Summary
Bu protokol, C. elegans germline yerinde protein-protein etkileşimleri için prob yakınlık ligasyon test kullanımını göstermektedir.
Abstract
Protein-protein etkileşimlerinin (PPI) ne zaman ve nerede oluştuğunu anlamak, hücredeki protein işlevini ve gelişim gibi daha geniş süreçlerin ne kadar etkilendiğini anlamak için çok önemlidir. Caenorhabditis elegans germline kök hücrelerin düzenlenmesi ile ilgili PPIs eğitimi için harika bir model sistemidir, kekozis, ve gelişme. İlgi proteinlerin standart antikorlar tarafından tanınmak üzere etiketlenmelerine olanak tanıyan çeşitli iyi geliştirilmiş teknikler vardır, bu da bu sistemi yakınlık ligasyon testisi (PLA) reaksiyonları için avantajlı hale getirir. Sonuç olarak PLA, ppi'lerin germlines'de mekansal ve zamansal bir şekilde nerede oluştuğunu alternatif yaklaşımlardan daha etkili bir şekilde gösterebiliyor. Burada açıklanan uygulama ve c. elegans germline ppis araştırmak için bu teknolojinin niceliklendirme için bir protokoldür.
Introduction
Proteinlerin %80'inden fazlasının diğer moleküllerle etkileşimleri olduğu tahmin edilmektedir1, bu da PPI'ların hücre2'dekibelirli biyolojik fonksiyonların yürütülmesinde ne kadar önemli olduğunu vurgular. Bazı proteinler hücre sağkalım için gerekli olan büyük komplekslerin montajını kolaylaştıran hub'lar olarak işlevgörürler 1. Bu hub'lar birden çok PPI'ya aracılık eder ve proteinlerin hücre3'tekibelirli işlevleri kolaylaştıran bir ağ halinde organize etmeye yardımcı olur. Protein komplekslerinin oluşumu da biyolojik bağlam etkilenir, belirli etkileşimli ortakların varlığı veya yokluğu gibi4,hücre sinyal olayları, ve bir hücrenin gelişim evresi.
C. elegans yaygın geliştirme de dahil olmak üzere çeşitli çalışmalar için bir model organizma olarak kullanılır. Bu hayvanın basit anatomisi, solucan gelişiminin analizini kolaylaştıran gonad, bağırsak ve şeffaf mitikül de dahil olmak üzere çeşitli organlardan oluşur. Gonad'da yaşayan germin, germline kök hücrelerinin embriyolara ve sonunda yeni nesil singenlere dönüşengametler 5'e nasıl olgunlaştığını incelemek için harika bir araçtır. Germline distal uç bölgesi kendi kendini yenileyen kök hücrelerden oluşan bir havuz içerir(Şekil 1). Kök hücreler niş bırakın gibi, onlar meiyotik pachytene içine ilerleme ve sonunda genç yetişkin aşamasında yumurta içine gelişir (Şekil 1). Germline geliştirme Bu program sıkı rna bağlayıcı proteinler (RRB)6tarafından kolaylaştırılen bir post-transkripsiyonel düzenleyici ağ da dahil olmak üzere farklı mekanizmalar aracılığıyla düzenlenir. PpI'lar bu düzenleyici etkinlik için önemlidir, çünkü KP'ler işlevlerini yerine getirmek için diğer kofaktörlerle ilişkilendirilir.
Solucanda PPI'lar için sondalamak için kullanılabilecek çeşitli yaklaşımlar vardır, ancak her birinin benzersiz sınırlamaları vardır. In vivo immünopresipite (IP) protein-protein komplekslerini tüm solucan özlerinden ayırmak için kullanılabilir; ancak bu yaklaşım, ÜFE'nin solucanda nerede oluştuğunu göstermez. Buna ek olarak, geçici ve sadece gelişim belirli bir aşamada veya sınırlı sayıda hücre de form protein kompleksleri co-immünopresid ile kurtarmak zor olabilir. Son olarak, IP deneyleri lysis ve afinite matris proteinlerin non-spesifik tutma sonra protein kompleksi reassortment endişeleri ele almak gerekir.
PPI yerinde tespiti için alternatif yaklaşımlar ko-immünboyama, Förster rezonans enerji transferi (FRET) ve bimoleküler floresan kompleman (BiFC) vardır. Ko-immünboyama sabit solucan dokusunda ilgi iki protein eşzamanlı algılama ve sinyal kolokalizasyonu ölçüde ölçümü dayanır. Standart mikroskopi7daha fazla ayrıntı sunan süper çözünürlüklü mikroskopi kullanımı, 200-300 nm8kırınım sınırlı bariyer ötesinde protein kolokalizasyonu daha sıkı test etmek için yardımcı olur. Ancak, hem konvansiyonel hem de süper çözünürlüklü mikroskopi kullanarak ko-immünboyama iyi tanımlanmış lokalizasyon desenleri olan proteinler için en iyi çalışır. Buna karşılık, yaygın olarak dağıtılan etkileşimli ortaklar için çok daha az bilgilendirici hale gelir. Örtüşmeye dayalı sinyallerin birlikte lokalizasyonu için ölçüm proteinlerin birbiriyle karmaşık olup olmadığı hakkında doğru bilgi sağlamaz9,10.
Ayrıca, protein-protein komplekslerinin ko-immünopresipitasyon ve ko-immünboyboyama kantitatif değildir, bu tür etkileşimlerin önemli olup olmadığını belirlemek zor hale. FRET ve BiFC floresan tabanlı tekniklerdir. FRET floresan proteinler ile ilgi proteinleri etiketleme dayanır (FPs) hangi bir FP enerji transfer spektral örtüşme var (donör) başka bir FP (alıcı)11aktarılır. Enerjinin bu radyatif olmayan transferi, kendi dalga boyunda tespit edilebilen alıcı FP'nin floresanlığına neden olur. BiFC in vivofloresan proteinin yeniden yapılandırılmasına dayanır. GFP'nin helikes 1-10 ve helix 1112gibi iki tamamlayıcı parçaya bölünmesini gerektirir ve bu parçalar daha sonra iki proteinle kaynaşır. Eğer bu iki protein etkileşirse, GFP'nin tamamlayıcı parçaları katlamak ve biraraya gelmek için yeterince yakınlaşır ve GFP floroforu yeniden kurar. Yeniden oluşturulan GFP daha sonra doğrudan floresan olarak gözlenir ve üfe'nin nerede oluştuğunu gösterir.
Bu nedenle, hem FRET hem de BiFC, etiketlenen proteinin işlevini bozabilecek büyük floresan etiketlere bağlıdır. Buna ek olarak, FRET ve BiFC doğru veri elde etmek için etiketli proteinlerin bol ve karşılaştırılabilir ifade gerektirir. FRET, bir ortağın diğerini aşan olduğu ve yüksek arka plan13'eyol açabilen deneyler için uygun olmayabilir. BiFC denemelerinde aşırı ifadeden de kaçınılmalıdır, çünkü bu, daha yüksek arka planla sonuçlanan nonspesifik derleme14'ü tetikleyebilir. Her iki teknik de, etiketli proteinlerin ekspresyonu ve görüntüleme koşullarının optimizasyonu gerektirir, bu da deneyleri tamamlamak için gereken süreyi uzatabilir.
Yakınlık ligasyon tsurju (PLA) yukarıda bahsedilen tekniklerin sınırlamalarını ele alabilecek alternatif bir yaklaşımdır. PLA, ilgi çeken proteinleri (veya etiketlerini) tanıyan birincil antikorlardan yararlanır. Bu primer antikorlar daha sonra 40 nm (veya daha kısa) mesafe15içinde birbirleriyle melezleşebilir oligonükleotid probları içeren ikincil antikorlar ile bağlanır. Ortaya çıkan melezdna, DNA'yı tamamlayan problar tarafından algılanan bir PCR reaksiyonu ile güçlenir. Bu bir mikroskop tarafından görselleştirilmiş foci sonuçlanır. Bu teknoloji, gelişim ve farklılaşmanın çeşitli aşamalarında hücreleri içeren bir montaj hattı olarak organize edilen karmaşık dokularda (yani solucan gonad) yerinde PPI'ları algılayabilir. PLA ile PPI'lar sabit solucan gonad'da doğrudan görselleştirilebilir, bu da PPI'ların gelişimin belirli bir aşamasında oluşup oluşmadığını araştırmak için avantajlıdır. PLA, kesin ölçümler yapmak için ideal olan eş-lokalizasyon tabanlı tahliller yerine PPI'lerin daha fazla çözünürlüğü sunar. Kullanılırsa, süper çözünürlüklü mikroskopi bir hücre içinde PLA foci konumu hakkında ince ayrıntı sağlama potansiyeline sahiptir. Başka bir avantajı pla reaksiyonları kaynaklanan foci bir ImageJ tabanlı analiz iş akışı ile sayılır olabilir, bu tekniği nicel hale.
Dynein Hafif Zincirleri LC8 ailesi ilk dynein motor kompleksi16 bir alt birim olarak tanımlanan ve bir kargo adaptörü olarak hizmet hipotezi. İlk keşfinden bu yana, LC8 dynein motor kompleksi ek olarak birden fazla protein kompleksleri bulunmuştur17,18,19,20. LC8 etkileşim motifi içeren protein dizileri için tarama19 LC8 farklı proteinlerin geniş bir dizi ile birçok etkileşimleri olabileceğini düşündürmektedir17,18,19,20,21,22. Sonuç olarak, LC8 aile proteinleri şimdi daha büyük protein kompleksleri montaj teşvik yardımcı hub olarak kabul edilir19,22, özünde düzensiz proteinlerin meclisleri gibi21.
Bir C. elegans LC8-aile protein, dynein ışık zinciri-1 (DLC-1), yaygın birçok dokular arasında ifade edilir ve belirli hücre altı yapılarda zenginleştirilmiş değil23,24. Sonuç olarak, C. elegans DLC-1 biyolojik olarak ilgili in vivo ortaklarının belirlenmesi çeşitli nedenlerle zor: 1) co-immünoprepitasyon etkileşimoluşur doku kaynağı göstermez; 2) belirli ortakların sınırlı ekspresyonu veya geçici etkileşimleri co-immünoprepitasyon ile bir etkileşimi tespit etme yeteneğini engelleyebilir; ve 3) DLC-1 diffüz dağılımı co-immünboyama tarafından potansiyel ortak proteinler ile non-spesifik örtüşme yol açar. Bu zorluklara dayanarak PLA, DLC-1 ile in vivo etkileşimlerini test etmek için ideal bir yaklaşımdır.
Daha önce DLC-1 ile doğrudan etkileşim ve RNA bağlayıcı proteinler (RRB) FBF-223 ve GLD-1 25 için bir kofaktör olarak hizmetbildirilmiştir. Çalışmalarımız dlc-1 bir hub protein olarak hizmet modeli destekler ve DLC-1 dynein ötesinde kapsayan bir etkileşim ağı kolaylaştırır düşündürmektedir19,22. GST pulldown tetkik kullanarak, OMA-1 adlı yeni bir DLC-1-etkileşen RBP26tespit edilmiştir. OMA-1 yumurta büyümesi ve meiyotik olgunlaşma27 için önemlidir ve bir dizi çevirisel baskılayıcı ve aktivatörlerle birlikte işlevler28. FBF-2 ve GLD-1 sırasıyla kök hücreler ve meyolitik pakiten bölgelerinde ifade edilirken, OMA-1 oositler27 ile meiyotik pachytenden mikropta yaygın olarak ifade edilir (Şekil 1). Bu, DLC-1 gonad farklı bölgelerde RbPs ile kompleksleri oluşturur düşündürmektedir. Ayrıca in vitro gözlenen DLC-1 ve OMA-1 arasındaki doğrudan etkileşim in vivo IP ile kurtarılamadı bulunmuştur. PLA başarıyla C. elegans germline bu etkileşimi daha fazla çalışma için alternatif bir yaklaşım olarak kullanılmıştır, ve sonuçlar PLA solucan diğer birçok PPIs araştırmak için kullanılabilir öneririz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokol, potansiyel etkileşim ortaklarının etiketlendiği C. elegans suşlarını kullanır. Etiketlenmiş bir proteinin başka bir etiketli aday etkileşim ortağıyla etkileşime geçmesinin beklenmediğini niçin negatif kontrol suşlanması kuvvetle tavsiye edilir. Burada, DLC-1 solucan GFP ile etkileşim beklenmiyor gibi, tek başına Arka plan değerlendirmek için olumsuz bir kontrol olarak kullanılmıştır. GFP etiketli OMA-1 deneysel zorlanma olarak kullanılmıştır, ön veriler DLC-1 ile etkileşimi göstermektedir. 3xFLAG etiketli DLC-1 ile birlikte kontrol ve test proteinleri ifade nematod suşları 3xFLAG olarak adlandırılır::DLC-1; GFP ve 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP (istek üzerine suşlar; Malzemeler Tablosu'ndadaha fazla bilgi ), sırasıyla. Burada, 3xFLAG ve GFP etiketleri kullanılır; ancak, antikorları PLA kiti reaktifleri ile uyumlu olduğu sürece diğer etiketler ikame edilebilir.
1. Hayvan bakımı
- Solucanları E. coli'nin OP50 suşu ile tohumlanmış nematod büyüme ortamı (NGM) plakalarında tutun ve GFP'nin optimum ifadesi için 24 °C'de tutun.
- Geçiş yetişkin solucanlar her 2-3 günde bir solucanlar yaymak ve onları iyi beslenen tutmak için.
2. Senkron kültürün hazırlanması
- Solucanları iyi beslenmiş, gravid hermafroditlerden oluşan bir tabak beyazlatarak senkronize edin. Bir ağartma protokolü Porta-de-la-Riva ve ark.29açıklanmıştır. Embriyoların 24 °C'de bir santrifüj tüpünde bir gecede yumurtadan çıkmalarına izin verin ve 10 mL'lik M9 minimal ortam (M9) tamponu üzerinde dönerler. Bu tutuklanan L1 larvaları bir kültür üretecek.
- 10 dakika boyunca buz üzerinde tutuklanan L1 sahne larvaları tüp kuluçka, sonra buz soğuk 1x M9 ile tüp kapalı üst.
- Larvaları 600 x g'de 4 °C'de 5 dk için peletlemek için bir santrifüj kullanın. Supernatant'ı dikkatlice aspire edin, böylece sadece 1-2 mL supernatant kalır.
- Larva peletini yeniden askıya alın ve 2 μL'lik askılı larva kültürünü cam bir kaydırağa aktarmak için bir mikropipet kullanın. Larva kültürünün yoğunluğunu belirlemek için kaç larva bulunduğunu sayın, bu da solucanların 2.5.
NOT: 10-15 L1 larva/1 μL yoğunluğu tohumlama için iyi çalışır. - 60 mm OP50 plaka üzerinde yaklaşık 100-120 L1 etap larvatohum için gerekli larva kültürünün hacmi aktarmak için bir mikropipet kullanın. Örneğin, 10 L1 larva/1 μL kültür yoğunluğuna sahip larva kültürünün 10 μL'si tohum.
NOT: Larvaları tohumlamak için 40 μL'lik bir hacmi aşmayın veya fazla sıvı OP50 çimlerini bozar. Kültür hacmi 40 μL'yi aşarsa, hacmi daha da azaltmak ve larva kültürünün yoğunluğunu artırmak için 2.3-2.4 adımlarını tekrarlayın. - 24 °C'de solucan yetiştirin. L1'lerin plakaya tohumunun ne zaman tohumlataolduğunu kaydedin ve diseksiyon için ideal zamanı belirlemek için gelişim aşamasını periyodik olarak kontrol edin.
NOT: L1'lerin tohumlanmasından 52 saat sonra, 24 °C'de kültürlenen solucanlar genellikle genç yetişkin evresindedir, bu da gonad hedefli PLA için diseksiyon için ideal bir aşamadır. Ancak, senkronize solucanların genç yetişkin aşamasına ulaşma süresi suşlar ve kuluçka sıcaklığı arasında değişebilir.
3. Diseksiyon/gonad ekstrüzyonu
NOT: Gonad ekstrüzyonu için diseksiyon gonad hedefli PLA'nın başarılı bir şekilde çalışması için gereklidir. Bu yaklaşım aynı zamanda PLA için bu protokolü kullanarak çalışan embriyoları da serbest bırakabilir (daha fazla bilgi için Tartışma'ya bakın). Diseksiyondan sonra hem negatif kontrol hem de deney numuneleri sabitlenir ve PLA için paralel olarak tedavi edilir. Ayrıca, floresan co-immunostaining23 amacıyla protein ortaklarının ifade desenlerini göstermek için ek bir örnek seti hazırlanması önerilmektedir.
- 30-40 genç yetişkin solucanı 500 μL 1x M9 + levamisole (2,5 mM son konsantrasyon) içeren bir saat cam çanağı içine seçin. Solucanlar topladıktan sonra, dikkatle kaldırmak ve solucanlar ile birlikte transfer bakterileri kaldırmak için ortamın çoğunu atın.
- 1x M9 + levamisole taze 500 μL ekleyin ve yavaşça çizmek ve solucanlar durulama medya dağıtmak için pipet kullanın. Solucanlarla birlikte aktarılan bakterileri temizlemek için ortamın çoğunu dikkatlice çıkarın ve atın.
- Tüm bakteriler uzaklaştırılana kadar bu adımı 2x-3x tekrarlayın. Yıkar lar tamamlandıktan sonra, susuz kalmak için solucanları yaklaşık 100 μL'lik bir ortama bırakın.
NOT: Solucanların 7 dakikadan uzun süre medyada bekletme, çünkü bu diseksiyon sırasında gondadların ekstrüzyonunu bozar. Solucanların kaybolmaması için ortamın kaldırılmasını izlemek için mikroskopun kesilmesi yardımıyla yıkar lar.
- Tüm bakteriler uzaklaştırılana kadar bu adımı 2x-3x tekrarlayın. Yıkar lar tamamlandıktan sonra, susuz kalmak için solucanları yaklaşık 100 μL'lik bir ortama bırakın.
- Cam veya polietilen pipet kullanarak solucanları %0,001 poli-L-l-lizin ile kaplanmış 25 mm x 75 mm mikroskop slaytına aktarın (bu işlemde kullanılan slaytlar epoksi kaplı çevreye sahiptir ve her biri 14 mm x 14 mm olmak üzere üç çalışma alanı bırakır). Fazla ortamları, yaklaşık 10-15 μL'lik ortam kalacak şekilde kaldırın.
- Bir diseksiyon mikroskobu yardımıyla ve iki 26 gauge iğnekullanarak, uçları makas bir çift oluşturacak şekilde diğer üzerinde bir iğne yerleştirin. Bu şekilde odaklı iğneler kullanarak, germlines serbest bırakmak için farinks arkasında solucanlar kesti. 5 dakika içinde tüm solucanları ayırın.
NOT: Gervaise ve Arur30'unbir önceki yayınında diseksiyonun nasıl yapılacılacılailgili daha fazla ayrıntılı bilgi - Tüm solucanlar kesildikten sonra, 22 mm x 40 mm'lik bir kapağı yavaşça kaydırağa dik olacak şekilde yerleştirin. Kapak kaymasının uçları slayttan sarkmalıdır.
- En az 20 dakika boyunca kuru buz üzerinde tutulan önceden soğutulmuş alüminyum blok üzerinde slaytlar dondurun.
4. Fiksasyon/engelleme
- Fiksasyon ayarı için hazır olduğunuzda, bir kalem veya diğer künt kenarlı aletle kapakları hafifçe kaydırın ve kaydırağı hemen 1 dakika boyunca taze, buz gibi metanol (soğutulmuş -20 °C)içeren bir kavanoza daldırın.
- Bir sonraki reaktifin numunenin etrafındaki yüzey gerilimi tarafından tutulabilmesi için numuneyi çevreleyen slaytın kenarlarını yavaşça silin. RT'de 5 dakika için 150 μL fiksatif (%100 mM KH 2 PO 4'te%2formaldehit, pH = 7,2) uygulayın.4,
NOT: Ayrıca bir metanol / aseton fiksasyon prosedürü test ettik31,32 ve PLA reaksiyonu ile uyumlu olduğunu bulundu. - Fiksatif slayt kapalı çalıştırmak ve kağıt havlu içine absorbe izin dik 90 ° açıyla bir kağıt havlu slayt dokunun. 50 mL 1x PBS/1% Triton X-100/1% büyükbaş hayvan serum albumini (PBT/BSA) ile coplin kavanozda RT'de 15 dakika boyunca 2x kaydırağı engelleyin.
NOT: Coplin kavanozveya boyama kavanoz diğer türleri bu engelleme adımı ve bölüm 6-9 aşağıdaki yıkama adımları için tavsiye edilir. Bunlar, numuneyle birlikte tampon un etkin bir şekilde değiştirilmesi veya yıkanması için yeterli hacimsağlar. - %10 normal keçi serumu içeren PBT/BSA solüsyonu ile slaytları bloke edin. Slaydın çevreleyen kenarları hafifçe silin ve çözeltinin 100 μL'sini slayta uygulayın. Nemli bir odada RT'de 1 saat kuluçka.
NOT: Bu adım αFLAG primer antikor ile boyama için şiddetle tavsiye edilir. Nemli hazne, kaydıraklar kuluçkaya yatarken tepsiye bant ile cam pipetler ile güvenerek inşa edilir. Sönümlenmiş görev mendilleri(Malzeme Tablosu)buharlaşmayı önlemek için tepsinin iç nemini yükseltmek için tepsiye yerleştirilir. Kapak ve tepsi, ışığa duyarlı adımlar sırasında numuneleri ışıktan korumak için folyo ile kaplanır. - PBT/BSA/10%NGS çözümünün slayttan akmasını sağlamak ve slaydın kenarlarını nazikçe silmek için kağıt havlunun üzerine kaydırak yerleştirin. Slaytları engellemek için engelleme reaktifini(Malzeme Tablosu)kullanın. 14 mm x 14 mm alana bir damla uygulayın. Nemli bir odada 37 °C'de 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
5. Primer antikor kuluçka
NOT: En iyi PLA sonuçlarını ve en az arka planı elde etmek için, primer antikorların seyreltme faktörü optimizasyon gerektirebilir (daha fazla ayrıntı için Tartışma'ya bakınız). Ayrıca, primer antikorlar PLA için kullanılan ikincil antikorların özgüllüğü maç farklı konaklarda yükseltilmelidir.
- Engelleme reaktifinin slayttan akmasını sağlamak ve kenarları nazikçe silmek için kağıt havlunun üzerine kaydırak yerleştirin. Birincil antikorları seyreltmek için antikor dilüentini(Malzeme Tablosu)kullanın. 14 mm x 14 mm uzaya 40 μL primer antikor çözeltisi uygulayın.
- Bir gecede 4 °C'de nemli bir odada kuluçkaya yat.
6. PLA prob (sekonder antikor) kuluçka
NOT: 6-9 adımlarında RT'de A ve B'yi yıkayın tamponlarını kullanın. Tamponlar 4 °C'de depolanırsa, kullanmadan önce RT'ye ısınsınlar.
- Bir Coplin kavanozunda 50 mL 1x yıkama tamponu A(Malzeme Tablosu)ile 5 dk için 2x kaydırakyı yıkayın. Coplin kavanozu 60 rpm'e ayarlanmış bir orbital shaker üzerine ayarlayın.
- Yıkama tamponunu kaydırağının akmasına izin vermek ve kenarları nazikçe silmek için kağıt havlunun üzerine kaydırak yerleştirin. PLUS ve MINUS probları içeren 40 μL'lik bir çözelti hazırlayın (antikor seyreltici ile seyreltilmiş 1:5). Çözümü her 14 mm x 14 mm alana uygulayın.
- 37 °C'de 1 saat nemli bir odada kuluçkaya yatırın.
7. Ligasyon
- 5 dakika boyunca 2x kaydıraklar 1x yıkama tampon U'nun 5 dakikayı Coplin kavanozunda RT'de yıkayın. Coplin kavanozu 60 rpm'e ayarlanmış bir orbital shaker üzerine ayarlayın.
- Ligasyon tamponunu seyreltin (Malzeme Tablosu) 1:5 ultra saf su ile. Ligase seyreltmek için bu tampon kullanın (Malzeme Tablosu) 1:40 ligasyon çözeltisi çalışan bir stok hazırlamak için.
- Yıkama arabellesinin slayttan akmasını sağlamak ve kenarları nazikçe silmek için slaydı kağıt havlunun üzerine yerleştirin. Ligasyon çözeltisinin 40 μL'sini her 14 mm x 14 mm alana uygulayın.
- 37 °C'de 30 dk nemli bir odada kuluçkaya yatırın.
8. Amplifikasyon
NOT: Kırmızı florofororlu algılama reaktiflerinin kullanılması(Malzeme Tablosu) C. elegans dokusunda en az arka plan sağlar.
- 5 dakika boyunca 2x kaydıraklar 1x yıkama tampon U'nun 5 dakikayı Coplin kavanozunda RT'de yıkayın. Coplin kavanozu 60 rpm'e ayarlanmış bir orbital shaker üzerine ayarlayın.
- Amplifikasyon kırmızı tampon seyreltmek (Malzeme Tablosu) 1:5 ultrasaf su ile. Polimeraz(Malzeme Tablosu)1:80'i seyreltmek ve amplifikasyon çözeltisi stoku hazırlamak ve ışıktan korumak için bu tamponu kullanın.
- Yıkama arabellesinin slayttan akmasını sağlamak ve kenarları nazikçe silmek için slaydı kağıt havlunun üzerine yerleştirin. Amplifikasyon çözeltisinin 40 μL'sini her 14mm x 14 mm alana uygulayın.
- 37 °C'de 1 saat ve 40 dk nemli bir odada kuluçka yalar. Numuneleri ışıktan korumak için nemli haznenin folyo ile kaplandığından emin olun.
9. Son yıkıntılar
- Bir Coplin kavanozunda RT'de 50 mL 1x yıkama tamponu B(Malzeme Tablosu)ile 10 dakika boyunca 2x kaydırakyı yıkayın. Coplin kavanozu 60 rpm'e ayarlanmış bir orbital shaker üzerine ayarlayın.
- Bir Coplin kavanozda RT'de 50 mL 0,01x yıkama tampon U ile 1 dakika boyunca 1 x kaydırakları yıkayın. Coplin kavanozu 60 rpm'e ayarlanmış bir orbital shaker üzerine ayarlayın. Bu tampon ultrasaf su ile yıkama tampon B seyreltilmesi ile hazırlanır.
10. Coverslip montaj
- Fazla yıkama tamponunun slayttan kağıt havluya akmasına izin verin ve kaydıranın epoksi kaplı çevresinde kalan artık tamponu silin.
- Numune almak için 10 μL montaj ortamı(Malzeme Tablosu)ekleyin ve yavaşça üzerine bir kapak slip döşeyerek montaj ortamının yayılmasını bekleyin.
- Coverslip ve slayt mühür için oje ile coverslip kenarına boya. Germlines zarar verecek coverslip, hareket önlemek için oje uygulaması ile nazik olun. Ojenin RT'de en az 20 dakika sertlemasına izin verin, slaytlar mikroskop altında görüntülemeden önce ışıktan korunur.
- PLA etiketli örnekler ışığa duyarlı olduğundan slaytları koyu bir kapta veya slayt tutucuda saklayın. Üretici, slaytların uzun süreli depolama için -20 °C'de veya kısa süreli depolama için 4 °C'de depolanabileceğini önermektedir. Bu protokol kullanılarak hazırlanan slaytlar 20 °C'de depolandığında en az 2 ay dayanır.
11. Görüntü edinimi
- Niceleme amacıyla, açık görüşte, hasarsız ve engelsiz ekstrüde mikrosilerin görüntülerini yakalamak için bir konfokal mikroskop kullanın. Z düzlemindeki tüm germline yayılan germline bir z-yığını yakalayın ve nicel lik için kullanılacak maksimum projeksiyon görüntüsü oluşturun.
NOT: Konfokal mikroskopi, epifloresan mikroskop kullanılarak elde edilenlere kıyasla daha az arka plana sahip PLA görüntülerini elde etmek ve ölçmek için idealdir.- Germline bir görüş alanına sığmazsa, tüm germline görüntülemek için gerekli görüş çakışan alanları yakalamak. Bu görüntülerin maksimum projeksiyonları FIJI'de bir araya getirilebilir.
- Görüntü analizi sırasında foci'nin tanımlanması için adil ve uygun bir eşik belirlemek için görüntüleme koşullarını kontrol ve deneysel numuneler arasında aynı tuttuğundan emin olun.
NOT: PLA nicelemesinin istatistiksel analizini kolaylaştırmak için her bir örneklemden her biri için en az 8-10 mikrop satırı kaydedin. Pla'nın güvenilir ve tutarlı kantitatif sonuçlar elde etmesi için en az üç biyolojik kopya önerilir.
12. FIJI/ImageJ kullanarak görüntü analizi ve nicelleştirme
NOT: Aşağıdaki iş akışı, bir confocal mikroskop üzerindeki 40x hedefi kullanılarak elde edilen ve görüntülerin .czi biçiminde kaydedildiği görüntülere dayanır. Bu .czi görüntüleri ve bunlara eşlik eden meta verilere boyutlar da dahil olmak üzere, daha fazla analiz için FIJI/ImageJ'de erişilebilir ve açılabilir. FIJI'nin konfokal dosyaların biçimini belirli bir kullanıcıtarafından kullanılabilir confocal'tan kabul edip etmediği kontrol edilmelidir. Değilse, .tiff formatındaki görüntüler alternatif olarak analiz için kullanılabilir, ancak kullanıcının görüntünün ölçeğini FIJI/ImageJ'de el ile ayarlaması gerekir (Analiz | Ölçek ayarlayın). Tüm negatif kontrol görüntülerinin arka plan düzeyini belirlemek için önce birlikte analiz edilmesi önerilir.
- Önce tüm negatif kontrol görüntülerini analiz ederek analiz iş akışını başlatın, sonra deneysel numunelere geçin. Analiz etmek için FIJI/ImageJ'de maksimum projeksiyon görüntüsünü açın (Şekil 2A). .czi dosyası kullanıyorsanız, Bir Bio-Formats Alma Seçenekleri kutusu istenir.
- Resminizi açmak için aşağıdaki seçenekleri ekleyin: Veri Tarayıcısıile yığın görüntüleyin; renk modu = Renkli. Görüntünün olduğu bir pencere, confocal (örneğin, DAPI veya PLA) tarafından yakalanan farklı kanallar arasında geçiş yapmak için bir slayt çubuğu yla açılmalıdır.
- Görüntülerin dikilmesi gerekiyorsa, görüntüyü fareyle sağ seçerek ve Yinelenen pencereyi açmak için Yinelenen'i seçerek her görüntüden her bir kanalın kopyalarını oluşturun. Yalnızca PLA veya DAPI kanalına karşılık gelen kanal numarasını (c) belirtin (örn. 2)ve Yinelenen Hyperstackiçin kutunun işaretlerini kaldırın.
- Her iki görüntü de açık dikişli olarak Eklentileri seçin | Dikiş | Amortismana uğradı | 2D dikiş. 2B Görüntüler penceresinin Dikişi açılır. Dikiş için hangi görüntülerin kullanılacağını seçin ve pencerede önceden ayarlanmış varsayılan parametreleri kullanın, ardından Tamam'ıseçin. Elde edilen görüntü birleştirilmiş gri tonlama görüntüsü olacaktır.
NOT: Alt görüntüler mükemmel bir şekilde hizalanmazsa, parametreleri ayarlamak (örneğin, kontrol edilecek tepe sayısını 5'ten 500'e çıkarmak veya doğrusal harmanlamadan Max'e füzyon yöntemini değiştirmek). Yoğunluk) istenilen görüntü elde etmek için yardımcı olabilir. Diğer dikiş araçları mevcut olmakla birlikte, bu yaklaşım sayısallaştırma için önemli olan görüntünün boyutsallığını korur.
- Klavyedeki T tuşuna basarak Yatırım Getirisi (İlgi Alanı) yöneticisini açın. YG Yöneticisi adlı yeni bir pencere açılır.
- FIJI araç seti kutusundan çokgen aracını seçin. Anahat ve roi oluşturmak için germline etrafında damla noktaları (Şekil 2B). Tam bir YG oluşturmak için son noktayı ilke bağlayın.
NOT: Daha koyu görüntüler için, daha doğru bir şekilde ana hatlarıyla ana hatlarıyla ana hatlarıyla ana hatlarıyla ana hatlarıyla ana hatlarıyla belirtilebilmek için germline'in (geri döndürülebilir) görünürlüğünü artırmak için kontrastı ayarlamak yararlıdır.- YG'yi tamamladıktan hemen sonra YG yöneticisine gidin ve YG'yi depolamak için Ekle [t] seçeneğini belirleyin. YG'de, YG'nin ve noktaların ekleme/kaldırma noktaları ve noktalarının hareketi de dahil olmak üzere herhangi bir değişikliğin bir sonraki adıma geçmeden önce güncellenmesi (YG yöneticisinden Güncelleştirme'yi seçin) veya bunların kaybolması zorunludur. ROI'ların manipülasyonu ve noktaları hakkında daha fazla ayrıntı FIJI/ImageJ Kullanım Kılavuzu'nda bulunabilir.
- YG yönlendirmesi ayarlandıktan sonra, YG yöneticisinde YG adını seçerek daha sonra başvuru için kaydedilebilir ve ardından Daha Fazla | Kaydet | (ad dosyası ve kaydetmek için hedef belirtin). Kaydedilen ROI'lar Daha Fazla seçilerek YG yöneticisinde açılabilir | Aç | (dosyayı seçin).
- YG yöneticisinden YG adını seçerek ve ardından YG yöneticisindeki Ölçü düğmesini seçerek YG içindeki alanı ölçün. Sonuç penceresi, resimde kapladığı alan (μM2) (Şekil 2B'nininset)'i de dahil olmak üzere YG hakkında bilgilerle açılır. Sonraki hesaplamalar için bu bilgileri elektronik tabloya kaydedin.
NOT: YG'nin doğru boyutlarının toplanacak şekilde görüntünün ölçeğinin düzgün ayarlandıklarından emin olun. Sonuçlar kutusunda bildirilen ölçüm türleri Analiz | Ölçümleri Ayarla.... - PLA görüntüsünü sağ seçerek ve Yinelenen (Şekil 2C)seçerek yalnızca PLA kanalının yinelenen görüntüsünü açın. Yinelenen pencere açılır. Yalnızca PLA kanalına karşılık gelen kanal numarasını (c) belirtin (örn. 2) ve Yinelenen Hyperstackiçin kutunun işaretlerini kaldırın. Bu görüntünün çoğaltılması, özgün görüntünün değiştirilmemesi için önerilir.
NOT: Bu seçenekler yalnızca FIJI/ImageJ'de birden çok kanal içeren görüntüleri görüntülerken gösterir. Alternatif bir yaklaşım kanalları bölmek için Resim | Renk | Kanalları böl,ancak bu orijinal resim dosyanızı değiştirir. - Yalnızca PLA kanalının görüntüsü seçilirse, Resim | Ayarla | Eşik. Görüntü için bir Eşik penceresi açılır. Eşik Default yöntemi olarak Varsayılan'ı, renk olarak Kırmızı'yı seçin ve Koyu arka plan kutusunu işaretleyin. Penceredeki üst parçayı kullanarak, tüm PLA odakları resimde belirgin bir şekilde vurgulanana kadar çubuğu sağa doğru kaydırın.
- Üst parçanın sağındaki kutudaki değeri kaydedin ve eşiği ayarlamak için hangi değerin kullanıldığını not alın. Eşiği sonuçlandırmak için Eşik penceresinde Uygula'yı seçin ve görüntü yalnızca siyah nokta olarak görünen eşik odakları ile beyaz bir arka plana dönüştürür (Şekil 2D). Sayısallaştırmadan önce görüntüden görüntüye tüm PLA odaklarını yakalamak için uygun olduğundan emin olmak için birkaç negatif kontrol görüntüsünde eşiği test edin.
NOT: Eşik odaklarını beyaz arka plandaki siyah nokta olarak görüntülemek için İşlem | İkili | Seçenekler... ve Siyah arka plan kutusunun işaretlerini kaldırın. 30-40 arasında bir eşik değeri germline PLA tanımlamak için iyi bir başlangıç noktasıdır; ancak, ideal değer arka plana bağlı olarak değişebilir.
- Üst parçanın sağındaki kutudaki değeri kaydedin ve eşiği ayarlamak için hangi değerin kullanıldığını not alın. Eşiği sonuçlandırmak için Eşik penceresinde Uygula'yı seçin ve görüntü yalnızca siyah nokta olarak görünen eşik odakları ile beyaz bir arka plana dönüştürür (Şekil 2D). Sayısallaştırmadan önce görüntüden görüntüye tüm PLA odaklarını yakalamak için uygun olduğundan emin olmak için birkaç negatif kontrol görüntüsünde eşiği test edin.
- PLA odaklarını ölçmek için, YG yöneticisi penceresinden YG adını seçerek eşik görüntüsüne 12.3-12.3.1 adımlarından oluşturulan YG'yi uygulayın. YG'nin anahattı, görüntüde kaynak görüntüdekiyle aynı konumda görünmelidir (Şekil 2E).
- Analize Git | Parçacıkları analiz edin. Analiz Parçacıkları penceresi açılır ve aşağıdaki parametreleri seçer: boyut (mikron^2) = 0-Sonsuzluk, dairesellik = 0.00-1.00, show = Nothing. Özetle kutusunu işaretleyin.
- Tamam'ıseçin ve Özet tablosu YG hakkında bilgi yle birlikte görünür (yani, PLA foci'nin toplam sayısı, YG'de PLA foci'nin içinde bulunan toplam alan, PLA foci'nin ortalama boyutu ve PLA foci tarafından işgal edilen alanın yüzdesi RoI'nin boyutuna göre) (Şekil 2E'nininset'i). Bu ölçümleri elektronik tabloya kaydedin.
- Aynı eşiği kullanan birkaç negatif denetim görüntüsü için 12.1-12.8 adımlarını yineleyin.
- Tüm negatif kontrol görüntüleri analiz edildikten sonra, PLA odaklarını tanımlamak ve ölçmek için negatif kontrol tarafından belirlenen eşik kullanılarak tüm deneysel numuneler için 12.1-12.8 adımlarını tekrarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her iki 3xFLAG co-immunostaining::DLC-1; GFP ve 3xFLAG::DLC-1; OMA-1:::BAYRAK ve GFP antikorları ile GFP mikropları germline ifade desenlerini ortaya koymuştur (Şekil 3Aii-iii,3Bii-iii). GFP germline boyunca ifade edilirken(Şekil 3Aiii),OMA-1:::GFP ekspresyonu geç pakimeten ve oositlerle sınırlandırılmıştır (Şekil 3Biii)27. BAYRAK immünboyama 3xFLAG gösterir::DLC-1 her iki suşlarda germline boyunca ifade edildi(Şekil 3Aii,3Bii). Co-immunostaining ile, 3xFLAG::DLC-1 ve OMA-1::GFP arasındaki örtüşme 3xFLAG::DLC-1 ve GFP (negatif kontrol) arasındaki ayırt edilemez.
Bu deneyler DLC-1 ve OMA-1 arasındaki etkileşimler için test edildiğinden, germline PLA nicelliği için ilgi bölgesi incelenen tüm mikroplardaki yumurtalar aracılığıyla geç pakimeteni kapsamaktadır (Şekil 2B), oma-1 ekspresyonunun bölgesi olduğu için (Şekil 1, Şekil 3Biii). 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP mikroplar3xFLAG göre bu bölgede PLA foci daha büyük bir miktar olduğu ortaya çıktı::DLC-1; GFP germlines (Şekil 3Ciii-iv,3Diii-iv). PLA'nın sayısallaştırılması, 3xFLAG::DLC-1'de bulunan PLA foci sayısının; OMA-1::GFP mikropları 3xFLAG::DLC-1'den önemli ölçüde büyüktü; GFP (Şekil 3Ciii-iv,3Diii-iv; Tablo 1). Ayrıca, GFP ve FLAG antikorlarının 10 kat daha yüksek seyreltilmesiyle bile, kontrol ve deneysel PLA arasındaki fark yine de önemli ölçüde farklıydı; ancak fosinin genel yoğunluğu ve ortalama boyutu azaltıldı (Tablo 1).
Şekil 1: C. elegans germline şematik. Distal uç bölgesi, meyotik pakitenin takip ettiği kök hücre havuzunu içerir ve burada hücreler mitozdan meyoze geçer. Meyyolik pachyten çıkan hücreler yumurtalara dönüşür, proksimal uçtaki en olgun oosit ile. Geç meyotik pachytene'den tüm yumurtalara kadar uzanan yeşil renkli bölge OMA-1 ifade modelini temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Germline PLA nicelemesi için iş akışının temsili görüntüleri. Bu şekilde kullanılan germline temsili 3xFLAG::DLC-1; Şekil 3C'denGFP germline. (A) Fiji/ImageJ'de açılan birleştirilmiş PLA ve DAPI kanallarının görüntüsü. (B) FIJI'deki çokgen aracı, ölçülen germline (beyaz kutularlı sarı çizgi) ilgi alanını (RoI) anahatlamak ve tanımlamak için kullanılır ve Yatırım Getirisi (μM2)alanı ölçülür (B kümesi). (C) PLA kanalının tek bir görüntüsü orijinal görüntünün (A,B) çoğaltılarak veya bölünmesiyle elde edilir. (D) Eşik, PLA görüntüsündeki tüm PLA odaklarını belirgin bir şekilde vurgulamak için dikkatlice ayarlanır. Aynı eşik birlikte analiz edilecek tüm deneysel ve kontrol görüntüleri uygulanmalıdır. (E) Eşik görüntüsünde seçilen YG ile, Analiz Parçacıkları işlevi YG içinde (E inset) içinde yer alan toplam foci sayısını içeren bir sonuç tablosu döndürecektir. Görüntüler FIJI/Image J: Eklentiler | Yardımcı Programlar | Görüntü yakalama. Ölçek çubukları = 10 μM. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Ko-immünboyama veya PLA sonrası mikropların temsili görüntüleri. (A,B) 3xFLAG etiketli proteinlerin ifade desenleri::DLC-1; GFP (Ai-iv) ve 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP (Bi-iv) diseksiyonlu, sabit ve immünosüle gondand'da değerlendirildi. Anti-FLAG antikor 1:1000 seyreltme de kullanılırken, anti-GFP antikor 1:200 seyreltme de kullanıldı, hangi immünororesans görüntüleri için en uygun olan. DNA DAPI tarafından lekelendi ve tek tek kanal daha iyi kontrast için gri tonlama gösterilir(Aiv,Biv). Her görüntüde, kök hücreler ve meyotik pachytene kesik çizgilerle özetlenirken, yumurtalar noktalı çizgilerle özetlenir. Görüntüler epifloresan mikroskopla elde edildi. Ölçek çubukları = 10 μM. (C,D) PLA ekstrüzyon 3xFLAG::DLC-1; GFP (C) ve 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP (D) gonadları. Anti-FLAG antikor 1:1000 seyreltme de kullanılırken, anti-GFP antikor 1:4000 seyreltme de kullanıldı. DNA DAPI ile boyandı ve hem bireysel DAPI(Cii,Dii)hem de PLA kanalları(Ciii,iv, Diii,iv)daha iyi kontrast için gri tonlama da gösterilmiştir. Yeşil, kesik kutu(Ciii,Diii)yakınlaştırılmış PLA görüntülerinin(Civ,Div)konumunu belirtir. Her görüntüde, kök hücreler ve meyotik pachytene kesik çizgilerle özetlenirken, yumurtalar noktalı çizgilerle özetlenir. Görüntüler konfokal mikroskopla elde edildi. Ölçek çubukları = 10 μM. (A,B,C,D) tüm görüntü işleme yazılımı ile monte edildi (Bkz. Malzeme Tablosu). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Antikor Seyreltme | Gerinim Testi | Ortalama PLA Yoğunluğu (foci/μM2) X 10-2 | T testi | PLA Foci Ortalama Boyutu (μM2) | T testi |
| αFLAG (1:1000), αGFP (1:4000) | 3xFLAG::DLC-1; GFP | 3.9 ± 1.4 | P = 1.917E-05 | 0,52 ± 0,127 | P = 0,057 |
| 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP | 9.1 ± 2.7 | 1.8 ± 2.08 | |||
| αFLAG (1:10.000), αGFP (1:40.000) | 3xFLAG::DLC-1; GFP | 3.2 ± 2.4 | P = 3.395E-04 | 0,51 ± 0,1 | P = 0,019 |
| 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP | 7.7 ± 3 | 0.7 ± 0.24 |
Tablo 1: PLA sonuçlarının özeti. Tablo primer antikor iki seyreltme pla nicel bir özeti raporlama. Her iki antikor titrasyonu arasındaki ORTALAMA PLA yoğunluğu veya PLA foci'nin ortalama boyutu arasındaki farklar anlamlı değildi (p-değeri gösterilmedi). Aynı karşılaştırma GFP'ye de uygulandı ve bu da önemli bir farka yol açtı (p değeri gösterilmedi). P-değerleri iki kuyruklu/eşit varyans t-testi kullanılarak belirlendi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C. elegans germline PPIs çalışırken, ko-immünboyama ile karşılaştırıldığında PLA tarafından sunulan yüksek çözünürlük görselleştirme ve etkileşimleri germline meydana yerlerin nicel sağlar. Daha önce DLC-1'in IN vitro GST pulldown tetkik26kullanarak OMA-1 ile doğrudan etkileşime girdiği bildirilmiştir; ancak, bu etkileşim bir in vivo pulldown tarafından kurtarılamadı. Floresan ko-immünboyboya 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP germlines DLC-1 ve OMA-1 için ifade desenleri bir örtüşme gösterir; ancak, germline etkileşimlerinin nerede oluştuğuna dair bir belirti yoktur ve örtüşme kendisi 3xFLAG::DLC-1 ve GFP arasında herhangi bir proteine (negatif kontrol) kaynaştırılmayan 3xFLAG::DLC-1 arasında olduğundan daha büyük değildir. Situ PLA'da kullanılarak, DLC-1'in mikropla OMA-1 ile etkileştiği saptandı, bu da PLA'nın ppi'lerin diğer yaklaşımlara göre daha duyarlı olabileceğini düşündürmektedir. Bu yaklaşım la, Bir RBP kofactor olarak DLC-1 ortaya çıkan rolü üzerine genişletmeye devam ediyor. Bu çalışma pla germline ppis tespit yeteneğini göstermektedir ve gelecekteki kullanıcılar için kendi ilgi proteinleri arasındaki etkileşimleri keşfetmek için bir referans kurar.
PLA, kullanıcılara FRET ve BiFC gibi diğer tekniklerle ilişkili sakıncaları olmadan benzer hassasiyetle PPI'ları test etme olanağı sunar. Biyolojik olarak ilgili protein ekspresyonu düzeyleri FRET ve BiFC için uygun olmayabilir. Ayrıca, olası etkileşim ortaklarının işlevi her iki yaklaşımda da kullanılan büyük etiketlerden etkilenebilir. Ayrıca, FRET tahlilleri hazır olmayabilir özel bir mikroskopi kurulum gerektirir. PLA, ppis'leri diğer tekniklere göre incelemek için de uygun maliyetli bir yaklaşım olabilir. Kullanıcıların sadece PLA reaktifleri edinmeleri ve immünboyama için gerekli reaktiflere ek olarak görüntüleme için konfokal mikroskoba erişmeleri gerekmektedir. Görüntü analizi, herhangi bir kullanıcıtarafından ücretsiz olarak kullanılabilen açık kaynak programı FIJI/ImageJ kullanılarak gerçekleştirilir. FRET veya BiFC ile hiçbir deneyimi olmayan kullanıcılar PLA'yı uygun bir alternatif olarak görebilirler. Burada sunulan protokol sadece tipik bir immünboyama prosedürü ötesinde birkaç ek adımlar içerir, bu tekniği neredeyse immunostaining deneyimi olan herhangi bir kullanıcı için erişilebilir hale.
Gonad'ın diseksiyon ile ekstrüzyonu PLA'nın başarılı bir şekilde çalışması için önemlidir. Solucan mığalının içinde tutulan dokular bu protokol kullanılarak PLA ile etiketlenmez. Ekstrüzyonlu embriyoların bu PLA protokolü ile etkili bir şekilde etiketlendirildiğini de tespit etmiştir. Bu diseksiyon sırasında yayımlanan diğer dokuların düşündürmektedir, bağırsak gibi, ayrıca PLA ile uyumlu olması muhtemeldir. PLA'nın gonad üzerinde sağlam sinyaller ve genellikle immünboyama için kullanılan iki fiksasyon protokolü ile hazırlanan embriyo örnekleri ürettiği bulunmuştur. Bu, alanında kullanılan ek fiksasyon yordamlarının PLA ile uyumlu olabileceğini, ancak kullanıcı tarafından ayrı ayrı değerlendirilmesi gerekeceğini göstermektedir.
Primer antikorların optimal seyreltilmesinin belirlenmesi başarılı PLA için çok önemlidir. Bu immünoresans için optimize edilmiştir seyreltme ile başlamak en iyisidir. Bu genellikle düşük arka plan ve yüksek, özel sinyal olduğu optimum seyreltme bulmak için bir immünofloresan deneyde birincil antikor titrating ile elde edilir. İmmünfloresan için en uygun seyreltmeler kurulduktan sonra, bu aynı seyreltmeler, potansiyel interaktörler tarafından üretilen sinyali, etkileşime girmeen proteinlerin kontrol çifti tarafından üretilen sinyalle karşılaştıran bir PLA testinde test edilebilir.
Kontrol numunesinde bol sinyalin gözlendiği durumlarda primer antikorların daha fazla seyreltilmesi gerekir. Pla için optimal primer antikor seyreltmelerinin immünoresans için kullanılandan en azından aynı ya da daha seyreltik olduğu bulunmuştur. Örneğin, Şekil 3A,B'deki immünororesans görüntüleri, 1:1000 anti-FLAG seyreltilmesini ve 1:200 anti-GFP seyreltilmesini temsil eder. Ancak Şekil 3C,D'deki PLA görüntülerindeki antikor seyreltmeleri 1:1000 anti-FLAG ve 1:4000 anti-GFP idi. PLA'da kullanılan anti-GFP antikorlarının seyreltilmesi immünfloresans için kullanılandan daha büyüktür ve PLA'nın çok daha duyarlı olduğunu düşündürmektedir. Seyreltme antikorların 10 kat daha fazla PLA yoğunluğunun azalmasına ve DLC-1/OMA-1 foci boyutunun azalmasına yol açtığı saptandı (Tablo 1). Bu azalmaya rağmen, negatif kontrol ile DLC-1/OMA-1 arasındaki PLA yoğunluğu farkı hala anlamlı olarak farklıydı. Bu PLA hala primer antikor yüksek seyreltme ile çok hassas olduğunu göstermektedir; ancak, saptanabilir etkileşimlerin yaygınlığı küçümsenecektir.
Buna karşılık, bir antikor seyreltme çok düşük zararlı sonuçları iki tür olabilir. İlk olarak, negatif kontrol önemli arka plan sinyali üretebilir. İkinci olarak, etkileşime girilen ortak proteinler tarafından üretilen PLA foci birleşebilir ve çakışabilir, bu da onları maksimum projeksiyon görüntüsünde çözmeyi zorlaştırabilir. Bu, görüntü analizi sırasında PLA odak sayısının ve yoğunluğunun azsayılmaya yol açar. PLA sinyali, etkileşime girmeen ortaklar arasındaki sahte yakınlığı algılamanın ve örnekte oluşan her gerçek PPI örneğini algılamanın dengesidir. Sonuç olarak, PLA deneylerinde arka plan düzeyini belirlemek için iki proteinin etkileşime giremeyen negatif bir kontrol eklenmesi esastır. Pla deneyinde primer antikor ihmali diğer raporlarda negatif kontrol olarak kullanılmıştır9,10; ancak bu yaklaşım, deneysel PLA'da sonucu etkileyebilecek nonspesifik etkileşimleri veya nonspesifik antikor bağlanmasını açıklayamaz. DLC-1 ve GFP arasında doğrudan etkileşim beklendiğiiçin GFP burada negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Negatif kontrolde bazı arka plan sinyali olduğu tespit edildi. Bu, deneysel verileri değerlendirirken PLA telbetteiçin negatif kontrolün önemini daha da destekler.
PLA için optimize edilmiş seyreltmeler kurulduktan sonra, bu seyreltmeler, aynı yakınlık etiketleri ile etiketlenmiş farklı etkileşim ortakları çiftleri içeren farklı solucan suşları bir dizi genelinde test etmek için kullanılabilir. Antikor yakınlığındaki varyasyon PLA deneyinin sonucunu etkileyebileceğinden, ortaya çıkan PLA sinyallerinin adil bir şekilde karşılaştırılmasını sağlamak için aynı çift primer antikor kullanmak önemlidir. PLA ile ilgili başka bir rapor, PLA sekonder antikorlarının seyreltilmesini optimize etme yi öneriyor10; ancak, bu önerilmez. Sekonder antikorların daha yüksek seyreltilmesi, ikincil antikorlara konjuge olan PLUS ve MINUS problarının tanınmasına bağlı olan diğer downstream PLA adımlarının etkinliğini azaltabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yok.
Acknowledgments
Bu çalışmada kullanılan bazı nematod suşları NIH (P40OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi tarafından sağlanmıştır. Nih Ödülleri P20GM103546 ve S10OD021806'nın desteğiyle işletilen Montana BiyoSpektroskopi Çekirdek Araştırma Laboratuvarı'nda konfokal mikroskopi yapıldı. Bu çalışma kısmen NIH'nin GM109053'ü E.V.'ye, American Heart Association Fellowship 18PRE34070028'i X.W.'ye ve Montana Academy of Sciences ödülü ile X.W.'ye desteklenmiştir. Fon çalışmaları tasarımı veya rapor yazma dahil değildi. Tartışma için M. Ellenbecker'a teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy services | 15710 | used to make 4% working solution |
| 1M KH2PO4 | Sigma | P0662 | Prepare a 1M working stock |
| 1x M9 | various | various | prepared as 10x stock used at 1x; see wormbook.org for protocol |
| 1x PBS | various | various | see wormbook.org for protocol |
| 26.5 Gauge Needle | Exel International | 26402 | Needles used for dissection |
| BSA | Lampire | 7500802 | |
| Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 05-529C | 50ml Oak ridge centrifuge tube used for synchronization |
| Confocal Microscope | Zeiss | 880 | |
| Coplin Jar | PolyLab | 62101 | |
| Coverslip to Freeze Sample | Globe Scientific | 1411-10 | 22x40mm, No. 1 |
| Coverslip to Seal Slide | Globe Scientific | 1404-15 | 22x22mm, No. 1.5 |
| DAPI Mounting Medium for Immunofluorescence | Vector | H-1200 | |
| Ligase | Sigma-Aldrich | DUO82029 | Duolink 1x Ligase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
| Amplification red buffer | Sigma-Aldrich | DUO82011 | Duolink 5x Amplification Red buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
| Ligation Buffer | Sigma-Aldrich | DUO82009 | Duolink 5x Ligation buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
| Antibody Diluent | Sigma-Aldrich | DUO82008 | Duolink antibody diluent,Comes with DUO92004 and DUO92002, Note: A 1x PBS/1% BSA solution can also be used as a substitute to dilute the antibody. |
| Blocking Solution | Sigma-Aldrich | DUO82007 | Duolink blocking solution, Comes with DUO92004 and DUO92002 |
| Mounting Medium for PLA | Sigma-Aldrich | DUO82040 | Duolink In Situ mounting medium with DAPI |
| MINUS Probe | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS |
| PLUS Probe | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS |
| Wash Buffer A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink In Situ wash Buffer A |
| Wash Buffer B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink In Situ wash Buffer B |
| Polymerase | Sigma-Aldrich | DUO82030 | Duolink Polymerase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
| Epifluorescent Microscope | Leica | DFC300G camera, DM5500B microscope | |
| Goat anti-mouse Alexa 594 | JacksonImmuno | 115-585-146 | Use at 1:500 |
| Goat anti-rabbit Alexa 488 | JacksonImmuno | 111-545-144 | Use at 1:200 |
| Image Processing Software | Adobe | Adobe Photoshop + Illsutrator CS3 | |
| Glass Pipette | Corning | 7095B-5X | |
| Levamisole | ACROS Organics | 187870100 | Prepare a 250mM working stock |
| Methanol | Fisher Scientific | A454 | |
| Mouse anti-FLAG | Sigma | F1804 | Use at 1:1000 for immunofluorescence and PLA, pre-block with normal goat serum recommended |
| Nailpolish | L.A. colors | CNP195 | |
| Nematode Growth Medium (NGM) | various | See wormbook.org for protocol | |
| Normal Goat Serum | JacksonImmuno | 005-000-121 | |
| Polyethylene Pasteur Pipette | Globe Scientific | 135030 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | Prepared as 0.1% stock solution in water, stored at -20C, and diluted 1:100 in water to coat slides |
| Petri Dishes | Tritech | PD7060 | 60 mm diameter |
| Rabbit anti-GFP | Thermo Fisher | G10362 | Use at 1:200 for immunofluorescence, 1:4000 for PLA |
| Slides | Thermo Fisher | 30-2066A-Brown | Three-square 14x14mm autoclavable slides with bars are custom-ordered through Fisher Scientific. Poly-L-Lysine added to slides in the lab |
| Sodium Hypochlorite solution | Fisher Scientific | SS290-1 | |
| task wipes | Kimtech | 34120 | 4.4x8.4 inch task wipes |
| Trays (242x241x20mm) | Thermo Fisher | 240845 | Used to make humid chamber |
| Triton X-100 | ACROS Organics | 327372500 | |
| Ultrapure water | Milli-Q | Ultrapure water obtained from Milli-Q Integral Water Purification System | |
| Watchglass | Carolina Biological | 742300 | |
| -20 °C freezer | |||
| -80 °C freezer | |||
| Aluminum Foil | |||
| OP50 strain E. coli | |||
| Orbital Shaker | |||
| Tape | |||
| Nematode strains used in this study (both available upon request) | |||
| mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475] | UMT 376 | dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Reference 24 | |
| mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III | UMT 422 | dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Reference: this study |
References
- Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Nooren, I. M., Thornton, J. M.
- Patil, A., Kinosselecta, K., Nakamura, H.
- De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), e1000807 (2010).
- Pazdernik, N., Schedl, T. Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 1-16 (2013).
- Nousch, M., Eckmann, C. R. Translational control in the Caenorhabditis elegans germ line. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 205-247 (2013).
- Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).
- Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).
- Thymiakou, E., Episkopou, V. Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Wang, S., et al. Detection of in situ protein-protein complexes at the Drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay. Journal of Visualized Experiments. (95), 52139 (2015).
- Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
- Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. Biotechniques. 53 (5), 285-298 (2012).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Science. 32 (9), 407-414 (2007).
- Hiatt, S. M., Shyu, Y. J., Duren, H. M., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Methods. 45 (3), 185-191 (2008).
- Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
- Wilson, M. J., Salata, M. W., Susalka, S. J., Pfister, K. K. Light chains of mammalian cytoplasmic dynein: identification and characterization of a family of LC8 light chains. Cell Motility and Cytoskeleton. 49 (4), 229-240 (2001).
- Erdős, G., et al. Novel linear motif filtering protocol reveals the role of the LC8 dynein light chain in the Hippo pathway. PLoS Computational Biology. 13 (12), e1005885 (2017).
- Navarro-Lérida, I., et al. Proteomic identification of brain proteins that interact with dynein light chain LC8. Proteomics. 4 (2), 339-346 (2004).
- Rapali, P., et al. DYNLL/LC8: a light chain subunit of the dynein motor complex and beyond. FEBS Journal. 278 (17), 2980-2996 (2011).
- Rapali, P., et al. Directed evolution reveals the binding motif preference of the LC8/DYNLL hub protein and predicts large numbers of novel binders in the human proteome. PLoS One. 6 (4), e18818 (2011).
- Clark, S. A., Jespersen, N., Woodward, C., Barbar, E. Multivalent IDP assemblies: Unique properties of LC8-associated, IDP duplex scaffolds. FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2543-2551 (2015).
- Jespersen, N., et al. Systematic identification of recognition motifs for the hub protein LC8. Life Science Alliance. 2 (4), (2019).
- Wang, X., et al. Dynein light chain DLC-1 promotes localization and function of the PUF protein FBF-2 in germline progenitor cells. Development. 143 (24), 4643-4653 (2016).
- Dorsett, M., Schedl, T. A role for dynein in the inhibition of germ cell proliferative fate. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 6128-6139 (2009).
- Ellenbecker, M., et al. Dynein Light Chain DLC-1 Facilitates the Function of the Germline Cell Fate Regulator GLD-1 in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (2), 665-681 (2019).
- Day, N. J., Ellenbecker, M., Voronina, E. Caenorhabditis elegans DLC-1 associates with ribonucleoprotein complexes to promote mRNA regulation. FEBS Letters. 592 (22), 3683-3695 (2018).
- Detwiler, M. R., Reuben, M., Li, X., Rogers, E., Lin, R. Two zinc finger proteins, OMA-1 and OMA-2, are redundantly required for oocyte maturation in C. elegans. Developmental Cell. 1 (2), 187-199 (2001).
- Spike, C. A., et al. Translational control of the oogenic program by components of OMA ribonucleoprotein particles in Caenorhabditis elegans. Genetics. 198 (4), 1513-1533 (2014).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).
- Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
- Duerr, J. S. Antibody staining in C. elegans using "freeze-cracking". Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
- Crittenden, S., Kimble, J. Preparation and immunolabeling of Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2009).
