Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

في الكشف عن الموقع من التجمع مجمع Ribonucleoprotein في C. elegans Germline باستخدام القرب الربط اساي

Published: May 5, 2020 doi: 10.3791/60982
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Biological Sciences, University of Montana

Summary

يوضح هذا البروتوكول استخدام فحص ربط القرب للتحقيق في التفاعلات بين البروتين والبروتين في الموقع في خط ج. elegans الجرثومي.

Abstract

إن فهم متى وأين تحدث التفاعلات بين البروتين والبروتين (PPIs) أمر بالغ الأهمية لفهم وظيفة البروتين في الخلية وكيفية تأثر العمليات الأوسع مثل التنمية. إن خط كريات الإيجان اتّصال Caenorhabditis elegans هو نظام نموذجي رائع لدراسة مؤشرات أسعار الصفحات المرتبطة بتنظيم الخلايا الجذعية وداء الميوس والتنمية. هناك مجموعة متنوعة من التقنيات المتطورة التي تسمح بالموسومة البروتينات ذات الأهمية للاعتراف بها من قبل الأجسام المضادة القياسية ، مما يجعل هذا النظام مفيدًا لتفاعلات تقدير الربط القربي (PLA). ونتيجة لذلك، فإن جيش التحرير الشعبي قادر على إظهار أين تحدث مؤشرات أسعار الشراكة بين القطاعين العام والخاص بطريقة مكانية وزمنية في الخطوط الجرثومية على نحو أكثر فعالية من النهج البديلة. يوصف هنا هو بروتوكول لتطبيق وتقدير هذه التكنولوجيا للتحقيق PPIs في خط الجراثيم C. elegans.

Introduction

ويقدر أن أكثر من 80٪ من البروتينات لديها تفاعلات مع الجزيئات الأخرى1، مما يؤكد على مدى أهمية PPIs لتنفيذ وظائف بيولوجية محددة في الخلية2. تعمل بعض البروتينات كمحاور تسهل تجميع المجمعات الأكبر الضرورية لبقاء الخلية1. هذه المحاور التوسط PPIs متعددة وتساعد على تنظيم البروتينات في شبكة تسهل وظائف محددة في الخلية3. كما يتأثر تكوين مجمعات البروتين بالسياق البيولوجي، مثل وجود أو عدم وجود شركاء محددين يتفاعلون4،وأحداث إشارات الخلايا، ومرحلة نمو الخلية.

C. يستخدم الإيغانك ككائن حي نموذجي لمجموعة متنوعة من الدراسات، بما في ذلك التنمية. يتكون التشريح البسيط لهذا الحيوان من عدة أعضاء ، بما في ذلك الغدد التناسلية والأمعاء وبشرة شفافة ، مما يسهل تحليل تطور الدودة. الخط الجرثومي المقيم في الغدد التناسلية هو أداة عظيمة لدراسة كيفية نضج الخلايا الجذعية الجرثومية إلى gametes5 التي تتطور إلى أجنة وفي نهاية المطاف الجيل القادم من ذرية. تحتوي منطقة الطرف المنفّر من الخط الجرثومي على مجموعة من الخلايا الجذعية المجددة ذاتيًا(الشكل 1). كما الخلايا الجذعية ترك مكانة، فإنها تتقدم إلى pachytene meiotic وتتطور في نهاية المطاف إلى البويضات في مرحلة الكبار الشباب(الشكل 1). يتم تنظيم هذا البرنامج من التنمية في خط الجراثيم بإحكام من خلال آليات مختلفة، بما في ذلك شبكة تنظيمية ما بعد النسخ التي تسهلها البروتينات الملزمة الحمض النووي الريبي (RBPs)6. وتتسم مؤشرات أسعار الشراكة بين القطاعين العام والخاص بأهمية هذا النشاط التنظيمي، حيث ترتبط الممارسات التجارية التقييدية بعوامل مساعدة أخرى لممارسة وظائفها.

هناك العديد من النهج التي يمكن استخدامها للتحقيق في PPIs في الدودة ، ولكن كل منها له قيود فريدة من نوعها. في الامطار المناعية على الجسم الحي (IP) يمكن استخدامها لعزل المجمعات البروتين البروتينمن مقتطفات دودة كاملة; ومع ذلك، لا يشير هذا الأسلوب إلى مكان حدوث مؤشر أسعار المنتجين في الفيروس المتنقل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يصعب استرداد مجمعات البروتين العابرة وتتشكل فقط خلال مرحلة محددة من التطور أو في عدد محدود من الخلايا عن طريق الترسيب المناعي المشترك. وأخيرا، تحتاج تجارب الملكية الفكرية إلى معالجة مخاوف إعادة الفرز المعقدة البروتينية بعد الانزل والاحتفاظ غير محددة من البروتينات على مصفوفة تقارب.

النهج البديلة للكشف في الموقع من PPIs هي المناعة المشتركة، نقل الطاقة صدى Förster (FRET)، ومكملات الفلورسيان ثنائي الجزيئية (BiFC). يعتمد المناعي المشترك على الكشف المتزامن عن بروتينين مهتمين بأنسجة الديدان الثابتة وقياس مدى التوطين المشترك للإشارة. استخدام المجهر فائقة الدقة، والتي توفر تفاصيل أكبر من المجهر القياسي7،ويساعد على اختبار أكثر صرامة توطين البروتين المشترك وراء حاجز حيود محدودة من 200-300 نانومتر8. ومع ذلك ، فإن المناعة المشتركة باستخدام كل من المجهر التقليدي وفائق الدقة يعمل بشكل أفضل للبروتينات ذات أنماط التعريب المحددة جيدًا. وعلى النقيض من ذلك، يصبح أقل إفادة بكثير بالنسبة للشركاء المتفاعلين الموزعين توزيعاً. قياس لتوطين مشترك للإشارات على أساس التداخل لا يوفر معلومات دقيقة حول ما إذا كانت البروتينات في معقدة مع بعضها البعض9,10.

وعلاوة على ذلك، فإن الترسيب المناعي المشترك والمناعة المشتركة لمجمعات البروتين البروتينليست كمية، مما يجعل من الصعب تحديد ما إذا كانت هذه التفاعلات كبيرة. FRET و BiFC كلاهما تقنيات تستند إلى الفلورسنت. تعتمد FRET على وضع علامات على البروتينات ذات الأهمية مع البروتينات الفلورية (FPs) التي تتداخل الطيفية التي يتم فيها نقل الطاقة من FP واحد (المانح) إلى FP آخر (مقبول)11. وينتج عن هذا النقل غير الإشعاعي للطاقة الفلورسية للFP المقبول التي يمكن اكتشافها عند الطول الموجي للانبعاثات. ويستند BiFC على إعادة تشكيل بروتين الفلورسنت في الجسم الحي. فإنه ينطوي على تقسيم GFP إلى اثنين من شظايا تكميلية، مثل الحلزون1-10 والحلزون 1112،والتي تنصهر بعد ذلك إلى اثنين من البروتينات ذات الفائدة. إذا تفاعل هذان البروتينان، تصبح الأجزاء التكميلية من GFP قريبة بما يكفي من القرب لطيها وتجميعها، مما يعيد تشكيل فلوروفور GFP. ثم يلاحظ GFP المعاد تشكيله مباشرة على أنه فلورسين ويشير إلى مكان حدوث مؤشر أسعار المنتجين.

على هذا النحو ، يعتمد كل من FRET و BiFC على العلامات الفلورية الكبيرة التي يمكن أن تعطل وظيفة البروتين الموسوم. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب FRET و BiFC تعبيرًا وفيرًا وقابلًا للبروتينات الموسومة للحصول على بيانات دقيقة. قد لا تكون FRET مناسبة للتجارب حيث يكون أحد الشريكين أكثر من الآخر ، مما قد يؤدي إلى خلفية عالية13. يجب أيضًا تجنب التعبير المفرط في تجارب BiFC ، لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى تجميع غير محدد14 يؤدي إلى زيادة الخلفية. تتطلب كلتا التقنيتين تحسين ظروف التعبير والتصوير للبروتينات الموسومة ، والتي قد تطيل الوقت اللازم لإكمال التجارب.

إن فحص ربط القرب (PLA) هو نهج بديل يمكن أن يعالج قيود التقنيات المذكورة أعلاه. يستفيد جيش التحرير الشعبي من الأجسام المضادة الأولية التي تتعرف على البروتينات ذات الأهمية (أو علاماتها). ثم يتم ربط هذه الأجسام المضادة الأولية بواسطة الأجسام المضادة الثانوية التي تحتوي على تحقيقات oligonucleotide التي يمكن أن تهجين مع بعضها البعض عندما ضمن مسافة 40 نانومتر (أو أقصر)15. يتم تضخيم الحمض النووي الهجين الناتج عن ذلك من خلال تفاعل PCR ، والذي يتم اكتشافه بواسطة المسابير التي تكمل الحمض النووي. وهذا يؤدي إلى بؤر التي يتم تصورها بواسطة المجهر. يمكن لهذه التكنولوجيا الكشف عن PPIs في الموقع في الأنسجة المعقدة (أي الغدد التناسلية دودة)، والتي يتم تنظيمها كخط تجميع يحتوي على خلايا في مراحل مختلفة من التطور والتمايز. مع جيش التحرير الشعبي، يمكن تصور PPIs مباشرة في الغدد التناسلية دودة ثابتة، وهو أمر مفيد للتحقيق في ما إذا كان PPIs تحدث خلال مرحلة محددة من التنمية. يقدم جيش التحرير الشعبي دقة أكبر لمؤشرات أسعار التطبيقات مقارنة بالمقالات القائمة على التعريب المشترك ، وهو مثالي لإجراء قياسات دقيقة. إذا ما استخدمت، المجهري ة فائقة الدقة لديه القدرة على توفير تفاصيل أدق حول موقع بؤر جيش التحرير الشعبى الصينى داخل الخلية. ميزة أخرى هي أن بؤر الناتجة عن ردود فعل جيش التحرير الشعبي يمكن أن تحسب من قبل سير عمل تحليل ImageJ المستندة إلى، مما يجعل هذه التقنية الكمية.

تم وصف عائلة LC8 من سلاسل الضوء الدينين لأول مرة بأنها وحدة فرعية لمجمع محركات dynein16 وافترض أنها بمثابة محول بضائع. منذ اكتشافه الأولي، تم العثور على LC8 في مجمعات البروتين متعددة بالإضافة إلى مجمع محركات الدينين17،18،19،20. المسح الضوئي لتسلسل البروتين التي تحتوي على التفاعل LC8 عزر19 يشير إلى أن LC8 قد يكون لها العديد من التفاعلات مع مجموعة واسعة من البروتينات المختلفة17،18،,19،20،21،22. ونتيجة لذلك، تعتبر الآن البروتينات العائلية LC8 المحاور التي تساعد على تعزيز تجميع مجمعات البروتين اتّفا ً19،22، مثل تجميع البروتينات المفككة بشكل جوهري21.

واحد C. elegans LC8-الأسرة البروتين، dynein سلسلة الضوء-1 (DLC-1)، وأعرب على نطاق واسع عبر العديد من الأنسجة وليس المخصب في هياكل محددة تحت الخلوية23،,24. وبالتالي، فإن تحديد الصلة بيولوجيا ً في الحياة العضوية في الشركاء في DLC-1 في C. elegans يشكل تحدياً لعدد من الأسباب: 1) عدم هطول المناعة المشتركة يشير إلى مصدر الأنسجة حيث يحدث التفاعل؛ (2) لا يشير الهطول المناعي المشترك إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه التفاعل؛ (2) لا يشير الهطول المناعي المشترك إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه التفاعل؛ (2) لا يشير الهطول المناعي المشترك إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه التفاعل؛ (2) لا يشير إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه التفاعل؛ (2) لا يشير الهطول المناعي المشترك إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه التفاعل؛ (2) لا يشير الهطول المناعي المشترك إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه 2) التعبير المحدود عن شركاء معينين أو تفاعلات عابرة قد تعيق القدرة على الكشف عن التفاعل عن طريق الترسيب المناعي المشترك؛ و 3) توزيع منتشر من DLC-1 يؤدي إلى تداخل غير محدد مع البروتينات الشريك المحتملة عن طريق المناعة المشتركة. وبناء على هذه التحديات، جيش التحرير الشعبي هو نهج مثالي لاختبار في تفاعلات الجسم الحي مع DLC-1.

وقد أفيد سابقا أن DLC-1 يتفاعل مباشرة مع ويعمل كعامل مساعد للبروتينات الحمض النووي الريبي ملزمة23 (RBPs) FBF-23 وGLD-125. يدعم عملنا نموذج DLC-1 الذي يعمل كبروتين محوري ويشير إلى أن DLC-1 يسهل شبكة التفاعل التي تمتد إلى ما بعد dynein19،22. باستخدام تقسيم السحب GST, تم التعرف على RBP DLC-1 التفاعل الجديد اسمه OMA-126. OMA-1 مهم لنمو البويضات والنضج الميوطي27 ويعمل بالتزامن مع عدد من المكبوتات والمنشطات المترجمة28. في حين يتم التعبير عن FBF-2 و GLD-1 في الخلايا الجذعية ومناطق pachytene meiotic ، على التوالي ، يتم التعبير عن OMA-1 بشكل منتشر في الخط الجرثومي من pachytene meiotic من خلال البويضات27 (الشكل 1). وهذا يشير إلى أن DLC-1 تشكل مجمعات مع RBPs في مناطق مختلفة من الغدد التناسلية. كما تبين أن التفاعل المباشر بين DLC-1 و OMA-1 الذي لوحظ في المختبر لا يتم استرداده بواسطة IP في الجسم الحي. وقد استخدم جيش التحرير الشعبى الصينى بنجاح كنهج بديل لمزيد من دراسة هذا التفاعل في خط الجراثيم C. elegans، وتشير النتائج إلى أنه يمكن استخدام جيش التحرير الشعبي للتحقيق في العديد من PPIs الأخرى في الدودة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول سلالات C. elegans التي يتم فيها وضع علامات على كل من الشركاء التفاعل المحتملين. يوصى بشدة باستخدام سلالة تحكم سلبية ، حيث لا يتوقع أن يتفاعل بروتين واحد مع علامة مع شريك آخر للتفاعل المرشح الموسوم. هنا، تم استخدام GFP وحده كتحكم سلبي لتقييم الخلفية، حيث لا يتوقع أن يتفاعل DLC-1 مع GFP في الدودة. تم استخدام OMA-1 الموسوم ة بـ GFP كسلالة تجريبية ، حيث تشير البيانات الأولية إلى تفاعل مع DLC-1. ويشار إلى سلالات نيماتودا المشتركة في التعبير عن التحكم واختبار البروتينات مع 3xFLAG الموسومة DLC-1 في هذا النص باسم 3xFLAG::DLC-1; GFP و 3xFLAG: :DLC-1; OMA-1::GFP (السلالات المتاحة عند الطلب؛ مزيد من المعلومات في جدول المواد)،على التوالي. هنا، يتم استخدام علامات 3xFLAG و GFP; ومع ذلك، قد يتم استبدال علامات أخرى طالما أن أجسامها المضادة متوافقة مع كواشف مجموعة جيش التحرير الشعبي.

1- رعاية الحيوان

  1. الحفاظ على الديدان على المتوسطة نمو النيماتودا (NGM) لوحات التي يتم زرعها مع سلالة OP50 من الإشريكية القولونية والحفاظ على 24 درجة مئوية للتعبير الأمثل عن GFP.
  2. مرور الديدان البالغة كل 2-3 أيام لنشر الديدان والاحتفاظ بها تغذية جيدة.

2. إعداد الثقافة المتزامنة

  1. مزامنة الديدان عن طريق تبييض لوحة من تغذية جيدة، hermaphrodites gravid. ويرد وصف لبروتوكول التبييض في بورتا دي لا ريفا وآخرون29. السماح للأجنة يفقس بين عشية وضحاها في أنبوب الطرد المركزي في 24 درجة مئوية في حين تنتهي الدورية على نهاية في 10 مل من الوسائط الدنيا M9 (M9) العازلة. هذا سوف تنتج ثقافة اليرقات L1 القبض.
  2. احتضان أنبوب اليرقات المرحلة L1 القبض على الجليد لمدة 10 دقيقة، ثم أعلى قبالة الأنبوب مع الجليد الباردة 1x M9.
  3. استخدام جهاز طرد مركزي لبيليه اليرقات في 600 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجات مئوية. يستنشق بعناية supernatant بحيث فقط 1-2 مل من supernatant لا يزال.
  4. إعادة تعليق بيليه اليرقات واستخدام ميكروبيبيت لنقل 2 ميكرولتر من ثقافة اليرقات المعلقة إلى شريحة زجاجية. عد عدد اليرقات الموجودة لتحديد كثافة زراعة اليرقات ، والتي ستساعد في توجيه بذر الديدان في الخطوة 2.5.
    ملاحظة: كثافة 10-15 يرقات L1/1 μL تعمل بشكل جيد للبذر.
  5. استخدم ميكروبيبيت لنقل حجم زراعة اليرقات اللازمة لبذر يرقات مرحلة 100-120 L1 تقريبًا على لوحة OP50 مقاس 60 مم. على سبيل المثال، البذور 10 ميكرولتر من ثقافة اليرقات التي لديها كثافة 10 يرقات L1/1 μL من الثقافة.
    ملاحظة: لا تتجاوز حجم 40 ميكرولتر لبذر اليرقات، أو السائل الزائد سوف يعطل العشب OP50. إذا تجاوز حجم الثقافة 40 ميكرولتر ، كرر الخطوات 2.3-2.4 لزيادة تقليل الحجم وزيادة كثافة زراعة اليرقات.
  6. زراعة الديدان عند 24 درجة مئوية. سجل الوقت الذي يتم فيه بذر L1s على لوحة وتحقق بشكل دوري من مرحلة التطوير لتحديد الوقت المثالي للتشريح.
    ملاحظة: في 52 ساعة بعد البذر من L1s، الديدان المستزرعة في 24 درجة مئوية وعادة ما تكون في مرحلة الكبار الشباب، والتي هي المرحلة المثالية للتشريح لجيش التحرير الشعبي بلا فناد المستهدفة. ومع ذلك ، فإن الوقت الفعلي الذي تصل فيه الديدان المتزامنة إلى مرحلة الشباب البالغين قد تختلف بين السلالات ودرجة حرارة الحضانة.

3. تشريح / قذف الغدد التناسلية

ملاحظة: تشريح لقذف الغدد التناسلية ضروري لجيش التحرير الشعبي الغدد التناسلية المستهدفة للعمل بنجاح. ويمكن لهذا النهج أيضا إطلاق الأجنة، والتي تعمل أيضا باستخدام هذا البروتوكول لجيش التحرير الشعبي (انظر المناقشة لمزيد من المعلومات). بعد تشريح، يتم إصلاح كل من التحكم السلبي والعينات التجريبية وعلاجها لجيش التحرير الشعبى الصينى معا بالتوازي. ويقترح أيضا أن يتم إعداد مجموعة إضافية من العينات لغرض الفلورسنت المناعة المشتركة23 لإثبات أنماط التعبير من شركاء البروتين ذات الاهتمام.

  1. اختيار الديدان البالغة 30-40 الشباب في طبق زجاجي ووتش تحتوي على 500 ميكرولتر من 1x M9 + levamisole (2.5 mM التركيز النهائي). بعد جمع الديدان، وإزالة بعناية والتخلص من معظم وسائل الإعلام لإزالة البكتيريا التي يتم نقلها جنبا إلى جنب مع الديدان.
  2. إضافة في الطازجة 500 ميكرولتر من 1x M9 + levamisole واستخدام ماصة لرسم بلطف والاستغناء عن وسائل الإعلام لشطف الديدان. إزالة بعناية والتخلص من معظم وسائل الإعلام لمسح البكتيريا التي يتم نقلها جنبا إلى جنب مع الديدان.
    1. كرر هذه الخطوة 2x-3x حتى تتم إزالة جميع البكتيريا. بعد الانتهاء من النُهُز، اترك الديدان في حوالي 100 ميكرولتر من الوسائط للحفاظ على رطوبة.
      ملاحظة: لا تدع الديدان الجلوس في وسائل الإعلام لفترة أطول من 7 دقيقة، لأن هذا سوف يضعف قذف الغدد التناسلية أثناء تشريح. إجراء الغسل اتّجاه تشريح المجهر لمراقبة إزالة الوسائط حتى لا تضيع الديدان.
  3. باستخدام ماصة الزجاج أو البولي ايثيلين، نقل الديدان إلى شريحة مجهر 25 ملم × 75 ملم المغلفة مع 0.001٪ بولي-L-ليسين (الشرائح المستخدمة في هذا الإجراء لديها محيط المغلفة الايبوكسي، وترك ثلاث مساحات عمل، 14 ملم × 14 ملم لكل منهما). إزالة الوسائط الزائدة بحيث يبقى ما يقرب من 10-15 ميكرولتر من الوسائط.
  4. تحت مساعدة من المجهر تشريح واستخدام اثنين من 261/2 قياس الإبر، ووضع إبرة واحدة على الأخرى بحيث ينتهي شكل زوج من مقص. باستخدام الإبر الموجهة في هذا الشكل، وقطع الديدان وراء البلعوم للافراج عن germlines. تشريح جميع الديدان في غضون 5 دقائق.
    ملاحظة: يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول كيفية إجراء عمليات التشريح في منشور سابق من قبل جيرفايز وآرور30.
  5. بعد تشريح جميع الديدان، ضع بلطف قسيمة تغطية 22 مم × 40 مم فوق الشريحة بحيث تكون عموديًا على الشريحة. يجب أن تتدلى نهايات قسيمة الغطاء من الشريحة.
  6. تجميد الشرائح على كتلة الألومنيوم المبردة مسبقا الحفاظ على الجليد الجاف لمدة 20 دقيقة على الأقل. وضع بلطف قلم رصاص المبردة على رأس coverslip لمنع coverslip من أن تصبح فضفاضة بسبب التوسع الجليد.

4. التثبيت / حظر

  1. عندما تكون جاهزة للتثبيت، نفض الغبار قبالة coverslips مع قلم رصاص أو أداة أخرى حادة الحواف وتراجع على الفور الشريحة في جرة تحتوي على الميثانول الطازجة الباردة الجليد (مبردة إلى -20 درجة مئوية) لمدة 1 دقيقة.
  2. امسح حواف الشريحة التي تحيط بالعينة برفق بحيث يتم الاحتفاظ بالكاشف التالي بواسطة التوتر السطحي حول العينة. تطبيق 150 ميكرولتر من المثبت (2٪ الفورمالديهايد في 100 mM KH2PO4، درجة الحموضة = 7.2) لمدة 5 دقيقة في RT.
    ملاحظة: لقد اختبرنا أيضا ً إجراء تثبيت الميثانول/الأسيتون31،32 ووجدنا أنه متوافق مع رد فعل جيش التحرير الشعبي.
  3. المس الشريحة إلى منشفة ورقية بزاوية 90 درجة متعامدة للسماح للمثبت بالجري من الشريحة وامتصاصه في منشفة ورقية. كتلة الشرائح 2x لمدة 15 دقيقة في RT في جرة كوبلين مع 50 مل من 1x PBS/1% تريتون X-100/1% ألبوم مصل البقري (PBT/BSA).
    ملاحظة: ينصح بجرار كوبلين أو أنواع أخرى من جرار تلطيخ لهذه الخطوة المحظورة وخطوات الغسيل أدناه في الأقسام 6-9. هذه توفر كميات كافية لتبادل كفاءة من حظر أو غسل المخزن المؤقت مع العينة.
  4. كتلة الشرائح مع محلول PBT / BSA التي تحتوي على مصل الماعز العادي 10٪. امسح الحواف التي تحيط بالشريحة بلطف وطبق 100 ميكرولتر من المحلول على الشريحة. احتضان لمدة 1 ساعة في RT في غرفة رطبة.
    ملاحظة: ينصح بشدة هذه الخطوة للتلطيخ مع الأجسام المضادة الأساسية αFLAG. يتم بناء الغرفة الرطبة عن طريق تأمين الماصة الزجاجية مع الشريط في الدرج للشرائح لوضع على لأنها احتضان. يتم وضع مناديل المهام المبللة(جدول المواد)في الدرج لرفع الرطوبة الداخلية للصينية لمنع التبخر. يتم تغطية الغطاء والدرج في احباط لحماية العينات من الضوء خلال الخطوات الحساسة للضوء.
  5. ضع الشريحة على منشفة ورقية للسماح لـ PBT/BSA/10% NGS بالحل في إيقاف الشريحة ومسح حواف الشريحة بلطف. استخدم كاشف الحظر(جدول المواد)لمنع الشرائح. تطبيق قطرة واحدة على مساحة 14 ملم × 14 ملم. الشرائح المحتضنة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في غرفة رطبة.

5. الحضانة الأولية للأجسام المضادة

ملاحظة: للحصول على أفضل نتائج جيش التحرير الشعبي والحد الأدنى من الخلفية، قد يتطلب عامل التخفيف من الأجسام المضادة الأولية التحسين (انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل). بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تثار الأجسام المضادة الأولية في المضيفين المختلفة التي تتطابق مع خصوصية الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة لجيش التحرير الشعبي.

  1. ضع الشريحة على منشفة ورقية للسماح بإزاحة كاشف الحجب عن الشريحة ومسح الحواف بلطف. استخدام الأجسام المضادة المخفف(جدول المواد)لتخفيف الأجسام المضادة الأولية. تطبيق 40 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية لكل مساحة 14 مم × 14 مم.
  2. الانضلاق في غرفة رطبة بين عشية وضحاها في 4 °C.

6. جيش التحرير الشعبي التحقيق (الأجسام المضادة الثانوية) الحضانة

ملاحظة: بالنسبة للخطوات 6-9، استخدم مخازن الغسيل A و B في RT. إذا تم تخزين المخازن المؤقتة في 4 درجة مئوية، ثم السماح لهم الحارة إلى RT قبل استخدام.

  1. غسل الشرائح 2x لمدة 5 دقيقة مع 50 مل من 1x غسل المخزن المؤقت A(جدول المواد)في RT في جرة كوبلين. تعيين جرة كوبلين على شاكر المداري تعيين إلى 60 دورة في الدقيقة.
  2. ضع الشريحة على منشفة ورقية للسماح لغسل المخزن المؤقت تشغيل قبالة الشريحة ومسح حواف بلطف. إعداد محلول 40 ميكرولتر يحتوي على مسبارPLUS وناقص اليورانيوم (مخفف 1:5 مع الأجسام المضادة المخففة). تطبيق الحل على كل مساحة 14 ملم × 14 ملم.
  3. الانضلاق في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.

7- الربط

  1. غسل الشرائح 2x لمدة 5 دقيقة مع 50 مل من 1x غسل المخزن المؤقت A في RT في جرة كوبلين. تعيين جرة كوبلين على شاكر المداري تعيين إلى 60 دورة في الدقيقة.
  2. تمييع المخزن المؤقت الربط(جدول المواد)1:5 مع المياه فائقة النقاء. استخدم هذا المخزن المؤقت لتخفيف الرباط(جدول المواد)1:40 لإعداد مخزون عمل من حل الربط.
    1. ضع الشريحة على منشفة ورقية للسماح للعازل الغسيل بالخروج من الشريحة ومسح الحواف بلطف. تطبيق 40 ميكرولتر من محلول الربط على كل مساحة 14 مم × 14 مم.
  3. الانضلاق في غرفة رطبة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

8- التضخيم

ملاحظة: استخدام الكواشف الكشف مع الفلوروبورورس الأحمر(جدول المواد)يؤدي إلى أقل قدر من الخلفية في أنسجة Elegans C. elegans.

  1. غسل الشرائح 2x لمدة 5 دقيقة مع 50 مل من 1x غسل المخزن المؤقت A في RT في جرة كوبلين. تعيين جرة كوبلين على شاكر المداري تعيين إلى 60 دورة في الدقيقة.
  2. تمييع التضخيم الأحمر المخزن المؤقت(جدول المواد)1:5 مع المياه فائقة النقاء. استخدام هذا المخزن المؤقت لتخفيف البوليمرات(جدول المواد)1:80 لإعداد مخزون العمل من محلول التضخيم وحماية من الضوء.
    1. ضع الشريحة على منشفة ورقية للسماح للعازل الغسيل بالخروج من الشريحة ومسح الحواف بلطف. تطبيق 40 ميكرولتر من محلول التضخيم على كل مساحة 14 مم × 14 مم.
  3. الانضلاق في غرفة رطبة لمدة ساعة و40 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تأكد من أن الغرفة الرطبة مغطاة بالرقائق لحماية العينات من الضوء.

9. السهو النهائي

  1. غسل الشرائح 2x لمدة 10 دقيقة مع 50 مل من 1x غسل المخزن المؤقت B(جدول المواد)في RT في جرة كوبلين. تعيين جرة كوبلين على شاكر المداري تعيين إلى 60 دورة في الدقيقة.
  2. غسل الشرائح 1x لمدة 1 دقيقة مع 50 مل من 0.01x غسل المخزن المؤقت B في RT في جرة كوبلين. تعيين جرة كوبلين على شاكر المداري تعيين إلى 60 دورة في الدقيقة. يتم إعداد هذا المخزن المؤقت عن طريق تخفيف العازلة غسل B بالماء الترانقية.

10. Coverslip تصاعد

  1. اسمحوا الزائد غسل المخزن المؤقت تشغيل قبالة الشريحة على منشفة ورقية ومسح قبالة أي العازلة المتبقية المتبقية على محيط الايبوكسي المغلفة من الشريحة.
  2. إضافة 10 ميكرولتر من تصاعد المتوسطة(جدول المواد)لعينة ووضع بلطف غطاء على القمة، مما يسمح للوسط تصاعد لنشر.
  3. الطلاء حول حافة coverslip مع طلاء الأظافر لختم coverslip والشريحة. كن لطيفًا مع تطبيق طلاء الأظافر لتجنب تحريك قسيمة الغطاء ، والتي ستلحق الضرر بالجراثيم. دع طلاء الأظافر يصلب لمدة 20 دقيقة على الأقل في RT ، في حين أن الشرائح محمية من الضوء ، قبل مشاهدته تحت المجهر.
  4. تخزين الشرائح في حاوية داكنة أو حامل شريحة، كما عينات المسمى جيش التحرير الشعبي حساسة للضوء. تقترح الشركة المصنعة أنه يمكن تخزين الشرائح عند -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل أو عند 4 درجات مئوية للتخزين على المدى القصير. ستستمر الشرائح المعدة باستخدام هذا البروتوكول لمدة شهرين على الأقل عند تخزينها عند 20 درجة مئوية.

11- الحصول على الصور

  1. لغرض التحديد الكمي، استخدم مجهر ًا بؤريًا لالتقاط صور للجراثيم المقذوفة التي هي في عرض واضح، غير تالف، ودون عائق. التقط كومة z من الخط الجرثومي الذي يمتد عبر الخط الجرثومي بأكمله في المستوى z ويولد صورة إسقاط قصوى لاستخدامها للكمية.
    ملاحظة: المجهر المحوري مثالي للحصول على صور جيش التحرير الشعبي وقياسها بخلفية أقل مقارنة بتلك التي تم الحصول عليها باستخدام مجهر epifluorescent.
    1. إذا كان الخط الجرثومي لا يصلح في مجال واحد من الرؤية، والتقاط مجالات الرؤية المتداخلة حسب الضرورة لتصوير خط الجراثيم كله. ويمكن خياطة أقصى إسقاطات هذه الصور معا في فيجي.
  2. تأكد من الحفاظ على ظروف التصوير نفسها بين عينات التحكم والعينات التجريبية لتحديد عتبة عادلة ومناسبة لتحديد بؤر أثناء تحليل الصورة.
    ملاحظة: سجل ما لا يقل عن 8-10 خطوط الجراثيم من كل عينة لكل تكرار لتسهيل التحليل الإحصائي للكمية PLA. ويوصى بما لا يقل عن ثلاث نسخ بيولوجية من التحديثات لكي تحصل جيش التحرير الشعبي على نتائج كمية موثوقة ومتسقة.

12 - تحليل الصور وتقديرها كميا باستخدام فيجي/إيماج

ملاحظة: يستند سير العمل التالي إلى الصور التي تم الحصول عليها باستخدام هدف 40x على المجهر المحوري، حيث يتم حفظ الصور بتنسيق .czi. يمكن الوصول إلى هذه الصور .czi والبيانات الوصفية المصاحبة لها ، بما في ذلك الأبعاد ، وفتحها في فيجي / ImageJ لمزيد من التحليل. وينبغي التحقق مما إذا كانت فيجي تقبل تنسيق الملفات المحورية من مركز الاتصال المتاح للمستخدم المحدد. إذا لم يكن كذلك ، يمكن استخدام الصور بتنسيق .tiff بدلاً من ذلك للتحليل ، ولكن المستخدم سيحتاج إلى تعيين مقياس الصورة يدويًا في فيجي / ImageJ (تحليل | تعيين مقياس). من المستحسن أن يتم تحليل جميع صور التحكم السلبية معًا أولاً لتحديد مستوى الخلفية.

  1. ابدأ سير عمل التحليل من خلال تحليل جميع صور التحكم السلبية أولاً، ثم انتقل إلى العينات التجريبية. فتح صورة الإسقاط الأقصى في فيجي / ImageJ لتحليل(الشكل 2A). في حالة استخدام ملف .czi، سيتم مطالبة مربع خيارات استيراد التنسيقات الحيوية.
    1. تضمين الخيارات التالية لفتح صورتك: عرض مكدس مع متصفح البيانات; وضع اللون = ملون. يجب فتح نافذة مع الصورة الآن مع شريط شرائح للتبديل بين القنوات المختلفة التي تم التقاطها بواسطة confocal (على سبيل المثال، DAPI أو PLA).
    2. إذا كانت الصور بحاجة إلى خياطة، فقم بإنشاء تكرارات لكل قناة من كل صورة عن طريق تحديد الصورة بالماوس وتحديد مكررة لفتح النافذة المكررة. حدد رقم القناة (c) الذي يتوافق مع قناة PLA أو DAPI (على سبيل المثال، 2)واإلغاء تحديد المربع لـ Duplicate Hyperstack.
    3. مع كل من الصور لتكون مخيط مفتوحة، حدد الإضافات | خياطة | مهمل | خياطة 2D. سيتم فتح نافذة خياطة الصور 2D. حدد الصور التي سيتم استخدامها لخياطة واستخدام المعلمات الافتراضية التي تم إعدادها مسبقا في الإطار، ثم حدد موافق. ستكون الصورة الناتجة صورة تدرج رمادي مجمعة.
      ملاحظة: إذا كانت الصور الفرعية لا محاذاة تماماً، ضبط المعلمات (أي زيادة عدد القمم التي سيتم فحصها من 5 إلى 500 أو تغيير طريقة الانصهار من المزج الخطي إلى الحد الأقصى. كثافة) قد تساعد على الحصول على الصورة المطلوبة. في حين تتوفر أدوات خياطة أخرى ، يحتفظ هذا النهج بأبعاد الصورة ، وهو أمر مهم للقياس الكمي.
  2. افتح مدير عائد الاستثمار (منطقة الاهتمام) عن طريق الضغط على T على لوحة المفاتيح. سيتم فتح نافذة جديدة تسمى مدير عائد الاستثمار.
  3. حدد أداة المضلع من مربع مجموعة أدوات فيجي. إسقاط النقاط حول خط الجراثيم لالخطوط العريضة وتوليد عائد الاستثمار(الشكل 2B). قم بتوصيل النقطة الأخيرة بالنقطة الأولى لإنشاء عائد استثمار كامل.
    ملاحظة: بالنسبة للصور الداكنة، من المفيد ضبط التباين لتحسين رؤية الخط الجرثومي (الذي يمكن عكسه) بحيث يمكن تحديده بدقة أكبر.
    1. مباشرة بعد الانتهاء من عائد الاستثمار، انتقل إلى مدير عائد الاستثمار وحدد إضافة [t] لتخزين عائد الاستثمار. من الضروري أن يتم تحديث أي تغييرات على عائد الاستثمار بما في ذلك إضافة / إزالة النقاط أو حركة عائد الاستثمار والنقاط (حدد تحديث من مدير عائد الاستثمار) قبل الانتقال إلى الخطوة التالية ، أو سيتم فقدانها. ويمكن الاطلاع على مزيد من التفاصيل بشأن التلاعب بـ ROIs ونقاطها في دليل مستخدمي فيجي/ImageJ.
  4. بمجرد تعيين اتجاه عائد الاستثمار، يمكن حفظه للرجوع إليه لاحقًا عن طريق تحديد اسم عائد الاستثمار في مدير عائد الاستثمار متبوعاً بالمزيد | حفظ | (ملف الاسم وتحديد الوجهة لمكان الحفظ). يمكن فتح ROIs المحفوظة في مدير عائد الاستثمار عن طريق تحديد المزيد | مفتوح | (حدد الملف).
  5. قم بقياس المنطقة داخل عائد الاستثمار عن طريق تحديد اسم عائد الاستثمار من مدير عائد الاستثمار، ثم تحديد زر القياس على مدير عائد الاستثمار. سيتم فتح نافذة النتائج بمعلومات حول عائد الاستثمار، بما في ذلك المنطقة التي تغطيها في الصورة (μM2)(مجموعة الشكل 2B). سجل هذه المعلومات في جدول بيانات للحسابات اللاحقة.
    ملاحظة: تأكد من تعيين مقياس الصورة بشكل صحيح بحيث يتم تجميع الأبعاد الصحيحة لعائد الاستثمار. يمكن تعديل أنواع القياسات التي تم الإبلاغ عنها في مربع النتائج عن طريق الانتقال إلى التحليل | تعيين القياسات...
  6. افتح صورة مكررة لقناة PLA فقط عن طريق الاختيار الأيمن لصورة PLA واختيار مكررة (الشكل 2C). سيتم فتح إطار مكرر. حدد رقم القناة (c) الذي يتوافق مع قناة PLA (على سبيل المثال، 2) واإلغاء تحديد المربع لـ Duplicate Hyperstack. يوصى بازدواجية هذه الصورة بحيث لا يتم تعديل الصورة الأصلية.
    ملاحظة: ستظهر هذه الخيارات فقط عند عرض الصور التي تحتوي على قنوات متعددة على فيجي/ImageJ. نهج بديل هو تقسيم القنوات صورة | اللون | تقسيم القنوات، ولكن هذا سوف يعدل ملف الصورة الأصلي.
  7. مع اختيار صورة قناة جيش التحرير الشعبي فقط ، انتقل إلى الصورة | ضبط | العتبة. سيتم فتح نافذة عتبة للصورة. حدد الافتراضي كأسلوب عتبة، أحمر كلون، وتحقق من مربع الخلفية الداكنة. باستخدام المسار العلوي على النافذة ، حرك الشريط نحو اليمين حتى يتم تمييز جميع بؤر PLA بوضوح في الصورة.
    1. سجل القيمة في المربع إلى يمين المسار العلوي ودوّن القيمة المستخدمة لتعيين العتبة. حدد تطبيق في إطار العتبة لإنهاء العتبة، وسيتم تحويل الصورة إلى خلفية بيضاء مع بؤر العتبة فقط مرئية كنقاط سوداء(الشكل 2D). اختبار عتبة على العديد من صور التحكم السلبية للتأكد من أنه من المناسب لالتقاط جميع بؤر جيش التحرير الشعبي من صورة إلى صورة قبل الكمية.
      ملاحظة: لعرض بؤر العتبة كنقاط سوداء على خلفية بيضاء، انتقل إلى عملية | ثنائي | خيارات... وإلغاء تحديد مربع الخلفية الأسود. قيمة عتبة بين 30-40 هو نقطة انطلاق جيدة لتحديد جيش التحرير الشعبى الصينى في خط الجراثيم; ومع ذلك، قد تختلف القيمة المثالية اعتماداً على الخلفية.
  8. لتحديد بؤر PLA، قم بتطبيق عائد الاستثمار المتولد من الخطوات 12.3-12.3.1 على صورة العتبة عن طريق تحديد اسم عائد الاستثمار من نافذة مدير عائد الاستثمار. يجب أن يظهر مخطط عائد الاستثمار على الصورة في نفس الموقع كما كان من الصورة المصدر(الشكل 2E).
    1. انتقل إلى تحليل | تحليل الجسيمات. سيتم فتح نافذة تحليل الجسيمات وتحديد المعلمات التالية: الحجم (ميكرون^2) = 0-اللانهاية،التعميم = 0.00-1.00،إظهار = لا شيء. حدد مربع التلخيص.
    2. حدد موافق، وسوف تظهر جدول ملخص مع معلومات حول العائد على الاستثمار (أي العدد الإجمالي لبؤر جيش التحرير الشعبي ، والمساحة الإجمالية التي يشغلها بؤر جيش التحرير الشعبي داخل في عائد الاستثمار ، ومتوسط حجم بؤر جيش التحرير الشعبي ، والنسبة المئوية للمساحة التي يشغلها جيش التحرير الشعبي بؤر بالنسبة لحجم العائد على الاستثمار) (مجموعة من الشكل 2E). سجل هذه القياسات في جدول بيانات.
  9. كرر الخطوات 12.1-12.8 للعديد من صور التحكم السلبية باستخدام نفس العتبة.
    1. بمجرد تحليل جميع صور التحكم السلبية ، كرر الخطوات 12.1-12.8 لجميع العينات التجريبية باستخدام نفس العتبة التي تم تحديدها من قبل التحكم السلبي لتحديد وقياس بؤر PLA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

المناعة المشتركة لكل من 3xFLAG::DLC-1; GFP و 3xFLAG: :DLC-1; كشفت OMA-1::GFP germlines مع الأجسام المضادة العلم وGFP أنماط التعبير في خط الجراثيم(الشكل 3Aii-iii, 3Bii-iii). في حين تم التعبير عن GFP في جميع أنحاء خط الجراثيم(الشكل 3Aiii)، تم تقييد التعبير OMA-1::GFP إلى أواخر pachytene والبويضات(الشكل 3Biii)27. FLAG immunostaining يظهر أن 3xFLAG::DLC-1 تم التعبير عنها في جميع أنحاء الخط الجرثومي في كل من السلالات(الشكل 3Aii، 3Bii). من خلال المناعة المشتركة، التداخل بين 3xFLAG::DLC-1 و OMA-1::GFP لا يمكن تمييزه عن التداخل بين 3xFLAG::DLC-1 و GFP (التحكم السلبي).

منذ هذه التجارب اختبار التفاعلات بين DLC-1 و OMA-1، وشملت المنطقة ذات الاهتمام بالتقدير الكمي PLA في خط الجراثيم pachytene في وقت متأخر من خلال البويضات في جميع الخلايا الجرثومية فحص(الشكل 2B)،لأن هذه هي منطقة التعبير OMA-1(الشكل 1، الشكل 3Biii). 3xFLAG::DLC-1; يبدو أن خطوط أم -1::GFP الجرثومية تحتوي على كمية أكبر من بؤر جيش التحرير الشعبي داخل هذه المنطقة مقارنة بـ 3xFLAG::DLC-1. GFP germlines(الشكل 3Ciii-iv, 3Diii-iv). وكشف القياس الكمي لجيش التحرير الشعبي أن عدد بؤر جيش التحرير الشعبي الموجود في 3xFLAG::DLC-1؛ كانت خطوط الجراثيم OMA-1::GFP أكبر بكثير من 3xFLAG::DLC-1; GFP(الشكل 3Ciii-iv, 3Diii-iv; الجدول 1). وعلاوة على ذلك، حتى مع 10أضعاف تخفيف أعلى من GFP والأجسام المضادة العلم، كان الفرق بين السيطرة ومختبر جيش التحرير الشعبى الصينى لا يزال مختلفا بشكل ملحوظ. ومع ذلك، تم تخفيض الكثافة الإجمالية ومتوسط حجم البؤر(الجدول 1).

Figure 1
الشكل 1: التخطيطي لخط ج. إليغانس الجرثومي. تحتوي منطقة البقشيش المنفّت على تجمع الخلايا الجذعية، الذي يتبعه الـ pachytene meiotic، حيث تحولت الخلايا من الانقسام إلى الميوس. الخلايا التي تخرج من pachytene meiotic تتطور إلى البويضات، مع البويضات الأكثر نضجا في نهاية قريبة. المنطقة المعلّمة باللون الأخضر، والتي تمتد من البسيتين الميّاتيكي المتأخر من خلال جميع البويضات، تمثل نمط التعبير OMA-1. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: صور تمثيلية لسير العمل للقياس الكمي لـ PLAالخط الجرثومي. الخط الجرثومي المستخدم في هذا الرقم هو ممثل 3xFLAG::DLC-1; GFP خط جرثومي من الشكل 3C. (أ)صورة من دمج قنوات جيش التحرير الشعبي وDAPI افتتح في فيجي / ImageJ. (ب)تستخدم أداة المضلع في فيجي لتحديد وتحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) في الخط الجرثومي (الخط الأصفر مع مربعات بيضاء) التي يتم قياسها كميا، ويتم قياس مساحة العائد على الاستثمار (μM2)(مجموعة من B). (ج)يتم الحصول على صورة واحدة لقناة جيش التحرير الشعبي عن طريق تكرار أو تقسيم الصورة الأصلية في (A، B). (د)يتم تعيين عتبة بعناية لتسليط الضوء بشكل واضح على جميع بؤر جيش التحرير الشعبي في صورة جيش التحرير الشعبي. يجب تطبيق نفس العتبة على جميع الصور التجريبية والخاصة بالتحكم التي سيتم تحليلها معًا. (E)مع تحديد عائد الاستثمار في صورة العتبة، ستقوم وظيفة تحليل الجسيمات بإرجاع جدول النتائج الذي يتضمن العدد الإجمالي للبؤر المدرجة داخل عائد الاستثمار (inset من E). الصور هي لقطات من فيجي / صورة J: الإضافات | المرافق العامة | التقاط الصورة. أشرطة مقياس = 10 μM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: صور تمثيلية للجراثيم بعد المناعة المشتركة أو جيش التحرير الشعبي. (أ، ب) أنماط التعبير من البروتينات الموسومة في 3xFLAG::DLC-1; GFP (Ai-iv) و 3xFLAG::DLC-1; تم تقييم OMA-1::GFP (Bi-iv) في الغدد التناسلية المنقّحة والثابتة والمناعة. تم استخدام الأجسام المضادة للراية في تخفيف 1:1000 ، في حين تم استخدام الأجسام المضادة لGFP في تخفيف 1:200 ، وهو الأمثل لصور الفلورالية المناعية. تم تلطيخ الحمض النووي من قبل DAPI ، وتظهر القناة الفردية في تدرج رمادي للحصول على تباين أفضل(Aiv ، Biv). في كل صورة ، يتم تحديد الخلايا الجذعية وpachytene meiotic مع خطوط متقطعة ، في حين يتم تحديد البويضات مع خطوط منقط. تم الحصول على الصور بمجهر الفلورسنت. أشرطة مقياس = 10 ميكرومتر .(C، D)جيش التحرير الشعبي في مقذوف 3xFLAG::DLC-1؛ GFP (C) و 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP (D) الغدد التناسلية. تم استخدام الأجسام المضادة للراية في تخفيف 1:1000 ، في حين تم استخدام الأجسام المضادة لGFP في تخفيف 1:4000. تم تلطيخ الحمض النووي من قبل DAPI ، ويظهر كل من DAPI الفردية(Cii ، Dii)وقنوات جيش التحرير الشعبي(Ciii ، iv ، Diii ، iv)في تدرج رمادي للحصول على تباين أفضل. الأخضر، مربع متقطعة(Ciii، Diii)يدل على موقع الصور جيش التحرير الشعبي التكبير في(Civ، Div). في كل صورة ، يتم تحديد الخلايا الجذعية وpachytene meiotic مع خطوط متقطعة ، في حين يتم تحديد البويضات مع خطوط منقط. تم الحصول على الصور بمجهر بؤري. تم تجميع أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر (A، B، C، D) مع برامج معالجة الصور (انظر جدول المواد). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تخفيف الأجسام المضادة اختبار الإجهاد متوسط كثافة جيش التحرير الشعبي (بؤري/ميكرومتر2)×10-2 اختبار T متوسط حجم بؤري جيش التحرير الشعبي (μM2) اختبار T
αFLAG (1:1000)، αGFP (1:4000) 3xFLAG::DLC-1; GFP 3.9 ± 1.4 P = 1.917E-05 0.52 ± 0.127 P = 0.057
3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP 9.1 ± 2.7 1.8 ± 2.08
αFLAG (1:10,000)، αGFP (1:40,000) 3xFLAG::DLC-1; GFP 3.2 ± 2.4 P = 3.395E-04 0.51 ± 0.1 P = 0.019
3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP 7.7 ± 3 0.7 ± 0.24

الجدول 1: موجز لنتائج جيش التحرير الشعبي. الجدول الإبلاغ عن ملخص للككم PLA في تخفيفا اثنين من الأجسام المضادة الأولية. لم تكن الاختلافات في متوسط كثافة جيش التحرير الشعبي أو متوسط حجم بؤر PLA لـ OMA-1::GFP بين كل من التهيئة المضادة كبيرة (P-value غير مبين). وطبقت المقارنة نفسها أيضا على إطار العمل العالمي، مما لم يسفر أيضا عن أي فرق كبير (لم تظهر القيمة ف). تم تحديد القيم p باستخدام اختبار تبايناثنين/متساوي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

عند دراسة PPIs في خط الجراثيم C. elegans ، فإن الدقة الأعلى التي يقدمها جيش التحرير الشعبي مقارنة بالاستمناة المشتركة تسمح بالتصور والتقدير الكمي للمواقع التي تحدث فيها التفاعلات في الخط الجرثومي. وأفيد سابقا أن DLC-1 يتفاعل مباشرة مع OMA-1 باستخدام في المختبر ضريبة السلع والخدمات السحب من القول26; ومع ذلك، لم يتم استرداد هذا التفاعل من قبل في السحب الحي. الفلورسنت المناعة المشتركة من 3xFLAG::DLC-1; تظهر خطوط الجراثيم OMA-1::GFP تداخلًا في أنماط التعبير لـ DLC-1 و OMA-1؛ ومع ذلك، لا يوجد أي مؤشر على مكان تفاعلاتها تحدث في خط الجراثيم، والتداخل نفسه ليس أكبر من ذلك بين 3xFLAG::DLC-1 وGFP التي لا تنصهر إلى أي بروتين (التحكم السلبي). باستخدام جيش التحرير الشعبي في الموقع، وجد أن DLC-1 لا تتفاعل مع OMA-1 في خط الجراثيم، مما يشير إلى أن جيش التحرير الشعبي قد يكون أكثر حساسية للكشف عن PPIs مقارنة مع النهج الأخرى. ومن خلال هذا النهج، نواصل التوسع في الدور الناشئ لـ DLC-1 كعامل مساعد في الممارسات التجارية التقييدية. هذا العمل يدل على قدرة جيش التحرير الشعبي للكشف عن PPIs في خط الجراثيم ويؤسس مرجعا للمستخدمين في المستقبل استكشاف التفاعلات بين البروتينات من مصلحتهم الخاصة.

يوفر جيش التحرير الشعبي للمستخدمين القدرة على اختبار مؤشرات أسعار الصفحات بحساسية مماثلة دون العيوب المرتبطة بتقنيات أخرى مثل FRET و BiFC. قد لا تكون مستويات التعبير البروتيني ذات الصلة بيولوجياً مثالية لـ FRET و BiFC. كما أن وظيفة شركاء التفاعل المحتملين قد تتأثر بالعلامات الكبيرة المستخدمة في كلا النهجين. وعلاوة على ذلك، تتطلب مقالات FRET إعداد ًا متخصصًا للنسخ المجهري قد لا يكون متاحًا بسهولة. وقد يكون جيش التحرير الشعبي أيضاً نهجاً فعالاً من حيث التكلفة لدراسة مؤشرات أسعار المؤشرات مقارنة بالتقنيات الأخرى. يحتاج المستخدمون فقط إلى الحصول على كواشف PLA والوصول إلى المجهر البؤري للتصوير بالإضافة إلى الكواشف اللازمة للمناعة. يتم إجراء تحليل الصور باستخدام برنامج المصدر المفتوح فيجي /ImageJ، وهو متاح لأي مستخدم دون أي تكلفة. قد يجد المستخدمون الذين ليس لديهم خبرة مع FRET أو BiFC أن PLA بديلمناسب. يحتوي البروتوكول المعروض هنا فقط على عدة خطوات إضافية تتجاوز إجراء المناعة النموذجي ، مما يجعل هذه التقنية متاحة تقريبًا لأي مستخدم لديه خبرة في المناعة.

قذف الغدد التناسلية عن طريق تشريح مهم لجيش التحرير الشعبي للعمل بنجاح. لا يتم تسمية الأنسجة التي يتم الاحتفاظ بها داخل بشرة الدودة من قبل جيش التحرير الشعبي باستخدام هذا البروتوكول. وقد وجد كذلك أن الأجنة المقذوفة يتم تصنيفها بشكل فعال من قبل بروتوكول جيش التحرير الشعبى الصينى هذا. وهذا يشير إلى أن الأنسجة الأخرى التي يتم تحريرها أثناء التشريح، مثل القناة الهضمية، من المرجح أيضا أن تكون متوافقة مع جيش التحرير الشعبي. وقد وجد أن جيش التحرير الشعبي تنتج إشارات قوية على الغدد التناسلية وكذلك عينات الأجنة أعدت مع اثنين من بروتوكولات التثبيت التي غالبا ما تستخدم لمناعة. وهذا يشير إلى أن إجراءات التثبيت الإضافية المستخدمة في الحقل قد تكون متوافقة مع جيش التحرير الشعبي ولكن يجب تقييمها بشكل فردي من قبل المستخدم.

تحديد التخفيف الأمثل للأجسام المضادة الأولية أمر بالغ الأهمية لنجاح جيش التحرير الشعبي. فمن الأفضل أن تبدأ مع التخفيف الذي تم تحسينه لimmunofluorescence. ويتحقق ذلك عادة عن طريق تهيئة الجسم المضاد الأساسي في تجربة الفلور المناعة للعثور على التخفيف الأمثل حيث توجد خلفية منخفضة وإشارة عالية ومحددة. بمجرد تحديد التخفيف الأمثل للفلور المناعي ، يمكن اختبار هذه التخفيفات نفسها في فحص جيش التحرير الشعبي الذي يقارن الإشارة التي ينتجها زوج من الممثلين المحتملين بالإشارة التي ينتجها زوج تحكم من البروتينات غير المتفاعلة.

في الحالة التي لوحظت إشارة وفيرة في عينة التحكم، مطلوب مزيد من التخفيف من الأجسام المضادة الأولية. وقد وجد أن تخفيف الأجسام المضادة الأولية المثلى لجيش التحرير الشعبي هي على الأقل نفس أو حتى أكثر تمييع ًا مما يستخدم للفلورالنسي. على سبيل المثال، تمثل صور الفلور المناعي في الشكل 3A، B تخفيف 1:1000 من مضادات العلم وتخفيف 1:200 من مضادات GFP. ومع ذلك ، فإن تخفيف الأجسام المضادة في صور جيش التحرير الشعبي في الشكل 3C، D كانت 1:1000 من مكافحة العلم و 1:4000 من مكافحة GFP. تخفيف الأجسام المضادة لGFP المستخدمة في جيش التحرير الشعبي أكبر مما كان يستخدم لالفلورات المناعية، مما يشير إلى أن جيش التحرير الشعبي هو أكثر حساسية بكثير. ووجد أن تخفيف الأجسام المضادة 10 أضعاف أخرى أدى إلى انخفاض كثافة جيش التحرير الشعبي وكذلك حجم DLC-1/OMA-1 بؤر(الجدول 1). وعلى الرغم من هذا الانخفاض، فإن الفرق في كثافة جيش التحرير الشعبي بين عنصر التحكم السلبي وDLC-1/OMA-1 لا يزال مختلفاً اختلافاً كبيراً. وهذا يشير إلى أن جيش التحرير الشعبي لا يزال حساسا جدا مع تخفيف أعلى من الأجسام المضادة الأولية; ومع ذلك، سيتم التقليل من انتشار التفاعلات التي يمكن الكشف عنها.

وعلى النقيض من ذلك، قد يكون منخفض جدا من تخفيف الأجسام المضادة نوعين من العواقب الضارة. أولاً، قد ينتج إشارة خلفية كبيرة في عنصر التحكم السلبي. ثانياً، قد تندمج بؤر جيش التحرير الشعبي التي تنتجها بروتينات الشريك ة المتفاعلة وتتداخل، مما يجعل من الصعب حلها في صورة إسقاط قصوى. وهذا يؤدي إلى التقليل من شأن عدد بؤر جيش التحرير الشعبي والكثافة أثناء تحليل الصورة. إشارة جيش التحرير الشعبي هو توازن بين الكشف عن القرب زائفة بين الشركاء غير التفاعل والكشف عن كل مثيل من PPIs الحقيقي التي تحدث في العينة. ونتيجة لذلك ، فإن دمج عنصر تحكم سلبي حيث لا يتفاعل بروتينان أمر ضروري لتحديد مستوى الخلفية في تجارب PLA. وقد استخدم إغفال الأجسام المضادة الأولية في تجربة جيش التحرير الشعبي كتحكم سلبي في تقارير أخرى9,10; ومع ذلك، لا يمكن أن تأخذ هذه الطريقة في الاعتبار التفاعلات غير المحددة أو ربط الأجسام المضادة غير محددة التي قد تؤثر على النتيجة في جيش التحرير الشعبى الصينى التجريبي. وقد استُخدم هذا البرنامج كرقابة سلبية، حيث لم يكن من المتوقع حدوث تفاعل مباشر بين DLC-1 وGFP. ووجد أن عنصر التحكم السلبي لديه بعض الإشارات الخلفية. وهذا يدعم كذلك أهمية السيطرة السلبية لمقياس جيش التحرير الشعبي عند تقييم البيانات التجريبية.

بمجرد إنشاء تخفيفات تحسين PLA ، يمكن استخدام هذه التخفيفات لاختبار مجموعة من سلالات الديدان المختلفة التي تحتوي على أزواج مختلفة من شركاء التفاعل الموسومة بنفس علامات التقارب. من المهم استخدام نفس زوج الأجسام المضادة الأولية لضمان مقارنة عادلة لإشارات جيش التحرير الشعبي الناتجة ، حيث أن الاختلاف في تقارب الأجسام المضادة يمكن أن يؤثر على نتيجة تجربة PLA. تقرير آخر عن جيش التحرير الشعبي يقترح تحسين تخفيف الأجسام المضادة الثانوية جيش التحرير الشعبي10; ومع ذلك، لا ينصح هذا. قد يقلل تخفيف أعلى من الأجسام المضادة الثانوية فعالية الخطوات الأخرى جيش التحرير الشعبي المصب التي تعتمد على الاعتراف PLUS وناقص السبير التي يتم اقترانها إلى الأجسام المضادة الثانوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يوجد تضارب في المصالح بين أصحاب البلاغ.

Acknowledgments

تم توفير بعض سلالات النيماتودا المستخدمة في هذه الدراسة من قبل مركز علم الوراثة Caenorhabditis الممولمن المعاهد القومية للصحة (P40OD010440). تم إجراء الفحص المجهري Confocal في مختبر الأبحاث الأساسية في جامعة مونتانا الذي تم تشغيله بدعم من جوائز NIH P20GM103546 و S10OD021806. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل منحة المعاهد القومية للصحة GM109053 إلى E.V. ، زمالة جمعية القلب الأمريكية 18PRE34070028 إلى X.W.، وجائزة أكاديمية مونتانا للعلوم إلى X.W. ولم يشارك الممولون في تصميم الدراسة أو كتابة التقرير. ونشكر م. إلينبيكر على المناقشة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% paraformaldehyde solution Electron Microscopy services 15710 used to make 4% working solution
1M KH2PO4 Sigma P0662 Prepare a 1M working stock
1x M9 various various prepared as 10x stock used at 1x; see wormbook.org for protocol
1x PBS various various see wormbook.org for protocol
26.5 Gauge Needle Exel International 26402 Needles used for dissection
BSA Lampire 7500802
Centrifuge Tubes Thermo Scientific 05-529C 50ml Oak ridge centrifuge tube used for synchronization
Confocal Microscope Zeiss 880
Coplin Jar PolyLab 62101
Coverslip to Freeze Sample Globe Scientific 1411-10 22x40mm, No. 1
Coverslip to Seal Slide Globe Scientific 1404-15 22x22mm, No. 1.5
DAPI Mounting Medium for Immunofluorescence Vector H-1200
Ligase Sigma-Aldrich DUO82029 Duolink 1x Ligase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Amplification red buffer Sigma-Aldrich DUO82011 Duolink 5x Amplification Red buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Ligation Buffer Sigma-Aldrich DUO82009 Duolink 5x Ligation buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Antibody Diluent Sigma-Aldrich DUO82008 Duolink antibody diluent,Comes with DUO92004 and DUO92002, Note: A 1x PBS/1% BSA solution can also be used as a substitute to dilute the antibody.
Blocking Solution Sigma-Aldrich DUO82007 Duolink blocking solution, Comes with DUO92004 and DUO92002
Mounting Medium for PLA Sigma-Aldrich DUO82040 Duolink In Situ mounting medium with DAPI
MINUS Probe Sigma-Aldrich DUO92004 Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS
PLUS Probe Sigma-Aldrich DUO92002 Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS
Wash Buffer A Sigma-Aldrich DUO82046 Duolink In Situ wash Buffer A
Wash Buffer B Sigma-Aldrich DUO82048 Duolink In Situ wash Buffer B
Polymerase Sigma-Aldrich DUO82030 Duolink Polymerase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Epifluorescent Microscope Leica DFC300G camera, DM5500B microscope
Goat anti-mouse Alexa 594 JacksonImmuno 115-585-146 Use at 1:500
Goat anti-rabbit Alexa 488 JacksonImmuno 111-545-144 Use at 1:200
Image Processing Software Adobe Adobe Photoshop + Illsutrator CS3
Glass Pipette Corning 7095B-5X
Levamisole ACROS Organics 187870100 Prepare a 250mM working stock
Methanol Fisher Scientific A454
Mouse anti-FLAG Sigma F1804 Use at 1:1000 for immunofluorescence and PLA, pre-block with normal goat serum recommended
Nailpolish L.A. colors CNP195
Nematode Growth Medium (NGM) various See wormbook.org for protocol
Normal Goat Serum JacksonImmuno 005-000-121
Polyethylene Pasteur Pipette Globe Scientific 135030
Poly-L-Lysine Sigma-Aldrich P1524 Prepared as 0.1% stock solution in water, stored at -20C, and diluted 1:100 in water to coat slides
Petri Dishes Tritech PD7060 60 mm diameter
Rabbit anti-GFP Thermo Fisher G10362 Use at 1:200 for immunofluorescence, 1:4000 for PLA
Slides Thermo Fisher 30-2066A-Brown Three-square 14x14mm autoclavable slides with bars are custom-ordered through Fisher Scientific. Poly-L-Lysine added to slides in the lab
Sodium Hypochlorite solution Fisher Scientific SS290-1
task wipes Kimtech 34120 4.4x8.4 inch task wipes
Trays (242x241x20mm) Thermo Fisher 240845 Used to make humid chamber
Triton X-100 ACROS Organics 327372500
Ultrapure water Milli-Q Ultrapure water obtained from Milli-Q Integral Water Purification System
Watchglass Carolina Biological 742300
-20 °C freezer
-80 °C freezer
Aluminum Foil
OP50 strain E. coli
Orbital Shaker
Tape
Nematode strains used in this study (both available upon request)
mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475] UMT 376 dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Reference 24
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III UMT 422 dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Reference: this study

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Nooren, I. M., Thornton, J. M. Diversity of protein-protein interactions. EMBO Journal. 22 (14), 3486-3492 (2003).
  3. Patil, A., Kinosselecta, K., Nakamura, H. Hub promiscuity in protein-protein interaction networks. International Journal of Molecular Science. 11 (4), 1930-1943 (2010).
  4. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), e1000807 (2010).
  5. Pazdernik, N., Schedl, T. Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 1-16 (2013).
  6. Nousch, M., Eckmann, C. R. Translational control in the Caenorhabditis elegans germ line. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 205-247 (2013).
  7. Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).
  8. Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).
  9. Thymiakou, E., Episkopou, V. Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
  10. Wang, S., et al. Detection of in situ protein-protein complexes at the Drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay. Journal of Visualized Experiments. (95), 52139 (2015).
  11. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  12. Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. Biotechniques. 53 (5), 285-298 (2012).
  13. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Science. 32 (9), 407-414 (2007).
  14. Hiatt, S. M., Shyu, Y. J., Duren, H. M., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Methods. 45 (3), 185-191 (2008).
  15. Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
  16. Wilson, M. J., Salata, M. W., Susalka, S. J., Pfister, K. K. Light chains of mammalian cytoplasmic dynein: identification and characterization of a family of LC8 light chains. Cell Motility and Cytoskeleton. 49 (4), 229-240 (2001).
  17. Erdős, G., et al. Novel linear motif filtering protocol reveals the role of the LC8 dynein light chain in the Hippo pathway. PLoS Computational Biology. 13 (12), e1005885 (2017).
  18. Navarro-Lérida, I., et al. Proteomic identification of brain proteins that interact with dynein light chain LC8. Proteomics. 4 (2), 339-346 (2004).
  19. Rapali, P., et al. DYNLL/LC8: a light chain subunit of the dynein motor complex and beyond. FEBS Journal. 278 (17), 2980-2996 (2011).
  20. Rapali, P., et al. Directed evolution reveals the binding motif preference of the LC8/DYNLL hub protein and predicts large numbers of novel binders in the human proteome. PLoS One. 6 (4), e18818 (2011).
  21. Clark, S. A., Jespersen, N., Woodward, C., Barbar, E. Multivalent IDP assemblies: Unique properties of LC8-associated, IDP duplex scaffolds. FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2543-2551 (2015).
  22. Jespersen, N., et al. Systematic identification of recognition motifs for the hub protein LC8. Life Science Alliance. 2 (4), (2019).
  23. Wang, X., et al. Dynein light chain DLC-1 promotes localization and function of the PUF protein FBF-2 in germline progenitor cells. Development. 143 (24), 4643-4653 (2016).
  24. Dorsett, M., Schedl, T. A role for dynein in the inhibition of germ cell proliferative fate. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 6128-6139 (2009).
  25. Ellenbecker, M., et al. Dynein Light Chain DLC-1 Facilitates the Function of the Germline Cell Fate Regulator GLD-1 in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (2), 665-681 (2019).
  26. Day, N. J., Ellenbecker, M., Voronina, E. Caenorhabditis elegans DLC-1 associates with ribonucleoprotein complexes to promote mRNA regulation. FEBS Letters. 592 (22), 3683-3695 (2018).
  27. Detwiler, M. R., Reuben, M., Li, X., Rogers, E., Lin, R. Two zinc finger proteins, OMA-1 and OMA-2, are redundantly required for oocyte maturation in C. elegans. Developmental Cell. 1 (2), 187-199 (2001).
  28. Spike, C. A., et al. Translational control of the oogenic program by components of OMA ribonucleoprotein particles in Caenorhabditis elegans. Genetics. 198 (4), 1513-1533 (2014).
  29. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).
  30. Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  31. Duerr, J. S. Antibody staining in C. elegans using "freeze-cracking". Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
  32. Crittenden, S., Kimble, J. Preparation and immunolabeling of Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2009).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 159، الخط الجرثومي، بروتين الحمض النووي الريبي الملزم، LC8، جيش التحرير الشعبي، C. elegans، تقدير ربط القرب
في الكشف عن الموقع من التجمع مجمع Ribonucleoprotein في <em>C. elegans</em> Germline باستخدام القرب الربط اساي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Day, N. J., Wang, X., Voronina, E.… More

Day, N. J., Wang, X., Voronina, E. In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay. J. Vis. Exp. (159), e60982, doi:10.3791/60982 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter