Summary
Denne protokol beskriver en in vivo-analyse af fagocytose, der anvendes til at vurdere og kvantificere unges og alderen drosophila melanogastereøges evne til fagocytosebakterier..
Abstract
Fagocytose er en væsentlig funktion af det medfødte immunrespons. Denne proces udføres af fagocytiske hæmocytter, hvis primære funktion er at genkende en bred vifte af partikler og ødelægge mikrobielle patogener. Som organismer alder, denne proces begynder at falde, men lidt er kendt om de underliggende mekanismer eller det genetiske grundlag for immunosenescence. Her, en injektion baseret in vivo fagocytose assay bruges til at vurdere aldersrelaterede ændringer i forskellige aspekter af fagocytose, såsom bindende, opslugelse, og nedbrydning af internaliserede partikler, ved at kvantificere fagocytiske hændelser i hæmocytter hos voksne Drosophila. Drosophila melanogaster er blevet en ideel model til at undersøge aldersrelaterede ændringer i medfødte immunfunktion af mange årsager. For én, mange genetiske komponenter og funktioner i den medfødte immunrespons, herunder fagocytose, er evolutionært bevaret mellem Drosophila og pattedyr. Derfor vil resultater opnået ved anvendelse af denne protokol sandsynligvis være bredt relevante for forståelsen af de aldersrelaterede ændringer i immunforsvaret i en række organismer. Derudover bemærker vi, at denne metode giver kvantitative skøn over hemocyt fagocytiske evne, som kunne være nyttige for en række forskningsemner, og behøver ikke at være begrænset til undersøgelser af aldring.
Introduction
Det medfødte immunsystem, som består af fysiske og kemiske barrierer for infektion samt cellulære komponenter, er evolutionær bevaret på tværs af flercellede organismer1,2. Som den første forsvarslinje spiller det medfødte immunsystem en afgørende rolle i bekæmpelsen af at invadere patogener hos alle dyr1,2,3. Komponenterne i det medfødte immunrespons omfatter en lang række celletyper , som klassificeres ud fra , at de mangler specificitet og immunologisk hukommelse2,3,4. Hos mennesker omfatter disse celletyper fagocytiske monocytter og makrofager, neutrofiler og cytotoksiske naturlige dræberceller4,5. Mens der har et funktionelt immunsystem er bydende nødvendigt for vært overlevelse, er det klart, at funktionen af immunceller falder med alderen, et fænomen kendt som immunosenescence5,6. At være i stand til at vurdere aldersrelaterede ændringer i immunresponset, herunder forskellige aspekter af processen med fagocytose, kunne støtte i vores forståelse af immunosenescence. Den procedure, vi beskriver her giver en effektiv og repeterbar tilgang til at evaluere og kvantificere fagocytiske hændelser af hæmocytter i Drosophila melanogaster.
Drosophila er en ideel model til at studere immunrespons af mange grunde. For det første er der et omfattende sæt af genetiske værktøjer til rådighed, der gør det muligt nemt at manipulere genekspression i en vævsafhængig måde7. Disse værktøjer omfatter en samling af mutanter, RNA interferens bestande, GAL4/UAS bestande, og Drosophila Genetic Reference Panel, der indeholder 205 forskellige indavlede linjer, som hele genom sekvenser er katalogiseret8. Den korte livscyklus Drosophila og det store antal producerede personer giver forskerne mulighed for at teste flere personer i et kontrolleret miljø, i en kort periode. Dette forbedrer i høj grad evnen til at identificere subtile forskelle i immunrespons på infektion blandt genotyper, mellem kønnene eller på tværs af aldre. Vigtigere er det, mange genetiske komponenter og funktioner i den medfødte immunrespons, herunder fagocytose, er evolutionært bevaret mellem Drosophila og pattedyr1,2.
I Drosophila udføres den proces med fagocytose, der følger efter infektionen, af fagocæntiske hæmocytter kaldet plasmatocytter, som svarer til pattedyrsmakrofager9. Hæmocytter er afgørende for at genkende en lang række partikler og rense mikrobielle patogener9,10,11,12,13. Disse celler udtrykker en række receptorer, der skal differentiere sig fra ikke-selv, og indlede signalering begivenheder er nødvendige for at udføre den fagocytiske proces10,11,,12,13,14,15. Når en partikel er bundet, det begynder at blive internaliseret ved reorganisering af actin cytoskeleton og remodeling af plasmamembranen til at udvide omkring partiklen, danner en fagocytisk kop11,,12,,13,14. Under denne proces, et andet sæt af signaler fortæller cellen at internalisere partiklen yderligere ved at lukke den fagocytiske kop, danner en membran-bundet phagosome11,,12,,13,14,15. Den fagolige derefter gennemgår en modning proces, der forbinder med forskellige proteiner og sammensmeltning med lysosomer, danner en sur phagolysosome11,,12,,13,,14,15. På dette tidspunkt kan partikler effektivt nedbrydes og elimineres11,12,13,14,15. Drosophila undersøgelser har vist, at ældre fluer (4 uger) har en nedsat evne til at klare en infektion i forhold til yngre fluer (1 uge gamle), sandsynligvis på grund af, i det mindste delvis, til et fald i nogle aspekter af fagocytose16,17.
Den metode, der er beskrevet her, anvender to separate fluorescerende mærkede varme-dræbte E. coli partikler, en forsynet med en standard fluorophore og en, der er pH-følsomme, at vurdere to forskellige aspekter af fagocytose: den oprindelige opslugelse af partikler, og nedbrydningen af partikler i phagolysosome. I denne analyse kan fluoro-partikelfluorescens observeres, når partiklerne er bundet og opslugt af hæmocytter, mens pH-følsomme partikler fluorescerer kun under de lave pH-forhold i det phagosome. Fluorescerende begivenheder kan derefter observeres i hæmocytter, der lokaliserer langs dorsale fartøj. Vi fokuserer på hæmocytter lokaliseret til dorsale fartøj, som giver en anatomisk vartegn for at finde hæmocytter, der er kendt for at bidrage til bakteriel clearance, og til konsekvent at isolere dem. Men, hemocytter i andre dele af kroppen og hæmolymfe er også vigtige for clearance. Selv om vi ikke har studeret denne cellepopulation, vores generelle procedure kunne være gældende for fagocytiske analyser af disse celler samt. En fordel ved vores tilgang er, at vi kan kvantificere fagocytiske hændelser inden for individuelle hæmocytter, så vi kan opdage subtile variation i fagocytiske processer. Andre undersøgelser, der visualiserer fluorescerende begivenheder gennem neglebånd18,19 ikke tegner sig for forskelle i antallet af hæmocytter til stede, hvilket er særligt vigtigt at overveje i vores tilfælde som samlede hemocyt tæller forventes at ændre sig med17år .
Protocol
1. Saml og alder Drosophila
- For at generere samme alderen F1 fluer til test af fagocytose, tilsættes 5-10 jomfru hunner og 5 hanner af de relevante genotyper til et hætteglas indeholdende frisk fluemad. Vi bruger en majsmelasse agar baseret mad20,men metoden skal arbejde uanset hvilken type kost fluerne er opdrættet på. Til dette eksperiment brugte vi Hemese (Han) -GAL4; UAS-GFP flyver for at mærke hæmocytter genetisk.
BEMÆRK: Flere fluer kan bruges, men nogle linjer af D. melanogaster kan ikke parre sig eller reproducere godt, når overfyldte, og overbelægning kan have negative virkninger på larve udvikling21 og fagocytose. - Vedligehold fluer under de ønskede eksperimentelle forhold. For dette eksperiment, vedligeholde He-GAL4; UAS-GFP flyver ved 24 °C. Tillad voksne fluer at parre sig i en uge, og derefter fjerne voksne. F1 fluer vil derefter blive indsamlet fra disse hætteglas efter eklosion til eksperimentel brug.
- Saml jomfrufluer hele ugen, eller indtil det ønskede antal fluer er indsamlet. Jomfruer er ikke påkrævet; parring kan dog påvirke immunresponset. Hvis F1 fluer skal testes som jomfruer, adskille hanner og hunner inden for 8 timer efter eklosion og vedligeholdes i separate hætteglas for at forhindre parring. Indsamle nok fluer til at tillade vurdering af fagocytose i mindst 10 fluer pr genotype / behandling / køn per alder.
- Hvis ældes fluer til en uge, indsamle mindst 50 fluer i alt, eller 20 fluer pr behandling tilstand for hver partikel, enten fluor-partikler eller pH følsomme partikler, der skal injiceres. Dette vil sikre mindst 10 fluer til analyse på tidspunktet for forsøget.
- Hvis aldring flyver til mere end 3 uger, indsamle mindst 100-150 fluer i alt, eller 50-75 fluer pr behandling tilstand for at sikre, at der er nok fluer til rådighed til at måle fagocytose. Når ældes fluer i laboratoriet, bruger vi typisk insektbure, der holdes ved 24 °C i 12:12 L:D og ændre maden hver anden dag. Hvis der anvendes hætteglas i stedet for bure, flyver spidsen ind i nye hætteglas hver 3-5 dag, afhængigt af fødevarens tilstand i hætteglasset. Antallet af nødvendige fluer vil afhænge af, hvor sent i alder fagocytose vil blive analyseret, og de aldersspecifikke overlevelsesrater for denne genotype i en bestemt miljømæssig tilstand.
- Hvis unge og ældre fluer vil blive vurderet, skal du planlægge i overensstemmelse hermed, så 1 uge gamle og ældre fluer vil blive injiceret samme dag. Dette vil minimere variationer i partikelkoncentrationen mellem forsøg og vil sikre, at alderseffekten på den fagocytiske måling ikke er forvirret med effekten af den dag, analysen blev udført.
- Hus de indsamlede fluer ved 24 °C, indtil de er 5-7 dage gamle, eller vedligeholde fluer til den ønskede alder.
2. Forbered fluorescerende mærkede partikler
- Rekonstituere varmeaflivede E. coli fluorpartikler eller pH-følsomme E. coli-partikler til en koncentration på henholdsvis 20 mg/ml eller 1 mg/ml. Andre bakterier er tilgængelige til brug, der kan være mere egnet til visse forsøg, men henvises til producentens anvisninger for passende lagerkoncentrationer.
- For fluorpartikler tilsættes 990 μL 1x PBS (pH 7,4) eller foretrukken buffer og 10 μL 2 mM (20%) natriumazid. Vortex at blande.
BEMÆRK: Natriumazid er et konserveringsmiddel, der kan udelades; partikler, der fremstilles uden natriumazid, varer dog ikke så længe. Fluorpartikler skal anvendes inden for 24 timer, og pH-følsomme partikler skal anvendes inden for 7 dage. - For pH-følsomme partikler tilsættes 1.980 μL 1x PBS (pH 7,4) eller foretrukken buffer og 20 μL 2 mM (20%) natriumazid. Vortex at blande.
- Der anvendes 20 μL-prøver i 1,5 ml mikrocentrifugerør til flere engangsbrug. Fluorpartikler opbevares ved -20 °C i op til et år, og pH-følsomme partikler opbevares ved 4 °C i op til 6 måneder, beskyttet mod lys.
- For fluorpartikler tilsættes 990 μL 1x PBS (pH 7,4) eller foretrukken buffer og 10 μL 2 mM (20%) natriumazid. Vortex at blande.
- På injektionsdagen fjernes natriumazid fra partiklerne før brug. For at gøre dette centrifugeres partiklerne i 5 min ved 15.000 x g ved stuetemperatur.
- Supernatanten fjernes, og partiklerne vaskes to gange ved at resuffe forbruget i 50 μL 1x PBS eller foretrukken buffer og centrifugeres i 5 min ved 15.000 x g.
- Efter den anden vask fjernes supernatanten og opslæmmepartiklerne i 100 μL 1x PBS eller foretrukken buffer. Opbevar opløsningen i røret, og minimer eksponeringen for lys under hele forsøget. Når natriumaziden er fjernet, skal fluorpartiklerne anvendes inden for 24 timer, og pH-følsomme partikler anvendes inden for 5-7 dage.
BEMÆRK: I vores tidligere forsøg fandt vi, at denne koncentration af partikler gav tællelige antal fagocytiske hændelser, og at antallet af partikler til rådighed for fagocytose af hæmocytter ikke var begrænsende17. Brugere af denne protokol ønsker dog måske at sammenligne resultater ved hjælp af andre koncentrationer for at sikre, at der er et tilstrækkeligt antal partikler til rådighed for fagocytose ved hæmocytter i betingelserne for deres eksperimenter.- Hvis natriumazid blev udeladt, fortyndes partiklerne 1:5 i samme buffer partiklerne blev forberedt med, til injektioner.
- Tilsæt en dråbe (~ 10 μL) af grøn mad farve til partiklerne. Dette gør det lettere at sikre, at fluerne er blevet injiceret.
3. Injicer fluerne
- Tilbered glasnåle til injektioner.
- Træk glasnåle ved hjælp af en pipettetrækker. Pipettetrækervarmeren indstilles til 55 °C og magnetventilen til 45. Brug kun de nåle, der følger med injektoren, da det ikke er garanteret, at andre nåle vil fungere med samme præcision.
- Fyld en 1 ml steril sprøjte med mineralsk olie, og fastgør 30 gauge hypodermisk (G) nål, der følger med nanoinjektoren.
- Fyld den trak kapillære nål op ved at indsætte 30 G nålen i den stumpe ende af den trak glasnål og fyld med mineralsk olie. Fjern langsomt 30 G nålen, så der ikke er luftbobler i hele nålen, da dette kan forårsage unøjagtige injektionsmængder. Injektoren fungerer ikke korrekt uden at fylde nålen op på.
- Brug pincet, bryde spidsen af nålen for at skabe en åbning for at tillade udslyngning af opløsning.
- Saml nanoinjektoren.
BEMÆRK: Andre injektorer kan anvendes. Den metode, der er beskrevet nedenfor, gælder for nanoinjektoren. For andre injektorer, se brugervejledningen for instruktioner.- Indstil injektoren til den ønskede lydstyrke (mellem 46 nL og 69 nL).
- Fjern spændetangen og placer forseglingen O-ringen, den hvide afstandsstykke med fordybningen opad for at modtage den bageste ende af nålen, og den større O-ring på metalstemplet i den rækkefølge. Sæt collet igen uden at stramme den.
- Sæt metalstemplet ind i den stumpe ende af den oliefyldte glasnål. Skub forsigtigt nålen ned og sæt den ind i den større O-ring. Stram spændetrings collet indtil sikker.
BEMÆRK: Hvis metalstemplet ikke strækker sig forbi spændetredalen, skal du trykke på og holde 'EMPTY' nede, indtil stemplet er synligt. Dette gør det lettere at sikre, at stemplet er indsat i nålen. - Tryk på og hold 'EMPTY' nede, indtil injektoren bipper. Dette skubber det meste af mineralsk olie fra nålen, efterlader en lille mængde olie til at fungere som en barriere mellem de to væsker, samt fjerner luftbobler.
- Nålen fyldes med enten fluorpartikler eller pH-følsomme partikler ved at sætte spidsen af glasnålen ind i mikrocentrifugerøret, der indeholder de forberedte partikler.
- Tryk og hold 'FILL' nede, indtil injektoren bipper.
- Injektioner
- Overfør fluerne, der skal injiceres, i et tomt hætteglas. Immobiliser fluerne ved at placere hætteglasset i is. CO2 kan også bruges til at immobilisere fluerne. Bemærk dog, at ved brug af pH-følsomme partikler kan forhøjede CO2-niveauer kunstigt forsure eventuelle buffere, der anvendes, og kan øge baggrundsfluorescensen.
- Indsprøjt fluerne i brystkassens agterstavnplade (figur 1A). Injektionen lykkes, hvis der ses grønt farvestof i fluen (Figur 1B). Hvis fluen ikke bliver grøn, skal du sørge for, at nålen ikke er tilstoppet.
BEMÆRK: Alternativt kan fluer injiceres i maven, men hold injektionsstedet ensartet på tværs af alle eksperimenter. - Placer injiceres fluer i en ny fødevare hætteglas, bemærke den tid, at den første og sidste flue blev injiceret. For at minimere eksperimentelle fejl på grund af den tid, det tager at fuldføre injektioner, komplet injektioner i tide. Med praksis, bør det tage ikke længere end 10 min at injicere et sæt fluer. Læg hætteglasset på siden, indtil alle fluerne er kommet sig, for at forhindre fluerne i at sidde fast i maden.
- Lad fluer komme sig i 60-90 min, afhængigt af eksperimentelle forhold. Her blev der brugt en 60-minutters restitutionstid. Bemærk, at dette restitutionstidsinterval var optimalt til at tælle fagocytiske hændelser i forsøgsbetingelserne i Horn et al. studie17. Men, under nogle betingelser, Dette kan være for lang til at opdage subtile forskelle i fagocytose mellem behandlingsgrupper. Det kan være nyttigt at udføre tidsforløbsforsøg, som det blev gjort tidligere17 for at bestemme restitutionstiden, der vil afsløre maksimale forskelle mellem kontrol- og forsøgsresultater. Uanset restitutionstid er valgt, holde denne konsekvent på tværs af alle eksperimentelle behandlinger.
- Hvis du injicerer med fluorpartikler og pH-følsomme partikler samme dag, skal du bruge en ny nål til hver opløsning. Injicer ikke individuelle fluer med begge partikler, hvis de begge fluorescerer rødt, da resultatet ikke ville skelne mellem de to aspekter af fagocytose, partikelbinding/opslugelse vs. partikeloptagelse i phagosome.
4. Dissekere dorsale fartøjet
- Efter fluer er kommet sig i 60-90 min, overføre alle levende fluer til et tomt hætteglas og immobilisere på is.
- Overfør en flue ad gangen på en silikoneelastomer dissektion plade.
BEMÆRK: Klargør dissektionsplader mindst 1 uge før brug, hvis de hærdes ved stuetemperatur. For at gøre dette, forberede elastomer og hæld det i en 33 mm x 10 mm petriskål, fylde fadet omkring halvvejs. Bank forsigtigt på skålen på en flad overflade for at minimere luftbobler. Lad pladerne sidde ved stuetemperatur, uforstyrret, i mindst en uge.- Under et dissekerende stereomikroskop skal du orientere flueventilationssiden op.
- Brug insektstifter til at fastgøre fluen på pladen ved at indsætte en stift gennem brystkassen og en anden stift gennem den mest bageste ende af maven, nær kønsdelene (Figur 2A). Det kan være nyttigt at skære stifterne i halve, før prøven fastgøres, så dissektionen ikke hindres. Gentag med op til 10 fluer pr dissektion plade.
BEMÆRK: Valgfrit: Fjern vinger og ben, før fastgørelse flyver til plade. Dette vil hjælpe med at forhindre en boble danner omkring fluen, når medierne er tilføjet. - Når alle fluer er blevet fastgjort til pladen, tilføje nok dissektion medier til at dække fluer (~ 1 ml) ved hjælp af en overførsel pipet.
- Brug pincet eller neglebånd saks, fjerne hovedet.
- Brug neglebånd saks, gøre to vandrette snit: en direkte over den bageste pin i maven, og en anden i den mest forreste ende af maven, hvor brystkassen og maven mødes (Figur 2B, C). I figur 2blev hovedet efterladt intakt for at tydeliggøre retningen.
- Lav et lodret snit, der forbinder de to vandrette snit (de tre snit ligner bogstavet I). Dette vil åbne bughulen (Figur 2D).
- Brug pincet, fjerne de indre organer og væv, undgå dorsale fartøj. Hvis uforstyrret, den gennemsigtige ryg fartøj kan ofte ses pulserende nær den forreste ende af maven. Yderligere stifter kan bruges til at fastgøre åbne nyligt afskårne ender af neglebånd (Figur 2E, F).
- Ved hjælp af neglebånd saks, fjerne brystkassen. Alternativt kan brystkassen fjernes, før de dissekerede neglebånd og dorsale beholdere monteres på et mikroskop dias.
- Gentag med de resterende fluer. dissekere fluer i tide, for at minimere mulige variationer i fagocytisk sats. Når alle fluer er blevet dissekeret, lad neglebånd med den vedlagte dorsale fartøj fastgjort til pladen. Alle trin 5 vil blive udført i dissektionspladen. Dette vil forhindre beskadigelse eller utilsigtet kassere neglebånd mellem trinene.
5. Fiksering og farvning
- Ret dissekerede neglebånd med påsatte dorsale beholder i 4% paraformaldehyd (PFA).
- Ved hjælp af en ny engangsoverførselspipet til hvert trin kasseres dissektionsmediet, og udskift det med 1 ml 4% PFA. Under hele fiksering og farvning, holde dissektioner beskyttet mod lys så meget som muligt.
- Inkubere ved stuetemperatur i 15 minutter med rokkende ved 20 rpm. Lad ikke dissektioner sidde i fiksativ i mere end 20 min, da dette kan begynde at beskadige vævet.
- Vask neglebånd 2x i 1x PBS + 0,1% Tween (PBST).
- Fjern fiksativ og udskift med 1 ml 1x PBST.
- Vask ved stuetemperatur i 15 minutter med rokkende.
- Gentag 1x.
BEMÆRK: Dissekret, fast væv kan opbevares ved 4 °C, i op til 3 dage, beskyttet mod lys, efter den første vask ved at erstatte vask med frisk PBST. Opbevar ikke fast væv, hvis der anvendes antistoffer. Antistoffer bør anvendes med frisk væv for at opnå de bedste resultater.
- Valgfrit: Antistof farvning. Antistoffer kan anvendes til klart at visualisere dorsale beholderen klart (Figur 3), eller til at detektere hæmocyt specifikke markører. Dette kan sikre, at kun celler langs dorsale beholder tælles eller for at markere membranen af hæmocytter.
- Fjern den anden vask, tilsæt primær antistof ved den relevante fortynding. Inkuberes natten over ved 4 °C, med rokkende.
- Fjern primære antistof, og vask to gange med PBST i 15 min med rokkende.
- Tilsæt fluorescerende sekundært antistof. Vi anbefaler et grøn-fluorescerende antistof, så det ikke tilslører de fluorescerende partikler. Inkubere ved stuetemperatur i 2 timer, med vuggende.
- Fjern sekundært antistof, vask to gange i 15 minutter hver med PBST.
- Pletten med DAPI.
- Den endelige vask fjernes, og den erstattes med 1 ml DAPI fortyndet i PBST (1:1000).
- Plettet i 20 minutter med rokkende ved stuetemperatur.
- Fjern DAPI, og vask 2x (gentag trin 5.2).
- Udskift den endelige vask med frisk 1x PBST.
BEMÆRK: Fluer kan opbevares ved 4 °C i op til 3 dage, beskyttet mod lys, efter den første vask ved at udskifte vasken med frisk PBST.
6. Montering af neglebånd på mikroskopdias og billeddannelse
- Forbered dissekerede neglebånd.
- Under dissekere stereomikroskopet, afbrød overskydende neglebånd, der kan forstyrre billeddannelse.
- Ved hjælp af pincet overføres neglebåndene med fastgjort dorsale beholder til et 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 70% glycerol. Placering af neglebånd i glycerol vil hjælpe med at fjerne PBST og giver mulighed for et klarere billede under billeddannelse.
- Monter neglebånd på mikroskopet dias.
- Tilføj et par dråber af 70% glycerol til et mikroskop dias.
- Ved hjælp af pincet, fjerne neglebånd fra glycerol røret og sted i glycerol på diaset.
- Under dissekere stereo mikroskop, bruge pincet til at orientere neglebånd ventrale side op, sikre dorsale fartøjet er synlig. Den mørkere pigment af neglebånd vil være med billedsiden nedad.
- Tilføj en ekstra dråbe glycerol, hvis det er nødvendigt. Dette hjælper med at forhindre luftbobler og giver mulighed for et klarere billede.
- Forsigtigt placere en coverslip over neglebånd og forsegle kanter med fingernegl polish. Lad det tørre i 10-15 minutter, før du fortsætter. Fluerne afbildes straks, eller opbevar dem i en lystæt æske ved 4 °C.
- Billede af dorsale fartøjet.
- Brug et fluorescerende mikroskop til at bruge det strukturelle interferenssystem til at generere optiske dele af dorsale beholderen. Et konfokalt mikroskop kan alternativt anvendes, hvilket kan give yderligere nøjagtighed. Få Z-stack billeder af dorsale fartøj ved hjælp af en 20x objektiv og foretrukne billedbehandling software. Tilføj en 10 mm skalalinje, og korrekt etiket og gemme billeder som tiff filer (Figur 4) eller det ønskede format.
BEMÆRK: Antallet af opnåede Z-stakbilleder kan variere mellem dissektioner og afhænger af, hvor godt dorsale beholderen blev dissekeret, og på den ønskede trinstørrelse mellem billederne. Her blev trinstørrelsen sat til 0,49 mm. Dette tal kan variere alt fra 3 til 40 billeder pr stak i vores erfaring.
- Brug et fluorescerende mikroskop til at bruge det strukturelle interferenssystem til at generere optiske dele af dorsale beholderen. Et konfokalt mikroskop kan alternativt anvendes, hvilket kan give yderligere nøjagtighed. Få Z-stack billeder af dorsale fartøj ved hjælp af en 20x objektiv og foretrukne billedbehandling software. Tilføj en 10 mm skalalinje, og korrekt etiket og gemme billeder som tiff filer (Figur 4) eller det ønskede format.
7. Analysere billeder
- Kvantificer lysstofrør ved hjælp af ImageJ.
- Åbne billeder og stable dem: Billede à stakke à billeder til stak.
- Tæl kun de ~1 mm størrelse fluorescerende signaler inden for en 10 mm diameter centreret på en DAPI-positiv kerne ved at klikke på hver hændelse fra mindst 10 celler per flue, fra mindst 10 fluer per alder pr partikeltype injiceres: Plugins à Analyze à Cell Counter Notice ( Figur5A). Værktøjet til meddelelse af celler tildeler en anden farve til hver celle, der spores, med en farvet prn, der svarer til hver fluorescerende hændelse, der klikkes på i den pågældende celle.
- Hvis du vil have vist den tæller- og stakposition, der er knyttet til hvert punkt, skal du trykke på 'm' eller vælge Mål under fanen Analysér eller for at få vist antallet af hændelser, der tælles i hver celle i en resultattabel, ved at trykke på 'alt +y' (Figur 5B).
- Overfør celletallet til et regneark, der skal bruges til statistisk analyse.
- Udfør statistisk analyse.
- Analysér forskelle i fagocytiske hændelser ved hjælp af enten fast-effekter ANOVA eller blandet model indlejret ANOVA. Blandede modeller kan anvendes til at teste de vigtigste faste virkninger af alder og genotype og den tilfældige effekt af personer indlejret inden for hver genotype17.
BEMÆRK: Efterforskere bør være strenge i at teste antagelserne om enhver statistisk procedure, der anvendes til at analysere data.
- Analysér forskelle i fagocytiske hændelser ved hjælp af enten fast-effekter ANOVA eller blandet model indlejret ANOVA. Blandede modeller kan anvendes til at teste de vigtigste faste virkninger af alder og genotype og den tilfældige effekt af personer indlejret inden for hver genotype17.
Representative Results
For at illustrere de beskrevne injektionsmetoder viser figur 1A injektionsstedet på Drosophila melanogaster, samt hvordan fødevarefarvestof giver mulighed for en visuel bekræftelse af, at fluen blev injiceret (Figur 1B). Tilsætning af fødevarer farvestof også hjælpemidler i anerkendelsen af en tilstoppet nål. Injektioner kan udføres i maven, men holde injektionsstedet konsekvent på tværs af eksperimenter. Dette vil hjælpe med at minimere mulige variationer mellem hvert eksperiment.
For at visualisere de fluorescerende mærkede partikler i hjemmehørende hemocytter langs rygbeholderen dissekerede vi rygbeholderen og vedlagde abdominal neglebånd. Figur 2A-F skitserer dissektionsmetoderne.
For at vurdere unge og ældede fluers aldersspecifikke evne til at udføre fagocytose visualiseres hæmocytter langs dorsale beholdere ved hjælp af et fluorescerende mikroskop. For at sikre, at kun celler langs dorsale beholder tælles, antistoffer eller GFP-mærkede gener for visse blodcellemarkører eller hjertespecifikke kollagen, såsom Hemese og Hemolectin, eller Pericardin (Figur 3), henholdsvis kan anvendes22,23,24. Fluorescerende mærket E. coli partikler er 1 mm i længden, mens hæmocytter er 10 mm i diameter17. Kun de fluorescerende hændelser, der er placeret inden for en diameter på 10 mm centreret på en DAPI-positiv kerne, tælles (figur 4). Til at kvantificere fluorescerende hændelser bruges ImageJ-software (Figur 5).
Figur 1: Injektionsstedet og visuel verifikation. (A) Lateral side af brystkassen er gennemboret med en trukket kapillær nål. (B) Injektioner verificeres visuelt ved at tilsætte grøn mad farvestof til partikelopløsning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Dissektion af dorsalkar. (A) Stifter er placeret i brystkassen og bageste mave (sorte pile). ( B-C) To vandrette snit (grønne pile) er lavet i den bageste ende af maven (B), og forreste ende (C). (D) Et lodret snit (grøn pil) er lavet ned i midten af maven, der forbinder de to vandrette nedskæringer. (E) Valgfrie stifter (*) bruges til filet åbne bughulen, udsætter indre væv. (F) Internt væv (afgrøde, tarm, livmoder, æggestokke, fedt organer) er fjernet, udsætter dorsale fartøj. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Ventralt udsyn til en dissekeret dorsale beholder fra en 5 uger gammel hun injiceres med pH-følsomme partikler, plettet med antistof rettet mod Pericardin (A). Stiplet hvid linje skitserer den laterale side af dorsale fartøj, med pil peger mod den forreste region. (B) Forstørret billede af (A): klynger af hæmocytter (blå pil), der var aktivt nedbrydende bakterier, inden for den første aorta kammer af dorsale fartøj. (C) Forstørret billede af (A) skitserer den ekstracellulære matrix (ECM) kollagen-lignende protein, Pericardin (grøn pil), der holder dorsale fartøj på plads24. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Dissekerede dorsale beholdere og tilhørende hæmocytter fra en hunflue injiceret med pH-følsomme partikler eller fluorpartikler. (A) Dorsale beholderen og tilhørende hæmocytter med opslugt pH-følsomt E. coli-partikler (rød) eller (E) fluormærkede E. coli-partikler (rød), isoleret fra en 1 uge gammel flue, efter at de er blevet i 60 min. (B,F) Forstørrelsesglasset (A) og (E) (hvid boks), der viser to individuelle hemocytter med tællelige hændelser. cC) Dorsale beholderen og tilhørende hæmocytter med opslugt pH-følsomt E. coli-partikler(rød) eller ( G) fluormærkede E. coli-partikler (rød), isoleret fra en 5 uger gammel flue, efter at de er kommet sig i 60 min. (D,HForstørrelsesglas ) indsat af henholdsvis( C) og (G) (hvid boks), der viser to individuelle hemocytter med tællelige hændelser. Stiplet hvid linje skitserer den laterale side af dorsale fartøj, med pil peger mod den forreste region. Nuclei farves med DAPI (blå). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Kvantificering af fagocytiske hændelser inden for en 10 mm hemocytter ved hjælp af celletælleren i ImageJ. (A) Efter åbning af billeder i ImageJ kan værktøjet Til meddelelse af celletæller bruges til at holde styr på fagocytiske hændelser pr. celle. (B) Dette værktøj tildeler en anden farve til hver celle, der vælges til at blive talt, med hver prn svarende til en fluorescerende hændelse i den pågældende celle. Hvis du trykker på 'alt+y', vises en tabel, der viser antallet af hændelser, der tælles pr. celle. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Den protokol, der er beskrevet her, er en pålidelig måde at kvantificere forskellige aspekter af fagocytose under kontrollerede eksperimentelle forhold. Vi bemærker, at vi kun har testet denne procedure med gram negative bakterielle partikler og resultaterne kan variere, hvis gram positive bakterielle partikler anvendes. Faktisk ville det være interessant at sammenligne de fagocytiske reaktioner på både gram negative og gram positive bakterier i forskellige eksperimentelle forhold. Brugen af en nanoinjektor giver mulighed for præcis kontrol over injektionsmængderne, hvilket sikrer, at hver flue injiceres med den samme mængde partikler. En begrænsning af protokollen kommer fra uoverensstemmelser i partikelpræparater. Partikler vil samle når frosset, så små variationer i fortynding mængder, eller mangel på vortexing, kan påvirke partikelkoncentrationen mellem eksperimenter. For at minimere mulige variationer i partikelkoncentrationer mellem aldre er det gavnligt at injicere 1- og 5 uger gamle fluer samme dag ved hjælp af den samme nål- og partikelopløsning. En anden potentiel ulempe er, at under dissektioner, dorsale fartøj og / eller neglebånd kan nemt blive beskadiget, hvis stifter ikke håndteres korrekt. For at undgå at forstyrre dorsale beholderen, minimere antallet af stifter, der anvendes pr dissektion. Fordelen ved denne dissektion metode er, at alle fiksering, vask og farvning trin kan udføres i dissektion plade. Fordi neglebånd er fastgjort ned, dette forhindrer neglebånd fra at blive tabt mellem trin.
Sammenlignet med eksisterende metoder18,19,25,26,27,28,29, den beskrevne protokol har sine fordele og begrænsninger. Ved at dissekere dorsale fartøj, er vi i stand til at visualisere og kvantificere individuelle hemocytter på dette sted. Dette gør det muligt at opdage subtile variationer i fagocytisk aktivitet mellem eksperimentelle grupper. Andre metoder visualisere fluorescerende mærkede partikler ved at indsamle hæmocytter ved hjælp af en Bleed /Scrape-analyse19,25,26,27eller gennem en intakt ventral neglebånd18,19,28,29; De enkelte hæmocytter kan dog ikke vurderes, når de visualiseres gennem dorsale neglebånd. Fordelen ved denne protokol, sammenlignet med Bleed / Scrape metode er, at vores metode giver os mulighed for at vurdere kun de hemocytter forbundet med dorsale fartøj, og gør tegner sig for cirkulerende celler eller dem langs kroppen væggen, som kan være funktionelt anderledes. Dissekere dorsale fartøjet fjerner også behovet for at medtage en anden runde af injektioner med en fluorescens quencher, ligesom Trypan blå19,26. Dette skyldes, at partikler, der ikke er bundet til eller opslugt af en celle, vil blive vasket væk under vasketrin. Omvendt kan alternative metoder være lettere at udføre, fordi de ikke kræver dissektioner. Mens dissekere dorsale fartøjet er let at lære, dette trin tilføjer et niveau af kompleksitet, som måske ikke er muligt i nogle eksperimentelle design.
Selv om den beskrevne brug af denne in vivo fagocytose assay er at vurdere og kvantificere fagocytiske hændelser i forskellige aldre, denne protokol er meget fleksibel og kan bruges til at analysere forskellige aspekter af fagocytose mellem genotype, køn, eller vævstype. Med fagocytose er af central betydning for de fleste flercellede dyr, forståelse af, hvordan denne proces falder med alderen kan føre til bedre terapeutiske behandlinger for den aldrende befolkning. Denne tilgang giver langsigtede potentiale for at belyse aspekter af aldersrelaterede ændringer i immunrespons, med særlig fokus på fagocytose.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health R03 AG061484-02 og UMBC College of Natural and Mathematical Sciences Becton Dickinson Faculty Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.10 mm Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Here: pins are cut in half, and the sharp end is used |
| 1 mL sterile syringes | Becton Dickinson | 309602 | Filled with mineral oil to load needle |
| 15% Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | for dissection media |
| 16 % Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | EM-grade, 4% working, diluted in 1X PBS |
| 1x Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| 3 mL Trasnfer Pipet | Falcon | 357524 | |
| 3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | 1.14mm O.D X 3.5" length X 0.53" I.D |
| 35x10 mm Petri dishes | Becton Dickinson | 351008 | Used as dissection plate, filled half way with Sylgard |
| 6x penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | for dissection media |
| 70% Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Analog Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
| Biological point forceps, Dumont No. 5 | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Life Technologies | D1306 | Diluted 1:1000 in 1x PBST |
| Drosophila strain | w[*]; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8 | ||
| E. coli (K-12 strain) BioParticles™, Alexa Fluor™ 594 conjugate | Life Technologies | E23370 | |
| Glass slides | Premiere | D17026102 | |
| Live cell imaging solution | Life Technologies | A14291DJ | preferred buffer for particle preparation and dilutions |
| Mineral oil | Mpbio | 194836 | |
| Nanoject II automatic nanoliter injector | Drummond | 3-000-204 | |
| Narrow Polystyrene Super Bulk Drosophila Vials | Genesee | 32-116SB | Size: 25 X 95 mm |
| Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | Speed used: 20 rpm |
| pHrodo™ Red E. coli BioParticles™ Conjugate for Phagocytosis | Life Technologies | P35361 | |
| Schneider's Drosophila cell culture media (1x) | Gibco | 21720-024 | Dissection media, combine: Schneiders, FBS, and pen/strep; filter sterilize |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | 2mM (or 20%) working |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Prepare according to provided protocol |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | For PBS + 0.1% tween |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 812368 | Heater: 55? Solenoid: 45 |
| Zeiss AxioImager.Z1 fluorescent microscope | Zeiss | Here: Apotome structural interference system with Zeiss Zen imaging software |
References
- Abhyankar, V., Kaduskar, B., Kamat, S. S., Deobagkar, D., Ratnaparkhi, G. S. Drosophila DNA/RNA methyltransferase contributes to robust host defense in ageing animals by regulating sphingolipid metabolism. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 22 (2018).
- DeVeale, B., Brummel, T., Seroude, L. Immunity and aging: the enemy within. Aging Cell. 3 (4), 195-208 (2004).
- Gomez, C. R., Nomellini, V., Faunce, D. E., Kovacs, E. J.
- Panda, A., et al. Human innate immunosenescence: causes and consequences for immunity in old age. Trends in Immunology. 30 (7), 325-333 (2009).
- Aw, D., Silva, A. B., Palmer, D. B. Immunosenescence: emerging challenges for an ageing population. Immunology. 120 (4), 435-446 (2007).
- Min, K. -J., Tatar, M. Unraveling the molecular mechanism of immunosenescence in Drosophila. International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), 2472 (2018).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- Banerjee, U., Girard, J. R., Goins, L. M., Spratford, C. M. Drosophila as a genetic model for hematopoiesis. Genetics. 211 (2), 367-417 (2019).
- Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. B. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).
- Garschall, K., Flatt, T. The interplay between immunity and aging in Drosophila. F1000Research. 7, (2018).
- Brennan, C. A., Anderson, K. V. Drosophila: The genetics of innate immune recognition and response. Annual Review of Immunology. 22 (1), 457-483 (2004).
- Rosales, C., Uribe-Querol, E. Phagocytosis: a fundamental process in immunity. BioMed Research International. 9042851, Research article (2017).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (10), 781-795 (2008).
- Stuart, L., et al. A systems biology analysis of the Drosophila phagosome. Nature. 445 (7123), 95-101 (2007).
- Mackenzie, D. K., Bussière, L. F., Tinsley, M. C. Senescence of the cellular immune response in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 46 (11), 853-859 (2011).
- Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes. Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).
- Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila. Current Biology. 10 (13), 781-784 (2000).
- Garg, A., Wu, L. P. Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus. Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).
- Bloomington Drosophila Stock Center: Indiana University Bloomington. , Available from: https://bdsc.indiana.edu/innformation/recipes/molassesfood.html (2019).
- Fellous, S., Lazzaro, B. P. Larval food quality affects adult (but not larval) immune gene expression independent of effects on general condition. Molecular Ecology. 19 (7), 1462-1468 (2010).
- Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2622-2627 (2003).
- Goto, A., et al. A Drosophila haemocyte-specific protein, hemolectin, similar to human von Willebrand factor. Biochemical Journal. 359, Pt 1 99-108 (2001).
- Cevik, D., Acker, M., Michalski, C., Jacobs, J. R. Pericardin, a Drosophila collagen, facilitates accumulation of hemocytes at the heart. Developmental Biology. 454 (1), 52-65 (2019).
- Ghosh, S., Mandal, S., Mandal, L. Detecting proliferation of adult hemocytes in Drosophila by BrdU incorporation and PH3 expression in response to bacterial infection. Wellcome Open Research. 3, (2018).
- Hao, Y., Yu, S., Luo, F., Jin, L. H. Jumu is required for circulating hemocyte differentiation and phagocytosis in Drosophila. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 95 (2018).
- Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. Assaying blood cell populations of the Drosophila melanogaster larva. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
- Gyoergy, A., et al. Tools allowing independent visualization and genetic manipulation of Drosophila melanogaster macrophages and surrounding Tissues. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (3), 845-857 (2018).
- Bosch, P. S., et al. Blood cells of adult Drosophila do not expand, but control survival after bacterial infection by induction of Drosocin around their reservoir at the respiratory epithelia. BioRxiv. 578864, (2019).
