Please note that all translations are automatically generated.
Denne protokol beskriver en in vivo-analyse af fagocytose, der anvendes til at vurdere og kvantificere unges og alderen drosophila melanogastereøges evne til fagocytosebakterier..
Vores protokol giver en effektiv og repeterbar tilgang til at evaluere og kvantificere fagocytiske hændelser i hæmocytter. Den største fordel ved denne teknik er, at vi kan kvantificere fagocytiske hændelser inden for individuelle hæmocytter, som giver os mulighed for at opdage variationer i fagocytiske processer blandt genotyper i individuelle fluer. Udførelse dissektioner kan være udfordrende, så når du udfører denne teknik for første gang, praksis dissektioner så meget som muligt, før du udfører den fulde procedure.
Begynd med at forberede glasnåle til injektion. Fyld en en millimeter sprøjte med mineralsk olie, og fastgør den 30 gauge hypodermiske nål, der er forsynet med nanoinjektoren. Sæt 30 gauge nålen i den stumpe ende af en trukket kapillær nål og fyld den med mineralsk olie.
Fjern langsomt 30 gauge nålen og sørg for, at der ikke dannes luftbobler. Tag spændet sammen, og placer den forseglede O-ring med indrykningen opad. Placer den større O-ring på metalstemplingen, og sæt derefter spændetapen igen uden at stramme.
Sæt metalstempelet ind i den stumpe ende af den oliefyldte glasnål, og skub det forsigtigt ned og sæt det ind i den større O-ring. Stram derefter spændet, indtil den er sikker. Efter påfyldning af nålen med fluor eller pH-følsomme partikler injiceres fluerne i brystkassens sternopleural plade.
Injektionen er vellykket, hvis det grønne farvestof går i flue. Anvend de injicerede fluer i et nyt hætteglas, der bemærker det tidspunkt, hvor den første og sidste flue blev injiceret. Læg hætteglasset på sin side, indtil alle fluer er kommet sig for at forhindre dem i at sidde fast i maden.
Vend flue ventrale side op under en dissekerende stereomikroskop. Derefter indsætte et insekt pin i brystkassen og en anden gennem den mest bageste ende af maven nær kønsorganerne. Når alle fluer er blevet fastgjort, skal du bruge en overførsel pipet til at tilføje nok dissektion medier til at dække fluer.
Fjern hovedet med neglebånd saks, og foretage en vandret snit direkte over den bageste pin i maven, så en anden på den mest forreste ende af maven. Lav et lodret snit, der forbinder de to vandrette snit, som vil åbne bughulen. Brug sceskiver til at fjerne de indre organer og væv, og sørg for at undgå dorsal fartøj.
Brug om nødvendigt yderligere stifter til at fastgøre neglebåndets afskårne ender. Fjern derefter brystkassen med neglebåndssaksen. Dissektionsmediet kasseres, og udskift det med en milliliter 4% PFA, og beskyt dissektionerne mod lys så meget som muligt.
Fastgør dissektionerne i 15 minutter ved stuetemperatur, mens du rokker ved 20 omdrejninger i minuttet. Fjern derefter fiksativet og tilsæt en milliliter 1X PBST. Hvis det ønskes, plette dissektioner med antistoffer.
Efter montering af neglebånd på et mikroskop dias, skal du bruge kraftang til at orientere dem ventrale side op, og sørg for, at dorsal fartøjet er synlig. Unge og ældre fluer blev vurderet for aldersspecifik evne til at udføre fagocytose ved fluorescerende billeddannelse af hæmocytter langs dorsalfartøjet. Et antistof mod pericardin blev brugt til at sikre, at kun celler langs dorsale beholderen blev talt.
Da fluorescerende mærkede E.coli partikler er et mikrometer i længden og hæmocytter er 10 mikrometer i diameter, kun fluorescerende begivenheder inden for en 10 mikrometer diameter centreret på en DAPI-positiv kerne blev talt. ImageJ software blev derefter brugt til at kvantificere begivenhederne. Når du forsøger denne procedure, er det vigtigt at visualisere, at fluen faktisk blev injiceret, og at huske, at timingen er kritisk.
Fuldførelse af injektioner og dissektioner i tide vil bidrage til at minimere eksperimentelle fejl og mulige variationer i fagocytiske sats. Denne teknik vil give forskerne mulighed for at udforske en række forskningsemner, herunder spørgsmål vedrørende cellulære immunitet, forskellige populationer af blodlegemer eller skelne fagocytose fra AMP produktion under en vellykket immunrespons.
