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Developmental Biology

सी एलिगेंस जर्मलाइन में रिब्रोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स असेंबली के सीटू डिटेक्शन में निकटता लिगेशन परख का उपयोग कर

Published: May 5, 2020 doi: 10.3791/60982
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Biological Sciences, University of Montana

Summary

यह प्रोटोकॉल सी एलिगेंस जर्मलाइन में सीटू में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की जांच के लिए निकटता लिगेशन परख के उपयोग को दर्शाता है।

Abstract

यह समझना कि प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) कब और कहां होते हैं, कोशिका में प्रोटीन फ़ंक्शन को समझने के लिए महत्वपूर्ण है और विकास जैसी व्यापक प्रक्रियाएं कैसे प्रभावित होती हैं। कैनोरहैब्डिटिस एलेग्नस जर्मलाइन पीपीआई का अध्ययन करने के लिए एक महान मॉडल प्रणाली है जो स्टेम सेल, मेयोसिस और विकास के नियमन से संबंधित है। विभिन्न प्रकार की अच्छी तरह से विकसित तकनीकें हैं जो मानक एंटीबॉडी द्वारा मान्यता के लिए ब्याज के प्रोटीन को टैग करने की अनुमति देती हैं, जिससे इस प्रणाली को निकटता लिगेशन परख (पीएलए) प्रतिक्रियाओं के लिए लाभप्रद बना दिया जाता है। नतीजतन, पीएलए यह दिखाने में सक्षम है कि पीपीआई वैकल्पिक दृष्टिकोणों की तुलना में अधिक प्रभावी ढंग से जर्मलाइन में स्थानिक और लौकिक तरीके से कहां होते हैं । यहां वर्णित सी एलिगेंस जर्मलाइन में पीपीआई की जांच करने के लिए इस तकनीक के आवेदन और मात्राकरण के लिए एक प्रोटोकॉल है।

Introduction

80% से अधिक प्रोटीन ों के अन्यअणुओंके साथ बातचीत होने का अनुमान है , जो इस बात पर जोर देता है कि सेल2में विशिष्ट जैविक कार्यों के निष्पादन के लिए पीपीआई कितना महत्वपूर्ण है । कुछ प्रोटीन बड़े परिसरों की असेंबली को सुविधाजनक बनाने वाले हब के रूप में कार्य करते हैं जो सेल सर्वाइवल के लिए आवश्यक हैं1. ये हब कई पीपीआई में मध्यस्थता करते हैं और प्रोटीन को एक नेटवर्क में व्यवस्थित करने में मदद करते हैं जो सेल3में विशिष्ट कार्यों की सुविधा प्रदान करता है । प्रोटीन परिसरों का गठन जैविक संदर्भ से भी प्रभावित होता है, जैसे विशिष्ट बातचीत भागीदारों की उपस्थिति या अनुपस्थिति4,सेल सिग्नलिंग घटनाओं, और एक कोशिका के विकासात्मक चरण।

सी एलिगेंस आमतौर पर विकास सहित विभिन्न अध्ययनों के लिए एक आदर्श जीव के रूप में उपयोग किया जाता है। इस जानवर की सरल शरीर रचना में कई अंग शामिल हैं, जिनमें गोनाड, आंत और पारदर्शी छल्ली शामिल है, जो कीड़ा विकास के विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है। गोंद में रहने वाली जर्मलाइन यह अध्ययन करने के लिए एक महान उपकरण है कि कैसे जर्मलाइन स्टेम सेल गेमट्स5 में परिपक्व होते हैं जो भ्रूण में विकसित होते हैं और अंततः संतान की अगली पीढ़ी। जर्मलाइन के डिस्टल टिप क्षेत्र में आत्म-नवीनीकरण स्टेम कोशिकाओं का एक पूल होता है(चित्रा 1)। स्टेम सेल आला छोड़ने के रूप में, वे मेयोटिक पचिटेन में प्रगति करते हैं और अंततः युवा वयस्क चरण(चित्रा 1)में ओसाइट्स में विकसित होते हैं। जर्मलाइन में विकास के इस कार्यक्रम को विभिन्न तंत्रों के माध्यम से कसकर विनियमित किया जाता है, जिसमें आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन (आरबीपी)6द्वारा सुविधा प्रदान किए जाने वाले पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल नियामक नेटवर्क शामिल हैं। पीपीआई इस नियामक गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण हैं, क्योंकि आरबीपीएस अपने कार्यों को लागू करने के लिए अन्य कोकारकों के साथ संबद्ध है।

ऐसे कई दृष्टिकोण हैं जिनका उपयोग कीड़ा में पीपीआई की जांच करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन प्रत्येक की अनूठी सीमाएं हैं। वीवो इम्यूनोप्रिसिप्रिशन (आईपी) में प्रोटीन-प्रोटीन परिसरों को पूरे कृमि अर्क से अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, यह दृष्टिकोण यह नहीं बताता है कि कीड़ा में पीपीआई कहां होता है। इसके अलावा, प्रोटीन परिसर जो विकास के एक विशिष्ट चरण के दौरान या सीमित संख्या में कोशिकाओं के रूप में क्षणिक और केवल रूप में होते हैं, सह-इम्यूनोप्रिसिप्रिशन द्वारा ठीक करना मुश्किल हो सकता है। अंत में, आईपी प्रयोगों को lysis और आत्मीयता मैट्रिक्स पर प्रोटीन की गैर विशिष्ट अवधारण के बाद प्रोटीन जटिल पुनर्वर्गीकरण की चिंताओं को दूर करने की जरूरत है ।

पीपीआई के सीटू डिटेक्शन में वैकल्पिक दृष्टिकोण सह-इम्यूनोस्टेनिंग, फॉर्स्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरटी), और द्विआणविक फ्लोरेसेंस पूरण (बीएफसी) हैं। सह इम्यूनोस्टेनिंग निश्चित कृमि ऊतक में ब्याज के दो प्रोटीन का एक साथ पता लगाने और सिग्नल सहस्थानीयकरण की सीमा के माप पर निर्भर करता है। सुपर-रेजोल्यूशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग, जो मानक माइक्रोस्कोपी7की तुलना में अधिक विस्तार प्रदान करता है, 200-300 एनएम8के विवर्तन-सीमित बाधा से परे प्रोटीन कोस्थानीयकरण का अधिक कड़ाई से परीक्षण करने में मदद करता है। हालांकि, पारंपरिक और सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी दोनों का उपयोग करके सह-इम्यूनोस्टेनिंग अच्छी तरह से परिभाषित स्थानीयकरण पैटर्न के साथ प्रोटीन के लिए सबसे अच्छा काम करता है। इसके विपरीत, यह फैलाना वितरित बातचीत भागीदारों के लिए बहुत कम जानकारीपूर्ण हो जाता है। ओवरलैप के आधार पर संकेतों के सह-स्थानीयकरण के लिए मापने से इस बारे में सटीक जानकारी नहीं मिलती कि प्रोटीन एक दूसरे के साथजटिल हैं यानहीं 9,10।

इसके अलावा, प्रोटीन-प्रोटीन परिसरों के सह-इम्यूनोप्रिसिप्रिशन और सह-इम्यूनोस्टेनिंग मात्रात्मक नहीं हैं, जिससे यह निर्धारित करना चुनौतीपूर्ण हो जाता है कि क्या ऐसी बातचीत महत्वपूर्ण है । FRET और BiFC दोनों फ्लोरोसेंट आधारित तकनीक हैं। FRET फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपीएस) के साथ ब्याज के प्रोटीन टैगिंग पर निर्भर करता है कि स्पेक्ट्रल ओवरलैप है जिस पर एक एफपी (दाता) से ऊर्जा एक और एफपी (स्वीकारकर्ता)11को हस्तांतरित किया जाता है । ऊर्जा के इस गैर-विकिरणीय हस्तांतरण के परिणामस्वरूप स्वीकारकर्ता एफपी का फ्लोरेसेंस होता है जिसे उत्सर्जन की अपनी संबंधित तरंगदैर्ध्य में पता लगाया जा सकता है। बीएफसी वीवो मेंफ्लोरोसेंट प्रोटीन के पुनर्गठन पर आधारित है . यह दो पूरक टुकड़ों में बंटवारे GFP जरूरत पर जोर देता है, जैसे हेलिक्स 1-10 और हेलिक्स १११२,जो तो ब्याज के दो प्रोटीन के लिए जुड़े रहे हैं । यदि ये दो प्रोटीन बातचीत करते हैं, तो जीएफपी के पूरक टुकड़े गुना और इकट्ठा होने के निकटता में काफी करीब हो जाते हैं, जीएफपी फ्लोरोफोर को फिर से तैयार करते हैं। पुनर्गठित जीएफपी को सीधे फ्लोरेसेंस के रूप में मनाया जाता है और इंगित करता है कि पीपीआई कहां हुई है।

जैसे, एफआरईटी और बीआईएफसी दोनों बड़े फ्लोरोसेंट टैग पर निर्भर करते हैं जो टैग किए गए प्रोटीन के कार्य को बाधित कर सकते हैं। इसके अलावा, FRET और BiFC सटीक डेटा प्राप्त करने के लिए टैग प्रोटीन की प्रचुर मात्रा में और तुलनीय अभिव्यक्ति की आवश्यकता है । FRET उन प्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है जहां एक साथी दूसरे से अधिक है, जो उच्च पृष्ठभूमि13का कारण बन सकता है। बीएफसी प्रयोगों में अतिअभिव्यक्ति से भी बचा जाना चाहिए, क्योंकि इससे गैर-विशिष्ट असेंबली14 को प्रेरित किया जा सकता है जिसके परिणामस्वरूप पृष्ठभूमि में वृद्धि होती है। दोनों तकनीकों को टैग किए गए प्रोटीन की अभिव्यक्ति और इमेजिंग स्थितियों के अनुकूलन की आवश्यकता होती है, जो प्रयोगों को पूरा करने के लिए आवश्यक समय को लम्बा कर सकती है।

निकटता लिगेशन परख (पीएलए) एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है जो ऊपर उल्लिखित तकनीकों की सीमाओं को संबोधित कर सकता है। पीएलए प्राथमिक एंटीबॉडी का लाभ उठाता है जो ब्याज के प्रोटीन (या उनके टैग) को पहचानता है। ये प्राथमिक एंटीबॉडी तब माध्यमिक एंटीबॉडी से बंधे होते हैं जिनमें ओलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच होती है जो 40 एनएम (या छोटी) दूरी15के भीतर एक-दूसरे के साथ संकरण कर सकते हैं। जिसके परिणामस्वरूप संसंकरित डीएनए एक पीसीआर प्रतिक्रिया के माध्यम से परिलक्षित होता है, जो डीएनए के पूरक जांच द्वारा पाया जाता है । इसके परिणामस्वरूप फोसी होता है जो माइक्रोस्कोप द्वारा कल्पना की जाती है। यह तकनीक जटिल ऊतकों (यानी, कृमि गोंड़) में सीटू में पीपीआई का पता लगा सकती है, जो विकास और भेदभाव के विभिन्न चरणों में कोशिकाओं वाली असेंबली लाइन के रूप में आयोजित की जाती है। पीएलए के साथ, पीपीआई को सीधे एक निश्चित कृमि गोंड में कल्पना की जा सकती है, जो विकास के एक विशिष्ट चरण के दौरान पीपीआई होते हैं या नहीं, इसकी जांच करने के लिए लाभप्रद है। पीएलए पीपीआई का अधिक से अधिक समाधान प्रदान करता है, जैसा कि सह-स्थानीयकरण आधारित परखों के विपरीत है, जो सटीक माप बनाने के लिए आदर्श है । यदि उपयोग किया जाता है, तो सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी में सेल के भीतर पीएलए फोसी के स्थान के बारे में बेहतर विवरण प्रदान करने की क्षमता है। एक और लाभ यह है कि पीएलए प्रतिक्रियाओं के परिणामस्वरूप फोसी को इमेजजे-आधारित विश्लेषण कार्यप्रवाह द्वारा गिना जा सकता है, जिससे यह तकनीक मात्रात्मक हो जाती है।

dynein प्रकाश श्रृंखला के LC8 परिवार पहले dynein मोटर परिसर16 के एक उपइकाई के रूप में वर्णित किया गया था और एक कार्गो एडाप्टर के रूप में सेवा करने की परिकल्पना की । अपनी प्रारंभिक खोज के बाद से, एलसी8 में डिनेइन मोटर कॉम्प्लेक्स17,18,1919,20के अलावा कई प्रोटीन परिसरों में पाया गया है । एलसी 8 इंटरैक्शन मोटिफ19 में मौजूद प्रोटीन सीक्वेंस के लिए स्कैनिंग से पता चलता है कि एलसी8 में विभिन्न प्रोटीनों की एक विस्तृत सरणी17,18,19,,20 ,21,21,22के साथ कई बातचीत हो सकती है । नतीजतन, एलसी 8 परिवार प्रोटीन को अब हब माना जाता है जो बड़े प्रोटीन परिसरों19,,22की असेंबली को बढ़ावा देने में मदद करते हैं, जैसे आंतरिक रूप से अस्त-व्यस्त प्रोटीन21की विधानसभाएं ।

एक सी एलिगेंस एलसी 8-फैमिली प्रोटीन, डायनेइन लाइट चेन-1 (डीएलसी-1), कई ऊतकों में व्यापक रूप से व्यक्त किया जाता है और विशिष्ट उपकोशिकीय संरचनाओं में समृद्ध नहींहोता है 23,,24। नतीजतन, सी एलिगेंस में डीएलसी-1 के वीवो भागीदारों में जैविक रूप से प्रासंगिक की पहचान कई कारणों से चुनौतीपूर्ण है: 1) सह-इम्यूनोप्रिसिप्रिफिकेशन ऊतक स्रोत को इंगित नहीं करता है जहां बातचीत होती है; 2) विशेष भागीदारों या क्षणिक बातचीत की सीमित अभिव्यक्ति सह-इम्यूनोप्रिसिप्रिशन द्वारा बातचीत का पता लगाने की क्षमता में बाधा डाल सकती है; और 3) डीएलसी-1 का फैलाना वितरण सह-इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा संभावित साथी प्रोटीन के साथ गैर-विशिष्ट ओवरलैप की ओर जाता है। इन चुनौतियों के आधार पर पीएलए डीएलसी-1 के साथ वीवो इंटरैक्शन में परीक्षण के लिए एक आदर्श दृष्टिकोण है ।

पहले यह बताया गया है कि डीएलसी-1 सीधे के साथ बातचीत करता है और आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन (आरबीपी) एफबीएफ-223 और जीएलडी-125के लिए एक सहकारक के रूप में कार्य करता है । हमारा काम डीएलसी-1 के मॉडल को हब प्रोटीन के रूप में परोसने का समर्थन करता है और पता चलता है कि डीएलसी-1 एक इंटरैक्शन नेटवर्क की सुविधा प्रदान करता है जो19,22से आगे फैला है । जीएसटी पुलडाउन परख का इस्तेमाल करते हुए ओएमए-1 नाम की एक नई डीएलसी-1-इंटरैटिंग आरबीपी की पहचान26कर दी गई है । ओएमए-1 ओसाइट विकास और मेओटिक परिपक्वता27 के लिए महत्वपूर्ण है और कई ट्रांसलेशनल दमनकों और एक्टिवेटर28के साथ मिलकर कार्य करता है। जबकि एफबीएफ-2 और जीएलडी-1 क्रमशः स्टेम सेल और मेओटिक पचिटेन क्षेत्रों में व्यक्त किए जाते हैं, ओमा-1 को ओसाइट्स27 (चित्रा 1)के माध्यम से मेयोटिक पचिटेन से जर्मलाइन में विरूपित रूप से व्यक्त किया जाता है। इससे पता चलता है कि डीएलसी-1 गोंड़ के विभिन्न क्षेत्रों में आरबीपी के साथ परिसर बनाता है। यह भी पाया गया है कि वीवो आईपी में डीएलसी-1 और ओएमए-1 के बीच सीधी बातचीत का पालन नहीं किया जाता है। पीएलए को सी एलिगेंस जर्मलाइन में इस बातचीत का आगे अध्ययन करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है, और परिणाम बताते हैं कि पीएलए का उपयोग कीड़ा में कई अन्य पीपीआई की जांच करने के लिए किया जा सकता है ।

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Protocol

नोट: यह प्रोटोकॉल सी एलिगेंस उपभेदों का उपयोग करता है जिसमें संभावित इंटरैक्शन पार्टनर दोनों टैग किए जाते हैं। यह दृढ़ता से सिफारिश की जाती है कि एक नकारात्मक नियंत्रण तनाव का उपयोग किया जाए, जिसमें एक टैग किए गए प्रोटीन को किसी अन्य टैग किए गए उम्मीदवार इंटरैक्शन पार्टनर के साथ बातचीत करने की उम्मीद नहीं है। यहां, अकेले जीएफपी का उपयोग पृष्ठभूमि का आकलन करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था, क्योंकि डीएलसी-1 को कीड़ा में जीएफपी के साथ बातचीत करने की उम्मीद नहीं है। जीएफपी-टैग किए गए ओएमए-1 का उपयोग प्रयोगात्मक तनाव के रूप में किया गया था, क्योंकि प्रारंभिक डेटा डीएलसी-1 के साथ बातचीत का सुझाव देता है। नेमाटोड उपभेदों सह नियंत्रण व्यक्त करने और 3xFLAG टैग डीएलसी-1 के साथ प्रोटीन का परीक्षण इस पाठ में 3xFLAG: :DLC-1 के रूप में संदर्भित कर रहे हैं; जीएफपी और 3xFLAG: :Dएलसी-1; ओएमए-1:: जीएफपी (अनुरोध पर उपलब्ध उपभेद; सामग्री की तालिकामें अधिक जानकारी), क्रमशः। यहां, 3xFLAG और GFP टैग का उपयोग किया जाता है; हालांकि, अन्य टैग को तब तक प्रतिस्थापित किया जा सकता है जब तक कि उनके एंटीबॉडी पीएलए किट रिएजेंट्स के साथ संगत हों।

1. पशु देखभाल

  1. नेमाटोड विकास माध्यम (एनजीएम) प्लेटों पर कीड़े रखें जो ई कोलाई के OP50 तनाव के साथ वरीयता प्राप्त हैं और जीएफपी की इष्टतम अभिव्यक्ति के लिए 24 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
  2. कीड़े का प्रचार करने और उन्हें अच्छी तरह से खिलाया रखने के लिए हर 2-3 दिनों में वयस्क कीड़े पारित करें।

2. समकालिक संस्कृति की तैयारी

  1. अच्छी तरह से खिलाया, gravid hermaphrodites की एक थाली ब्लीचिंग द्वारा कीड़े सिंक्रोनाइज । पोर्टा-डी-ला-रिवा एट अल29में ब्लीचिंग प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है । भ्रूण M9 ंयूनतम मीडिया (M9) बफर के 10 mL में अंत पर अंत घूर्णन करते हुए 24 डिग्री सेल्सियस पर एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में रात भर निकलना करते हैं । यह गिरफ्तार L1 लार्वा की संस्कृति का उत्पादन करेगा।
  2. 10 मिन के लिए बर्फ पर गिरफ्तार L1 चरण लार्वा की ट्यूब इनक्यूबेट, तो बर्फ ठंड 1x M9 के साथ ट्यूब से ऊपर ।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 600 x ग्राम पर लार्वा को गोली मारने के लिए एक अपकेंद्री का उपयोग करें। ध्यान से अधिनादक को एस्पिरेट करें ताकि केवल 1-2 मीटर का अलौकिक रहता है।
  4. लार्वा के पैलेट को फिर से निलंबित करें और निलंबित लार्वा संस्कृति के 2 माइक्रोन को ग्लास स्लाइड में स्थानांतरित करने के लिए माइक्रोपाइपेट का उपयोग करें। गिनती कितने लार्वा लार्वा संस्कृति के घनत्व का निर्धारण करने के लिए मौजूद हैं, जो चरण 2.5 में कीड़े के सीडिंग का मार्गदर्शन करने में मदद करेगा।
    नोट: सीडिंग के लिए 10-15 एल1 लार्वा/1 माइक्रोन का घनत्व अच्छी तरह से काम करता है।
  5. 60 मिमी OP50 प्लेट पर लगभग 100-120 L1 चरण लार्वा बीज के लिए आवश्यक लार्वा संस्कृति की मात्रा स्थानांतरित करने के लिए एक माइक्रोपाइपेट का उपयोग करें। उदाहरण के लिए, एक लार्वा संस्कृति का बीज 10 माइक्रोन जिसमें 10 एल1 लार्वा/संस्कृति का घनत्व होता है।
    नोट: लार्वा को बीज करने के लिए 40 माइक्रोन की मात्रा से अधिक न करें, या अतिरिक्त तरल OP50 लॉन को बाधित करेगा। यदि संस्कृति की मात्रा 40 माइक्रोन से अधिक है, तो मात्रा को और कम करने और लार्वा संस्कृति के घनत्व को बढ़ाने के लिए चरण 2.3-2.4 दोहराएं।
  6. 24 डिग्री सेल्सियस पर कीड़े उगाएं। उस समय को रिकॉर्ड करें जब L1s को प्लेट पर वरीयता दी जाती है और विच्छेदन के लिए आदर्श समय की पहचान करने के लिए समय-समय पर विकास के चरण की जांच करें।
    नोट: L1s के बोने के बाद 52 घंटे में, 24 डिग्री सेल्सियस पर सुसंस्कृत कीड़े आम तौर पर युवा वयस्क चरण में होते हैं, जो गोनाड-लक्षित पीएलए के लिए विच्छेदन के लिए आदर्श चरण है। हालांकि, वास्तविक समय जिस पर सिंक्रोनाइज्ड कीड़े युवा वयस्क चरण तक पहुंचते हैं, वह उपभेदों और इनक्यूबेशन तापमान के बीच भिन्न हो सकता है।

3. विच्छेदन/गोंद निष्कासन

नोट: गोनाद को बाहर निकालने के लिए विच्छेदन गोनाड-लक्षित पीएलए के लिए सफलतापूर्वक काम करने के लिए आवश्यक है। यह दृष्टिकोण भ्रूण को भी जारी कर सकता है, जो पीएलए के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके भी काम करता है (अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें)। विच्छेदन के बाद, नकारात्मक नियंत्रण और प्रायोगिक दोनों नमूने तय किए जाते हैं और पीएलए के लिए समानांतर रूप से इलाज किया जाता है। यह भी सुझाव दिया गया है कि फ्लोरोसेंट सह इम्यूनोस्टेनिंग23 के उद्देश्य से नमूनों का एक अतिरिक्त सेट तैयार किया जाए ताकि ब्याज के प्रोटीन भागीदारों के अभिव्यक्ति पैटर्न का प्रदर्शन किया जा सके ।

  1. एक घड़ी ग्लास डिश में 30-40 युवा वयस्क कीड़े उठाओ जिसमें 1x M9 + लेवमिसोल (2.5 mM अंतिम एकाग्रता) के 500 माइक्रोन शामिल हैं। कीड़े इकट्ठा करने के बाद, कीड़े के साथ स्थानांतरित बैक्टीरिया को हटाने के लिए अधिकांश मीडिया को सावधानी से हटा दें और त्याग दें।
  2. 1x M9 + लेविसोल के ताजा 500 μL में जोड़ें और धीरे से आकर्षित करने के लिए पिपेट का उपयोग करें और कीड़े कुल्ला करने के लिए मीडिया को बांटना। कीड़े के साथ स्थानांतरित किए जाने वाले बैक्टीरिया को साफ करने के लिए अधिकांश मीडिया को सावधानी से हटा दें और त्यागें।
    1. इस स्टेप को 2x-3x तब तक दोहराएं जब तक कि सभी बैक्टीरिया निकल न जाएं। वॉश पूरा होने के बाद, हाइड्रेटेड रखने के लिए मीडिया के लगभग 100 माइक्रोन में कीड़े छोड़ दें।
      नोट: कीड़े को 7 मिन से अधिक समय तक मीडिया में न बैठने दें, क्योंकि यह विच्छेदन के दौरान गोनादों के निष्कासन को ख़राब कर देगा। मीडिया को हटाने की निगरानी के लिए माइक्रोस्कोप विच्छेदन की सहायता से धोता है ताकि कीड़े खो न जाएं।
  3. एक ग्लास या पॉलीथीन पिपेट का उपयोग करके, कीड़े को 25 मिमी x 75 मिमी माइक्रोस्कोप स्लाइड में स्थानांतरित करें जो 0.001% पॉली-एल-लाइसिन के साथ लेपित है (इस प्रक्रिया में उपयोग की जाने वाली स्लाइडों में एक एपॉक्सी लेपित परिधि होती है, जिससे तीन कार्यस्थान, 14 मिमी x 14 मिमी प्रत्येक हो जाते हैं)। अतिरिक्त मीडिया को हटा दें ताकि मीडिया का लगभग 10-15 माइक्रोन बना रहे।
  4. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप की सहायता से और दो 261/2 गेज सुइयों का उपयोग करके, एक सुई को दूसरे के ऊपर रखें ताकि सिरों कैंची की एक जोड़ी बना सके। इस फैशन में उन्मुख सुइयों का उपयोग करना, जर्मलाइन को छोड़ने के लिए फेरिन्स के पीछे कीड़े काटें। 5 मिनट के भीतर सभी कीड़े विच्छेदन।
    नोट: विच्छेदन करने के तरीके के बारे में अधिक विस्तार से Gervaise और Arur30द्वारा एक पिछले प्रकाशन में पाया जा सकता है ।
  5. सभी कीड़े विच्छेदित होने के बाद, धीरे-धीरे स्लाइड पर 22 मिमी x 40 मिमी कवरस्लिप रखें ताकि यह स्लाइड तक लंबवत हो। कवरस्लिप के सिरों को स्लाइड से लटकादेना चाहिए।
  6. स्लाइड्स में रखें कम से कम 20 किमी तक सूखी बर्फ पर बनाए रखा गया एक प्री-चिल एल्यूमीनियम ब्लॉक पर धीरे-धीरे कवरस्लिप के ऊपर एक ठंडा पेंसिल रखें ताकि कवरस्लिप को बर्फ के विस्तार के कारण ढीला होने से रोका जा सके।

4. निर्धारण/अवरुद्ध

  1. निर्धारण के लिए तैयार होने पर, पेंसिल या अन्य कुंद-धार वाले उपकरण के साथ कवरस्लिप को झटका दें और तुरंत स्लाइड को 1 मिन के लिए ताजा, बर्फ-ठंडे मेथनॉल (ठंडा से -20 डिग्री सेल्सियस) वाले जार में डुबोएं।
  2. नमूना को घेरने वाली स्लाइड के किनारों को धीरे से पोंछें ताकि अगला अभिकर्ता नमूने के चारों ओर सतह तनाव से आयोजित हो। आरटी में 5 मिन के लिए फिक्सेटिव (2% फॉर्मलडिहाइड इन 100 एमएमएमएम 2 पीओ4, पीएच = 7.2) लागू करें।
    नोट: हमने एक मेथनॉल/एसीटोन निर्धारण प्रक्रिया31,,32 का भी परीक्षण किया है और पाया है कि यह पीएलए प्रतिक्रिया के साथ संगत है।
  3. स्लाइड को लंबवत 90 डिग्री कोण पर एक पेपर तौलिया में स्लाइड को स्पर्श करें ताकि फिक्सेटिव को स्लाइड से दूर चलाया जा सके और पेपर तौलिया में अवशोषित किया जा सके। ब्लॉक स्लाइड 1x PBS/1% ट्राइटन एक्स-100/1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (PBT/बीएसए) के ५० mL के साथ एक Coplin जार में आरटी में 15 मिन के लिए 2x ।
    नोट: इस अवरुद्ध कदम और वर्ग6-9 में नीचे धोने के चरणों के लिए कोप्लिन जार या अन्य प्रकार के धुंधला जार की सिफारिश की जाती है। ये नमूने के साथ बफर को अवरुद्ध करने या धोने के कुशल आदान-प्रदान के लिए पर्याप्त मात्रा प्रदान करते हैं।
  4. 10% सामान्य बकरी सीरम युक्त पीबीटी/बीएसए समाधान के साथ ब्लॉक स्लाइड। स्लाइड को घेरने वाले किनारों को धीरे-धीरे पोंछें और स्लाइड के समाधान के 100 माइक्रोन लागू करें। एक आर्द्र कक्ष में आरटी में 1 एच के लिए इनक्यूबेट ।
    नोट: यह कदम αFLAG प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ धुंधला करने के लिए अत्यधिक अनुशंसित है। आर्द्र कक्ष का निर्माण स्लाइड के लिए ट्रे में टेप के साथ ग्लास पिपेट को सुरक्षित करके किया जाता है ताकि वे इनक्यूबेट पर चल ें। वाष्पीकरण को रोकने के लिए ट्रे की आंतरिक आर्द्रता को बढ़ाने के लिए घटा कार्य पोंछे(सामग्री की तालिका)ट्रे में रखी जाती है। हल्के संवेदनशील चरणों के दौरान नमूनों को प्रकाश से बचाने के लिए ढक्कन और ट्रे को पन्नी में कवर किया जाता है।
  5. पीबीटी/बीएसए/10% एनजीएस समाधान स्लाइड से चलाने के लिए एक कागज तौलिया पर स्लाइड रखें और धीरे से स्लाइड के किनारों को पोंछें । स्लाइड ब्लॉक करने के लिए अवरुद्ध अभिकर्ता(सामग्री की तालिका) काउपयोग करें। 14 मिमी x 14 मिमी जगह पर एक बूंद लगाएं। एक आर्द्र कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट स्लाइड।

5. प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन

नोट: सर्वश्रेष्ठ पीएलए परिणाम और न्यूनतम पृष्ठभूमि प्राप्त करने के लिए, प्राथमिक एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने वाले कारक को अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है (अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें)। इसके अतिरिक्त, प्राथमिक एंटीबॉडी को विभिन्न मेजबानों में उठाया जाना चाहिए जो पीएलए के लिए उपयोग किए जाने वाले द्वितीयक एंटीबॉडी की विशिष्टता से मेल खाते हैं।

  1. एक कागज तौलिया पर स्लाइड प्लेस करने के लिए उत्तेजक स्लाइड से चलाने के अवरुद्ध और धीरे किनारों पोंछ । प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करने के लिए एंटीबॉडी डिल्यूंट(टेबल ऑफ मैटेरियल)का उपयोग करें। 14 मिमी x 14 मिमी जगह पर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 40 माइक्रोन लागू करें।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर उमस भरे चैंबर में इनक्यूबेट स्लाइड।

6. पीएलए जांच (माध्यमिक एंटीबॉडी) इनक्यूबेशन

नोट: 6-9 चरणों के लिए, आरटी पर वॉश बफ़र्स ए और बी का उपयोग करें। यदि बफ़र्स 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जाते हैं, तो उपयोग करने से पहले उन्हें आरटी पर गर्म होने दें।

  1. एक Coplin जार में आरटी में 1x वॉश बफर ए(सामग्री की तालिका)के 50 mL के साथ 5 मिन के लिए स्लाइड 2x धोएं। 60 आरपीएम के लिए सेट एक कक्षीय शेखर पर Coplin जार सेट करें।
  2. एक कागज तौलिया पर स्लाइड प्लेस जाने के लिए धोने बफर स्लाइड से चलाने के लिए और धीरे किनारों पोंछ । प्लस और माइनस जांच (एंटीबॉडी डिल्यूंट के साथ पतला 1:5) युक्त 40 माइक्रोन समाधान तैयार करें। प्रत्येक 14 मिमी x 14 मिमी अंतरिक्ष के लिए समाधान लागू करें।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एक आर्द्र कक्ष में इनक्यूबेट स्लाइड।

7. लिगेशन

  1. एक Coplin जार में आरटी में 1x वॉश बफर ए के 50 mL के साथ 5 मिन के लिए स्लाइड 2x धोएं। 60 आरपीएम के लिए सेट एक कक्षीय शेखर पर Coplin जार सेट करें।
  2. अल्ट्राप्योर पानी के साथ लिगेशन बफर(टेबल ऑफ मैटेरियल)1:5 को पतला करें। लिगाज(टेबल ऑफ मैटेरियल)1:40 को पतला करने के लिए इस बफर का उपयोग करें ताकि लिगेशन सॉल्यूशन का वर्किंग स्टॉक तैयार किया जा सके।
    1. स्लाइड को एक पेपर तौलिया पर रखें ताकि वॉश बफर को स्लाइड से दूर चलाया जा सके और किनारों को धीरे से पोंछ सके। प्रत्येक 14 मिमी x 14 मिमी अंतरिक्ष के लिए लिगेशन समाधान के 40 माइक्रोन लागू करें।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए एक आर्द्र कक्ष में इनक्यूबेट स्लाइड।

8. प्रवर्धन

नोट: लाल फ्लोरोफोरस(सामग्री की तालिका)के साथ पता लगाने वाले अभिकर्मकों का उपयोग करने से सी एलिगेंस ऊतक में पृष्ठभूमि की कम से कम मात्रा होती है।

  1. एक Coplin जार में आरटी में 1x वॉश बफर ए के 50 mL के साथ 5 मिन के लिए स्लाइड 2x धोएं। 60 आरपीएम के लिए सेट एक कक्षीय शेखर पर Coplin जार सेट करें।
  2. अल्ट्राप्यूरी पानी के साथ प्रवर्धन लाल बफर(सामग्री की तालिका)1:5 को पतला करें। प्रवर्धन समाधान का कार्य स्टॉक तैयार करने और प्रकाश से बचाने के लिए पॉलीमरेज(सामग्री की तालिका)1:80 को पतला करने के लिए इस बफर का उपयोग करें।
    1. स्लाइड को एक पेपर तौलिया पर रखें ताकि वॉश बफर को स्लाइड से दूर चलाया जा सके और किनारों को धीरे से पोंछ सके। प्रत्येक 14 मिमी x 14 मिमी अंतरिक्ष के लिए प्रवर्धन समाधान के 40 μL लागू करें।
  3. इनक्यूबेट 1 घंटे और 40 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र कक्ष में स्लाइड। सुनिश्चित करें कि आर्द्र कक्ष प्रकाश से नमूनों की रक्षा के लिए पन्नी के साथ कवर किया जाता है।

9. अंतिम वॉश

  1. एक Coplin जार में आरटी में 1x वॉश बफर बी(सामग्री की तालिका)के 50 mL के साथ 10 min के लिए स्लाइड 2x धोएं। 60 आरपीएम के लिए सेट एक कक्षीय शेखर पर Coplin जार सेट करें।
  2. एक Coplin जार में आरटी में 0.01x वॉश बफर बी के 50 mL के साथ 1 मिन के लिए 1x धोएं। 60 आरपीएम के लिए सेट एक कक्षीय शेखर पर Coplin जार सेट करें। इस बफर को अल्ट्राप्योर पानी के साथ वॉश बफर बी को पतला करके तैयार किया जाता है।

10. कवरस्लिप बढ़ते

  1. अतिरिक्त धोने बफर एक कागज तौलिया पर स्लाइड से चलाने के लिए और स्लाइड के epoxy-लेपित परिधि पर शेष किसी भी अवशिष्ट बफर को मिटा दें ।
  2. नमूने के लिए बढ़ते माध्यम(सामग्री की तालिका) के10 μL जोड़ें और धीरे से शीर्ष पर एक कवरस्लिप रखना, बढ़ते माध्यम के लिए बाहर फैल करने के लिए अनुमति देता है ।
  3. कवरस्लिप और स्लाइड को सील करने के लिए नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप के किनारे के चारों ओर पेंट करें। कवरस्लिप को ले जाने से बचने के लिए नेल पॉलिश के आवेदन के साथ कोमल रहें, जिससे जर्मलाइन को नुकसान होगा। नेल पॉलिश आरटी में कम से कम 20 किमी के लिए कठोर चलो, जबकि स्लाइड प्रकाश से संरक्षित कर रहे हैं, यह एक माइक्रोस्कोप के नीचे देखने से पहले ।
  4. एक अंधेरे कंटेनर या स्लाइड धारक में स्लाइड स्टोर करें, क्योंकि पीएलए लेबल वाले नमूने हल्के-संवेदनशील होते हैं। निर्माता का सुझाव है कि स्लाइड को दीर्घकालिक भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस या अल्पकालिक भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर तैयार स्लाइड 20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने पर कम से कम 2 महीने तक चलेगा।

11. छवि अधिग्रहण

  1. क्वांटिफिकेशन के उद्देश्य से, स्पष्ट दृश्य, अक्षतिग्रस्त और अबाधित की छवियों को कैप्चर करने के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। जर्मलाइन के एक जेड-स्टैक को कैप्चर करें जो जेड-प्लेन में पूरे जर्मलाइन तक फैला है और क्वांटिटेशन के लिए उपयोग करने के लिए अधिकतम प्रक्षेपण छवि उत्पन्न करता है।
    नोट: कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी एक एपिफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त लोगों की तुलना में कम पृष्ठभूमि वाली पीएलए छवियों को प्राप्त करने और मात्रा देने के लिए आदर्श है।
    1. यदि जर्मलाइन देखने के एक क्षेत्र में फिट नहीं बैठता है, तो पूरे जर्मलाइन को छवि देने के लिए आवश्यक दृश्य के ओवरलैपिंग क्षेत्रों पर कब्जा करें। इन छवियों के अधिकतम अनुमानों को फिजी में एक साथ सिले जा सकते हैं।
  2. इमेजिंग की स्थिति को नियंत्रण और प्रयोगात्मक नमूनों के बीच समान रखना सुनिश्चित करें ताकि छवि विश्लेषण के दौरान फोसी की पहचान के लिए उचित और उचित सीमा निर्धारित की जा सके।
    नोट: पीएलए क्वांटिफिकेशन के सांख्यिकीय विश्लेषण को सुविधाजनक बनाने के लिए प्रति दोहराने वाले प्रत्येक नमूने से कम से कम 8-10 जर्मलाइन रिकॉर्ड करें। विश्वसनीय और लगातार मात्रात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए पीएलए के लिए कम से कम तीन जैविक प्रतिकृति की सिफारिश की जाती है।

12. फिजी/इमेजजे का उपयोग करके छवि विश्लेषण और मात्राकरण

नोट: निम्नलिखित कार्यप्रवाह एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर 40x उद्देश्य का उपयोग करके प्राप्त छवियों पर आधारित है, जिसमें छवियों को .czi प्रारूप में सहेजा जाता है। इन .czi छवियों और आयामों सहित उनके साथ मेटाडेटा, आगे विश्लेषण के लिए फिजी/ImageJ में पहुँचा और खोला जा सकता है। यह जांचा जाना चाहिए कि क्या फिजी विशिष्ट उपयोगकर्ता के लिए उपलब्ध कॉन्फोकल से कॉन्फोकल फ़ाइलों के प्रारूप को स्वीकार करता है। यदि नहीं, तो .tiff प्रारूप में छवियों को वैकल्पिक रूप से विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन उपयोगकर्ता को फिजी/इमेजजे (विश्लेषण) में मैन्युअल रूप से छवि के पैमाने को सेट करने की आवश्यकताहोगी। स्केल सेट करें)। यह सिफारिश की जाती है कि पृष्ठभूमि के स्तर को स्थापित करने के लिए सभी नकारात्मक नियंत्रण छवियों का एक साथ विश्लेषण किया जाए।

  1. पहले सभी नकारात्मक नियंत्रण छवियों का विश्लेषण करके विश्लेषण कार्यप्रवाह शुरू करें, फिर प्रायोगिक नमूनों पर जाएं। फिजी/इमेजजे में एक अधिकतम प्रक्षेपण छवि खोलने का विश्लेषण करने के लिए(चित्र ा 2ए)। यदि .czi फ़ाइल का उपयोग कर, एक जैव प्रारूप आयात विकल्प बॉक्स के लिए प्रेरित किया जाएगा ।
    1. अपनी छवि खोलने के लिए निम्नलिखित विकल्प शामिल करें: डेटा ब्राउज़रके साथ स्टैक देखें ; कलर मोड = रंगीन. छवि के साथ एक खिड़की अब कॉन्फोकल (जैसे, DAPI या PLA) द्वारा कैप्चर किए गए विभिन्न चैनलों के बीच टॉगल करने के लिए स्लाइड बार के साथ खुलनी चाहिए।
    2. यदि छवियों को सिले जाने की आवश्यकता है, तो माउस के साथ छवि का सही चयन करके और डुप्लिकेट विंडो खोलने के लिए डुप्लिकेट का चयन करके प्रत्येक छवि से प्रत्येक चैनल के डुप्लिकेट बनाएं। केवल चैनल नंबर (सी) निर्दिष्ट करें जो पीएलए या डीपीआई चैनल (जैसे, 2)से मेल खाता है और डुप्लिकेट हाइपरस्टैकके लिए बॉक्स को अनचेक करें।
    3. दोनों छवियों को खुला सिले जाने के साथ, प्लगइन्स का चयन करें। सिलाई । बहिष्कृत । 2D सिलाई। 2D छवियों की खिड़की की सिलाई खुलेगी। चयन करें कि सिलाई के लिए कौन सी छवियों का उपयोग किया जाएगा और खिड़की में पूर्व निर्धारित डिफ़ॉल्ट मापदंडों का उपयोग करें, फिर ओकेका चयन करें। परिणामस्वरूप छवि एक इकट्ठे ग्रेस्केल छवि होगी।
      नोट: यदि उप-छवियां पूरी तरह से संरेखित नहीं होती हैं, तो मापदंडों को समायोजित करती हैं (यानी, चोटियों की संख्या को 5 से 500 तक चेक करने या लीनियर ब्लेंडिंग से मैक्स तक फ्यूजन विधि को बदलना। तीव्रता)वांछित छवि प्राप्त करने में मदद कर सकती है। जबकि अन्य सिलाई उपकरण उपलब्ध हैं, यह दृष्टिकोण छवि की आयामीता को बरकरार रखता है, जो मात्राकरण के लिए महत्वपूर्ण है।
  2. कीबोर्ड पर टी दबाकर आरओआई (ब्याज का क्षेत्र) प्रबंधक खोलें। आरओआई मैनेजर नाम की एक नई विंडो खुलेगी।
  3. फिजी टूलसेट बॉक्स से बहुभुज उपकरण का चयन करें। इसे रेखांकित करने और आरओआई(चित्रा 2बी)उत्पन्न करने के लिए जर्मलाइन के चारों ओर अंक छोड़ें। पूर्ण आरओआई उत्पन्न करने के लिए पहले डॉट से कनेक्ट करें।
    नोट: गहरे रंग की छवियों के लिए, जर्मलाइन (जो प्रतिवर्ती है) की दृश्यता में सुधार करने के लिए विपरीत को समायोजित करने के लिए यह उपयोगी है ताकि इसे और अधिक सटीक रूप से रेखांकित किया जा सके।
    1. आरओआई पूरा करने के तुरंत बाद आरओआई मैनेजर के पास जाएं और आरओआई को स्टोर करने के लिए ऐड [टी] का चयन करें । यह जरूरी है कि आरओआई और पॉइंट्स को जोड़ने/हटाने या आरओआई के मूवमेंट सहित आरओआई में किसी भी बदलाव को अगले कदम पर आगे बढ़ने से पहले अपडेट किया जाए (आरओआई मैनेजर से अपडेट का चयन करें) या फिर वे खो जाएंगे । आरओआई और उनके अंकों में हेरफेर के बारे में आगे विस्तार फिजी/इमेजजे यूजर गाइड में पाया जा सकता है ।
  4. एक बार आरओआई अभिविन्यास सेट हो जाने के बाद, इसे बाद में आरओआई प्रबंधक में आरओआई नाम का चयन करके बचाया जा सकता है जिसके बाद अधिक । सहेजें । (नाम फ़ाइल और जहां बचाने के लिए के लिए गंतव्य निर्दिष्ट)। सेव आरओआई को आरओआई मैनेजर में अधिक चयन करके खोला जा सकता है । खुला । (फ़ाइल का चयन करें)।
  5. आरओआई मैनेजर से आरओआई नाम का चयन करआरओआई के अंदर के क्षेत्र को मापें, फिर आरओआई प्रबंधक पर उपाय बटन का चयन करें। एक परिणाम खिड़की आरओआई के बारे में जानकारी के साथ खुलेगी, जिसमें वह क्षेत्र शामिल है जो छवि (μM2) (चित्रा 2बीकी इनसेट) में शामिल है। बाद की गणना के लिए एक स्प्रेडशीट में इस जानकारी को रिकॉर्ड करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि छवि का पैमाना ठीक से सेट किया गया है ताकि आरओआई के सही आयाम एकत्र किए जा सकें। परिणाम बॉक्स में रिपोर्ट किए गए मापों के प्रकारों का विश्लेषण करके संशोधित किया जा सकता है। माप निर्धारित करें...।
  6. पीएलए छवि का सही चयन करके और डुप्लिकेट (चित्रा 2सी)का चयन करके केवल पीएलए चैनल की डुप्लिकेट छवि खोलें। एक डुप्लीकेट विंडो खुलेगी। केवल चैनल नंबर (ग) निर्दिष्ट करें जो पीएलए चैनल (जैसे, 2) से मेल खाती है और डुप्लिकेट हाइपरस्टैकके लिए बॉक्स को अनचेक करें। इस छवि के दोहराव की सिफारिश की जाती है ताकि मूल छवि संशोधित न हो।
    नोट: ये विकल्प फिजी/इमेजजे पर कई चैनलों वाली छवियों को देखने पर ही दिखाई देंगे । एक वैकल्पिक दृष्टिकोण चैनलों छवि विभाजित करने के लिए है । रंग । स्प्लिट चैनल,लेकिन यह आपकी मूल छवि फ़ाइल को संशोधित करेगा।
  7. केवल पीएलए चैनल की छवि के साथ चयनित, छवि के लिए जाओ । समायोजित करते हैं । दहलीज। छवि के लिए एक सीमा खिड़की खुलेगी। दहलीज विधि के रूप में डिफ़ॉल्ट का चयन करें, रंग के रूप में लाल, और डार्क बैकग्राउंड बॉक्स की जांच करें। खिड़की पर ऊपरी ट्रैक का उपयोग करना, जब तक सभी पीएलए फोसी छवि में स्पष्ट रूप से हाइलाइट नहीं होते हैं, तब तक दाईं ओर बार स्लाइड करें।
    1. बॉक्स में मूल्य को ऊपरी ट्रैक के दाईं ओर रिकॉर्ड करें और इस बात पर ध्यान दें कि सीमा निर्धारित करने के लिए किस मूल्य का उपयोग किया गया था। दहलीज को अंतिम रूप देने के लिए दहलीज खिड़की में आवेदन करें, और छवि केवल काले डॉट्स(चित्रा 2डी)के रूप में दिखाई सीमा foci के साथ एक सफेद पृष्ठभूमि में परिवर्तित हो जाएगा । यह सुनिश्चित करने के लिए कि यह मात्रा से पहले छवि से छवि के लिए सभी पीएलए फोसी पर कब्जा करने के लिए उपयुक्त है, यह सुनिश्चित करने के लिए कई नकारात्मक नियंत्रण छवियों पर दहलीज का परीक्षण करें।
      नोट: सफेद पृष्ठभूमि पर काले डॉट्स के रूप में दहलीज foci देखने के लिए, प्रक्रिया पर जाएं । बाइनरी । विकल्प... और ब्लैक बैकग्राउंड बॉक्स को अनचेक करें। 30-40 के बीच एक सीमा मूल्य जर्मलाइन में पीएलए की पहचान करने के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है; हालांकि, पृष्ठभूमि के आधार पर आदर्श मूल्य भिन्न हो सकता है।
  8. पीएलए फोसी की मात्रा निर्धारित करने के लिए, आरओआई प्रबंधक विंडो से आरओआई नाम का चयन करके थ्रेसहोल्ड छवि के लिए 12.3-12.3.1 चरणों से उत्पन्न आरओआई लागू करें। आरओआई की रूपरेखा छवि पर उसी स्थान पर दिखाई देनी चाहिए जैसा कि स्रोत छवि(चित्रा 2ई)से था।
    1. विश्लेषण करने के लिए जाओ । कणों का विश्लेषण करें। विश्लेषण कणों खिड़की खुल जाएगा और निम्नलिखित मापदंडों का चयन करें: आकार (माइक्रोन ^2) = 0-अनंत,परिपत्र = 0.00-1.00,शो = कुछ भी नहीं। सारांश बॉक्स की जांच करें।
    2. ठीकचुनें, और एक सारांश तालिका आरओआई के बारे में जानकारी के साथ दिखाई देगी (यानी, पीएलए फोसी की कुल गिनती, आरओआई में अंदर पीएलए फोसी द्वारा कब्जा किया गया कुल क्षेत्र, पीएलए फोसी का औसत आकार, और पीएलए फोसी द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र का प्रतिशत आरओआई के आकार के सापेक्ष) (चित्रा 2ईका इनसेट)। इन मापों को स्प्रेडशीट में रिकॉर्ड करें।
  9. एक ही सीमा का उपयोग करके कई नकारात्मक नियंत्रण छवियों के लिए चरण 12.1-12.8 दोहराएं।
    1. एक बार सभी नकारात्मक नियंत्रण छवियों का विश्लेषण किया गया है, एक ही दहलीज है कि नकारात्मक नियंत्रण द्वारा निर्धारित किया गया था की पहचान करने और पीएलए foci मात्रा का उपयोग कर सभी प्रयोगात्मक नमूनों के लिए 12.1-12.8 कदम दोहराने ।

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Representative Results

3xFLAG: :Dएलसी-1 दोनों का सह-इम्यूनोस्टेनिंग; जीएफपी और 3xFLAG: :Dएलसी-1; ओएमए-1:: फ्लैग और जीएफपी एंटीबॉडी के साथ जीएफपी जर्मलाइन ने जर्मलाइन(चित्रा 3एआई-iii,3Bii-iii)में अभिव्यक्ति के अपने पैटर्न का खुलासा किया। जबकि जीएफपी को पूरे जर्मलाइन(चित्रा 3Aiii),OMA-1:: GFP अभिव्यक्ति को देर से पचिटेन और ओसाइट्स(चित्रा 3Biii)27तक सीमित किया गया था । फ्लैग इम्यूनोस्टेनिंग से पता चलता है कि 3xFLAG: :Dएलसी-1 दोनों उपभेदों में जर्मलाइन भर में व्यक्त किया गया था(चित्रा 3Aii,3Bii)। सह-इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा, 3xFLAG: :Dएलसी-1 और OMA-1 के बीच ओवरलैप:: GFP 3xFLAG: :Dएलसी-1 और GFP (नकारात्मक नियंत्रण) के बीच से अविवेच्य है ।

चूंकि डीएलसी-1 और ओएमए-1 के बीच बातचीत के लिए परीक्षण किए गए इन प्रयोगों के बाद से, जर्मलाइन में पीएलए क्वांटिफिकेशन के लिए ब्याज के क्षेत्र में जांच की गई सभी जर्मलाइन(चित्रा 2बी)में ओसाइट्स के माध्यम से देर से पचिटेन शामिल था, क्योंकि यह ओएमए-1 अभिव्यक्ति(चित्रा 1, चित्रा 3Biii)का क्षेत्र है। 3xFLAG: :Dएलसी-1; OMA-1:: GFP जर्मलाइन 3xFLAG की तुलना में इस क्षेत्र के भीतर पीएलए फोसी की अधिक मात्रा में दिखाई दिया: :Dएलसी-1; जीएफपी जर्मलाइन्स(चित्रा 3सीआईआई-iv,3Diii-iv)। पीएलए के परिमाणीकरण से पता चला है कि 3xFLAG में मौजूद पीएलए फोसी की संख्या: :Dएलसी-1; OMA-1:: GFP जर्मलाइन काफी 3xFLAG से अधिक था: :Dएलसी-1; जीएफपी(चित्रा 3Ciii-iv,3Diii-iv; तालिका 1)। इसके अलावा, यहां तक कि GFP और फ्लैग एंटीबॉडी के 10x उच्च कमजोर पड़ने के साथ, नियंत्रण और प्रयोगात्मक पीएलए के बीच अंतर अभी भी काफी अलग था; हालांकि, फोसी के समग्र घनत्व और औसत आकार(तालिका 1)को कम किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: सी एलिगन्स जर्मलाइन की योजनाबद्ध। डिस्टल टिप क्षेत्र में स्टेम सेल पूल होता है, जिसके बाद मेयोटिक पचिटेन होता है, जहां कोशिकाओं ने माइटोसिस से मेयोसिस में स्विच किया है। मेयोटिक पाचिटेन से बाहर निकलने वाली कोशिकाएं समीपस्थ अंत में सबसे परिपक्व ओसाइट के साथ ओसाइट्स में विकसित होती हैं। क्षेत्र हरे रंग में छायांकित है, जो सभी oocytes के माध्यम से देर से meiotic pachytene से फैला है, अभिव्यक्ति के OMA-1 पैटर्न का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: जर्मलाइन पीएलए क्वांटिफिकेशन के लिए कार्यप्रवाह की प्रतिनिधि छवियां। इस आंकड़े में इस्तेमाल जर्मलाइन एक प्रतिनिधि 3xFLAG है: :Dएलसी-1; चित्रा 3सीसे GFP जर्मलाइन । (A)फिजी/इमेजजे में मर्ज पीएलए और डीपीआई चैनलों की छवि खोली गई । (ख)फिजी में बहुभुज उपकरण का उपयोग जर्मलाइन (सफेद बक्से के साथ पीली रेखा) में ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) को रेखांकित करने और परिभाषित करने के लिए किया जाता है जो मात्रा निर्धारित है, और आरओआई (माइक्रोएम2)के क्षेत्र को मापा जाता है (बी का इनसेट)। (ग)पीएलए चैनल की एक भी छवि (ए, बी) में मूल छवि को डुप्लिकेट या विभाजित करके प्राप्त की जाती है । (D)पीएलए छवि में सभी पीएलए फोसी को स्पष्ट रूप से उजागर करने के लिए दहलीज सावधानीपूर्वक तैयार की गई है । एक ही सीमा सभी प्रयोगात्मक और नियंत्रण छवियों है कि एक साथ विश्लेषण किया जाएगा पर लागू किया जाना चाहिए । (ई)सीमा छवि में चयनित आरओआई के साथ, विश्लेषण कण ों समारोह परिणामों की एक मेज है कि ROI (ई के इनसेट) के अंदर शामिल foci की कुल गिनती भी शामिल है वापस आ जाएगा । छवियां फिजी/छवि जम्मू से स्नैपशॉट हैं: प्लगइन्स । यूटिलिटीज । कैप्चर इमेज। स्केल बार = 10 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: सह इम्यूनोस्टेनिंग या पीएलए के बाद जर्मलाइन की प्रतिनिधि छवियां। (ए, बी) 3xFLAG में टैग प्रोटीन की अभिव्यक्ति पैटर्न: :Dएलसी-1; जीएफपी (एआई-iv) और 3xFLAG: :Dएलसी-1; ओएमए-1::जीएफपी (द्वि-चतुर्थ) का मूल्यांकन विच्छेदित, निश्चित और इम्यूनोदागेड गोंड्स में किया गया था। एंटी-फ्लैग एंटीबॉडी का उपयोग 1:1000 कमजोर पड़ने पर किया गया था, जबकि एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी का उपयोग 1:200 कमजोर पड़ने पर किया गया था, जो प्रतिकार छवियों के लिए इष्टतम है। डीएनए DAPI द्वारा दाग था, और व्यक्तिगत चैनल बेहतर विपरीत(Aiv, Biv)के लिए ग्रेस्केल में दिखाया गया है । प्रत्येक छवि में, स्टेम सेल और मेओटिक पचिटेन को धराशायी लाइनों के साथ रेखांकित किया जाता है, जबकि ओसाइट्स को बिंदीदार रेखाओं के साथ रेखांकित किया जाता है। छवियों को एक एपिफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ अधिग्रहीत किया गया था। स्केल बार = 10 μM.(सी, डी)पीएलए में बाहर निकाले गए 3xFLAG: :Dएलसी-1; जीएफपी (सी) और 3xFLAG: :Dएलसी-1; OMA-1::GFP (D) गोंड्स। एंटी-फ्लैग एंटीबॉडी का उपयोग 1:1000 कमजोर पड़ने पर किया गया था, जबकि एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी का उपयोग 1:4000 कमजोर पड़ने पर किया गया था। डीएनए को डीपीआई द्वारा दाग दिया गया था, और दोनों व्यक्तिगत डीएपीआई(सीआईआई, डीआईआई)और पीएलए चैनल(सीआईआई, चतुर्थ, डीआईआई, iv)को बेहतर विपरीत के लिए ग्रेस्केल में दिखाया गया है। हरे, धराशायी बॉक्स(Ciii, Diii)ज़ूम-इन पीएलए छवियों(Civ, Div)के स्थान को दर्शाता है। प्रत्येक छवि में, स्टेम सेल और मेओटिक पचिटेन को धराशायी लाइनों के साथ रेखांकित किया जाता है, जबकि ओसाइट्स को बिंदीदार रेखाओं के साथ रेखांकित किया जाता है। छवियों को एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ अधिग्रहीत किया गया था। स्केल बार = 10 माइक्रोन (ए, बी, सी, डी) सभी छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ इकट्ठे हुए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एंटीबॉडी कमजोर पड़ने तनाव का परीक्षण किया गया औसत पीएलए घनत्व (foci/μM2)X10-2 टी टेस्ट पीएलए फोसी का औसत आकार (μM2) टी टेस्ट
αFLAG (1:1000), αGFP (1:4000) 3xFLAG: :Dएलसी-1; जीएफपी 3.9 ± 1.4 पी = 1.917E-05 0.52 ± 0.127 पी = 0.057
3xFLAG: :Dएलसी-1; ओएमए-1::जीएफपी 9.1 ± 2.7 1.8 ± 2.08
αFLAG (1:10,000), αGFP (1:40,000) 3xFLAG: :Dएलसी-1; जीएफपी 3.2 ± 2.4 पी = 3.395E-04 0.51 ± 0.1 पी = 0.019
3xFLAG: :Dएलसी-1; ओएमए-1::जीएफपी 7.7 ± 3 0.7 ± 0.24

तालिका 1: पीएलए परिणामों का सारांश । टेबल रिपोर्टिंग प्राथमिक एंटीबॉडी के दो कमजोर होने पर पीएलए क्वांटिफिकेशन का सारांश। औसत पीएलए घनत्व या OMA-1 के लिए पीएलए फोसी के औसत आकार में अंतर:: दोनों एंटीबॉडी टिट्रेशन के बीच GFP महत्वपूर्ण नहीं थे (पी-मूल्य नहीं दिखाया गया) । यही तुलना जीएफपी पर भी लागू की गई थी, जिसके परिणामस्वरूप कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं हुआ (पी-वैल्यू नहीं दिखाया गया)। पी-मूल्यों का निर्धारण दो पूंछ/समान विचरण टी-टेस्टका उपयोग करके किया गया था ।

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Discussion

सी एलिगेंस जर्मलाइन में पीपीआई का अध्ययन करते समय, सह-इम्यूनोस्टेनिंग की तुलना में पीएलए द्वारा पेश किया गया उच्च संकल्प उन स्थानों के दृश्य और मात्राकरण की अनुमति देता है जहां बातचीत जर्मलाइन में होती है। पहले यह बताया गया था कि डीएलसी-1 ओएमए-1 के साथ एक इन विट्रो जीएसटी पुलडाउन परख26का उपयोग करके सीधे बातचीत करता है; हालांकि, यह बातचीत वीवो पुलडाउन में एक द्वारा बरामद नहीं किया गया था । 3xFLAG: :Dएलसी-1 के फ्लोरोसेंट सह इम्यूनोस्टेनिंग; OMA-1:: GFP जर्मलाइन डीएलसी-1 और OMA-1 के लिए अभिव्यक्ति पैटर्न में एक ओवरलैप से पता चलता है; हालांकि, इस बात का कोई संकेत नहीं है कि उनकी बातचीत जर्मलाइन में कहां होती है, और ओवरलैप खुद 3xFLAG के बीच से अधिक नहीं है: :Dएलसी-1 और जीएफपी जो किसी भी प्रोटीन (नकारात्मक नियंत्रण) से जुड़ा नहीं है। सीटू पीएलए में उपयोग करते हुए, यह पाया गया कि डीएलसी-1 जर्मलाइन में ओएमए-1 के साथ बातचीत करता है, जिससे पता चलता है कि पीएलए अन्य दृष्टिकोणों की तुलना में पीपीआई का पता लगाने के लिए अधिक संवेदनशील हो सकता है । इस दृष्टिकोण के माध्यम से हम एक आरबीपी कोफैक्टर के रूप में डीएलसी-1 की उभरती भूमिका का विस्तार जारी रखते हैं । यह काम जर्मलाइन में पीपीआई का पता लगाने के लिए पीएलए की क्षमता को दर्शाता है और भविष्य के उपयोगकर्ताओं के लिए अपने स्वयं के हित के प्रोटीन के बीच बातचीत की खोज के लिए एक संदर्भ स्थापित करता है ।

पीएलए उपयोगकर्ताओं को एफआरईटी और बीआईएफसी जैसी अन्य तकनीकों से जुड़ी कमियों के बिना तुलनीय संवेदनशीलता के साथ पीपीआई के लिए परीक्षण करने की क्षमता प्रदान करता है। प्रोटीन अभिव्यक्ति के जैविक रूप से प्रासंगिक स्तर FRET और BiFC के लिए इष्टतम नहीं हो सकता है। इसके अलावा, संभावित इंटरैक्शन पार्टनर्स का कार्य दोनों दृष्टिकोणों में उपयोग किए जाने वाले बड़े टैग से प्रभावित हो सकता है। इसके अलावा, FRET परखों के लिए एक विशेष माइक्रोस्कोपी सेट-अप की आवश्यकता होती है जो आसानी से उपलब्ध नहीं हो सकती है। पीएलए अन्य तकनीकों की तुलना में पीपीआई का अध्ययन करने के लिए एक लागत प्रभावी दृष्टिकोण भी हो सकता है। उपयोगकर्ताओं को केवल पीएलए अभिकर्मकों और इम्यूनोस्टेनिंग के लिए आवश्यक अभिकर्मकों के अलावा इमेजिंग के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप तक पहुंच प्राप्त करने की आवश्यकता है। इमेज एनालिसिस ओपन-सोर्स प्रोग्राम फिजी/इमेजेज का इस्तेमाल किया जाता है, जो किसी भी यूजर के लिए किसी भी कीमत पर उपलब्ध नहीं है । जिन उपयोगकर्ताओं को FRET या BiFC के साथ कोई अनुभव नहीं है, वे पीएलए को एक उपयुक्त विकल्प मिल सकते हैं। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में केवल एक विशिष्ट इम्यूनोस्टेनिंग प्रक्रिया से परे कई अतिरिक्त कदम शामिल हैं, जिससे यह तकनीक इम्यूनोस्टेनिंग अनुभव वाले किसी भी उपयोगकर्ता के लिए लगभग सुलभ हो जाती है।

विच्छेदन द्वारा गोंद का निष्कासन पीएलए के लिए सफलतापूर्वक काम करने के लिए महत्वपूर्ण है । कृमि छल्ली के अंदर बनाए गए ऊतकों को पीएलए द्वारा इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके लेबल नहीं किया जाता है। यह भी पाया गया है कि निकाले गए भ्रूण प्रभावी ढंग से इस पीएलए प्रोटोकॉल द्वारा लेबल कर रहे हैं । इससे पता चलता है कि विच्छेदन के दौरान जारी किए गए अन्य ऊतक, जैसे आंत, पीएलए के साथ संगत होने की भी संभावना है। यह पाया गया है कि पीएलए गोंद पर मजबूत संकेतों के साथ-साथ भ्रूण के नमूनों को दो निर्धारण प्रोटोकॉल के साथ तैयार करता है जिसका उपयोग अक्सर इम्यूनोस्टेनिंग के लिए किया जाता है । इससे पता चलता है कि क्षेत्र में उपयोग की जाने वाली अतिरिक्त निर्धारण प्रक्रियाएं पीएलए के साथ संगत हो सकती हैं लेकिन उपयोगकर्ता द्वारा व्यक्तिगत रूप से मूल्यांकन किए जाने की आवश्यकता होगी।

सफल पीएलए के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के इष्टतम कमजोर पड़ने का निर्धारण महत्वपूर्ण है। मुनमुन के लिए अनुकूलित किए गए कमजोर पड़ने से शुरुआत करना सबसे अच्छा है। यह आमतौर पर एक प्रतिकार प्रयोग में प्राथमिक एंटीबॉडी को टिटरेटिंग करके इष्टतम कमजोर पड़ने का पता लगाने के लिए हासिल किया जाता है जहां कम पृष्ठभूमि और एक उच्च, विशिष्ट संकेत होता है। एक बार इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए इष्टतम कमजोरपड़ की स्थापना की गई है, तो इन एक ही कमजोर पड़ने का परीक्षण पीएलए परख में किया जा सकता है जो संभावित इंटरएक्टर्स की एक जोड़ी द्वारा उत्पादित संकेत की तुलना गैर-बातचीत प्रोटीन की नियंत्रण जोड़ी द्वारा उत्पादित संकेत से करता है।

जिस मामले में नियंत्रण नमूने में प्रचुर मात्रा में संकेत देखा जाता है, प्राथमिक एंटीबॉडी को और कमजोर करने की आवश्यकता होती है। यह पाया गया है कि पीएलए के लिए इष्टतम प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ना कम से कम वही या उससे भी अधिक पतला है जो प्रतिरक्षण के लिए उपयोग किया जाता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 3ए में प्रतिकार छवियां,बी विरोधी ध्वज के 1:1000 कमजोर पड़ने और एंटी-जीएफपी के 1:200 कमजोर पड़ने के प्रतिनिधि हैं। हालांकि, चित्रा 3सी में पीएलए छवियों में एंटीबॉडी कमजोरियां एंटी-फ्लैग के 1:1000 और एंटी-जीएफपी के 1:4000 थे। पीएलए में इस्तेमाल होने वाले एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी का कमजोर पड़ना प्रतिरक्षण के लिए इस्तेमाल की गई तुलना में अधिक है, जिससे यह सुझाव दिया जा रहा है कि पीएलए बहुत अधिक संवेदनशील है । यह पाया गया कि एंटीबॉडी को 10 गुना और कमजोर करने के परिणामस्वरूप पीएलए घनत्व में कमी आई और साथ ही डीएलसी-1/ओएमए-1 फोसी(तालिका 1)का आकार भी कम हुआ । इस कमी के बावजूद, नकारात्मक नियंत्रण और डीएलसी-1/OMA-1 के बीच पीएलए घनत्व में अंतर अभी भी काफी अलग था । इससे पता चलता है कि पीएलए अभी भी प्राथमिक एंटीबॉडी के उच्च कमजोर होने के साथ बहुत संवेदनशील है; हालांकि, पता लगाने योग्य बातचीत की व्यापकता को कम करके आंका जाएगा ।

इसके विपरीत, एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के बहुत कम हानिकारक परिणाम के दो प्रकार हो सकता है । सबसे पहले, यह नकारात्मक नियंत्रण में महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि संकेत का उत्पादन कर सकता है। दूसरा, बातचीत साथी प्रोटीन द्वारा उत्पादित पीएलए फोसी विलय और ओवरलैप हो सकता है, जिससे उन्हें अधिकतम प्रक्षेपण छवि में हल करना मुश्किल हो सकता है। इससे इमेज एनालिसिस के दौरान पीएलए फोसी नंबर और घनत्व का कम अनुमान होता है । पीएलए सिग्नल गैर-बातचीत करने वाले भागीदारों के बीच नकली निकटता का पता लगाने और नमूने में होने वाले वास्तविक पीपीआई के हर उदाहरण का पता लगाने का संतुलन है। नतीजतन, एक नकारात्मक नियंत्रण का समावेश जहां दो प्रोटीन बातचीत नहीं पीएलए प्रयोगों में पृष्ठभूमि के स्तर का निर्धारण करने के लिए आवश्यक है । पीएलए प्रयोग में प्राथमिक एंटीबॉडी की चूक का उपयोग अन्य रिपोर्टों9,10में नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया है . हालांकि, यह दृष्टिकोण गैर-विशिष्ट बातचीत या गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी बाध्यकारी के लिए जिम्मेदार नहीं हो सकता है जो प्रायोगिक पीएलए में परिणाम को प्रभावित कर सकता है। जीएफपी का उपयोग यहां नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था, क्योंकि डीएलसी-1 और जीएफपी के बीच कोई सीधी बातचीत की उम्मीद नहीं थी। यह पाया गया कि नकारात्मक नियंत्रण में कुछ पृष्ठभूमि संकेत था। यह आगे एक पीएलए परख के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के महत्व का समर्थन करता है जब प्रयोगात्मक डेटा का मूल्यांकन ।

एक बार पीएलए-अनुकूलित कमजोर पड़ने की स्थापना होने के बाद, इन कमजोर होने का उपयोग विभिन्न कृमि उपभेदों की एक सरणी में परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है जिसमें एक ही आत्मीयता टैग के साथ टैग किए गए विभिन्न जोड़े इंटरैक्शन पार्टनर होते हैं। परिणामस्वरूप पीएलए संकेतों की निष्पक्ष तुलना सुनिश्चित करने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी की एक ही जोड़ी का उपयोग करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि एंटीबॉडी आत्मीयता में भिन्नता पीएलए प्रयोग के परिणाम को प्रभावित कर सकती है। पीएलए पर एक अन्य रिपोर्ट में पीएलए सेकेंडरी एंटीबॉडी10के कमजोर पड़ने का अनुकूलन करने का सुझाव दिया गया है; हालांकि, इसकी सिफारिश नहीं की गई है। माध्यमिक एंटीबॉडी के उच्च कमजोर होने से अन्य डाउनस्ट्रीम पीएलए चरणों की प्रभावकारिता कम हो सकती है जो प्लस और माइनस जांच की मान्यता पर निर्भर करते हैं जो माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए संयुग्मित हैं।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले कुछ सूत्रकृमि उपभेदों को एनआईएच (P40OD010440) द्वारा वित्त पोषित कैनोरहैब्डिटिस जेनेटिक्स सेंटर द्वारा प्रदान किया गया था। कॉनफोकल माइक्रोस्कोपी एनआईएच पुरस्कार P20GM103546 और S10OD021806 के समर्थन से संचालित मोंटाना बायोस्पेक्ट्रोस्कोपी कोर रिसर्च लेबोरेटरी विश्वविद्यालय में किया गया था। इस काम को NIH अनुदान GM109053 द्वारा भाग में ईवी, अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन फैलोशिप 18PRE34070028 को X.W. और मोंटाना एकेडमी ऑफ साइंसेज पुरस्कार द्वारा एक्सडब्ल्यू को समर्थन दिया गया था । फंडर्स स्टडी डिजाइन या रिपोर्ट लिखने में शामिल नहीं थे । हम चर्चा के लिए एम एलेनबेकर को धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% paraformaldehyde solution Electron Microscopy services 15710 used to make 4% working solution
1M KH2PO4 Sigma P0662 Prepare a 1M working stock
1x M9 various various prepared as 10x stock used at 1x; see wormbook.org for protocol
1x PBS various various see wormbook.org for protocol
26.5 Gauge Needle Exel International 26402 Needles used for dissection
BSA Lampire 7500802
Centrifuge Tubes Thermo Scientific 05-529C 50ml Oak ridge centrifuge tube used for synchronization
Confocal Microscope Zeiss 880
Coplin Jar PolyLab 62101
Coverslip to Freeze Sample Globe Scientific 1411-10 22x40mm, No. 1
Coverslip to Seal Slide Globe Scientific 1404-15 22x22mm, No. 1.5
DAPI Mounting Medium for Immunofluorescence Vector H-1200
Ligase Sigma-Aldrich DUO82029 Duolink 1x Ligase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Amplification red buffer Sigma-Aldrich DUO82011 Duolink 5x Amplification Red buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Ligation Buffer Sigma-Aldrich DUO82009 Duolink 5x Ligation buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Antibody Diluent Sigma-Aldrich DUO82008 Duolink antibody diluent,Comes with DUO92004 and DUO92002, Note: A 1x PBS/1% BSA solution can also be used as a substitute to dilute the antibody.
Blocking Solution Sigma-Aldrich DUO82007 Duolink blocking solution, Comes with DUO92004 and DUO92002
Mounting Medium for PLA Sigma-Aldrich DUO82040 Duolink In Situ mounting medium with DAPI
MINUS Probe Sigma-Aldrich DUO92004 Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS
PLUS Probe Sigma-Aldrich DUO92002 Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS
Wash Buffer A Sigma-Aldrich DUO82046 Duolink In Situ wash Buffer A
Wash Buffer B Sigma-Aldrich DUO82048 Duolink In Situ wash Buffer B
Polymerase Sigma-Aldrich DUO82030 Duolink Polymerase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Epifluorescent Microscope Leica DFC300G camera, DM5500B microscope
Goat anti-mouse Alexa 594 JacksonImmuno 115-585-146 Use at 1:500
Goat anti-rabbit Alexa 488 JacksonImmuno 111-545-144 Use at 1:200
Image Processing Software Adobe Adobe Photoshop + Illsutrator CS3
Glass Pipette Corning 7095B-5X
Levamisole ACROS Organics 187870100 Prepare a 250mM working stock
Methanol Fisher Scientific A454
Mouse anti-FLAG Sigma F1804 Use at 1:1000 for immunofluorescence and PLA, pre-block with normal goat serum recommended
Nailpolish L.A. colors CNP195
Nematode Growth Medium (NGM) various See wormbook.org for protocol
Normal Goat Serum JacksonImmuno 005-000-121
Polyethylene Pasteur Pipette Globe Scientific 135030
Poly-L-Lysine Sigma-Aldrich P1524 Prepared as 0.1% stock solution in water, stored at -20C, and diluted 1:100 in water to coat slides
Petri Dishes Tritech PD7060 60 mm diameter
Rabbit anti-GFP Thermo Fisher G10362 Use at 1:200 for immunofluorescence, 1:4000 for PLA
Slides Thermo Fisher 30-2066A-Brown Three-square 14x14mm autoclavable slides with bars are custom-ordered through Fisher Scientific. Poly-L-Lysine added to slides in the lab
Sodium Hypochlorite solution Fisher Scientific SS290-1
task wipes Kimtech 34120 4.4x8.4 inch task wipes
Trays (242x241x20mm) Thermo Fisher 240845 Used to make humid chamber
Triton X-100 ACROS Organics 327372500
Ultrapure water Milli-Q Ultrapure water obtained from Milli-Q Integral Water Purification System
Watchglass Carolina Biological 742300
-20 °C freezer
-80 °C freezer
Aluminum Foil
OP50 strain E. coli
Orbital Shaker
Tape
Nematode strains used in this study (both available upon request)
mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475] UMT 376 dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Reference 24
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III UMT 422 dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Reference: this study

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 159 जर्मलाइन आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन LC8 पीएलए सी elegans, निकटता लिगेशन परख
सी <em>एलिगेंस</em> जर्मलाइन में रिब्रोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स असेंबली के सीटू डिटेक्शन में निकटता लिगेशन परख का उपयोग कर
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Day, N. J., Wang, X., Voronina, E. In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay. J. Vis. Exp. (159), e60982, doi:10.3791/60982 (2020).

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