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Developmental Biology

근접 결찰 분석술을 사용하여 C. 예쁜꼬마선에서 리보뉴클레오 단백질 복합어셈블리의 시투 검출

Published: May 5, 2020 doi: 10.3791/60982
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Biological Sciences, University of Montana

Summary

이 프로토콜은 C. elegans 생식선에서 의한 체르메게에서 단백질-단백질 상호작용을 조사하기 위한 근접 결찰 분석법의 사용을 입증한다.

Abstract

단백질 단백질 상호 작용 (PPIs)가 발생하는 시기와 위치를 이해하는 것은 세포에 있는 단백질 기능을 이해하고 발달과 같은 더 넓은 프로세스가 어떻게 영향을 받는지 이해하는 것이 중요합니다. Caenorhabditis 예쁜꼬마선충은 줄기 세포, 남성 분열 및 발달의 조절과 관련된 PPI를 연구하기위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 관심 있는 단백질이 표준 항체에 의해 인식을 위해 태그될 수 있도록 하는 다양한 잘 개발된 기술이 있으며, 이 시스템은 근접 결찰 분석(PLA) 반응에 유리합니다. 그 결과, PLA는 PPI가 다른 접근법보다 더 효과적으로 생식선에서 공간적 및 시간적 방식으로 발생하는 위치를 보여줄 수 있다. 여기서 설명된 것은 C. elegans 생식선에서 PPI를 프로브하기 위한 이 기술의 적용 및 정량화를 위한 프로토콜이다.

Introduction

단백질의 80% 이상은 세포2에있는 특정 생물학 기능의 실행에 PPI가 얼마나 중요한지 강조하는 그밖 분자1와상호 작용이 있기 위하여 추정됩니다. 몇몇 단백질은 세포 생존을 위해 필요한 더 큰 복합물의 집합을 촉진하는 허브로작동합니다 1. 이 허브는 다중 PPI를 중재하고 세포3에있는 특정 기능을 용이하게 하는 네트워크로 단백질을 구성하는 것을 돕습니다. 단백질 복합체의 형성은 또한 특정 상호 작용하는 파트너의 존재 또는 부재와 같은 생물학적 맥락에 의해 영향을 받습니다4,세포 신호 이벤트, 및 세포의 발달 단계.

C. 예쁜꼬마선충은 일반적으로 발달을 포함한 다양한 연구를 위한 모델 유기체로서 사용된다. 이 동물의 간단한 해부학은 고나드, 창자 및 투명 표피를 포함한 여러 장기로 구성되어 있어 웜 발달 분석을 용이하게합니다. gonad에 있는 생식선은 배아로 발전하고 결국 자손의 다음 세대로 발전하는 gametes5로 어떻게 생식선 줄기 세포가 성숙하는지 공부하는 중대한 공구입니다. 생식선의 말단 팁 영역은 자가 갱신 줄기 세포의 풀을 포함합니다(그림 1). 줄기 세포가 틈새 시장을 떠날 때, 그들은 meiotic pachytene로 진행하고 결국 젊은 성인 단계에서 oocytes로 발전합니다(그림 1). 생식선에서의 이러한 발달 프로그램은 RNA 결합 단백질(RBPs)에 의해 촉진된 전사 후 조절 네트워크를 포함하는 상이한 메커니즘을 통해 엄격하게 조절된다6. PP는 RBP가 다른 보조 인자와 연결하여 기능을 발휘하기 때문에 이러한 규제 활동에 중요합니다.

웜에서 PPI를 검색하는 데 사용할 수 있는 몇 가지 방법이 있지만 각 방법에는 고유한 제한이 있습니다. 생체 내 면역 침전 (IP)은 전체 웜 추출물에서 단백질 단백질 복합체를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 이 방법은 웜에서 PPI가 발생하는 위치를 나타내지 않습니다. 또한, 단백질 복합체는 특정 발달 단계 또는 제한된 수의 세포에서 일시적이며 단지 형성되는 단백질 복합체는 공동 면역 침전에 의해 회복되기 어려울 수 있다. 마지막으로, IP 실험은 친화성 매트릭스상에서 단백질의 용해 및 비특이적 보존 후 단백질 복합 재분류에 대한 우려를 해결해야 합니다.

PPI의 구내 검출에 대한 대안적 접근법은 공동 면역 염색, Förster 공명 에너지 전달(FRET), 및 이중 분자 형광 보완(BiFC)이다. 공동 면역 염색은 고정 된 웜 조직에서 관심있는 두 단백질의 동시 검출및 신호 동국화 의 정도 측정에 의존합니다. 표준 현미경 검사법7보다더 자세한 정보를 제공하는 초고해상도 현미경 검사법을 사용하면 200-300 nm8의회절 제한 장벽을 넘어 단백질 공동 국소화를 보다 엄격하게 테스트하는 데 도움이됩니다. 그러나, 기존의 및 초고해상도 현미경 검사법을 모두 사용하는 공동 면역 염색은 잘 정의된 국소화 패턴을 가진 단백질에 가장 적합합니다. 반대로 분산된 상호 작용 파트너에게는 훨씬 덜 유익합니다. 중첩에 기초한 신호의 공동 국소화를 위한 측정은 단백질이 서로 복잡한지 에 대한 정확한 정보를 제공하지 않습니다9,,10.

더욱이, 단백질 단백질 복합체의 공동 면역 침전 및 공동 면역 염색은 양이 아니므로 그러한 상호 작용이 중요한지 결정하기가 어렵습니다. FRET와 BiFC는 모두 형광 기반 기술입니다. FRET는 하나의 FP(공여자)로부터의 에너지가 다른FP(acceptor)(acceptor)(acceptor)(11)로이송되는 스펙트럼 이중되는 형광 단백질(FPs)을 가진 관심 단백질의 태그 지정에 의존한다. 이러한 비방사성 에너지 전달은 각각의 방출 파장에서 검출될 수 있는 수용기 FP의 형광을 초래한다. BiFC는 생체 내 형광 단백질의 재구성을기반으로합니다. 그것은 두 개의 상보적인 단편으로 GFP를 분할 수반, 나선 등 1-10 그리고 나선 1112,다음 관심의 두 단백질에 융합. 이 두 단백질이 상호 작용하는 경우에, GFP의 상보적인 단편은 GFP 불소를 재구성하는 접고 집합하기에 충분히 가깝게 됩니다. 재구성된 GFP는 형광으로 직접 관찰되고 PPI가 발생한 위치를 나타냅니다.

따라서, FRET와 BiFC 둘 다 태그된 단백질의 기능을 방해할 수 있는 큰 형광 태그에 의존합니다. 또한, FRET 및 BiFC는 정확한 데이터를 얻기 위해 태그가 지정된 단백질의 풍부하고 유사한 발현을 필요로 한다. FRET는 한 파트너가 다른 파트너를 초과하는 실험에 적합하지 않을 수 있으며, 이는 높은 배경13으로이어질 수 있습니다. BiFC 실험에서과발현은 배경이 증가하는 비특이적어셈블리(14)를 유도할 수 있기 때문에 피해야 한다. 두 기술 모두 태그가 지정된 단백질의 발현 및 이미징 조건의 최적화를 필요로 하며, 이는 실험을 완료하는 데 필요한 시간을 연장할 수 있습니다.

근접 결찰 분석법(PLA)은 위에서 언급한 기술의 한계를 해결할 수 있는 대안적인 접근법이다. PLA는 관심 있는 단백질(또는 그들의 꼬리표)을 인식하는 1차 항체를 이용한다. 이들 1차 항체는 40 nm(또는 더 짧은) 거리15내에 있을 때 서로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 함유하는 이차 항체에 의해 결합된다. 생성된 혼성화된 DNA는 DNA를 보완하는 프로브에 의해 검출되는 PCR 반응을 통해 증폭됩니다. 이것은 현미경에 의해 구상되는 초점에서 유래합니다. 이 기술은 복잡한 조직 (즉, 웜 고나드)에서 현장에서 PPI를 감지 할 수 있으며, 이는 다양한 개발 및 분화 단계에서 세포를 포함하는 조립 라인으로 구성됩니다. PLA를 사용하면 PPI가 고정 된 웜 고나드에서 직접 시각화 될 수 있으며, 이는 특정 개발 단계에서 PPI가 발생하는지 여부를 조사하는 데 유리합니다. PLA는 정확한 측정에 이상적인 공동 현지화 기반 분석에 반대되는 PPI의 더 큰 분해능을 제공합니다. 사용 하는 경우, 초고해상도 현미경 세포 내에서 PLA 초점의 위치에 대 한 더 미세한 세부 정보를 제공할 가능성이 있다. 또 다른 장점은 PLA 반응으로 인한 초점을 ImageJ 기반 분석 워크플로우에 의해 계산할 수 있어 이 기술을 정량적으로 만들 수 있다는 것입니다.

다인 경쇠의 LC8 제품군은 먼저 다인 모터 컴플렉스16의 소단위로 설명되었고 화물 어댑터역할을 하도록 가설되었다. 초기 발견 이후, LC8은 다인 모터 복합체 이외에 다중 단백질 복합체에서 발견되었으며17,,18,,19,,20. LC8 상호작용모티프(19)를 포함하는 단백질 서열을 스캐닝하는 것은 LC8이 다양한 단백질17,18,,19,,20,,21,,22와많은 상호작용을 가질 수 있음을 시사한다., 그 결과, LC8 패밀리 단백질은 이제 본질적으로 무질서한 단백질21의조립체와 같은 더 큰 단백질 복합체19,,22의조립을 촉진하는 데 도움이 되는 허브로 간주된다.

하나의 C. elegans LC8 패밀리 단백질, 다인 경막-1(DLC-1)은 많은 조직에 걸쳐 널리 발현되며 특정 세포내구조(23,,24)에서농축되지 않는다. 따라서, C. 예쁜꼬마선충에서 DLC-1의 생체 내 파트너의 생물학적으로 관련성이 있는 식별은 여러 가지 이유로 도전적입니다: 1) 공동 면역 침전은 상호작용이 발생하는 조직 공급원을 나타내지 않는다; 2) 특정 파트너 또는 일시적인 상호 작용의 제한된 발현은 공동 면역 침전에 의한 상호작용을 검출하는 능력을 방해할 수 있다; 및 3) DLC-1의 확산 분포는 공동 면역 염색에 의해 잠재적인 파트너 단백질과 비특이적 중첩을 유도한다. 이러한 과제를 바탕으로 PLA는 DLC-1과의 생체 내 상호 작용을 테스트하기 위한 이상적인 접근 방식입니다.

이전에는 DLC-1이 RNA 결합 단백질(RBPs) FBF-223 및 GLD-125와직접 상호 작용하고 보조 인자역할을 한다는 것이 보고되었다. 우리의 일은 허브 단백질로 봉사하는 DLC-1의 모형을 지원하고 DLC-1이 dynein19,,22를넘어 서 상호 작용 네트워크를 용이하게 한다는 것을 건의합니다. GST 풀다운 분석을 사용하여 OMA-1이라는 새로운 DLC-1 상호 작용 RBP가26으로확인되었습니다. OMA-1은 난모세포 성장 및 meiotic성숙(27)과 다수의 번역억제기 및활성제(28)와함께 기능하는 데 중요하다. FBF-2 및 GLD-1은 줄기 세포 및 메오틱 파키텐 영역에서 각각 발현되는 반면, OMA-1은 난모세포27(도 1)을통해 메오틱 파키텐으로부터 생식선으로 확산발된다.1.1. 이것은 DLC-1이 고나드의 다른 지역에 있는 RP를 가진 복합체를 형성한다는 것을 건의합니다. 또한 시험관 내에서 관찰된 DLC-1과 OMA-1 사이의 직접적인 상호작용이 생체 내 IP에 의해 회복되지 않는다는 것이 밝혀졌다. PLA는 C. elegans 생식선에서 이 상호 작용을 추가로 연구하기 위한 대체 접근법으로 성공적으로 사용되었으며, 결과는 PLA가 웜의 다른 많은 PPI를 조사하는 데 사용될 수 있음을 시사한다.

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Protocol

참고: 이 프로토콜은 잠재적인 상호 작용 파트너가 모두 태그가 지정된 C. elegans 균주를 사용합니다. 하나의 태그된 단백질이 다른 태그가 지정된 후보 상호 작용 파트너와 상호 작용할 것으로 예상되지 않는 음성 대조군 균주를 사용하는 것이 좋습니다. 여기서, GFP 만이 배경을 평가하기 위한 부정적인 대조군으로 사용되었으며, DLC-1은 웜에서 GFP와 상호 작용할 것으로 예상되지 않는다. GFP 태그가 있는 OMA-1은 실험균주로서 사용되었으며, 예비 데이터는 DLC-1과의 상호작용을 시사한다. 3xFLAG 태그DLC-1을 가진 대조군 및 시험 단백질을 공동 발현하는 선충 균주는 이 텍스트에서 3xFLAG::DLC-1로 지칭된다; GFP 및 3xFLAG: :DLC-1; OMA-1::GFP (요청 시 사용 가능한 균주, 재료 표에더 많은 정보), 각각. 여기서 는 3xFLAG 및 GFP 태그가 사용됩니다. 그러나, 그들의 항체가 PLA 키트 시약과 호환되는 한 다른 태그는 대체될 수 있다.

1. 동물 관리

  1. 대장균의 OP50 균주와 함께 시드되는 선충 성장 배지 (NGM) 플레이트에 벌레를 유지하고 GFP의 최적의 발현을 위해 24 °C에서 유지합니다.
  2. 통로 성인 벌레는 웜을 전파하고 잘 먹이를 유지하기 위해 2-3 일마다.

2. 동기 문화준비

  1. 잘 먹이, gravid hermaphrodites의 접시를 표백하여 벌레를 동기화합니다. 표백 프로토콜은 포르타 드 라 리바 외29에기재되어 있다. 배아가 M9 최소 매질(M9) 버퍼의 10 mL에서 끝을 회전시키면서 24°C에서 원심분리관에서 하룻밤 동안 부화하게 한다. 이것은 체포 된 L1 애벌레의 문화를 생산할 것입니다.
  2. 체포 된 L1 단계 유충의 튜브를 얼음에 10 분 동안 인큐베이션 한 다음 얼음 차가운 1x M9로 튜브를 위로 합니다.
  3. 원심분리기를 사용하여 유충을 600 x g에서 4°C에서 5분 동안 펠트합니다. 상급자 만 1-2 mL이 남아 있도록 조심스럽게 상류를 흡인합니다.
  4. 유충의 펠릿을 다시 중단하고 마이크로파이펫을 사용하여 부유 유충 배양액의 2 μL을 유리 슬라이드로 옮김을 옮김을 옮김을 이월한다. 2.5단계에서 벌레의 파종을 안내하는 데 도움이 될 애벌레 배양의 밀도를 결정하기 위해 얼마나 많은 애벌레가 존재하는지 계산합니다.
    참고 : 10-15 L1 유충 / 1 μL의 밀도는 파종에 적합합니다.
  5. 마이크로파이펫을 사용하여 60 mm OP50 플레이트상에서 약 100-120 L1 단계 유충을 종화하는 데 필요한 유충 배양량을 전달한다. 예를 들어, 배양물의 밀도가 10 L1 유충/1 μL의 유충 배양물의 종자 10 μL.
    참고 : 애벌레를 종화하기 위해 40 μL의 부피를 초과하지 마십시오, 또는 과잉 액체는 OP50 잔디를 방해합니다. 배양량이 40 μL을 초과하는 경우, 2.3-2.4 단계를 반복하여 부피를 더욱 줄이고 유충 배양밀도를 증가시다.
  6. 24 °C에서 벌레를 성장. L1s가 플레이트에 시드되는 시간을 기록하고 주기적으로 개발 단계를 확인하여 해부를 위한 이상적인 시간을 확인합니다.
    참고 : L1s의 파종 후 52 시간에서, 24 °C에서 배양 된 벌레는 일반적으로 젊은 성인 단계에 있으며, 이는 고나드 표적 PLA에 대한 해부에 이상적인 단계입니다. 그러나, 동기화된 벌레가 젊은 성인 단계에 도달하는 실제 시간은 긴장과 배양 온도 사이에서 변화할 수 있습니다.

3. 해부/고나드 압출

참고 : 고나드를 돌출하는 해부는 성공적으로 작동하기 위해 고나드 표적 PLA가 필요합니다. 이 접근법은 또한 PLA를 위해 이 프로토콜을 사용하여 작동하는 배아를 풀어 놓을 수 있습니다 (자세한 내용은 토론 참조). 해부 후, 음의 대조군과 실험 샘플은 모두 고정되고 PLA에 대해 병렬로 처리됩니다. 또한 관심 있는 단백질 파트너의 발현 패턴을 입증하기 위해 형광 공동 면역염색(23)의 목적을 위해 추가적인 샘플 세트를 제조할 것을 제안한다.

  1. 30-40명의 젊은 성인 벌레를 1x M9 + 레바미솔(최종 농도 2.5m)의 500 μL이 들어 있는 시계 유리 접시에 넣습니다. 벌레를 수집 한 후, 조심스럽게 제거하고 웜과 함께 전송되는 박테리아를 제거하기 위해 미디어의 대부분을 폐기.
  2. 신선한 500 μL의 1x M9 + levamisole를 추가하고 파이펫을 사용하여 부드럽게 그려서 미디어를 분배하여 웜을 헹구십시오. 조심스럽게 제거하고 벌레와 함께 전송되는 박테리아를 취소하기 위해 미디어의 대부분을 폐기.
    1. 모든 박테리아가 제거 될 때까지이 단계를 2x-3x 반복합니다. 세스가 완료된 후, 약 100 μL의 용지에 벌레를 두어 수분을 유지하십시오.
      참고 : 해부 중에 생식선의 압출을 손상시킬 수 있으므로 웜이 7 분 이상 미디어에 앉아 있지 않도록하십시오. 해부 현미경의 도움으로 세탁을 수행하여 벌레가 손실되지 않도록 미디어 제거를 모니터링합니다.
  3. 유리 또는 폴리에틸렌 파이펫을 사용하여 0.001 % 폴리 L-리신으로 코팅 된 25mm x 75mm 현미경 슬라이드로 웜을 옮깁니다 (이 절차에 사용되는 슬라이드는 에폭시 코팅 둘레를 가지며 3 개의 작업 공간, 14mm x 14mm 각각을 남깁니다). 약 10-15 μL의 용지가 남아 있도록 여분의 미디어를 제거합니다.
  4. 해부 현미경의 도움으로 두 개의 261/2 게이지 바늘을 사용하여, 끝이 가위 쌍을 형성할 수 있도록 다른 위에 한 바늘을 놓습니다. 이 방식으로 지향 바늘을 사용하여, 세균을 해제하기 위해 인두 뒤에 벌레를 잘라. 5분 이내에 모든 웜을 해부합니다.
    참고 : 해부를 수행하는 방법에 대한 자세한 내용은 Gervaise와 Arur30에의해 이전 출판물에서 찾을 수 있습니다.
  5. 모든 웜이 해부된 후 슬라이드에 수직이 되도록 슬라이드 위에 22mm x 40mm 커버슬립을 부드럽게 놓습니다. 커버 슬립의 끝은 슬라이드를 끊어야합니다.
  6. 드라이 아이스에 보관된 미리 차가운 알루미늄 블록에 슬라이드를 20분 이상 고정합니다.

4. 고정/차단

  1. 고정준비가 되면 연필이나 다른 무딘 모서리 도구로 커버슬립을 벗겨내고, 신선한 얼음으로 차가운 메탄올(-20°C까지 냉각)이 들어있는 항아리에 즉시 1분 간 담급니다.
  2. 다음 시약이 샘플 주위의 표면 장력에 의해 유지되도록 샘플을 둘러싼 슬라이드의 가장자리를 부드럽게 닦습니다. RT에서 5분 동안 150 μL의 고착제(100 mM KH2PO4, pH = 7.2)에서 2% 포름알데히드를 적용합니다.
    참고 : 우리는 또한 메탄올 / 아세톤 고정 절차31,,32를 테스트하고 PLA 반응과 호환되는 것으로 나타났습니다.
  3. 슬라이드를 수직으로 종이 타월로 터치하여 90° 각도로 고정이 슬라이드에서 실행되고 종이 타월로 흡수되도록 합니다. 블록 슬라이드 25 코플린 항아리에서 15 분 동안 1x PBS / 1 % 트리톤 X-100 / 1 % 소 혈청 알부민 (PBT / BSA)의 50 mL.
    참고 : 코플린 항아리 또는 염색 항아리의 다른 유형은이 차단 단계와 섹션 6-9에서 아래의 세척 단계에 권장됩니다. 이들은 샘플과 차단 또는 세척 버퍼의 효율적인 교환을위한 충분한 볼륨을 제공합니다.
  4. 10% 일반 염소 세럼을 함유한 PBT/BSA 용액으로 슬라이드를 차단합니다. 슬라이드를 둘러싼 가장자리를 부드럽게 닦고 100 μL의 용액을 슬라이드에 적용합니다. 습한 챔버에서 RT에서 1 시간 동안 배양하십시오.
    참고: 이 단계는 αFLAG 1차 항체로 염색하는 데 적극 권장됩니다. 습한 챔버는 슬라이드가 배양될 때 놓을 수 있도록 트레이에 테이프로 유리 파이펫을 고정하여 구성됩니다. 증발을 방지하기 위해 트레이의 내부 습도를 높이기 위해 트레이에 적신 작업 와이프(재료 표)를배치합니다. 뚜껑과 트레이는 빛에 민감한 단계에서 빛으로부터 샘플을 보호하기 위해 호일로 덮여 있습니다.
  5. 종이 타월에 슬라이드를 놓아 PBT/BSA/10% NGS 용액이 슬라이드에서 실행되고 슬라이드 가장자리를 부드럽게 닦을 수 있습니다. 차단시약(재질 표)을사용하여 슬라이드를 차단합니다. 14mm x 14mm 공간에 한 방울 을 바하십시오. 습한 챔버에서 37 °C에서 1 시간 동안 배양 슬라이드.

5. 1 차 항체 배양

참고: 최상의 PLA 결과 및 최소한의 배경을 얻으려면, 1차 항체의 희석 인자는 최적화가 필요할 수 있다(자세한 내용은 토론 참조). 부가적으로, 1차 항체는 PLA에 사용되는 이차 항체의 특이성과 일치하는 상이한 숙성에서 제기되어야 한다.

  1. 종이 타월에 슬라이드를 놓아 차단 시약이 슬라이드에서 실행되도록 하고 가장자리를 부드럽게 닦아냅니다. 1차 항체를 희석시키기 위해희석항체(물자 표)를사용한다. 14 mm x 14 mm 공간당 40 μL의 1 차 항체 솔루션을 적용하십시오.
  2. 4°C에서 습한 챔버에서 밤새 인큐베이팅 슬라이드.

6. PLA 프로브 (이차 항체) 배양

참고: 6-9단계의 경우 RT에서 세척 버퍼 A와 B를 사용하십시오. 버퍼가 4 °C에 저장되면 사용하기 전에 RT로 따뜻하게하십시오.

  1. 코플린 병에 RT에서 50 mL의 1 x 세척 버퍼 A(재료 표)로5 분 동안 2 x를 씻으십시오. 코플린 항아리를 60rpm으로 설정된 궤도 셰이커에 놓습니다.
  2. 종이 타월에 슬라이드를 놓아 세탁 버퍼가 슬라이드에서 흘러 나오도록 하고 가장자리를 부드럽게 닦아냅니다. PLUS 및 MINUS 프로브를 함유하는 40 μL 용액을 준비합니다(항체 희석제로 1:5 희석). 각 14mm x 14mm 공간에 솔루션을 적용합니다.
  3. 37 °C에서 1 시간 동안 습한 챔버에서 슬라이드를 인큐베이트합니다.

7. 결찰

  1. 코플린 항아리에 RT에서 50 mL의 1 x 세척 버퍼 A로 5 분 동안 2 x슬라이드를 씻으십시오. 코플린 항아리를 60rpm으로 설정된 궤도 셰이커에 놓습니다.
  2. 결찰 완충제(재료 표)1:5를 초순수로 희석합니다. 이 완충액을 사용하여 리가제(물자표)1:40을 희석하여 결찰 용액의 작업 재고를 준비한다.
    1. 용지 타월에 슬라이드를 놓아 세척 버퍼가 슬라이드에서 실행되도록 하고 가장자리를 부드럽게 닦아냅니다. 각 14 mm x 14mm 공간에 결찰 용액의 40 μL을 적용하십시오.
  3. 37 °C에서 30 분 동안 습한 챔버에서 슬라이드를 인큐베이팅합니다.

8. 증폭

참고 : 적색 형광단(재료표)이있는 검출 시약을 사용하면 C. elegans 조직에서 배경이 가장 적게 발생합니다.

  1. 코플린 항아리에 RT에서 50 mL의 1 x 세척 버퍼 A로 5 분 동안 2 x슬라이드를 씻으십시오. 코플린 항아리를 60rpm으로 설정된 궤도 셰이커에 놓습니다.
  2. 증폭 적색 완충제(재료 표)1 :5초순물로 희석하십시오. 이 버퍼를 사용하여 폴리머 라제(재료 표)1:80을 희석하여 증폭 용액의 작업 재고를 준비하고 빛으로부터 보호하십시오.
    1. 용지 타월에 슬라이드를 놓아 세척 버퍼가 슬라이드에서 실행되도록 하고 가장자리를 부드럽게 닦아냅니다. 각 14mm x 14mm 공간에 증폭 용액의 40 μL을 적용합니다.
  3. 37 °C에서 1 시간 및 40 분 동안 습한 챔버에서 슬라이드를 인큐베이팅합니다. 습한 챔버가 빛으로부터 샘플을 보호하기 위해 호일로 덮여 있는지 확인하십시오.

9. 최종 세정

  1. 코플린 병에 RT에서 1x 세척 버퍼 B(재료 표)의50mL로 10 분 동안 2 x 슬라이드를 씻으십시오. 코플린 항아리를 60rpm으로 설정된 궤도 셰이커에 놓습니다.
  2. 코플린 항아리에 RT에서 0.01x 세척 버퍼 B의 50 mL로 1 분 동안 1 x를 씻으십시오. 코플린 항아리를 60rpm으로 설정된 궤도 셰이커에 놓습니다. 이 완충액은 세척 버퍼 B를 초순수로 희석시킴으로써 제조된다.

10. 커버슬립 장착

  1. 여분의 세척 버퍼가 슬라이드를 종이 타월로 흘러 내고 슬라이드의 에폭시 코팅 된 둘레에 남아있는 잔류 버퍼를 닦아 냅니다.
  2. 10 μL의 장착 매체(재료 표)를추가하여 샘플링하고 커버 슬립을 부드럽게 위에 놓아 마운팅 매체가 퍼질 수 있습니다.
  3. 커버 슬립의 가장자리를 매니큐어로 칠하여 커버 슬립과 슬라이드를 밀봉합니다. 커버 슬립을 이동하지 않도록 매니큐어의 응용 프로그램에 부드럽게, 이는 세균을 손상시킬 것이다. 슬라이드가 현미경으로 보기 전에, 빛으로부터 보호되는 동안, RT에서 적어도 20 분 동안 매니큐어를 경화시키십시오.
  4. PLA 라벨이 부착된 샘플은 빛에 민감하므로 슬라이드를 어두운 용기 또는 슬라이드 홀더에 보관하십시오. 제조업체는 슬라이드를 장기 보관을 위해 -20 °C또는 단기 보관을 위해 4 °C에서 보관할 수 있다고 제안합니다. 이 프로토콜을 사용하여 제조된 슬라이드는 20°C에서 저장될 때 적어도 2개월 동안 지속됩니다.

11. 이미지 획득

  1. 정량화를 위해 공초점 현미경을 사용하여 명확한 시야, 손상되지 않은 및 방해받지 않는 압출 된 생식선의 이미지를 캡처하십시오. z 평면의 전체 생식선을 가로지르는 생식선의 z 스택을 캡처하고 정량화에 사용할 최대 투영 이미지를 생성합니다.
    참고: 공초점 현미경 검사는 후피광성 현미경을 사용하여 얻은 것과 비교하여 배경이 적은 PLA 이미지를 획득하고 정량화하는 데 이상적입니다.
    1. 생식선이 한 시야에 맞지 않으면 전체 생식선을 이미지화하기 위해 필요에 따라 겹치는 시야를 캡처합니다. 이러한 이미지의 최대 프로젝션은 FIJI에서 함께 스티치할 수 있습니다.
  2. 이미지 분석 중에 초점 식별을 위한 공정하고 적절한 임계값을 설정하려면 제어 샘플과 실험 샘플 간에 이미징 조건을 동일하게 유지해야 합니다.
    참고: PLA 정량화의 통계 분석을 용이하게 하기 위해 복제당 각 샘플에서 적어도 8-10개의 생식선을 기록합니다. PLA는 신뢰할 수 있고 일관된 정량적 결과를 얻기 위해 적어도 3개의 생물학적 복제를 권장합니다.

12. FIJI/ImageJ를 이용한 이미지 분석 및 정량화

참고: 다음 워크플로는 이미지가 .czi 형식으로 저장되는 공초점 현미경의 40x 목표를 사용하여 획득한 이미지를 기반으로 합니다. 이러한 .czi 이미지와 차원을 포함한 해당 메타데이터는 추가 분석을 위해 FIJI/ImageJ에서 액세스하고 열 수 있습니다. FIJI가 특정 사용자가 사용할 수 있는 공초점 파일의 형식을 허용하는지 여부를 확인해야 합니다. 그렇지 않은 경우 .tiff 형식의 이미지를 분석에 사용할 수도 있지만 사용자는 FIJI/ImageJ(Analyze| 축척을 설정합니다. 배경 수준을 설정하려면 모든 네거티브 컨트롤 이미지를 먼저 함께 분석하는 것이 좋습니다.

  1. 먼저 모든 음수 제어 이미지를 분석하여 분석 워크플로우를 시작한 다음 실험 샘플로 이동합니다. FIJI/ImageJ에서 최대 프로젝션 이미지를 열어 분석합니다(그림2A). .czi 파일을 사용하는 경우 바이오 형식 가져오기 옵션 상자가 표시됩니다.
    1. 이미지를 여는 다음 옵션을 포함: 데이터 브라우저와보기 스택; 색상 모드 = 컬러 . 이제 이미지가 있는 창이 슬라이드 막대로 열리면 공초점으로 캡처한 다른 채널(예: DAPI 또는 PLA)간에 전환할 수 있습니다.
    2. 이미지를 바느질해야 하는 경우 마우스로 이미지를 오른쪽으로 선택하고 중복 창을 여는 복제를 선택하여 각 이미지에서 각 채널의 복제를 만듭니다. PLA 또는 DAPI 채널(예: 2)에해당하는 채널 번호(c)만 지정하고 중복 하이퍼스택에대한 확인란을 선택 취소합니다.
    3. 두 이미지를 모두 열어 두 이미지를 열고 플러그인 | 바느질 | 더 이상 사용되지 않습니다 | 2D 스티치. 2D 이미지 창의 스티치가 열립니다. 스티치에 사용할 이미지를 선택하고 창에서 미리 설정된 기본 매개 변수를 사용한 다음 확인을선택합니다. 결과 이미지는 어셈블된 그레이스케일 이미지입니다.
      참고: 하위 이미지가 완벽하게 정렬되지 않으면 매개 변수를 조정(예: 검사할 피크 수를 5개에서 500개로 늘리거나 선형 혼합에서 최대로 융합 방법을 5 변경). 강도)는원하는 이미지를 얻는 데 도움이 될 수 있습니다. 다른 스티치 도구를 사용할 수 있지만 이 방법은 정량화에 중요한 이미지의 차원을 유지합니다.
  2. 키보드에서 T를 눌러 ROI(관심 지역) 관리자를 엽니다. ROI 관리자라는 새 창이 열립니다.
  3. FIJI 도구 상자에서 다각형 도구를 선택합니다. 배글라인 주위의 점을 드롭하여 윤곽을 그리며 ROI를 생성합니다(그림2B). 마지막 점을 첫 번째 점에 연결하여 전체 ROI를 생성합니다.
    참고: 어두운 이미지의 경우 대비를 조정하여 배글라인의 가시성을 향상(가역가능)하여 더 정확하게 윤곽을 그리는 것이 좋습니다.
    1. ROI를 완료한 직후 ROI 관리자로 이동하여 [t] 추가를 선택하여 ROI를 저장합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 ROI 및 포인트 추가/제거 및 포인트 변경(ROI 관리자에서 업데이트 선택)을 포함한 ROI 변경이 반드시 수행되거나 손실됩니다. ROI 및 해당 지점의 조작에 대한 자세한 내용은 FIJI/ImageJ 사용자 가이드에서 확인할 수 있습니다.
  4. ROI 방향이 설정되면 ROI 관리자에서 ROI 이름을 선택한 다음 More | 저장 | (파일 이름을 지정하고 저장할 위치에 대한 대상을 지정). 저장된 ROI는 더 많은 것을 선택하여 ROI 관리자에서 열 수 있습니다 | 오픈 | (파일 선택) .
  5. ROI 관리자에서 ROI 이름을 선택한 다음 ROI 관리자의 측정 버튼을 선택하여 ROI 내부 영역을 측정합니다. 결과 창은 이미지에서 다루는 영역(μM2)(그림 2B의인세트)을 포함하여 ROI에 대한 정보가 표시됩니다. 이후 계산을 위해 스프레드시트에 이 정보를 기록합니다.
    참고: ROI의 올바른 치수가 수집되도록 이미지의 배율이 제대로 설정되었는지 확인합니다. 결과 상자에 보고된 측정 유형은 ANALYZE로 이동하여 수정할 수 있습니다 | 측정 설정....
  6. PLA 이미지를 오른쪽으로 선택하고 복제(도 2C)를선택하여 PLA 채널의 중복 이미지만 엽니다. 중복 창이 열립니다. PLA 채널(예: 2)에 해당하는 채널 번호(c)만 지정하고 중복 하이퍼스택에대한 확인란을 선택 취소합니다. 원본 이미지가 수정되지 않도록 이 이미지의 복제를 권장합니다.
    참고: 이러한 옵션은 FIJI/ImageJ에서 여러 채널을 포함하는 이미지를 볼 때만 표시됩니다. 또 다른 방법은 채널을 분할하는 것입니다 이미지 | 색상 | 채널을 분할하지만원본 이미지 파일이 수정됩니다.
  7. PLA 채널의 이미지만 선택한 경우 이미지 | 조정 | 임계값. 이미지의 임계값 창이 열립니다. 기본값을 임계값 방법으로 선택하고 빨간색을 색상으로 선택하고 어두운 배경 상자를 선택합니다. 창의 위쪽 트랙을 사용하여 모든 PLA 초점이 이미지에서 뚜렷하게 강조 표시될 때까지 막대를 오른쪽으로 밉니다.
    1. 상단 트랙의 오른쪽에있는 상자에 값을 기록하고 임계 값을 설정하는 데 사용 된 값을 기록합니다. 임계값 창에서 적용을 선택하여 임계값을 완성하면 이미지가 검은색 점으로 표시되는 임계값 초점만 있는 흰색 배경으로 변환됩니다(그림2D). 여러 음수 제어 이미지의 임계값을 테스트하여 정량화 전에 이미지에서 이미지로 모든 PLA 초점을 캡처하는 데 적합한지 확인합니다.
      참고: 임계값 초점을 흰색 배경에 검은색 점으로 보려면 Process | 으로 이동하십시오. 바이너리 | 옵션... 및 검은 색 배경 상자를 선택 취소합니다. 30-40 사이의 임계값은 생식선에서 PLA를 식별하기 위한 좋은 출발점입니다. 그러나 이상적인 값은 배경에 따라 다를 수 있습니다.
  8. PLA 초점을 정량화하려면 ROI 관리자 창에서 ROI 이름을 선택하여 단계 12.3-12.3.1에서 생성된 ROI를 임계값 이미지에 적용합니다. ROI의 윤곽선은 소스 이미지와 동일한 위치에 이미지에 표시되어야합니다(그림 2E).
    1. 분석으로 이동 | 입자 분석. 파티클 분석 창이 열리고 다음 매개 변수를 선택합니다: 크기(micron^2) = 0-무한대,원형 = 0.00-1.00, 표시 = 없음. 요약 상자를 선택합니다.
    2. 확인을선택하면 요약 테이블이 ROI에 대한 정보(즉, PLA 초점의 총 개수, ROI 내부의 PLA 초점에 의해 점유된 총 면적, PLA 초점의 평균 크기 및 ROI 의 크기에 대한 PLA 초점에 의해 점유된 영역의 백분율)에 대한 정보와 함께 표시됩니다(그림 2E의인세트). 스프레드시트에 이러한 측정값을 기록합니다.
  9. 동일한 임계값을 사용하여 여러 네거티브 컨트롤 이미지에 대해 12.1-12.8 단계를 반복합니다.
    1. 모든 음성 대조군 이미지를 분석한 후, PLA 초점을 식별하고 정량화하기 위해 음의 대조군에서 결정된 것과 동일한 임계값을 사용하여 모든 실험 샘플에 대해 12.1-12.8단계를 반복합니다.

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Representative Results

둘 다 3xFLAG::DLC-1의 공동 면역 염색; GFP 및 3xFLAG: :DLC-1; OMA-1::국기 및 GFP 항체를 가진 GFP 생식선은 생식선에서 그들의 발현 패턴을밝혔다(그림 3Aii-iii, 3Bii-iii). GFP가 생식선 전체에 걸쳐 발현되었지만(도3Aiii),OMA-1::GFP 발현은 후기 파키텐 및 난모세포(도 3 Biii)로 제한되었다(도3Biii)27. FLAG 면역염색은 3xFLAG::DLC-1이 두 균주에서 생식선 전체에 걸쳐 발현되었다는 것을나타낸다(도 3Aii,3Bii). 공동 면역 염색에 의해, 3xFLAG::DLC-1과 OMA-1:GFP 사이의 중첩은 3xFLAG::DLC-1과 GFP(음성 대조군) 사이에서 구별할 수 없다.

이러한 실험은 DLC-1과 OMA-1 사이의 상호작용을 위해 시험되었기 때문에, 모든 생식선에서 난모를 통한 후기 파시틴을 포괄하는 생식선에서의 PLA 정량화에 대한 관심 영역은 모든 생식선에서 조사되었다(도2B),이것은 OMA-1 발현의 영역으로서(도1, 도 3Biii). 3xFLAG: :DLC-1; OMA-1::GFP 생식선은 3xFLAG::DLC-1에 비해 이 지역 내의 PLA 초점의 더 많은 양을 가지고 있는 것으로 나타났습니다. GFP 생식선(그림 3Ciii-iv, 3Diii-iv). PLA의 정량화는 PLA 초점의 수가 3xFLAG::DLC-1에 존재하는 것으로 나타났다; OMA-1::GFP 생식선은 3xFLAG보다 훨씬 컸습니다::DLC-1; GFP(그림 3Ciii-iv, 3Diii-iv; 표 1). 또한, GFP 및 FLAG 항체의 10배 더 높은 희석에도 불구하고, 대조군과 실험PLA의 차이는 여전히 현저하게 달랐다; 그러나 전체 밀도 및 평균 초점 크기가 감소했습니다(표1).

Figure 1
그림 1: C. 예쁜꼬마골라인의 개술. 말단 끝 지구에는 줄기 세포 풀이 포함되며, 그 다음에 는 meiotic pachytene가 뒤따르며, 세포는 유사분열에서 유사분열로 전환되었습니다. meiotic pachytene를 종료하는 세포는 근위 끝에 가장 성숙한 난모세포와 함께 난모세포로 발전합니다. 녹색으로 그늘진 영역은 후기 메오틱 파키텐에서 모든 난모세포에 이르기까지 OMA-1 표현 패턴을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 생식선 PLA 정량화를 위한 워크플로우의 대표적인 이미지. 이 그림에 사용되는 생식선은 대표적인 3xFLAG::DLC-1; 그림 3C에서GFP 생식선 . (A)피지/ImageJ에서 열린 병합된 PLA 및 DAPI 채널 이미지입니다. (B)FIJI의 다각형 도구는 정량화된 생식선(흰색 상자가 있는 노란색 선)에서 관심 영역(ROI)을 설명하고 정의하는 데 사용되며 ROI(μM2)의영역이 측정됩니다(B의 인세트). (C)PLA 채널의 단일 이미지는 원본 이미지를 복제하거나 분할하여 (A,B)로 얻어진다. (D)임계값은 PLA 이미지의 모든 PLA 초점을 뚜렷하게 강조표시하도록 신중하게 설정됩니다. 함께 분석할 모든 실험 및 제어 이미지에 동일한 임계값을 적용해야 합니다. (e)임계값 이미지에서 ROI를 선택한 경우 파티클 분석 함수는 ROI(E의 인세트) 내에 포함된 총 초점 수를 포함하는 결과 테이블을 반환합니다. 이미지는 피지 / 이미지 J에서 스냅 샷입니다 : 플러그인 | 유틸리티 | 이미지 캡처. 배율 막대 = 10 μM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 공동 면역 염색 또는 PLA 다음 생식선의 대표적인 이미지. (A, B) 3xFLAG::DLC-1에서 태그된 단백질의 발현 패턴; GFP (아이-iv) 및 3xFLAG::DLC-1; OMA-1:GFP(Bi-iv)를 해부, 고정 및 면역 염색 된 생식선으로 평가하였다. 항-FLAG 항체는 1:1000 희석에서 사용되었고, 반면 항GFP 항체는 면역형광 이미지에 최적인 1:200 희석에서 사용되었다. DNA는 DAPI에 의해 염색되었고, 개별 채널은 더 나은 대비를 위해 그레이스케일로도시된다(Aiv,Biv). 각 이미지에서 줄기 세포와 meiotic pachytene는 파선으로 윤곽이 있고, 난모세포는 점선으로 윤곽을 그었습니다. 심상은 에피플루오닉현미경으로 획득되었다. 스케일 바 = 10 μM.(C,D)PLA 압출 3xFLAG::DLC-1; GFP (C) 및 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP (D) 생식선. 항-FLAG 항체는 1:1000 희석에서 사용되었고, 반면 항-GFP 항체는 1:4000 희석에서 사용되었다. DNA는 DAPI에 의해 염색되었고, 개별DAPI(Cii, Dii)및 PLA채널(Ciii, iv, Diii, iv)은더 나은 대비를 위해 그레이스케일로 도시된다. 녹색, 파선 상자(Ciii, Diii)는확대 된 PLA 이미지(Civ, Div)의위치를 나타냅니다. 각 이미지에서 줄기 세포와 meiotic pachytene는 파선으로 윤곽이 있고, 난모세포는 점선으로 윤곽을 그었습니다. 이미지는 공초점 현미경으로 획득되었다. 배율 막대 = 10 μM.(A, B, C, D)은 모두 이미지 프로세싱 소프트웨어로 조립되었습니다(재료 표참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

항체 희석 스트레인 테스트 완료 평균 PLA 밀도(초점/μM2)X 10-2 T 테스트 PLA 포치의 평균 크기 (μM2) T 테스트
αFLAG (1:1000), αGFP (1:4000) 3xFLAG: :DLC-1; Gfp 3.9 ± 1.4 P = 1.917E-05 0.52 ± 0.127 P = 0.057
3xFLAG: :DLC-1; 오마-1::GFP 9.1 ± 2.7 1.8 ± 2.08
αFLAG (1:10,000), αGFP (1:40,000) 3xFLAG: :DLC-1; Gfp 3.2 ± 2.4 P = 3.395E-04 0.51 ± 0.1 P = 0.019
3xFLAG: :DLC-1; 오마-1::GFP 7.7 ± 3 0.7 ± 0.24

표 1: PLA 결과 요약. 1차 항체의 2가지 희석에서 PLA 정량화의 요약을 보고하는 표. OMA-1::GFP 에 대한 평균 PLA 밀도 또는 PLA 초점의 평균 크기의 차이는 두 항체 적정 사이의 유의하지 않았다(p-값은 도시되지 않음). 동일한 비교도 GFP에 적용되었으며, 이는 또한 유의한 차이(p-값이 표시되지 않음)를 초래하지 않았습니다. p-값은 2꼬리/등가 차이 t-test를사용하여 결정되었습니다.

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Discussion

C. elegans 생식선에 있는 PPI를 공부할 때, 공동 면역 염색에 비교된 PLA에 의해 제안된 더 높은 해결책은 상호 작용이 생식선에서 일어나는 위치의 시각화 그리고 정량화를 허용합니다. 이전에는 DLC-1이 시험관 내 GST 풀다운 분석(26)을26사용하여 OMA-1과 직접 상호 작용한다는 보고가 있었다. 그러나, 이 상호 작용은 생체 내 풀다운에 의해 복구되지 않았습니다. 3xFLAG::DLC-1의 형광 동면역염색; OMA-1::GFP 생식선은 DLC-1 및 OMA-1에 대한 발현 패턴의 중첩을 나타낸다; 그러나, 그들의 상호 작용이 생식선에서 어디에서 발생하는지에 대한 징후가 없으며, 중첩 자체는 어떤 단백질에 융합되지 않은 3xFLAG::DLC-1 및 GFP 사이의 것보다 크지 않다(음성 대조군). situ PLA에서, DLC-1은 다른 접근법에 비해 PLA가 PPI의 검출을 위해 더 민감할 수 있다는 것을 건의하는 생식선에서 OMA-1과 상호 작용한다는 것을 것을을 발견했습니다. 이러한 접근 방식을 통해 우리는 RBP 보조 인자로서 DLC-1의 새로운 역할을 지속적으로 확장하고 있습니다. 이 작품은 GERmline에 있는 PPI를 검출하는 PLA의 기능을 보여주고 그들의 자신의 관심사의 단백질 사이 상호 작용을 탐구하는 미래 사용자를 위한 기준을 설치합니다.

PLA는 FRET 및 BiFC와 같은 다른 기술과 관련된 단점 없이 유사한 감도로 PPI를 테스트할 수 있는 기능을 사용자에게 제공합니다. 생물학적으로 관련된 단백질 발현 수준은 FRET 및 BiFC에 최적이 아닐 수 있다. 또한, 잠재적인 상호 작용 파트너의 기능은 두 접근 방식 모두에 사용되는 큰 태그에 의해 영향을 받을 수 있다. 게다가, FRET 검사는 쉽게 유효하지 않을 수 있는 전문화한 현미경 설치를 요구합니다. PLA는 또한 다른 기술에 비해 PPI를 연구하는 비용 효율적인 접근법일 수 있다. 사용자는 면역 염색에 필요한 시약 이외에 화상 진찰을 위한 PLA 시약 및 공초점 현미경에 접근을 장악할 필요가 있습니다. 이미지 분석은 모든 사용자가 사용할 수있는 오픈 소스 프로그램 FIJI / ImageJ를 사용하여 수행됩니다. FRET 또는 BiFC에 대한 경험이 없는 사용자는 PLA가 적절한 대안이 될 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 일반적인 면역 염색 절차를 넘어서는 몇 가지 추가 단계를 포함하여 면역 염색 경험이있는 모든 사용자가이 기술을 사실상 접근 할 수 있게합니다.

해부에 의한 고나드의 압출은 PLA가 성공적으로 작동하기 위해 중요하다. 웜 표피의 안쪽에 유지되는 조직은 이 프로토콜을 사용하여 PLA에 의해 표지되지 않습니다. 압출된 배아가 이 PLA 프로토콜에 의해 효과적으로 표지된다는 것이 추가로 밝혀졌다. 이것은 창자와 같은 해부 도중 풀어 놓이는 그밖 조직이 또한 PLA와 호환될 가능성이 있다는 것을 건의합니다. PLA는 면역 염색에 자주 사용되는 두 개의 고정 프로토콜로 제조된 배아 샘플뿐만 아니라 고나드에 대한 강력한 신호를 생성한다는 것이 밝혀졌습니다. 이는 현장에서 사용되는 추가 고정 절차가 PLA와 호환될 수 있지만 사용자가 개별적으로 평가해야 한다는 것을 시사합니다.

1차 항체의 최적 희석을 결정하는 것은 성공적인 PLA에 매우 중요하다. 면역 형광에 최적화 된 희석으로 시작하는 것이 가장 좋습니다. 이는 전형적으로 면역형광 실험에서 1차 항체를 적정하여 배경이 낮고 높고 특이적인 신호가 있는 최적의 희석을 찾아서 달성한다. 면역형광에 대한 최적의 희석이 확립되면, 이러한 동일한 희석은 한 쌍의 잠재적인 인터랙터에 의해 생성된 신호를 비상호작용 단백질의 대조군 쌍에 의해 생성된 신호와 비교하는 PLA 분석실험에서 시험될 수 있다.

대조군 샘플에서 풍부한 신호가 관찰되는 경우, 1차 항체의 추가 희석이 요구된다. PLA에 대한 최적 1차 항체 희석은 면역형광에 사용되는 것보다 적어도 동일하거나 더 희석된 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 도 3A, B의 면역형광 이미지는 항-플래그의 1:1000 희석 및 항-GFP의 1:200 희석을 대표한다. 그러나, 도 3C,D에서 PLA 이미지에서 항체 희석은 항-FLAG의 1:1000 및 항-GFP의 1:4000이었다. PLA에 사용된 항 GFP 항체의 희석은 면역형광에 사용된 것보다 크며, 이는 PLA가 훨씬 더 민감하다는 것을 시사한다. 항체를 10배 더 희석시키는 것은 DLC-1/OMA-1 초점의 크기뿐만 아니라 PLA 밀도의 감소를 초래한다는 것을 발견하였다(표1). 이러한 감소에도 불구하고, 음의 대조군과 DLC-1/OMA-1 사이의 PLA 밀도의 차이는 여전히 현저하게 달랐다. 이것은 PLA가 1 차적인 항체의 더 높은 희석으로 아직도 아주 과민하다는 것을 건의합니다; 그러나, 검출 가능한 상호 작용의 보급은 과소평가될 것입니다.

대조적으로, 항체 희석의 너무 낮은 유해한 결과의 2개의 종류가 있을 수 있습니다. 먼저, 음의 대조군에서 상당한 배경 신호를 생성할 수 있다. 둘째, 상호 작용하는 파트너 단백질에 의해 생성된 PLA 초점병합 및 중첩될 수 있으며, 최대 프로젝션 이미지에서 해결하기가 어려울 수 있습니다. 이것은 이미지 분석 도중 PLA 초점 수 그리고 밀도의 과소평가로 이끌어 냅니다. PLA 신호는 상호 작용하지 않는 파트너 간의 스퓨리어스 근접을 감지하고 샘플에서 발생하는 실제 PPI의 모든 인스턴스를 감지하는 균형입니다. 그 결과, 두 단백질이 상호 작용하지 않는 음성 대조군을 통합하는 것은 PLA 실험에서 배경수준을 결정하는 데 필수적이다. PLA 실험에서 1차 항체의 생략은 다른보고9,,10; 그러나, 이러한 접근법은 실험PLA의 결과에 영향을 미칠 수 있는 비특이적 상호작용 또는 비특이적 항체 결합을 설명할 수 없다. GFP는 DLC-1과 GFP 간의 직접적인 상호 작용이 예상되지 않았기 때문에 여기에서 부정적인 대조군으로 사용되었습니다. 네거티브 컨트롤에 배경 신호가 있는 것으로 나타났습니다. 이는 실험 데이터를 평가할 때 PLA 분석에 대한 음성 제어의 중요성을 더욱 뒷받침한다.

PLA에 최적화된 희석이 설정되면 이러한 희석은 동일한 선호도 태그로 태그가 지정된 상호 작용 파트너의 서로 다른 쌍을 포함하는 다양한 웜 균주의 배열에서 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 항체 친화성의 변이가 PLA 실험의 결과에 영향을 미칠 수 있기 때문에 결과 PLA 신호의 공정한 비교를 보장하기 위해 동일한 쌍의 1 차 항체를 사용하는 것이 중요합니다. PLA에 대한 또 다른 보고서는 PLA 이차항체(10)의희석을 최적화하는 것을 시사한다. 그러나 이 방법은 권장되지 않습니다. 이차 항체의 높은 희석은 이차 항체에 공액되는 PLUS 및 MINUS 프로브의 인식에 의존하는 다른 다운스트림 PLA 단계의 효능을 감소시킬 수 있다.

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Disclosures

저자는 이해관계의 충돌이 없습니다.

Acknowledgments

이 연구에서 사용된 몇몇 선충 긴장은 NIH (P40OD010440)에 의해 투자된 Caenorhabditis 유전학 센터에 의해 제공되었습니다. 공초점 현미경 검사법은 NIH 어워드 P20GM103546 및 S10OD021806의 지원으로 운영되는 몬태나 대학교 생물분과 현미경 코어 연구소에서 수행되었습니다. 이 작품은 E.V.에 NIH 교부금 GM109053, 미국 심장 협회 펠로우십 18PRE34070028 X.W.에 의해 부분적으로 지원되었다, 그리고 X.W에 과학의 몬태나 아카데미 상. 기금은 연구 디자인이나 보고서 작성에 관여하지 않았다. 엘렌베커 에게 토론에 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% paraformaldehyde solution Electron Microscopy services 15710 used to make 4% working solution
1M KH2PO4 Sigma P0662 Prepare a 1M working stock
1x M9 various various prepared as 10x stock used at 1x; see wormbook.org for protocol
1x PBS various various see wormbook.org for protocol
26.5 Gauge Needle Exel International 26402 Needles used for dissection
BSA Lampire 7500802
Centrifuge Tubes Thermo Scientific 05-529C 50ml Oak ridge centrifuge tube used for synchronization
Confocal Microscope Zeiss 880
Coplin Jar PolyLab 62101
Coverslip to Freeze Sample Globe Scientific 1411-10 22x40mm, No. 1
Coverslip to Seal Slide Globe Scientific 1404-15 22x22mm, No. 1.5
DAPI Mounting Medium for Immunofluorescence Vector H-1200
Ligase Sigma-Aldrich DUO82029 Duolink 1x Ligase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Amplification red buffer Sigma-Aldrich DUO82011 Duolink 5x Amplification Red buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Ligation Buffer Sigma-Aldrich DUO82009 Duolink 5x Ligation buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Antibody Diluent Sigma-Aldrich DUO82008 Duolink antibody diluent,Comes with DUO92004 and DUO92002, Note: A 1x PBS/1% BSA solution can also be used as a substitute to dilute the antibody.
Blocking Solution Sigma-Aldrich DUO82007 Duolink blocking solution, Comes with DUO92004 and DUO92002
Mounting Medium for PLA Sigma-Aldrich DUO82040 Duolink In Situ mounting medium with DAPI
MINUS Probe Sigma-Aldrich DUO92004 Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS
PLUS Probe Sigma-Aldrich DUO92002 Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS
Wash Buffer A Sigma-Aldrich DUO82046 Duolink In Situ wash Buffer A
Wash Buffer B Sigma-Aldrich DUO82048 Duolink In Situ wash Buffer B
Polymerase Sigma-Aldrich DUO82030 Duolink Polymerase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Epifluorescent Microscope Leica DFC300G camera, DM5500B microscope
Goat anti-mouse Alexa 594 JacksonImmuno 115-585-146 Use at 1:500
Goat anti-rabbit Alexa 488 JacksonImmuno 111-545-144 Use at 1:200
Image Processing Software Adobe Adobe Photoshop + Illsutrator CS3
Glass Pipette Corning 7095B-5X
Levamisole ACROS Organics 187870100 Prepare a 250mM working stock
Methanol Fisher Scientific A454
Mouse anti-FLAG Sigma F1804 Use at 1:1000 for immunofluorescence and PLA, pre-block with normal goat serum recommended
Nailpolish L.A. colors CNP195
Nematode Growth Medium (NGM) various See wormbook.org for protocol
Normal Goat Serum JacksonImmuno 005-000-121
Polyethylene Pasteur Pipette Globe Scientific 135030
Poly-L-Lysine Sigma-Aldrich P1524 Prepared as 0.1% stock solution in water, stored at -20C, and diluted 1:100 in water to coat slides
Petri Dishes Tritech PD7060 60 mm diameter
Rabbit anti-GFP Thermo Fisher G10362 Use at 1:200 for immunofluorescence, 1:4000 for PLA
Slides Thermo Fisher 30-2066A-Brown Three-square 14x14mm autoclavable slides with bars are custom-ordered through Fisher Scientific. Poly-L-Lysine added to slides in the lab
Sodium Hypochlorite solution Fisher Scientific SS290-1
task wipes Kimtech 34120 4.4x8.4 inch task wipes
Trays (242x241x20mm) Thermo Fisher 240845 Used to make humid chamber
Triton X-100 ACROS Organics 327372500
Ultrapure water Milli-Q Ultrapure water obtained from Milli-Q Integral Water Purification System
Watchglass Carolina Biological 742300
-20 °C freezer
-80 °C freezer
Aluminum Foil
OP50 strain E. coli
Orbital Shaker
Tape
Nematode strains used in this study (both available upon request)
mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475] UMT 376 dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Reference 24
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III UMT 422 dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Reference: this study

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References

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발달 생물학 문제 159 생식선 RNA 결합 단백질 LC8 PLA C. 예쁜꼬마선충, 근접 결찰 분석
근접 결찰 분석술을 사용하여 <em>C. 예쁜꼬마선에서</em> 리보뉴클레오 단백질 복합어셈블리의 시투 검출
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Day, N. J., Wang, X., Voronina, E.… More

Day, N. J., Wang, X., Voronina, E. In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay. J. Vis. Exp. (159), e60982, doi:10.3791/60982 (2020).

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