущая вдоль восходящей аорты, которая часто разорвана во время эксплантации, описывается как причина смертельного кровотечения при реперфузии27.
Время ишемии и перфузия
Независимо от модели трансплантации, это всегда необходимо, чтобы уменьшить время ишемии, тем более, что сердце рассматривается как уязвимый орган в отношении повреждения ишемии. Выполняя операцию с двумя хирургами, мы можем достичь минимального теплого и холодного ишемического времени и, следовательно, откажитесь от использования кардиоплегических растворов для того, чтобы уменьшить повреждение ишемии-реперфузии30. Как правило, перфузия трансплантата играет ключевую роль и имеет важное значение для охлаждения трансплантата и удаления клеток крови, что может привести к тромбозу или эмболии. В то время как низкое давление перфузии приводит к недостаточной перфузии и, следовательно, к неполному удалению клеток крови, высокое давление перфузии может привести к эндотелиальному повреждению31,32. Мы советуем перфузии легочной артерии, а также восходящей аорты до тех пор, пока коронарные артерии заметно промыть ясно.
Разрез судов-получателей
Критическим шагом в протоколе является разрез сосудов-получателей, не причиняя ущерба сосудам задней стенки: Шмид и др. описал пользу аортомии или venotomy выполнения небольшой поперечной разреза с последующим продольной расширения в черепно-мозговой33и каудальной направленности, что в дальнейшем приводит к снижению скорости стеноза аортозоса3 . В нашей модели, сосуды-получатели проколоты с помощью небольшой канюли. После этого место прокола увеличивается с помощью ножниц Potts для создания продольного разреза. Для лучшей осуществимости, мы рекомендуем изгиб кончика канюли под углом 30-45 ", что приводит к снижению риска повреждения сосудов задней стенки. Мы не наблюдали клинически значимых сосудистых стенозов ни у одного из наших реципиентов. Аналогичные преимущества открытия сосудов получателя путем проколов брюшной аорты и нижней полы вены с канюлей были описаны Шань и др.34.
Освоение модели гетеротопной трансплантации сердца
В течение последнего десятилетия, модель была выполнена исследователями в отделении с небольшим или вообще без хирургического фона. Как уже говорилось выше, мы работаем в парах хирургов, в то время как более опытный исследователь отвечает за обеспечение успеха трансплантации и в то же время постепенное улучшение навыков неопытного исследователя. После короткого периода обучения примерно в десяти трансплантационных выделений и имплантации у мертвых животных, неопытный исследователь отвечает за выполнение эндплантации сердца и оказание помощи имплантации трансплантата примерно у десяти живых животных. Впоследствии неопытный исследователь активно выполняет сосудистые анастомы, так что после примерно десяти дальнейших трансплантаций, бывший неопытный исследователь, как правило, способен выполнять все критические шаги модели.
Применение этой концепции обучения, прошлые публикации из нашего отдела с использованием гетеротопной трансплантации сердца у крыс не показали никаких различий в отношении заболеваемости, смертности или трансплантата функции, несмотря на несколько различных групп хирургов13,18,19,20,21,22,23,24.
Следует отметить, что выполнение сосудистых анастомозов представляет собой наиболее важный шаг в этом протоколе и твердых моделей трансплантации органов в целом. Поэтому мы рекомендуем длительные периоды тренировок с использованием мертвых животных до тех пор, пока анастомоза не будут выполнены точно и быстро, особенно если опытный исследователь не доступен для руководства у живых животных.
Общие преимущества и недостатки модели
В то время как спонтанная индукция толерантности часто описывается как явление при трансплантациипечени,а также наблюдается при трансплантации почек, сердце рассматривается как довольно иммуногенный орган и, таким образом, позволяет надежный отказ в трансплантации модели35,36. Вопреки этим выводам, мы могли бы также заметить долгосрочное выживание и отсутствие отторжения после гетеротопической трансплантации сердца в некоторых комбинациях донора-реципиента, несмотря на полное крупное сложное неравенство в гистосовместимости.
Часто упоминаемый критицизм гетеротопной трансплантации сердца субъективность контролировать трансплантата ручным palpation. Таким образом, модель была расширена до методов бедренной анастомоз для того, чтобы облегчить доступ к пальпации и ввести дополнительные методы мониторинга, такие как трансфеморальная эхокардиография15,16. С другой стороны, Mottram et al. продемонстрировали, что мониторинг трансплантата с помощью пальпации хорошо коррелирует с электрокардиографическими измерениями37. Таким образом, ручная пальпация при гетеротопических пересадках сердца кажется достаточной для мониторинга функции трансплантата в острой модели отторжения.
В результате гетеротопного размещения и разгрузки левого желудочка сердце не функционирует в анатомических или физиологических условиях при условии, что это не влияет на иммунологические анализы. Вопреки этому предположению, было показано, что кардиоремоделирование в результате выгрузки левого желудочка во время левого желудочковой терапии вспомогательного устройства приводит к снижению высвобождения цитокинов38,39. С другой стороны, Тан-Куан и др. описал разгруженную настройку как более подходящий подход для иммунологического анализа, так как долгосрочные ишемические повреждения трансплантата в результате перфузии с частично дезоксигенированной крови в левом желудочковой загруженной модели наблюдалось40.
Хотя брюшное размещение трансплантатов предлагает хирургические преимущества с точки зрения практических, трудно собрать достаточное количество дренажных ретроперитоновых лимфатических узлов при отторжении трансплантата, ухудшающих дальнейший анализ. По этой причине мы внедрили новый метод инъекции в ухо аллогенных клеток сердечной мышцы. Исходя из паразитологических исследований, эта концепция не была применена для иммунологического анализа при трансплантации, несмотря на его осуществимость41,42. Преимуществом этой модели является возможность выявления и сбора значительного количества дренажных лимфатических узлов, что дает возможность проведения комплексного иммунологического анализа. Следует отметить, что обе модели могут быть объединены в одном реципиенте, предлагая дальнейшее понимание механизмов отторжения и толерантности при трансплантации клеток и органов у крыс.
Наши модели трансплантации крысиного сердца и сердечной мышечной клетки представляют собой практический и хорошо изученный подход и могут быть выполнены без дальнейшей хирургической подготовки или фона. Столкнувшись с тем, что новые технологии клонирования для крыс были внедрены и разработаны в последнее время, эти модели предлагают огромные возможности для трансплантации иммунологических исследователей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотим поблагодарить Бритту Траутевиг, Коринну Любберт и Ингрид Медер за их приверженность.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia device (including isoflurane vaporizer) | Summit Anesthesia Solutions | No Catalog Number available | |
| Cannula (27 G) | BD Microlance | 302200 | |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl 50 mg/mL | |
| Cellstar Tubes (15 mL) | GreinerBioOne | 188271 | |
| Cell strainer (40 µm) | BD Falcon | 2271680 | |
| Collagenase Type CLSII | Biochrome | C2-22 | |
| Compresses 5x5 cm | Fuhrmann | 31501 | |
| Compresses 7.5x7.5 cm | Fuhrmann | 31505 | |
| Cotton swabs | Heinz Herenz Medizinalbedarf | 1032128 | |
| Dexpathenol (5 %) | Bayer | "Bepanthen" | |
| DPBS BioWhittaker | Lonza | 17-512F | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD557R | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD313R | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD35 | |
| Heating mat | Gaymar Industries | "T/Pump" | |
| Hemostatic gauze | Ethicon | Tabotamp | |
| Heparin-Natrium 25 000 I.E. | Ratiopharm | No Catalog Number available | |
| Isofluran CP | CP-Pharma | No Catalog Number available | |
| Large-pored sieve (stainless steel) | Forschungswerkstätten Hannover Medical School | No Catalog Number available | |
| Lidocaine | Astra Zeneca | 2 % Xylocain | |
| Metamizol-Natrium | Ratiopharma | Novaminsulfon 500 mg/mL | |
| Micro forceps | B. Braun | Aesculap BD3361 | |
| Micro needle holder | Codman, Johnson & Johnson Medical | Codmann 80-2003 | |
| Micro needle holder | B. Braun | Aesculap BD336R | |
| Micro needle holder | B. Braun | Aesculap FD241R | |
| Micro scissors | B. Braun | Aesculap FD101R | |
| Micro scissors | B. Braun | Aesculap FM471R | |
| Needle holder | B. Braun | Aesculap BM221R | |
| Penicillin/Streptomycin/Glutamine (100x) | PAA | P11-010 | |
| Peripheral venous catheter (18 G) | B. Braun | 4268334B | |
| Peripheral venous catheter (22 G) | B. Braun | 4268091B | |
| Probe pointed scissors | B. Braun | Aesculap BC030R | |
| Retractors | Forschungswerkstätten Hannover Medical School | No Catalog Number available | |
| RPMI culture medium | Lonza | BE12-702F | |
| Saline solution (NaCl 0.9 %) | Baxter | No Catalog Number available | |
| Scissors | B. Braun | Aesculap BC414 | |
| Surgical microscope | Carl-Zeiss | OPMI-MDM | |
| Sutures (anastomoses) | Catgut | Mariderm 8-0 monofil | |
| Sutures (ligature) | Resorba | Silk 5-0 polyfil | |
| Sutures (skin, fascia) | Ethicon | Mersilene 3-0 | |
| Syringe (1 mL) | B. Braun | 9166017V | |
| Syringe (10 mL) | B. Braun | 4606108V | |
| Syringe (20 mL) | B. Braun | 4606205V | |
| Vascular clamp | B. Braun | Aesculap FB708R |
References
- Abbott, C. P., et al. A Technique for Heart Transplantation In the Rat. Archives of Surgery. 89 (4), 645-652 (1964).
- Tomita, F.
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).
- Wen, P., et al. A simple technique for a new working heterotopic heart transplantation model in rats. Transplantation Proceedings. 45 (6), 2522-2526 (2013).
- Benke, K., et al. Heterotopic abdominal rat heart transplantation as a model to investigate volume dependency of myocardial remodeling. Transplantation. 101 (3), 498-505 (2017).
- Kearns, M. J., et al. Rat Heterotopic Abdominal Heart/Single-lung Transplantation in a Volume-loaded Configuration. Journal of Visualized Experiments. (99), 52418 (2015).
- Ibrahim, M., et al. Heterotopic abdominal heart transplantation in rats for functional studies of ventricular unloading. The Journal of Surgical Research. 179 (1), e31-e39 (2013).
- Liu, F., Kang, S. M.
- Lu, W., et al. A new simplified volume-loaded heterotopic rabbit heart transplant model with improved techniques and a standard operating procedure. Journal of Thoracic Disease. 7 (4), 653-661 (2015).
- Kitahara, H., et al. Heterotopic transplantation of a decellularized and recellularized whole porcine heart. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 22 (5), 571-579 (2016).
- Kadner, A., et al. Heterotopic heart transplantation: experimental development and clinical experience. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 17 (4), 474-481 (2000).
- Zinöcker, S., et al. Immune reconstitution and graft-versus-host reactions in rat models of allogeneic hematopoietic cell transplantation. Frontiers in Immunology. 3 (NOV), 1-12 (2012).
- Klempnauer, J., et al. Genetic control of rat heart allograft rejection: effect of different MHC and non-MHC incompatibilities. Immunogenetics. 30, 81-88 (1989).
- Huang, G., et al. Genetic manipulations in the rat: Progress and prospects. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (4), 391-399 (2011).
- Gordon, C. R., et al. Pulse doppler and M-mode to assess viability of cardiac allografts using heterotopic femoral heart transplantation in rats. Microsurgery. 27 (4), 240-244 (2007).
- Gordon, C. R., et al. A new modified technique for heterotopic femoral heart transplantation in rats. The Journal of Surgical Research. 139 (2), 157-163 (2007).
- Ma, Y., Wang, G. Comparison of 2 heterotopic heart transplant techniques in rats: cervical and abdominal heart. Experimental and Clinical Transplantation. 9 (2), 128-133 (2011).
- Bektas, H., et al. Differential effect of donor-specific blood transfusions after kidney, heart, pancreas, and skin transplantation in major histocompatibility complex-incompatible rats. Transfusion. 37 (2), 226-230 (1997).
- Saiho, K. O., et al. Long-term allograft acceptance induced by single dose anti-leukocyte common antigen (RT7) antibody in the rat. Transplantation. 71 (8), 1124-1131 (2001).
- Bektas, H., et al. Blood transfers infectious immunologic tolerance in MHC-incompatible heart transplantation in rats. Journal of Heart and Lung Transplantation. 24 (5), 614-617 (2005).
- Jäger, M. D., et al. Sirolimus promotes tolerance for donor and recipient antigens after MHC class II disparate bone marrow transplantation in rats. Experimental Hematology. 35 (1), 164-170 (2007).
- Timrott, K., et al. Application of allogeneic bone marrow cells in view of residual alloreactivity: Sirolimus but not cyclosporine evolves tolerogenic properties. PLoS ONE. 10 (4), 1-16 (2015).
- Hadamitzky, M., et al. Memory-updating abrogates extinction of learned immunosuppression. Brain, Behavior, and Immunity. 52, 40-48 (2016).
- Beetz, O., et al. Recipient natural killer cells alter the course of rejection of allogeneic heart grafts in rats. Plos One. 14 (8), e0220546 (2019).
- Hirschburger, M., et al. Nicotine Attenuates Macrophage Infiltration in Rat Lung Allografts. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 28 (5), 493-500 (2009).
- Ruzza, A., et al. Heterotopic heart transplantation in rats: improved anesthetic and surgical technique. Transplantation Proceedings. 42 (9), 3828-3832 (2010).
- Wang, D., et al. A simplified technique for heart transplantation in rats: abdominal vessel branch-sparing and modified venotomy. Microsurgery. 26 (6), 470-472 (2006).
- Wang, C., et al. A modified method for heterotopic mouse heart transplantion. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).
- Al-Amran, F. G., Shahkolahi, M. M. Total arterial anastomosis heterotopic heart transplantation model. Transplantation Proceedings. 45 (2), 625-629 (2013).
- Hoerstrup, S. P., et al. Modified technique for heterotopic rat heart transplantation under cardioplegic arrest. Journal of Investigative Surgery. 13 (2), 73-77 (2000).
- Fry, D. L. Acute vascular endothelial changes associated with increased blood velocity gradients. Circulation Research. 22 (2), 165-197 (1968).
- Ahmadi, A. R., et al. Orthotopic Rat Kidney Transplantation: A Novel and Simplified Surgical Approach. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
- Schmid, C., et al. Successful heterotopic heart transplantation in rat. Microsurgery. 15 (4), 279-281 (1994).
- Shan, J., et al. A modified technique for heterotopic heart transplantation in rats. Journal of Surgical Research. 164 (1), 155-161 (2010).
- Moris, D., et al.
- Bickerstaff, A. A., et al. Murine renal allografts: spontaneous acceptance is associated with regulated T cell-mediated immunity. Journal of Immunology. 167 (9), 4821-4827 (2001).
- Mottram, P. L., et al. Electrocardiographic monitoring of cardiac transplants in mice. Cardiovascular Research. 22 (5), 315-321 (1988).
- Torre-Amione, G., et al. Decreased expression of tumor necrosis factor-α in failing human myocardium after mechanical circulatory support: A potential mechanism for cardiac recovery. Circulation. 100 (11), 1189-1193 (1999).
- Goldstein, D. J., et al. Circulatory resuscitation with left ventricular assist device support reduces interleukins 6 and 8 levels. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (4), 971-974 (1997).
- Tang-Quan, K. R., et al. Non-volume-loaded heart provides a more relevant heterotopic transplantation model. Transplant Immunology. 23 (1-2), 65-70 (2010).
- Lakhal-Naouar, I., et al. Transcutaneous immunization using SLA or rLACK skews the immune response towards a Th1 profile but fails to protect BALB/c mice against a Leishmania major challenge. Vaccine. 37 (3), 516-523 (2019).
- Sousa-Batista, A. J., et al. Novel and safe single-dose treatment of cutaneous leishmaniasis with implantable amphotericin B-loaded microparticles. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. , (2019).
