Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

באיתור באתרו של האסיפה המורכבת של ריבונאופאנפרוטאין ב -C. אלגיה germline באמצעות שיטת הסמיכות

Published: May 5, 2020 doi: 10.3791/60982
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Biological Sciences, University of Montana

Summary

פרוטוקול זה מדגים את השימוש בסדר הקירבה הצמוד כדי לבדוק את האינטראקציות של חלבון חלבון באתרו בתוך C. אלגיה germline.

Abstract

הבנת המועד והיכן מתרחשים אינטראקציות חלבונים בחלבון (PPIs) קריטיות להבנת פונקציית החלבון בתא וכיצד תהליכים רחבים יותר כגון פיתוח מושפעים. האלקאנס הוא מערכת מודל מעולה ללימוד ppis הקשורים בוויסות תאי גזע, מיוזיס ופיתוח. יש מגוון רחב של טכניקות מפותחות המאפשרות חלבונים של עניין להיות מתויג על ידי נוגדנים סטנדרטיים, מה שהופך את זה יתרון מערכת עבור הסמיכות הצורך הקשור (PLA) תגובות. כתוצאה מכך, PLA הוא מסוגל להראות איפה PPIs להתרחש בצורה מרחבית וטמפורלית באופן יעיל יותר מאשר גישות חלופיות. המתואר כאן הוא פרוטוקול עבור יישום וכימות של טכנולוגיה זו כדי לחקור את PPIs ב -C. אלגיה germline.

Introduction

מעל 80% של חלבונים מוערכים יש אינטראקציות עם מולקולות אחרות1, אשר מדגיש כיצד ppis חשוב לביצוע של פונקציות ביולוגיות ספציפיות בתא2. חלבונים מסוימים לתפקד כרכזות ההקלה על הרכבה של מתחמים גדולים יותר הנחוצים עבור הישרדות התא1. רכזות אלה מתווך PPIs מרובים ולעזור לארגן חלבונים לתוך רשת המאפשרת פונקציות ספציפיות בתא3. היווצרות של מכלולי חלבון מושפע גם על ידי הקשר הביולוגי, כגון נוכחות או היעדרות של שותפים ספציפיים אינטראקציה4, תא איתות אירועים, ובשלב ההתפתחותי של תא.

ג. אלגיה משמשת בדרך כלל כאורגניזם מודל למגוון מחקרים, כולל פיתוח. האנטומיה הפשוטה של בעל החיים מורכבת ממספר איברים, כולל הגונאד, הבטן והקוטיקולה השקופה, המאפשרת ניתוח של פיתוח תולעים. את germline המתגוררים לוטה הוא כלי נהדר ללמוד כיצד בתאי גזע germline בוגרים לתוך גמטות5 המתפתחים לעוברים ובסופו של דבר הדור הבא של צאצאי. אזור הקצה המרוחק של הגרמקו (germline) מכיל מאגר של תאי גזע המחדשים את עצמם (איור 1). כמו תאי גזע לעזוב את הנישה, הם התקדמות לתוך pachytene המיון ובסופו של דבר להתפתח oocytes בשלב המבוגר הצעיר (איור 1). תוכנית זו של פיתוח ב-germline מוסדר באופן הדוק באמצעות מנגנונים שונים, כולל רשת לאחר ההמרה הרגולציה הקלה על ידי ה-RNA-כריכת חלבונים (RBPs)6. PPIs חשוב עבור פעילות תקינה זו, כמו RBPs שותף עם קופנים אחרים כדי להפעיל את הפונקציות שלהם.

ישנן מספר גישות שניתן להשתמש בהן כדי לחקור עבור PPIs בתולעת, אבל לכל אחד יש מגבלות ייחודיות. ב vivo IMMUNOPRECIPITATION (IP) ניתן להשתמש כדי לבודד חלבון חלבון מתחמי מתמציות תולעת שלמות; עם זאת, גישה זו אינה מציינת היכן ה-PPI מתרחשת בתולעת. בנוסף, מתחמי חלבון כי הם ארעי ורק טופס במהלך שלב מסוים של פיתוח או במספר מוגבל של תאים יכול להיות קשה להתאושש על ידי co-immunoprecipitation. לבסוף, ניסויים בקניין רוחני צריכים לטפל בחששות של מורכבות חלבון לאחר הליזה ושימור לא ספציפי של חלבונים על מטריצת הזיקה.

גישות חלופיות לאיתור באתרו של ppis כתמים שיתוף חיסוני, Förster תהודה העברת אנרגיה (לדאוג), ומשלימה ביולקולרית הקומפלמנטציה (bimolecular). שיתוף חיסוני מסתמך על זיהוי סימולטני של שני חלבונים של עניין רקמת תולעת קבועה ומדידה של היקף לוקליזציה של אות. שימוש במיקרוסקופיה ברזולוציה סופר, המציעה פירוט רב יותר מאשר המיקרוסקופיה הסטנדרטית7, מסייע באופן מדוקדק יותר לבדוק לוקליזציה חלבון מעבר למכשול עקיפה-מוגבל של 200-300 ננומטר8. עם זאת, התאמה חיסונית משותפת באמצעות מיקרוסקופ קונבנציונאלי ברזולוציה סופר עובד הטוב ביותר עבור חלבונים עם דפוסי לוקליזציה מוגדרים היטב. לעומת זאת, הוא הופך להיות הרבה פחות אינפורמטיבי לשותפים בעלי אינטראקציה מבוזרת. מדידה להתאמה משותפת של אותות המבוססים על חפיפה אינה מספקת מידע מדויק על האם החלבונים מורכבים זה מזה9,10.

יתר על כן, co-immunoprecipitation ושיתוף חיסוני של מכלולי חלבון-חלבון אינם כמותיים, מה שהופך אותו מאתגר כדי לקבוע אם אינטראקציות כאלה הן משמעותיות. מדובר בשתי טכניקות המבוססות על פלורסנט. מסתמך על תיוג חלבונים של עניין עם חלבונים פלורסנט (FPs) כי יש חפיפה ספקטרלית שבה אנרגיה מאחד FP (תורם) מועבר אחר FP (קבלה)11. זו העברה לא רדיוטיבית של תוצאות האנרגיה הפלואורסצנטית של הקבלה FP שניתן לזהות בתוך הגל המתאים של פליטה. BiFC מבוססת על החוקה של חלבון פלורסנט ב vivo. זה כרוך בפיצול GFP לשני שברים משלימים, כגון ה1-10 ו סליל 1112, אשר התמזגו אז שני חלבונים של ריבית. אם שני החלבונים האלה אינטראקציה, השברים המשלימים של GFP להיות קרובים מספיק בסמיכות לקפל ולהרכיב, המהווים מחדש את fluorophore GFP. מחדש GFP הוא הבחין במישרין כמו פלואורסצנטית ומציין היכן PPI התרחשה.

ככזה, הן גם לדאוג וגם BiFC תלוי תגי פלורסנט גדול שיכול לשבש את הפונקציה של חלבון מתויג. בנוסף, יש לבקש ממנו ביטוי שופע ודומה של החלבונים המתויגים להשגת נתונים מדויקים. לא ניתן להתאים לניסויים שבהם שותף אחד הוא עודף של השני, אשר יכול להוביל לרקע גבוה13. ביטוי יתר בניסויים BiFC יש גם להימנע, כי זה יכול לגרום להרכבה לא ספציפית14 כי התוצאה היא מוגברת הרקע. שתי הטכניקות דורשות אופטימיזציה של הביטוי ותנאי הדימות של חלבונים מתויגים, אשר עשוי להאריך את הזמן הנדרש כדי להשלים ניסויים.

הטיפול הצמוד (PLA) הוא גישה חלופית שיכולה לטפל במגבלות הטכניקות המוזכרות לעיל. PLA מנצל את הנוגדנים העיקריים המכירים את חלבוני הריבית (או התגים שלהם). נוגדנים ראשוניים אלה מאוגדים לאחר מכן על ידי נוגדנים משניים המכילים בדיקה מחדש של olig, שיכולים לhybridize אחד עם השני כאשר בתוך 40 ננומטר (או קצר) מרחק15. ה-DNA הוכלא כתוצאה מוגבר באמצעות תגובת PCR, אשר מזוהה על ידי בדיקות המשלימים את ה-DNA. זה התוצאות וקדי כי הם דמיינו על ידי מיקרוסקופ. טכנולוגיה זו יכולה לזהות PPIs באתרו רקמות מורכבות (כלומר, gonad התולעת), אשר מאורגן כקו הרכבה המכיל תאים בשלבים שונים של פיתוח ובידול. עם PLA, PPIs יכול להיות במישרין דמיינו בתוך gonad תולעת קבועה, אשר יתרון עבור חקירת האם PPIs להתרחש במהלך שלב ספציפי של פיתוח. PLA מציע ברזולוציה גבוהה יותר של PPIs לעומת שיתוף לוקליזציה מבוסס assays אשר הוא אידיאלי לעשיית מדידות מדויקות. אם נעשה שימוש, מיקרוסקופ סופר-רזולוציה יש את הפוטנציאל לספק פרטים דקים יותר על המיקום של PLA וקדי בתוך תא. יתרון נוסף הוא כי וקדי הנובע מתגובות PLA ניתן לספור על ידי זרימת עבודה מבוססי imagej ניתוח, מה שהופך את הטכניקה הזאת כמותית.

המשפחה LC8 של שרשראות האור דינאין תוארה לראשונה כיחידת משנה של דינאין מנוע קומפלקס16 ו היפותזה לשמש מתאם המטען. מאז התגלית הראשונית שלה, LC8 נמצא מתחמי חלבון מרובים בנוסף למתחם דינאין מנוע17,18,19,20. סריקת רצפי חלבונים המכילים את מוטיב LC8 אינטראקציה19 מציע כי LC8 יכול להיות הרבה אינטראקציות עם מגוון רחב של חלבונים שונים17,18,19,20,21,22. כתוצאה מכך, חלבונים LC8 משפחתיים נחשבים כעת רכזות המסייעות לקדם את ההרכבה של מכלולי חלבון גדולים יותר19,22, כגון מכלולים של חלבונים בעלי סדר מבחינה מיסודה21.

אחד C. אלגיה LC8-חלבון משפחה, דינאין אור שרשרת-1 (DLC-1), מבוטא באופן נרחב על פני רקמות רבות ולא מועשר מבנים ספציפיים subcellular23,24. כתוצאה מכך, זיהוי של רלוונטיות ביולוגית בvivo שותפים של DLC-1 ב -C. אלגיה מאתגרת מספר סיבות: 1) co-immunoprecipitation אינו מצביע על מקור הרקמה שבו האינטראקציה מתרחשת; 2) ביטוי מוגבל של שותפים מסוימים או אינטראקציות ארעי עלול לעכב את היכולת לזהות אינטראקציה על ידי co-immunoprecipitation; ו-3) לפזר התפלגות של DLC-1 מוביל חפיפה לא ספציפית עם חלבונים שותפים פוטנציאליים על ידי שיתוף חיסוני. בהתבסס על האתגרים הללו, PLA היא גישה אידיאלית לבחינות באינטראקציות vivo עם DLC-1.

בעבר דווח כי DLC-1 מקיים אינטראקציה ישירה עם ומשמש כקופקטור עבור ה-RNA-כריכת חלבונים (RBPs) FBF-223 ו gld-125. העבודה שלנו תומכת במודל של dlc-1 לשמש כחלבון hub ומציע dlc-1 מקלה על רשת אינטראקציה המתפרס מעבר דינאין19,22. באמצעות השיטה הנפתחת GT, מחדש DLC-1-אינטראקציה RBP בשם OMA-1 זוהה26. OMA-1 חשוב עבור צמיחה oocyte ו meiotic התבגרות27 פונקציות בשילוב עם מספר מrepressors translational ומפעילי28. בעוד FBF-2 ו-GLD-1 מבוטאים בתאי הגזע ואזורי pachytene, בהתאמה, OMA-1 היא ביטוי בדרך מאוד מתבטאת ב-germline מתוך pachytene meiotic באמצעות האוציטים27 (איור 1). הדבר מרמז על כך DLC-1 צורות מתחמים עם RBPs באזורים שונים של gonad. יש גם נמצא כי האינטראקציה הישירה בין DLC-1 ו-OMA אחד נצפתה בתוך מבחנה לא התאושש על ידי vivo IP. ה-PLA שימש בהצלחה כגישה חלופית למחקר נוסף זה אינטראקציה ב -C. אלגיה germline, ואת התוצאות מרמזות כי PLA ניתן להשתמש כדי לחקור ppis רבים אחרים בתולעת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: פרוטוקול זה משתמש בזנים של C. אלגיה שבהם שותפים לאינטראקציה פוטנציאליים מתויגים. מומלץ מאוד להשתמש בלחץ שלילי לשמש, שבו אחד מתויג חלבון לא צפוי לתקשר עם שותף אחר מתויג אינטראקציה מועמד. כאן, GFP בלבד שימש שליטה שלילית כדי להעריך את הרקע, כמו DLC-1 לא צפוי אינטראקציה עם GFP בתולעת. GFP-tagged OMA-1 שימש זן ניסיוני, כמו נתונים ראשוניים להציע אינטראקציה עם DLC-1. זנים nematode שיתוף ביטוי שליטה וחלבונים בדיקה עם 3xFLAG-מתויג DLC-1 מכונים טקסט זה כ 3xFLAG::D LC-1; דגל GFP ו 3xFLAG::D LC-1; OMA-1:: GFP (זנים זמינים על פי בקשה; מידע נוסף בטבלה של חומרים), בהתאמה. כאן, תגי 3xFLAG ו-GFP משמשים; עם זאת, תגים אחרים עשויים להיות מוחלף כל עוד הנוגדנים שלהם תואמים עם ריאגנטים ערכת PLA.

1. טיפול בבעלי חיים

  1. לשמור על תולעים על הצמיחה נמטודות בינונית (ngm) צלחות כי הם הנזרע עם זן OP50 של E. coli ולשמור ב 24 ° c עבור ביטוי אופטימלי של gfp.
  2. מעבר תולעים מבוגרים כל 2-3 ימים כדי להפיץ תולעים ולשמור אותם מוזנים היטב.

2. הכנת התרבות הסינכרונית

  1. לסנכרן תולעים על ידי הלבנת צלחת של מוספר מוזן היטב, gravid הרמטים. פרוטוקול הלבנת מתואר בפורטה דה לה-ריוט-Riva et al. תנו לעוברים לבקוע לילה בצינור צנטריפוגה ב -24 ° c תוך כדי סיבוב בסוף על קצה של 10 מ ל של M9 מדיה מינימלית (M9) מאגר. זה יפיק תרבות של עצור L1 הזחלים.
  2. מודרת את השפופרת של נעצר L1 בשלב הזחלים על קרח במשך 10 דקות, ואז למעלה את השפופרת עם קרח קר 1x M9.
  3. השתמש צנטריפוגה לצנפי את הזחלים ב 600 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. בזהירות את הסופרנטאנט כך שרק 1-2 מ ל שרידים של סופרנטאנט.
  4. להשעות מחדש את הגלולה של הזחלים ולהשתמש במיקרופיפטה כדי להעביר 2 μL של תרבות הזחלים מושעה לשקופית זכוכית. לספור כמה הזחלים נוכחים כדי לקבוע את הצפיפות של תרבות הזחלים, אשר יסייעו הדרכה זריעה של התולעים בשלב 2.5.
    הערה: צפיפות של 10-15 L1 הזחלים/1 μL עובד היטב לזריעה.
  5. השתמש מיקרופיפטה כדי להעביר את הנפח של תרבות הזחלים הדרושים כדי זרע כ 100-120 L1 הזחלים הבמה על לוחית 60 mm OP50. לדוגמה, זרע 10 μL של תרבות הזחלים כי יש צפיפות של 10 L1 הזחלים/1 μL של התרבות.
    הערה: אל תחרוג מנפח של 40 μL כדי לזרוע את הזחלים, או שעודפי הנוזלים ישבש את מדשאת OP50. אם נפח התרבות עולה על 40 μL, חזור על שלבים 2.3-2.4 כדי להקטין עוד יותר את עוצמת הקול ולהגדיל את צפיפות תרבות הזחלים.
  6. הגדל תולעים ב -24 ° c. הקלט את הזמן כאשר L1s הם הזריעה על הצלחת ולבדוק מדי פעם את השלב של הפיתוח כדי לזהות את הזמן האידיאלי לניתוח.
    הערה: בשעה 52 h לאחר זריעה של L1s, תולעים המתורבתות ב -24 מעלות צלזיוס הן בדרך כלל בשלב המבוגר הצעיר, שהוא השלב האידיאלי לניתוח לצורך הפיכה ל-PLA. עם זאת, הזמן בפועל שבו תולעים מסונכרנים להגיע לשלב מבוגרים צעירים עשויים להשתנות בין זנים וטמפרטורת דגירה.

3. חיתוך/גונאד שחול

הערה: הניתוח כדי לבצע הבלטת ממד הוא הכרחי כדי לעבוד בהצלחה על-ידי PLA. גישה זו יכולה גם לשחרר עוברים, הפועלים גם באמצעות פרוטוקול זה עבור PLA (ראה דיון לקבלת מידע נוסף). לאחר הניתוח, הן השליטה השלילית והן הדגימות הנסיוניות קבועות ומטופלות עבור PLA יחד במקביל. הוא גם הציע מערכת נוספת של דגימות להיות מוכנים למטרה של שיתוף הפלורסנט משותף מכתים23 להפגין דפוסי הביטוי של שותפי החלבון של הריבית.

  1. בחר 30-40 תולעים למבוגרים צעירים לתוך צלחת זכוכית שעון המכיל 500 μL של 1x M9 + levamisole (2.5 הריכוז הסופי mM). לאחר איסוף התולעים, בזהירות להסיר ולמחוק את רוב המדיה כדי להסיר חיידקים המועברים יחד עם התולעים.
  2. הוסף טריים 500 μL של 1x M9 + levamisole ולהשתמש בפיפטה כדי לצייר בעדינות ולוותר על המדיה כדי לשטוף את התולעים. בזהירות להסיר ולמחוק את רוב המדיה כדי לנקות חיידקים כי הוא הועבר יחד עם התולעים.
    1. חזור על שלב זה 2x-3x עד שכל החיידקים יוסרו. לאחר השלמת שוטף, להשאיר תולעים כ 100 μL של מדיה כדי לשמור על נוזלים.
      הערה: אל תתנו לתולעים לשבת במדיה במשך יותר מ -7 דקות, שכן זה יפגע בהבלטה של הגונדות במהלך הניתוח. לבצע שוטף תחת סיוע של מיקרוסקופ מבתר כדי לפקח על הסרת מדיה, כך תולעים לא יאבדו.
  3. באמצעות שימוש בצנרת זכוכית או פוליאתילן, להעביר תולעים ל 25 מ"מ x 75 מ"מ מיקרוסקופ שקופית מצופה עם 0.001% פולי-L-ליזין (שקופיות המשמשות בהליך זה יש היקף מצופה אפוקסי, השארת שלוש סביבות עבודה, 14 מ"מ x 14 מ"מ כל אחד). להסיר מדיה עודפת כך כ 10-15 μL של מדיה נשאר.
  4. תחת הסיוע של מיקרוסקופ מבתר ושימוש בשני 261/2 מחטים למדוד, מניחים מחט אחת על השני, כך הקצוות ליצור זוג מספריים. באמצעות מחטים מונחה בצורה זו, לחתוך תולעים מאחורי הלוע כדי לשחרר את germlines. מנתחים את כל התולעים. תוך 5 דקות
    הערה: פרטים נוספים על אופן הביצוע של הניתוח ניתן למצוא בפרסום קודם על ידי Gervaise ו-Arur30.
  5. לאחר בגזור את כל התולעים, בעדינות למקם את שמיכות 22 מ"מ x 40 מ"מ על השקופית, כך שהוא בניצב לשקופית. קצות הכיסויים צריכים. להיתלות על המגלשה
  6. הקפאת השקופיות על בלוק אלומיניום מקורר מראש מתוחזק על קרח יבש לפחות 20 דקות. בעדינות המקום עיפרון מקורר על גבי שמיכות כדי למנוע את התפשטות הכיסויים בשל התרחבות הקרח.

4. קיבוע/חסימה

  1. כאשר מוכן קיבעון, קפיצי את שמיכות עם עיפרון או כלי בוטה אחרים ולטבול מיד את השקופית לתוך צנצנת המכילה טריים, קרח קר מתנול (מקורר עד 20 ° c) עבור 1 דקות.
  2. נגב בעדינות את קצות השקופית המקיפים את המדגם כך שהכימית הבאה מוחזקת על-ידי מתח פני השטח סביב המדגם. החל 150 μl של קבע (2% פורמלדהיד ב 100 mM KH2PO4, pH = 7.2) עבור 5 דקות ב-RT.
    הערה: בדקנו גם מתנול/אצטון הליך קיבוע31,32 ומצא כי הוא תואם את התגובה מפלה.
  3. גע בשקופית למגבת נייר בזווית 90 מעלות אנכית כדי לאפשר לתיקונים לפעול מחוץ לשקופית ולקלוט את מגבת הנייר. בלוק שקופיות 2x עבור 15 דקות ב-RT בצנצנת Coplin עם 50 mL של 1x PBS/1% טריטון X-100/1% סרום לפרה (PBT/BSA).
    הערה: צנצנות קופלין או סוגים אחרים של צנצנות מכתים מומלצות לשלב חסימה זה ולפעולות הכביסה שלהלן בסעיפים 6-9. אלה מספקים אמצעי אחסון מספיקים להחלפת יעילות של חסימה או שטיפת מאגר עם המדגם.
  4. חסום שקופיות עם פתרון PBT/BSA המכיל 10% סרום עז רגיל. נגב בעדינות קצוות המקיפים את השקופית והחל 100 μL של הפתרון לשקופית. . בחדר לחות
    הערה: שלב זה מומלץ מאוד לצביעת עם הנוגדן הראשי αFLAG. החדר הלח בנוי על ידי הבטחת הידוק זכוכית עם קלטת במגש עבור השקופיות לשכב כפי שהם להטיל. מגבונים לחות משימה (לוח חומרים) ממוקמים במגש להעלות את הלחות הפנימית של המגש כדי למנוע אידוי. המכסה והמגש מכוסים בנייר כסף כדי להגן על דגימות מהאור במהלך השלבים הרגישים לאור.
  5. מקם שקופית על מגבת נייר כדי לאפשר PBT/BSA/10% NGS פתרון להפעיל את השקופית ולנגב בעדינות את קצות השקופית. השתמש בחומר המגיב החוסם (טבלת חומרים) כדי לחסום שקופיות. למרוח טיפה אחת על שטח 14 מ"מ x 14 מ"מ. המשך 1 h ב 37 ° c בחדר לח.

5. הדגירה הנוגדן העיקרי

הערה: כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר של PLA ורקע מינימלי, מקדם הדילול של הנוגדנים העיקריים עשוי לדרוש אופטימיזציה (עיין בדיון לקבלת פרטים נוספים). בנוסף, יש לגדל את הנוגדנים הראשיים במחשבים מארחים שונים התואמים לספציפיות של הנוגדנים המשניים המשמשים ל-PLA.

  1. מקם שקופית על מגבת נייר כדי לאפשר לחסימת מגיב לפעול מחוץ לשקופית ולנגב בעדינות את הקצוות. השתמש נוגדן מדלל (הטבלה של חומרים) כדי לדלל את הנוגדנים העיקריים. החל 40 μL של פתרון הנוגדן העיקרי לכל 14 מ"מ x 14 מ"מ שטח.
  2. המלון משלב בין שקפים בחדר לח לבין לילה ב -4 ° c.

6. משחק בדיקה (נוגדן משני) הדגירה

הערה: עבור שלבים 6-9, השתמש במאגרי הכביסה A ו-B ב-RT. אם המאגרים מאוחסנים ב-4 ° c, הרשו להם להתחמם ל-RT לפני השימוש.

  1. לשטוף שקופיות 2x עבור 5 דקות עם 50 mL של 1x מאגר לשטוף A (טבלת חומרים) ב RT בצנצנת coplin. הגדר את הצנצנת Coplin על שייקר מסלולית להגדיר 60 סל ד.
  2. מקם שקופית על מגבת נייר כדי לאפשר לשטוף את המאגר לפעול מחוץ לשקופית ולנגב בעדינות את הקצוות. הכנת פתרון μL 40 המכיל הבדיקות פלוס ומינוס (מדולל 1:5 עם נוגדן דילול). להחיל את הפתרון על כל 14 מ"מ x 14 מ"מ שטח.
  3. מיכל שקופיות בחדר לח בשעה 37 ° c.

7. הארכה

  1. כביסה שקופיות 2x עבור 5 דקות עם 50 mL של מאגר שטיפת 1x A ב RT בצנצנת Coplin. הגדר את הצנצנת Coplin על שייקר מסלולית להגדיר 60 סל ד.
  2. לדלל את מאגר הקשר (טבלת חומרים) 1:5 עם מים באולטרטהורים. השתמש במאגר זה כדי לדלל את ליגאז (טבלת חומרים) 1:40 כדי להכין מלאי עבודה של פתרון הקשור.
    1. הצב את השקופית על מגבת נייר כדי להניח למאגר הכביסה לפעול מחוץ לשקופית ולנגב בעדינות את הקצוות. החל 40 μL של הפתרון הנוגע לשטח של 14 מ"מ x 14 מ"מ.
  3. מודקון שקופיות בתא לח במשך 30 דקות ב 37 ° c.

8. הגברה

הערה: שימוש ריאגנטים לזיהוי עם fluorophores אדום (טבלת חומרים) תוצאות בכמות הקטנה ביותר של הרקע ברקמת C. אלגיה .

  1. כביסה שקופיות 2x עבור 5 דקות עם 50 mL של מאגר שטיפת 1x A ב RT בצנצנת Coplin. הגדר את הצנצנת Coplin על שייקר מסלולית להגדיר 60 סל ד.
  2. לדלל את ההגברה אדום הגברה (טבלת חומרים) 1:5 עם מים באולטרטהורים. השתמש במאגר זה כדי לדלל את הפילמור (טבלת חומרים) 1:80 כדי להכין מלאי עבודה של פתרון הגברה ולהגן מפני אור.
    1. הצב את השקופית על מגבת נייר כדי להניח למאגר הכביסה לפעול מחוץ לשקופית ולנגב בעדינות את הקצוות. החל 40 μL של פתרון הגברה לכל 14 מ"מ x 14 מ"מ שטח.
  3. מודקון שקופיות בתא לח עבור 1 h ו 40 דקות ב 37 ° c. ודא שהתא הלח מכוסה בנייר כסף כדי להגן על הדגימות מהאור.

9. שוטף סופי

  1. לשטוף שקופיות 2x עבור 10 דקות עם 50 mL של 1x מאגר לשטוף B (טבלת חומרים) ב RT בצנצנת coplin. הגדר את הצנצנת Coplin על שייקר מסלולית להגדיר 60 סל ד.
  2. לשטוף שקופיות 1x עבור 1 דקות עם 50 mL של 0.01 x מאגר לשטוף B ב RT בצנצנת Coplin. הגדר את הצנצנת Coplin על שייקר מסלולית להגדיר 60 סל ד. מאגר זה מוכן על ידי דילול שטיפת מאגר B עם מים באולטרטהורים.

10. הרכבה כיסוי

  1. הנח לחוצץ העודף לשטוף את השקופית על מגבת נייר ונגב את כל מאגר השאריות שנותר בהיקף מצופה האפוקסי של השקופית.
  2. הוסף 10 μL של בינונית הרכבה (טבלה של חומרים) כדי לדגום ובעדינות להטיל שמיכות על גבי, ומאפשר את מדיום ההרכבה להתפשט.
  3. לצייר סביב הקצה של שמיכות עם לק ציפורניים כדי לאטום את הכיסויים ואת השקופית. להיות עדין עם היישום של לק ציפורניים כדי למנוע הזזת coverslip, אשר יפגע germlines. בואו להבריק את הציפורן במשך 20 דקות לפחות ב-RT, בעוד שהשקופיות מוגנות מאור, לפני הצגתם במיקרוסקופ.
  4. אחסן שקופיות במיכל כהה או במחזיק שקופיות, כאשר דגימות המסומנות בתווית PLA רגישות לאור. היצרן מציע כי ניתן לאחסן שקופיות ב-20 ° c לאחסון לטווח ארוך או ב -4 ° c לאחסון לטווח קצר. שקופיות שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה יימשך לפחות 2 חודשים כאשר יאוחסנו ב-20 ° c.

11. רכישת תמונה

  1. למטרת כימות, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלית וקד כדי ללכוד תמונות של germlines הבלטת מראה ברור, ניזוק, ו ללא הכול. לכוד z-מחסנית של germline המתפרס על כל germline במישור z וליצור תמונת הקרנה מקסימלית לשימוש עבור כימות.
    הערה: מיקרוסקופ Confocal וקד הוא אידיאלי להשגת ולכמת תמונות PLA עם הרקע פחות לעומת אלה שהתקבלו באמצעות מיקרוסקופ אפיסצנט.
    1. אם ה-germline אינו מתאים בשדה תצוגה אחד, לכוד את השדות החופפים של התצוגה בהתאם לצורך לצלם את כל germline. התחזיות המרביות של תמונות אלה ניתן לתפור יחד בפיג.
  2. הקפד לשמור על תנאי הדמיה זהה בין בקרה ודגימות ניסיוני כדי לקבוע סף הוגן ותקין לזיהוי של וקדי במהלך ניתוח תמונה.
    הערה: רשום לפחות 8-10 germlines מכל מדגם לשכפול כדי להקל על ניתוח סטטיסטי של כימות PLA. לפחות שלושה משכפל ביולוגי מומלצים ל-PLA כדי להשיג תוצאות כמותיים אמינות ועקביות.

12. ניתוח תמונה וקוונפיקציה באמצעות פיג'י/ImageJ

הערה: זרימת העבודה הבאה מבוססת על תמונות שנרכשו באמצעות מטרת 40x במיקרוסקופ קונפוקלית וקד, שבו תמונות נשמרות בתבנית. czi. את התמונות הללו ואת המטא-נתונים הנלווים שלהם, כולל ממדים, ניתן לגשת ולהיפתח בפיג/ImageJ לניתוח נוסף. יש לבדוק אם פיג'י מקבל את הפורמט של קבצי קונפוקלית וקד מן הקונמוקד זמין למשתמש הספציפי. אם לא, ניתן להשתמש בתמונות בתבנית. tiff לצורך ניתוח, אך המשתמש יצטרך לקבוע את קנה המידה של התמונה באופן ידני בפיג/ImageJ (לנתח | קביעת קנה מידה). מומלץ לנתח את כל תמונות הבקרה השליליות ביחד תחילה כדי לבסס את רמת הרקע.

  1. הפעל את זרימת העבודה של הניתוח על-ידי ניתוח כל תמונות הבקרה השליליות תחילה, ולאחר מכן עבור לדגימות הנסיוניות. פתחו תמונת הקרנה מרבית בפיג/ImageJ כדי לנתח (איור 2א). אם נעשה שימוש בקובץ. czi, תתבקש להשתמש בתיבת אפשרויות ייבוא של תבניות ביולוגיות .
    1. כלול את האפשרויות הבאות כדי לפתוח את התמונה שלך: הצג מחסנית עם דפדפן נתונים; מצב צבע = לצבוע. חלון עם התמונה צריך כעת לפתוח עם סרגל שקופיות כדי לעבור בין ערוצים שונים שנתפסו על ידי קונפוקלית וקד (g., dapi או PLA).
    2. אם התמונות צריכות להיות תפורות, ליצור כפילויות של כל ערוץ מכל תמונה באמצעות לחיצה ימנית על התמונה עם העכבר ובחירת שכפל כדי לפתוח את החלון הכפול . ציין רק את מספר הערוץ (c) המתאים לערוץ PLA או DAPI (לדוגמה, 2) ובטל את סימון התיבה עבור היפרמחסנית כפולות.
    3. עם שתי התמונות כדי להיות תפור פתוח, בחר תוספים | תפירה | לא אושר | 2D תפרים. החלון השני של התמונות ייפתח. בחרו בתמונות שישמשו לתפירת הקבצים והשתמשו בפרמטרי ברירת המחדל המוגדרים מראש בחלון, ולאחר מכן בחרו ' אישור '. התמונה שתיווצר תהיה תמונה בגווני אפור שנאספו.
      הערה: אם התתי-תמונות לא מיושרות באופן מושלם, התאמת פרמטרים (כלומר, הגדלת מספר הפסגות שייבדקו מ- 5 עד 500 או שינוי שיטת המיזוג ממיזוג ליניארי למקסימום. עוצמה) עשויה לסייע להשיג את התמונה הרצויה. בעוד כלי תפירה אחרים זמינים, גישה זו שומרת על הממד של התמונה, אשר חשוב לכמת.
  2. פתח את מנהל ה-ROI (אזור מעניין) על-ידי הקשה על T בלוח המקשים. חלון חדש בשם ROI Manager יפתח.
  3. בחרו בכלי המצולע מהתיבה ' ערכת כלים של פיג'י '. ירידה נקודות סביב germline כדי לתאר אותו וליצור ROI (איור 2ב). חבר את הנקודה האחרונה לראשונה כדי ליצור ROI שלם.
    הערה: לקבלת תמונות כהות יותר, מומלץ לכוונן את הניגודיות כדי לשפר את הניראות של ה-germline (שהוא הפיך) כך שניתן יהיה להתווה באופן מדויק יותר.
    1. מיד לאחר השלמת ההחזר, עבור אל מנהל ROI ובחר Add [t] כדי לאחסן את ההחזר. זה הכרחי כי כל שינוי התשואה כולל הוספה/הסרה של נקודות או תנועה של ROI ונקודות יעודכן (בחר עדכון מ-roi manager) לפני שתמשיך לשלב הבא, או שהם יאבדו. פרטים נוספים על מניפולציה של ROIs ואת הנקודות שלהם ניתן למצוא את פיג'י/ImageJ מדריך למשתמש.
  4. לאחר הגדרת האוריינטציה ROI, ניתן לשמור אותו לעיון מאוחר יותר על-ידי בחירת שם הROI במנהל ROI ואחריו עוד | שמור | (שם קובץ וציין יעד למיקום השמירה). ROIs שמור ניתן לפתוח במנהל ROI ידי בחירת עוד | פתח | (בחר את הקובץ).
  5. למדוד את האזור בתוך ההחזר על ידי בחירת שם ROI ממנהל ROI, ולאחר מכן בחירת לחצן מדידה במנהל roi. חלון התוצאות ייפתח עם מידע אודות ההחזר, כולל האזור שהוא מכסה בתמונה (μm2) (הזחה של איור 2ב). הקלט מידע זה בגיליון אלקטרוני לצורך חישובים עוקבים.
    הערה: ודא שקנה המידה של התמונה הוגדר כראוי כך שהממדים הנכונים של ה-ROI ייאספו. סוגי המדידות שדווחו בתיבת התוצאות ניתנות לשינוי על-ידי הולך לנתח | קביעת מדידות...
  6. פתחו תמונה משוכפלת של הערוץ PLA בלבד באמצעות בחירה ימנית של תמונת ה-PLA ובחירת השכפול (איור 2ג). חלון כפול ייפתח. ציין רק את מספר הערוץ (c) המתאים לערוץ ה-PLA (לדוגמה, 2) ובטל את סימון התיבה עבור היפרמחסנית כפולות. מומלץ לשכפל תמונה זו כך שהתמונה המקורית לא תשונה.
    הערה: אפשרויות אלה יופיעו רק בעת הצגת התמונות המכילות ערוצים מרובים ב-פיג'י/ImageJ. גישה חלופית היא פיצול התמונה הערוצים | צבע | פצל ערוצים, אך פעולה זו תשנה את קובץ התמונה המקורי.
  7. רק עם תמונה של ערוץ PLA נבחר, עבור לתמונה | כוונן | . אנימבין. חלון הסף של התמונה ייפתח. בחר באפשרות ברירת מחדל כשיטת הסף, אדום כצבע ובדוק את תיבת הרקע הכהה . באמצעות הרצועה העליונה על החלון, החלק את הסרגל לכיוון הימין עד שכולם מודגשים בבירור בתמונה.
    1. הקלט את הערך בתיבה מימין לרצועה העליונה ורשום את הערך ששימש להגדרת הסף. בחר באפשרות החל בחלון הסף כדי לסיים את הסף, והתמונה תמיר את הרקע הלבן עם האפשרות שהנקודות השחורות יהיו גלויות (איור 2D). בדוק את הסף על מספר תמונות בקרה שליליות כדי להבטיח שהוא מתאים ללכידת כל ה-PLA וקדי מתמונה לתמונה לפני כימות.
      הערה: כדי להציג את סף וקדי כנקודות שחורות על רקע לבן, עבור לתהליך | בינארי | . האופציות האלה ולבטל את הסימון בתיבת הרקע השחור . ערך הסף בין 30-40 הוא נקודת התחלה טובה לזיהוי PLA ב-germline; עם זאת, הערך האידיאלי עשוי להשתנות בהתאם לרקע.
  8. כדי לכמת את ה-PLA foci, החל את ה-ROI שנוצר משלבים 12.3-12.3.1 לתמונת הסף על-ידי בחירת שם הROI מהחלון של מנהל הROI. קו המתאר של ההחזר אמור להופיע בתמונה באותו מיקום שהיה מתמונת המקור (איור 2E).
    1. עבור לניתוח | ניתוח חלקיקים. החלון ' נתח חלקיקים ' יפתח ויבחר את הפרמטרים הבאים: גודל (מיקרון ^ 2) = 0-אינסוף, מעגליות = 0.00-1.00, הצג = כלום. בדוק את תיבת הסיכום .
    2. בחר אישור, וטבלת סיכום תופיע עם מידע על ההחזר (כלומר, הספירה הכוללת של pla וקדי, השטח הכולל שנכבש על ידי pla וקדי בתוך ההחזר, בגודל הממוצע של pla וקדי, ואחוז השטח שנכבש על ידי pla וקדי יחסית לגודל של ההחזר) (הזחה של איור 2e). הקלט מדידות אלה בגיליון אלקטרוני.
  9. חזור על שלבים 12.1-12.8 עבור מספר תמונות בקרה שליליות המשתמשות באותו סף.
    1. לאחר כל תמונות שליטה שלילית נותחו, חזור על שלבים 12.1-12.8 עבור כל הדגימות ניסיוני באמצעות אותו סף שנקבע על ידי השליטה השלילית לזהות ולכמת PLA foci.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שיתוף חיסוני של שני הדגלים של 3xFLAG::D LC-1; דגל GFP ו 3xFLAG::D LC-1; OMA-1:: GFP germlines עם הדגל ונוגדנים GFP חשף דפוסי הביטוי שלהם ב-germlines (איור 3כל-Iii, 3bii-iii). בעוד GFP התבטא ברחבי germline (איור 3Aiii), OMA-1:: gfp הביטוי היה מוגבל pachytene מאוחר ו oocytes (איור 3biii)27. חיסוני הדגל מראה כי 3xFLAG::D LC-1 התבטא ברחבי germline בשני הזנים (איור 3כל, 3xflag). על-ידי שיתוף חיסוני משותף, את החפיפה בין 3xFLAG::D LC-1 ו-OMA-1:: GFP הוא לא זהה בין זה בין 3xFLAG::D LC-1 ו-GFP (שליטה שלילית).

מאז ניסויים אלה שנבדקו עבור אינטראקציות בין DLC-1 ו-OMA-1, אזור העניין עבור כימות PLA ב germline הקיפה pachytene מאוחר דרך oocytes בכל germline בדק (איור 2B), כמו זה האזור של OMA-1 ביטוי (איור 1, איור 3biii). 3xFLAG::D LC-1; OMA-1:: gfp germlines נראה כמות גדולה יותר של PLA וקדי בתוך אזור זה בהשוואה ל 3xflag::D lc-1; שורות GFP (איור 3בשני-Iv, 3diii-iv). כימות של pla חשף כי מספר pla וקדי הנוכחי ב 3xflag::D lc-1; OMA-1:: GFP germlines היה גדול באופן משמעותי מאשר 3xFLAG::D LC-1; GFP (איור 3, ciii-Iv, 3diii-iv; בע) שולחן 1). עוד, גם עם דילול 10x גבוה יותר של נוגדנים GFP ו דגל, ההבדל בין השליטה וניסיוני PLA היה עדיין שונה באופן משמעותי; עם זאת, הצפיפות הכוללת והגודל הממוצע של וקדי הופחת (טבלה 1).

Figure 1
איור 1: סכימטי של ס. אלגיה . אזור הקצה המרוחק מכיל את מאגר תאי הגזע, שלאחריו מגיע התאים המיוטיניים, היכן שהתאים החליפו ממיטזיס ל-meiotic. תאים שיוצאים מתוך הפכיטיק pachytene להתפתח oocytes, עם oocyte הבוגר ביותר בקצה האבוכי. האזור מוצלל בירוק, המתפרס על-ידי הפכיטיקה המאוחרת, דרך כל האוציטים, מייצגת את תבנית ה-OMA-1 של הביטוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תמונות מייצגות של זרימת עבודה עבור germline כימות משחק. Germline בשימוש באיור זה הוא 3xFLAG נציג::D LC-1; . מחשב 3 ג (א) תמונה של ערוצי מיזוג ו-dapi ממוזג נפתח בפיג/imagej. (ב) כלי המצולע בפיג משמש לחלוקה לרמות ולהגדרת אזור הריבית (ROI) ב-germline (שורה צהובה עם תיבות לבנות) שהוא כימות, ואזור ההחזר (μm2) נמדד (כניסת B). (ג) תמונה בודדת של ערוץ PLA מתקבלת על-ידי שכפול או פיצול של התמונה המקורית ב (א, ב). (ד) הסף מוגדר בקפידה כדי להדגיש בבירור את כל ה-pla וקדי בתמונה pla. יש להחיל את אותו הסף על כל התמונות הנסיוניות והשולטות שינותחו יחד. (ה) עם הROI שנבחר בתמונת הסף, הפונקציה ניתוח חלקיקים תחזיר טבלה של תוצאות הכוללת את הספירה הכוללת של וקדי כלול בתוך ההחזר (הזחה של E). תמונות הן תמונות מפיג/תמונה J: תוספים | עזרי שירות | לכידת תמונה. קנה מידה של סרגלים = 10 μM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תמונות מייצגות של germlines בעקבות המכתים משותף או PLA. (א, ב) דפוסי הביטוי של חלבונים מתויגים ב 3xFLAG::D LC-1; GFP (Ai-iv) ו-3xFLAG::D LC-1; OMA-1:: GFP (Bi-iv) הוערכו ב בלוטות, קבוע, ומוכתם חיסוני. נוגדן נגד הדגל היה בשימוש בדילול 1:1000, בעוד נוגדן anti-GFP נעשה שימוש בדילול 1:200, אשר הוא אופטימלי עבור תמונות immunofluorescence. ה-DNA היה מוכתם על ידי DAPI, והערוץ הבודד מוצג בגווני אפור לניגודיות טובה יותר (Aiv, הבולוף). בכל תמונה, את התאים גזע ו-meiotic pachytene מתוארים עם קווים מקווקווים, בעוד oocytes מתוארים עם קווים מנוקדים. התמונות נרכשו עם. מיקרוסקופ אפיסנטי סולם ברים = 10 μM. (ג, ד) מפלה בדגל 3xflag::D lc-1; GFP (C) ו-3xFLAG::D LC-1; אומה -1:: GFP (D) הגונדות. נוגדן נגד הדגל שימש בדילול 1:1000, בעוד נוגדן anti-GFP שימש בדילול 1:4000. ה-DNA היה מוכתם על ידי DAPI, וגם DAPI הפרט (Cii, Dii) ו-PLA ערוצים (ciii, Iv, dii, iv) מוצגים בגווני אפור עבור ניגודיות טובה יותר. הירוק, הקופסה מקווקו (ciii, diii) מציין את המיקום של התמונה הגדלת של PLA (Civ, Div). בכל תמונה, את התאים גזע ו-meiotic pachytene מתוארים עם קווים מקווקווים, בעוד oocytes מתוארים עם קווים מנוקדים. . התמונות נרכשו עם מיקרוסקופ קונמוקד קנה מידה ברים = 10 μM. (A, B, C, D) התאספו כולם עם תוכנת עיבוד תמונה (ראה טבלת חומרים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

נוגדן דילול הנבג נבדק ממוצע צפיפות ה-PLA (foci/μM2) X 10-2 מבחן T גודל ממוצע של מיקוד PLA (μM2) מבחן T
αFLAG (1:1000), αGFP (1:4000) 3xFLAG::D LC-1; GFP 3.9 ± 1.4 P = 1.917 e-05 0.52 ± 0.127 P = 0.057
3xFLAG::D LC-1; אומה -1:: GFP 9.1 ± 2.7 1.8 ± 2.08
αFLAG (1:10000), αGFP (1:40000) 3xFLAG::D LC-1; GFP 3.2 ± 2.4 P = 3.395 e-04 0.51 ± 0.1 P = 0.019
3xFLAG::D LC-1; אומה -1:: GFP 7.7 ± 3 0.7 ± 0.24

טבלה 1: סיכום של תוצאות PLA. טבלה מדווחת על סיכום של כימות משחק בשתי מדלל של נוגדן ראשוני. ההבדלים הממוצע בצפיפות pla או בגודל הממוצע של pla וקדי עבור OMA-1:: gfp בין שני כבלי נוגדנים לא היו משמעותיים (p-ערך לא מוצג). אותה השוואה חלה גם על GFP, אשר גם הביא הבדל משמעותי (p-ערך לא מוצג). ערכי p נקבעו באמצעות מבחן tדו-זנבי/שווה-שוויון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאשר לימוד PPIs ב -C. אלגיה germline, הרזולוציה הגבוהה ביותר המוצעים על ידי PLA לעומת שיתוף חיסוני מאפשר הדמיה וכימות של מיקומים שבהם אינטראקציות להתרחש ב-germline. זה דווח בעבר כי DLC-1 לקיים אינטראקציה ישירה עם OMA-1 באמצעות שיטת מחוץ גופית בשנת 26; עם זאת, האינטראקציה הזאת לא התאושש על ידי vivo הנפתח. הפלורסנט שיתוף חיסוני של 3xFLAG::D LC-1; OMA-1:: GFP germlines מראה חפיפה בדפוסי הביטוי עבור DLC-1 ו-OMA-1; עם זאת, אין אינדיקציה היכן האינטראקציות שלהם מתרחשות ב-germline, ואת החפיפה עצמה אינה גדולה יותר מזו בין 3xFLAG::D LC-1 ו-GFP שאינו מחובר לחלבון כלשהו (שליטה שלילית). שימוש באתרו , זה נמצא כי DLC-1 עושה אינטראקציה עם OMA-1 ב germline, אשר מציע PLA עשוי להיות רגיש יותר לאיתור של ppis לעומת גישות אחרות. באמצעות גישה זו אנו ממשיכים להתרחב על התפקיד המתעוררים של DLC-1 כקופקטור RBP. עבודה זו ממחישה את היכולת של PLA כדי לזהות PPIs ב-germline ויוצר התייחסות למשתמשים עתידיים לחקור את האינטראקציות בין חלבונים של האינטרס שלהם.

PLA מציע למשתמשים את היכולת לבדוק PPIs עם רגישות דומה ללא החסרונות הקשורים טכניקות אחרות כגון למשל. רמות רלוונטיות ביולוגית של ביטוי חלבון לא יכול להיות אופטימלי עבור לדאוג ו-BiFC. כמו כן, הפונקציה של שותפי אינטראקציה פוטנציאליים עשויה להיות מושפעת מהתגים הגדולים המשמשים בשתי הגישות. יתר על כן, בנוסף, מומלץ להגדיר מיקרוסקופ מיוחדות שייתכן שאינו זמין בקלות. PLA עשוי גם להיות גישה חסכונית ללמוד PPIs לעומת טכניקות אחרות. משתמשים רק צריך להשיג ריאגנטים PLA וגישה למיקרוסקופ קונפוקלית וקד עבור הדמיה בנוסף הריאגנטים הדרוש עבור כתמים חיסוני. ניתוח תמונה מבוצע באמצעות תוכנית קוד פתוח פיג'י/ImageJ, הזמין לכל משתמש ללא עלות. משתמשים שאין להם ניסיון עם לדאוג או BiFC עשוי למצוא PLA להיות חלופה מתאימה. הפרוטוקול המוצג כאן מכיל רק כמה צעדים נוספים מעבר הליך חיסוני אופייני, מה שהופך את הטכניקה הזו לנגישה כמעט לכל משתמש עם ניסיון חיסוני.

הבלטה של הגונאד על-ידי חיתוך חשוב עבור PLA כדי לעבוד בהצלחה. רקמות הנשמרות בתוך קוטיקולה אינה מתייגת על ידי PLA באמצעות פרוטוקול זה. עוד נמצא כי עוברי הבלטת מתויג ביעילות על-ידי פרוטוקול PLA זה. הדבר מרמז על כך שרקמות אחרות שפורסמו במהלך הניתוח, כגון הבטן, עשויות להיות תואמות ל-PLA. נמצא כי PLA מייצרת אותות חזקים על לוטה, כמו גם דגימות העובר מוכן עם שני פרוטוקולי קיבוע המשמשים לעתים קרובות עבור כתמים חיסוני. הדבר מרמז על כך שהליכי קיבוע נוספים המשמשים בשדה עשויים להיות תואמים ל-PLA אך יהיה צורך להעריך בנפרד על-ידי המשתמש.

קביעת הדילול האופטימלי של נוגדנים ראשוניים היא קריטית להצלחה PLA. מומלץ להתחיל עם דילול כי כבר אופטימיזציה עבור מאימונוoforסנס. זה מושגת בדרך כלל על ידי מנסה את הנוגדן העיקרי בניסוי אימונוofor, כדי למצוא את הדילול האופטימלי שבו יש רקע נמוך, גבוה, מסוים האות. לאחר הדילול האופטימלי עבור immunofluorescence הוקמו, אלה הדלעות אותם ניתן לבדוק בתוך שיטת PLA המשווה את האות המיוצר על ידי זוג של שחקנים פוטנציאליים האות המיוצר על ידי זוג שליטה של חלבונים שאינם אינטראקציה.

במקרה שבו האות שופע נצפתה במדגם הבקרה, נדרש דילול נוסף של נוגדנים ראשוניים. זה נמצא כי הנוגדן הראשוני האופטימלי מדלל עבור PLA הם לפחות אותו דבר או אפילו יותר לדלל מאשר מה שמשמש immunofluorescence. לדוגמה, תמונות immunofluorescence באיור 3A, B הם נציגים של 1:1000 דילול של אנטי דגל ו 1:200 דילול אנטי-gfp. עם זאת, הנוגדן מדלל תמונות PLA באיור 3C, D היו 1:1000 של אנטי דגל ו 1:4000 של anti-gfp. הדילול של נוגדן anti-GFP בשימוש ב-PLA גדול יותר ממה ששימש לimmunofluorescence, הרומז כי PLA הוא הרבה יותר רגיש. נמצא כי דילול נוגדנים 10 מקפלים הביא לירידה של צפיפות PLA, כמו גם בגודל של DLC-1/OMA-1 וקדי (שולחן 1). למרות הפחתה זו, ההפרש בצפיפות הפעולה של PLA בין השליטה השלילית לבין DLC-1/OMA-1 עדיין היה שונה באופן משמעותי. זה מרמז כי PLA עדיין רגיש מאוד עם דילול גבוה יותר של הנוגדן העיקרי; עם זאת, השכיחות של אינטראקציות ניתן לזיהוי לא העריכו.

לעומת זאת, נמוך מדי מדילול נוגדנים יכול להיות שני סוגים של השלכות מזיקות. ראשית, הדבר עשוי ליצור אות רקע משמעותי בפקד השלילי. שנית, מוכן וקדי המיוצר על ידי חלבונים השותף אינטראקציה עשוי להתמזג וחופפים, מה שמקשה לפתור בתמונת הקרנה מקסימלית. הדבר מוביל להערכת החסר של מספר וצפיפות של PLA במהלך ניתוח תמונה. אות PLA הוא איזון של גילוי הקרבה מזויף בין שותפים שאינם אינטראקציה ומזהה כל מופע של PPIs אמיתי המתרחשים במדגם. כתוצאה מכך, התאגדות של שליטה שלילית שבה שני חלבונים אינם אינטראקציה חיונית לקביעת רמת הרקע בניסויים PLA. השמטה של נוגדן ראשוני בניסוי PLA שימש שליטה שלילית בדוחות אחרים9,10; עם זאת, גישה זו אינה יכולה להתחשב באינטראקציות לא ספציפיות או באיגוד נוגדנים ספציפי שעלול להשפיע על התוצאה ב-PLA הניסיוני. GFP שימש כאן כפקד שלילי, מאז לא האינטראקציה הישירה בין DLC-1 ו-GFP היה צפוי. נמצא שלכל הבקרה השלילית. יש אות רקע פעולה זו תומכת עוד יותר בחשיבות של שליטה שלילית לגבי שיטת PLA בעת הערכת הנתונים הניסיוניים.

לאחר הקמת מדלל PLA ממוטב מבוססים, דיעות אלה ניתן להשתמש כדי לבדוק על פני מערך של זנים תולעת שונים המכילים זוגות שונים של שותפים אינטראקציה מתויג עם תגי זיקה זהה. חשוב להשתמש באותם זוג של נוגדנים ראשוניים כדי להבטיח השוואה הוגנת של אותות PLA כתוצאה מכך, כמו וריאציה של זיקה נוגדן יכול להשפיע על התוצאה של ניסוי PLA. דו ח נוסף על PLA מציע אופטימיזציה של דילול הנוגדנים המשניים של PLA10; עם זאת, לא מומלץ לעשות זאת. מדלל גבוה של נוגדנים משני עשוי להפחית את היעילות של האחרים במורד המדרגות PLA כי תלוי בזיהוי של פלוס ומינוס מומצודים לנוגדנים משני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

כמה זנים נמטודות בשימוש במחקר זה סופקו על ידי המרכז הגנטיקה של caenorהאבודיטיס ממומן על ידי NIH (P40OD010440). מיקרוסקופ confocal וקד נערך באוניברסיטת מונטנה BioSpectroscopy ליבה מעבדה מחקר פעלו עם תמיכה מ-NIH פרסים P20GM103546 ו S10OD021806. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק NIH GM109053 כדי E.V., האגודה האמריקנית לאיגוד הלבבות 18 PRE34070028 ל X.W., ופרס האקדמיה למדעים של מונטנה ל-X.W. התורמים לא היו מעורבים בתכנון הלמידה או בכתיבת הדו ח. . אנו מודים למ אלאלבקר לדיון

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% paraformaldehyde solution Electron Microscopy services 15710 used to make 4% working solution
1M KH2PO4 Sigma P0662 Prepare a 1M working stock
1x M9 various various prepared as 10x stock used at 1x; see wormbook.org for protocol
1x PBS various various see wormbook.org for protocol
26.5 Gauge Needle Exel International 26402 Needles used for dissection
BSA Lampire 7500802
Centrifuge Tubes Thermo Scientific 05-529C 50ml Oak ridge centrifuge tube used for synchronization
Confocal Microscope Zeiss 880
Coplin Jar PolyLab 62101
Coverslip to Freeze Sample Globe Scientific 1411-10 22x40mm, No. 1
Coverslip to Seal Slide Globe Scientific 1404-15 22x22mm, No. 1.5
DAPI Mounting Medium for Immunofluorescence Vector H-1200
Ligase Sigma-Aldrich DUO82029 Duolink 1x Ligase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Amplification red buffer Sigma-Aldrich DUO82011 Duolink 5x Amplification Red buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Ligation Buffer Sigma-Aldrich DUO82009 Duolink 5x Ligation buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Antibody Diluent Sigma-Aldrich DUO82008 Duolink antibody diluent,Comes with DUO92004 and DUO92002, Note: A 1x PBS/1% BSA solution can also be used as a substitute to dilute the antibody.
Blocking Solution Sigma-Aldrich DUO82007 Duolink blocking solution, Comes with DUO92004 and DUO92002
Mounting Medium for PLA Sigma-Aldrich DUO82040 Duolink In Situ mounting medium with DAPI
MINUS Probe Sigma-Aldrich DUO92004 Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS
PLUS Probe Sigma-Aldrich DUO92002 Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS
Wash Buffer A Sigma-Aldrich DUO82046 Duolink In Situ wash Buffer A
Wash Buffer B Sigma-Aldrich DUO82048 Duolink In Situ wash Buffer B
Polymerase Sigma-Aldrich DUO82030 Duolink Polymerase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Epifluorescent Microscope Leica DFC300G camera, DM5500B microscope
Goat anti-mouse Alexa 594 JacksonImmuno 115-585-146 Use at 1:500
Goat anti-rabbit Alexa 488 JacksonImmuno 111-545-144 Use at 1:200
Image Processing Software Adobe Adobe Photoshop + Illsutrator CS3
Glass Pipette Corning 7095B-5X
Levamisole ACROS Organics 187870100 Prepare a 250mM working stock
Methanol Fisher Scientific A454
Mouse anti-FLAG Sigma F1804 Use at 1:1000 for immunofluorescence and PLA, pre-block with normal goat serum recommended
Nailpolish L.A. colors CNP195
Nematode Growth Medium (NGM) various See wormbook.org for protocol
Normal Goat Serum JacksonImmuno 005-000-121
Polyethylene Pasteur Pipette Globe Scientific 135030
Poly-L-Lysine Sigma-Aldrich P1524 Prepared as 0.1% stock solution in water, stored at -20C, and diluted 1:100 in water to coat slides
Petri Dishes Tritech PD7060 60 mm diameter
Rabbit anti-GFP Thermo Fisher G10362 Use at 1:200 for immunofluorescence, 1:4000 for PLA
Slides Thermo Fisher 30-2066A-Brown Three-square 14x14mm autoclavable slides with bars are custom-ordered through Fisher Scientific. Poly-L-Lysine added to slides in the lab
Sodium Hypochlorite solution Fisher Scientific SS290-1
task wipes Kimtech 34120 4.4x8.4 inch task wipes
Trays (242x241x20mm) Thermo Fisher 240845 Used to make humid chamber
Triton X-100 ACROS Organics 327372500
Ultrapure water Milli-Q Ultrapure water obtained from Milli-Q Integral Water Purification System
Watchglass Carolina Biological 742300
-20 °C freezer
-80 °C freezer
Aluminum Foil
OP50 strain E. coli
Orbital Shaker
Tape
Nematode strains used in this study (both available upon request)
mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475] UMT 376 dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Reference 24
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III UMT 422 dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Reference: this study

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Nooren, I. M., Thornton, J. M. Diversity of protein-protein interactions. EMBO Journal. 22 (14), 3486-3492 (2003).
  3. Patil, A., Kinosselecta, K., Nakamura, H. Hub promiscuity in protein-protein interaction networks. International Journal of Molecular Science. 11 (4), 1930-1943 (2010).
  4. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), e1000807 (2010).
  5. Pazdernik, N., Schedl, T. Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 1-16 (2013).
  6. Nousch, M., Eckmann, C. R. Translational control in the Caenorhabditis elegans germ line. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 205-247 (2013).
  7. Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).
  8. Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).
  9. Thymiakou, E., Episkopou, V. Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
  10. Wang, S., et al. Detection of in situ protein-protein complexes at the Drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay. Journal of Visualized Experiments. (95), 52139 (2015).
  11. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  12. Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. Biotechniques. 53 (5), 285-298 (2012).
  13. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Science. 32 (9), 407-414 (2007).
  14. Hiatt, S. M., Shyu, Y. J., Duren, H. M., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Methods. 45 (3), 185-191 (2008).
  15. Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
  16. Wilson, M. J., Salata, M. W., Susalka, S. J., Pfister, K. K. Light chains of mammalian cytoplasmic dynein: identification and characterization of a family of LC8 light chains. Cell Motility and Cytoskeleton. 49 (4), 229-240 (2001).
  17. Erdős, G., et al. Novel linear motif filtering protocol reveals the role of the LC8 dynein light chain in the Hippo pathway. PLoS Computational Biology. 13 (12), e1005885 (2017).
  18. Navarro-Lérida, I., et al. Proteomic identification of brain proteins that interact with dynein light chain LC8. Proteomics. 4 (2), 339-346 (2004).
  19. Rapali, P., et al. DYNLL/LC8: a light chain subunit of the dynein motor complex and beyond. FEBS Journal. 278 (17), 2980-2996 (2011).
  20. Rapali, P., et al. Directed evolution reveals the binding motif preference of the LC8/DYNLL hub protein and predicts large numbers of novel binders in the human proteome. PLoS One. 6 (4), e18818 (2011).
  21. Clark, S. A., Jespersen, N., Woodward, C., Barbar, E. Multivalent IDP assemblies: Unique properties of LC8-associated, IDP duplex scaffolds. FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2543-2551 (2015).
  22. Jespersen, N., et al. Systematic identification of recognition motifs for the hub protein LC8. Life Science Alliance. 2 (4), (2019).
  23. Wang, X., et al. Dynein light chain DLC-1 promotes localization and function of the PUF protein FBF-2 in germline progenitor cells. Development. 143 (24), 4643-4653 (2016).
  24. Dorsett, M., Schedl, T. A role for dynein in the inhibition of germ cell proliferative fate. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 6128-6139 (2009).
  25. Ellenbecker, M., et al. Dynein Light Chain DLC-1 Facilitates the Function of the Germline Cell Fate Regulator GLD-1 in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (2), 665-681 (2019).
  26. Day, N. J., Ellenbecker, M., Voronina, E. Caenorhabditis elegans DLC-1 associates with ribonucleoprotein complexes to promote mRNA regulation. FEBS Letters. 592 (22), 3683-3695 (2018).
  27. Detwiler, M. R., Reuben, M., Li, X., Rogers, E., Lin, R. Two zinc finger proteins, OMA-1 and OMA-2, are redundantly required for oocyte maturation in C. elegans. Developmental Cell. 1 (2), 187-199 (2001).
  28. Spike, C. A., et al. Translational control of the oogenic program by components of OMA ribonucleoprotein particles in Caenorhabditis elegans. Genetics. 198 (4), 1513-1533 (2014).
  29. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).
  30. Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  31. Duerr, J. S. Antibody staining in C. elegans using "freeze-cracking". Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
  32. Crittenden, S., Kimble, J. Preparation and immunolabeling of Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2009).

Tags

ביולוגיה התפתחותית סוגיה 159 germline רנ א-כריכת חלבון LC8 PLA ג. אלאנים שיטת היטל קירבה
באיתור באתרו של האסיפה המורכבת של ריבונאופאנפרוטאין ב <em>-C. אלגיה</em> germline באמצעות שיטת הסמיכות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Day, N. J., Wang, X., Voronina, E.… More

Day, N. J., Wang, X., Voronina, E. In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay. J. Vis. Exp. (159), e60982, doi:10.3791/60982 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter