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एक ऑस्टियोआर्थराइटिस मॉडल में मुरीन स्प्लेन, बोन मैरो, लिम्फ नोड्स और सिनोवियल ऊतक के भीतर प्रतिरक्षा सेल सबसेट का प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण

Published: April 24, 2020 doi: 10.3791/61008
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1, 1, 1
1Raymond Purves Bone and Joint Research Laboratory, Institute of Bone and Joint Research, Kolling Institute, Royal North Shore Hospital, University of Sydney, 2HTRG - Heidelberg Trauma Research Group, Center for Orthopedics, Trauma Surgery and Spinal Cord Injury, Trauma and Reconstructive Surgery, Heidelberg University Hospital, 3Department of Large Animal Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Michigan State University

Summary

यहां, हम मुरीन ऑस्टियोआर्थराइटिस के एक स्थापित सर्जिकल मॉडल का उपयोग करते हुए, मुरीन तिल्ली, बोन मैरो, लिम्फ नोड्स और सिनोवियल ऊतक के भीतर अतिरिक्त और इंट्रासेलुलर स्टेनिंग परख का उपयोग करके मोनोसाइट/मैक्रोफेज और टी-सेल सबसेट की पहचान करने के लिए एक विस्तृत और प्रजनन योग्य प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

Abstract

ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए) सबसे प्रचलित मस्कुलोस्केलेटल बीमारियों में से एक है, जो दर्द और शारीरिक सीमाओं से पीड़ित रोगियों को प्रभावित करता है। हाल के साक्ष्य रोग के संभावित भड़काऊ घटक को इंगित करता है, जिसमें टी-कोशिकाएं और मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज संभावित रूप से ओए के रोगजनन से जुड़े होते हैं । इसके अलावा अध्ययनों ने दोनों भड़काऊ सेल वंशों के सबसेट के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई, जैसे Th1, Th2, Th17, और टी-नियामक लिम्फोसाइट्स, और M1, M2, और सिनोवियम-ऊतक-निवासी मैक्रोफेज। हालांकि, स्थानीय सिनोवियल और प्रणालीगत भड़काऊ सेलुलर प्रतिक्रिया और संयुक्त में संरचनात्मक परिवर्तन के बीच बातचीत अज्ञात है। पूरी तरह से समझने के लिए कैसे टी कोशिकाओं और मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज OA की ओर योगदान करते हैं, यह महत्वपूर्ण है कि इन कोशिकाओं और उनके सबसेट को एक साथ सिनोवियल ऊतक, माध्यमिक लसीका अंगों और प्रणालीगत (तिल्ली और अस्थि मज्जा) में पहचान करने में सक्षम होना चाहिए । आजकल, विभिन्न भड़काऊ सेल सबसेट सेल-सतह मार्कर के संयोजन से पहचाना जा सकता है जो इन सेलुलर प्रक्रियाओं की जांच में बहु-रंग प्रवाह साइटोमेट्री को एक शक्तिशाली तकनीक बनाते हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम सिनोवियल ऊतक और माध्यमिक लसीका अंगों की फसल के साथ-साथ एकल कोशिका निलंबन की पीढ़ी के बारे में विस्तृत कदमों का वर्णन करते हैं। इसके अलावा, हम मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज और उनके सबसेट के साथ-साथ एक अतिरिक्त और इंट्रा-सेलुलर धुंधला परख की पहचान करने के लिए एक बाह्य रूप से एक बाहुल्य धुंधला परख दोनों को पेश करते हैं ताकि टी-कोशिकाओं और उनके सबसेट की पहचान की जा सके। इस प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण को अनुकूलित और परीक्षण किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप एक अत्यधिक प्रजनन योग्य परख होती है जिसका उपयोग अन्य सर्जिकल और गैर-सर्जिकल ओए माउस मॉडल के लिए किया जा सकता है।

Introduction

ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए) एक दुर्बल और दर्दनाक बीमारी है जिसमें संयुक्त1से जुड़े सभी ऊतकों की विभिन्न विकृतियों को शामिल किया गया है। वैश्विक जनसंख्या का लगभग 3.8% प्रभावित करना2, ओए सबसे प्रचलित मस्कुलोस्केलेटल रोगों में से एक है और यह 20203 तक दुनिया भर में विकलांगता का चौथा प्रमुख कारण बन गया है।3 पोस्ट-ट्रॉमेटिक ओए संयुक्त चोट के बाद होता है और सभी ओए के कम से कम 12% और घुटने4,,5 जैसे अतिसंवेदनशील जोड़ों में ओए के25%तक के लिए खाते हैं। इसके अलावा, संयुक्त चोट ओए के आजीवन जोखिम को पांच गुना से अधिक6से बढ़ाती है। नहीं जाहिरा तौर पर इसी तरह की अस्थिरता के साथ सभी चोटों के लिए OA विकसित करने पर जाना होगा, और इसलिए कारकों है कि ड्राइव दीर्घकालिक OA जोखिम चुनौतीपूर्ण रहता है परिभाषित । यह महत्वपूर्ण है ताकि रोकने के लिए प्रभावी उपचार विकसित करने के लिए और/या पोस्ट दर्दनाक OA का इलाज, जांच और बेहतर चोट विशिष्ट विकृति, कारणों को परिभाषित करने के लिए, और तंत्र है किOA 1के लिए संवेदनशील ।

ओए और इसके परिभाषित उपास्थि विनाश को पहले पूरी तरह से यांत्रिक तनाव के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था और इस प्रकार, ओए को एक गैर-भड़काऊ रोग माना जाता था2। हालांकि, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि सिनोवियल झिल्ली की भड़काऊ घुसपैठ और स्वस्थ नियंत्रण2की तुलना में ओए के साथ रोगियों में सिनोवियल ऊतक में भड़काऊ कोशिकाओं की वृद्धि, ओए में संभावित ड्राइविंग बल के रूप में एक भड़काऊ घटक पर प्रकाश बहा रही है। आगे के अध्ययनों से पता चला है कि सीडी 4 + और सीडी 8 + टी-सेल प्रोफाइल के साथ-साथ जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज दोनों में असामान्यताएं ओए2,,7के रोगजनन में योगदान दे सकती हैं । इन असामान्यताओं की विस्तृत जांच से विभिन्न टी सेल सबसेट2, जैसे Th18, Th29,Th17 8 और टी रेगुलेटरी (ट्रेग)आबादी 10,11केलिए प्रासंगिक भूमिकाओं का पता चला । इस सम्मोहक सबूत के बावजूद, टी-सेल प्रतिक्रियाओं के परिवर्तन और ओए के विकास और प्रगति के बीच कारण संबंध अभी भी अज्ञात2है।

ओए में भूमिका रखने वाली विशिष्ट टी-कोशिकाओं के अलावा, हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि अंतर से ध्रुवीकृत/सक्रिय मैक्रोफेज ओए12के रोगजनन के साथ जुड़े हो सकते हैं । विशेष रूप से, रक्त मोनोसाइट्स से निकलने वाले मैक्रोफेज सिनोवियम में जमा होते हैं और ओए विकास के दौरान शास्त्रीय रूप से सक्रिय मैक्रोफेज (एम 1) या वैकल्पिक रूप से सक्रिय मैक्रोफेज (एम 2) में ध्रुवित होते हैं, जिसका अर्थ है मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज और ओए13के बीच एक संबंध। इसके विपरीत, मैक्रोफेज के कुछ सबसेट विकास के दौरान जल्दी अंगों को पॉप्युलेट करते हैं और मोनोसाइट स्वतंत्र मामले14में अपनी संख्या को स्वयं बनाए रखते हैं। हाल ही में, इन सिनोवियल-टिश्यू-रेजिडेंट मैक्रोफेज (एसटीआरएमएस)14के लिए एक तंग-जंक्शन बैरियर द्वारा मध्यस्थता किए गए एक संयुक्त सुरक्षात्मक समारोह को दिखाया गया था। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि ओए के विकास के दौरान विशेष मैक्रोफेज सबसेट में असामान्यताएं महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती हैं । हालांकि, इस भड़काऊ सेलुलर प्रतिक्रिया और आघात के बाद संयुक्त में संरचनात्मक परिवर्तन के बीच बातचीत अज्ञात है ।

ऐतिहासिक रूप से, सिनोवियल ऊतक में प्रतिरक्षा कोशिकाओं का विश्लेषण इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) या एमआरएनए अभिव्यक्ति तक सीमित था, जो रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर)द्वारा 15,,16तक पहुंचता है। हालांकि, आईएचसी और आरटी-पीसीआर दोनों में कई अलग-अलग सेल प्रकारों और उनके सबसेट को एक साथ पहचानने की क्षमता की कमी है, इस प्रकार, इन तरीकों की प्रयोज्यता को सीमित करना। इसके अलावा, आईएचसी ऊतक के छोटे नमूनों के विश्लेषण तक सीमित है और फोकल भड़काऊ सेल संचय को याद कर सकता है। पिछले कई वर्षों में, विभिन्न सेल प्रकारों के लिए सतह मार्कर के असंख्य विकसित किए गए हैं, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सबसेट अब मज़बूती से इन मार्कर के अलग संयोजनों द्वारा पहचाना जा सकता है। स्थिर तकनीकी प्रगति के कारण, फ्लो साइटोमीटर अब विभिन्न फ्लोरोक्रोम की एक भीड़ की पहचान करने में सक्षम हैं जो बड़े बहुरंगी एंटीबॉडी पैनलों के विश्लेषण को सक्षम करते हैं।

फ्लो साइटोमेट्री जांचकर्ताओं को एक शक्तिशाली तकनीक प्रदान करता है जो एकल कोशिका स्तर पर प्रतिरक्षा कोशिकाओं और उनके सबसेट की एक भीड़ की एक साथ पहचान और मात्राकरण की अनुमति देता है। हमने मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज और उनके सबसेट के साथ-साथ टी-कोशिकाओं और मुरीन तिल्ली, बोन मैरो, लिम्फ नोड्स और सिनोवियल ऊतक के भीतर उनके सबसेट की पहचान करने के लिए एक बाह्य धुंधला परख दोनों को विकसित और अनुकूलित किया है । इस प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण को अनुकूलित और परीक्षण किया गया जिसके परिणामस्वरूप एक अत्यधिक प्रजनन योग्य परख का उपयोग अन्य सर्जिकल और गैर-सर्जिकल ओए माउस मॉडल17के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

उत्तरी सिडनी स्थानीय स्वास्थ्य जिला पशु नैतिकता समिति ने इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित सभी प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी है । चूहों की देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए गाइड के अनुसार रखे और देखभाल कर रहे है (राष्ट्रीय स्वास्थ्य और ऑस्ट्रेलिया के चिकित्सा अनुसंधान परिषद संशोधित २०१०) । सभी प्रयोगों के लिए 10-12 सप्ताह पुराने, पुरुष C57BL/6 चूहों का उपयोग किया गया ।

नोट: पोस्ट-ट्रॉमेटिक ओए को प्रेरित करने के लिए, सही दबाना संयुक्त में मध्यम मेनिस्कस (डीएमएम) की सर्जिकल अस्थिरता का प्रदर्शन किया गया था। इस पशु मॉडल के बारे में विस्तृत जानकारी ग्लासन एट अल18द्वारा प्रकाशित किया गया था । संक्षेप में, आइसोफ्लुन का उपयोग करके एक इंडक्शन कक्ष में सामान्य संज्ञाहरण को प्रेरित किया जाता है और उसके बाद नाक शंकु का उपयोग करके बनाए रखा जाता है। सर्जिकल पैर एक रेजर ब्लेड के साथ मुंडा है और शल्य चिकित्सा साइट धोया और संदूषण को कम करने के लिए इथेनॉल के साथ swabbed है । जानवर तो ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप में ले जाया जाता है और एक बाँझ तौलिया और बाँझ कागज कपड़ा के साथ लिपटी पैर पर रखा शल्य साइट को अलग करने और संदूषण को कम करने के लिए । माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, 0.5 सेमी मध्यम पारा-पटेला आर्थ्रोटॉमी बनाया जाता है, पटेला लक्सटेड पार्श्व रूप से, और इन्फ्रा-पटेला फैट पैड को औसत दर्जे के मेन्को-टिबियल स्नायु को बेनकाब करने के लिए ऊंचा किया जाता है, जिसे विच्छेदन संदंश के साथ स्थानांतरित किया जाता है। संयुक्त को किसी भी रक्त को हटाने के लिए बाँझ नमकीन के साथ निकाल दिया जाता है और घाव तीन परतों में बंद हो जाता है - संयुक्त कैप्सूल, चमड़े के नीचे ऊतक (सीवन सामग्री का उपयोग करके) और त्वचा (सर्जिकल ऊतक गोंद का उपयोग करके)। इस प्रोटोकॉल में वर्णित तरीकों, हालांकि, ओए को प्रेरित करने के लिए अन्य मॉडलों और तरीकों पर लागू किया जा सकता है। ओए को जानवर के दोनों तरफ प्रेरित किया जा सकता है, और ऊतकों की कटाई करते समय, इप्सिलाटेरल (ड्रेनिंग) लिम्फ नोड्स की कटाई करना महत्वपूर्ण है।

1. तिल्ली का अलगाव, कॉन्ट्रालेटरल बोन मैरो, इप्सिल्टरल लिम्फ नोड्स दबाना और सिनोवियल ऊतक को निकालने

  1. सर्वाइकल अपभ्रंश द्वारा माउस को इच्छामृत्यु दें। माउस को एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे एक रीढ़ की स्थिति में रखें और छाती, पेट और पैरों को 70% इथेनॉल के साथ मिटा दें। पेट की लंबाई के लिए त्वचा को सीधे कैंची का उपयोग करके त्वचा को मिडलाइन पर खोलें जिससे पेट की गुहा बरकरार हो।
  2. धीरे-धीरे जानवर के दाईं ओर त्वचा को अंतर्निहित मांसपेशियों से दूर खींचें जिससे त्वचा से जुड़े चमड़े के नीचे एडीपोज ऊतक छोड़ दें। आम तौर पर, अकेले कोमल कर्षण त्वचा को अलग करेगा और मांसपेशियों से अंतर्निहित एडीपोज ऊतक होगा। ऊतकों को कम से कम अलग करने के लिए आवश्यक तनाव को बनाए रखने और लिम्फ नोड्स को नुकसान पहुंचाने की संभावना को कम करने के लिए ठीक कैंची के माध्यम से छिटपुट पालन में कटौती की जानी चाहिए। दो घुमावदार ठीक संदंश का उपयोग करके जांघ पर स्थित आदिपोज ऊतक को धीरे-धीरे चिढ़ाकर तीन जहाजों के एक क्रॉसिंग की पहचान करें। इंगिनल लिम्फ नोड क्रॉसिंग पर स्थित है और इसके ओवोइड आकार और थोड़ा गहरा रंग से पहचाना जा सकता है।
  3. ठीक विच्छेदन संदंश का उपयोग कर इंजिनियल लिम्फ नोड निकालें। कैप्सूल को टूटना न हो, सावधान रहें। बलदंश के साथ लिम्फ नोड की सतह पर शेष वसा को हटा दें।
  4. पेट की गुहा खोलें और तिल्ली की पहचान करें। ठीक कैंची से तिल्ली काट लें। आंतों को धीरे-धीरे खींचें ताकि महाधमनी का पर्दाफाश किया जा सके और इसके विभाजन से उन्हें नुकसान न हो, ताकि संदूषण के जोखिम को कम किया जा सके। इलियाक लिम्फ नोड पेट महाधमनी के टर्मिनल खंड और आम इलियाक धमनी की उत्पत्ति पर स्थित है। सही iliac लिम्फ नोड निकालें और 1.3 में वर्णित के रूप में आगे बढ़ें।
  5. धीरे-धीरे दोनों पिछले अंगों की त्वचा को हटा दें। ब्लेड और ठीक कैंची का उपयोग करके मांसपेशियों के ऊतकों से इसे साफ करके बाएं फीमर को विच्छेदन करें। ध्यान से दबाना और कूल्हे संयुक्त दोनों डिस्कनेक्ट पूरी हड्डी बरकरार छोड़ और फीमर को हटा दें।
  6. सही दबाना संयुक्त के पटेला कण्डरा की पहचान करें, फिर आसपास के मांसपेशियों के ऊतकों को ठीक कैंची का उपयोग करके हटा दें जब तक कि लगभग 5 मिमी क्वाड्रिसेप्स टेंडन समीपस्थ को सामने न आ जाए। इसके बाद, क्वाड्रिसेप्स टेंडन के माध्यम से लगभग 3-4 मिमी समीपस्थ को एक हैंडल बनाने के लिए काटें और ठीक संदंश का उपयोग करके धीरे-धीरे इसे संयुक्त से दूर खींचें। यह संयुक्त कैप्सूल लगाव के किनारों को फीमर दिखाई देगा, और एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करके ध्यान से दोनों तरफ संयुक्त कैप्सूल के किनारों के साथ काटा जाएगा, जो टिबिया की ओर जाने वाले फीमर से शुरू होता है, ताकि काटा जाने वाली सिनोवियल झिल्ली की मात्रा को अधिकतम किया जा सके। जबकि काटने से क्वाड्रिसेप्स टेंडन पर एक सौम्य कर्षण बनाए रखना महत्वपूर्ण है और जब सिनोवियल ऊतक ब्लॉक केवल टिबिया से जुड़ा होता है तो इसे रोकें। इस स्तर पर इंट्राआर्टिकुलर फैट पैड अब पटेला के लिए स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है और ब्लेड का उपयोग करके मेनिसी के संयुक्त और पूर्वकाल पहलू से धीरे-धीरे अलग किया जा सकता है। इसके बाद, सिनोवियल टिश्यू ब्लॉक को हटाने के लिए संयुक्त कैप्सूल (टिबियल भाग) के शेष हिस्से के साथ काटें।
    नोट: विश्वसनीय परिणामों की अनुमति देने के लिए यह कदम बहुत सटीक रूप से किया जाना चाहिए। विच्छेदन को पूरा करने के बाद, "सिनोवियल ऊतक ब्लॉक" में पटेला, पटेला टेंडन, इन्फ्रापेटलर फैट पैड, सुपरा-और इन्फ्रापेटलर अवकाश सिनोवियल अस्तर और संपाश्र्वक स्नायुबंधन के लिए संबद्ध संयुक्त कैप्सूल पूर्वकाल शामिल होना चाहिए। 0.9% खारा समाधान का उपयोग कर विच्छेदन के दौरान सभी ऊतकों को नम रखें।
    नोट: प्रत्येक सिनोवियल ऊतक ब्लॉक नमूना को एक लेबल वाली 24-अच्छी प्लेट के एक अलग कुएं में रखें जिसमें 1.5 मिलीलीटर आरपीएमआई 1640 माध्यम होता है। दो चूहों से एक अच्छी तरह से और पूल ऊतकों में इलियाक और इंगिनल लिम्फ नोड दोनों को मिलाएं।

2. प्रत्येक ऊतक से एकल कोशिका निलंबन की पीढ़ी

नोट: आदेश में दो चूहों से प्रवाह विश्लेषण संश्लेषण ऊतकों के लिए पर्याप्त सेल संख्या सुनिश्चित करने के लिए पूल किया जाना चाहिए । वर्तमान प्रोटोकॉल में, सादृश्य बनाए रखने के लिए एक ही दो चूहों से सभी ऊतकों को पूल करें। इसके अलावा, प्रत्येक जानवर के लिए इलियाक और इंजिनियल लिम्फ नोड्स को जोड़ा गया था जिसके परिणामस्वरूप प्रत्येक नमूने के लिए कुल 4 लिम्फ नोड्स थे। सामान्य तौर पर, एक जानवर से तिल्ली, बोन मैरो और लिम्फ नोड्स में सेल नंबर प्रवाह विश्लेषण करने के लिए पर्याप्त हैं और प्रोटोकॉल लागू किया जा सकता है। हालांकि, केवल एक पशु lysing समय से ऊतकों का उपयोग करते समय समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।

  1. तिल्ली
    1. एक 15 एमएल ट्यूब के शीर्ष पर एक 70 माइक्रोन सेल छलनी पर दो पूल्ड प्लीहा रखें। धीरे-धीरे एक बाँझ 3 एमएल सिरिंज प्लंजर का उपयोग करके जाल फिल्टर के माध्यम से प्लीहा को मैकरेट करें। आरएमआई 1640 मध्यम के कुल 6 एमएल के साथ छन्नी को बार-बार फ्लश करें 10% एफबीएस के साथ पूरक।
    2. कोशिकाओं (500 x ग्राम,5 मिनट, आरटी) को स्पिन करें और लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) लाइसिस बफर के 5 एमएल में गोली को फिर से रखें। आरटी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट और पीबीएस के 10 एमएल के साथ लाइसिस बफर को कमजोर करके प्रतिक्रिया को रोकें। कोशिकाओं (500 x g,5 मिनट, आरटी) स्पिन और इस कदम को दोहराने के एक बार या जब तक कोई और आरबीसी गोली में हैं।
      नोट: जमावित कोशिकाओं को हटाने के लिए lysing के दो दौर के बीच एक नई 15 एमएल ट्यूब में एक 30 माइक्रोन सेल छलनी का उपयोग कर निलंबन रिफ़िल्टर ।
    3. lysing पूरा होने के बाद, कोशिकाओं (500 x g,5 मिनट, आरटी) को स्पिन करें, पीबीएस के 1 एमएल में सुपरनैंट और रिसिपेंड पेलेट को त्यागें। ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन का उपयोग करके हीमोसाइटोमीटर पर जीवित कोशिकाओं की संख्या गिनें।
  2. लिम्फ नोड्स
    1. एक 15 एमएल ट्यूब के शीर्ष पर एक 70 माइक्रोन सेल छलनी पर चार पूल्ड लिम्फ नोड्स रखें। धीरे-धीरे लिम्फ नोड्स को एक बाँझ 3 एमएल सिरिंज प्लंजर के साथ दबाकर एक सेल निलंबन में अलग करें। 10% एफबीएस के साथ आरपीएमआई के कुल 6 एमएल के साथ छन्नी को बार-बार फ्लश करें।
    2. कोशिकाओं को स्पिन करें (500 x ग्राम,5 मिनट, आरटी), सुपरनैंट को त्यागें और पीबीएस के 500 माइक्रोन में गोली को फिर से रखें। जमावित कोशिकाओं को हटाने के लिए एक नई 15 एमएल ट्यूब में 30 माइक्रोन सेल छलनी का उपयोग करके निलंबन को फिर से फाइल करें। ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन का उपयोग करके हीमोसाइटोमीटर पर जीवित कोशिकाओं की संख्या गिनें।
  3. बोन मैरो
    1. ध्यान से एक ऊतक अंगूठे का उपयोग कर बरकरार फीमर समझ यह फ्रैक्चरिंग के बिना संदंश । हड्डी के फ्लशिंग की सुविधा के लिए एक तेज कैंची के साथ समीपस्थ फीमर के बहुत अंत को काट लें। फीमर को चारों ओर घुमाएं और फीमर के इंटरकॉन्डीलर पायदान के बीच में 23 जी सुई की स्थिति रखें। कोमल दबाव लागू करते समय हड्डी गुहा में प्रवेश करने के लिए इंटरकॉन्डीलर पायदान में एक छेद ड्रिल करने के लिए अंगूठे और तर्जनी के बीच सुई घुमाएं।
      नोट: कभी-कभी हड्डी के कण छेद ड्रिलिंग के बाद सुई में बाधा डाल सकते हैं, फ्लशिंग से पहले सुई के परिवर्तन को फ्लश करने के दौरान अनावश्यक उच्च दबाव से बचने के लिए सिफारिश की जाती है।
    2. 15 एमएल ट्यूब पर रखे 70 माइक्रोन सेल छलनी पर 23 जी सुई के साथ 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करके 10% एफबीएस (या फ्लश सफेद हो जाने तक) के साथ आरपीएमआई के 6 एमएल के साथ हड्डी को फ्लश करें। धीरे से एक 3 एमएल सिरिंज के एक प्लंजर के साथ सेल छलनी के माध्यम से अस्थि मज्जा प्रेस और RPMI के एक और 3 एमएल के साथ छलनी कुल्ला ।
      नोट: हड्डियों सफेद दिखाई देना चाहिए एक बार सभी मज्जा पूरी तरह से बाहर निकाल दिया गया है ।
    3. कोशिकाओं (500 x g,5 मिनट, आरटी) स्पिन और आरबीसी लाइसिस बफर के 5 एमएल में गोली resuspend। आरटी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट और पीबीएस के 10 एमएल के साथ लाइसिस बफर को कमजोर करके प्रतिक्रिया को रोकें।
    4. कोशिकाओं को स्पिन करें (500 x ग्राम,5 मिनट, आरटी), सुपरनैंट को त्यागें और पीबीएस के 1 एमएल में गोली को फिर से रखें। जमावित कोशिकाओं को हटाने के लिए एक नई 15 एमएल ट्यूब में 30 माइक्रोन सेल छलनी का उपयोग करके निलंबन को फिर से फाइल करें। ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन का उपयोग करके हीमोसाइटोमीटर पर जीवित कोशिकाओं की संख्या गिनें।
  4. सिनोवियल ऊतक
    1. एक ठीक सर्जिकल कैंची के साथ छोटे टुकड़ों में दो सिनोवियल ऊतक ब्लॉक पासा। नमूनों को माध्यम के साथ 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। शेष कोशिकाओं और सिनोवियल ऊतकों को प्राप्त करने के लिए आरपीएमआई के अतिरिक्त 0.5 एमएल के साथ पुराने कुएं को कुल्लाएं, फाल्कन ट्यूब (अंतिम मात्रा 2 एमएल) में स्थानांतरित करें।
      टिप: एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करें और टिप के कट जहां व्यास इस चरण में चौड़ा होता है।
    2. निर्माता निर्देशों (जैसे, लिबेरास) के अनुसार एंजाइम और एलिकोट का पुनर्गठन करें। 1 यूनिट/एमएल (प्रति नमूना कुल 2 यूनिट) की अंतिम एकाग्रता के परिणामस्वरूप पर्याप्त एंजाइम जोड़ें। एक मैक रोटेटर का उपयोग कर 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पचा।
    3. एक नई 15 एमएल ट्यूब में एक 70 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से 10% एफबीएस और फिल्टर सेल निलंबन के साथ आरपीएमआई के 8 एमएल जोड़कर पाचन बंद करो। नई ट्यूब (15 एमएल अंतिम मात्रा) में एक ही सेल छलनी के माध्यम से 10% एफसीएस माध्यम और फिल्टर सेल निलंबन के साथ आरपीएमआई के एक और 5 एमएल के साथ पुराने 15 एमएल ट्यूब कुल्ला।
    4. कोशिकाओं को स्पिन करें (500 x ग्राम,10 मिनट, आरटी), सुपरनैंट को त्यागें और पीबीएस के 500 माइक्रोन में गोली को फिर से रखें। ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन का उपयोग करके हीमोसाइटोमीटर पर जीवित कोशिकाओं की संख्या गिनें।

3. कोशिकाओं का आवंटन

  1. ऊतक, पशु आईडी, और नामित एंटीबॉडी पैनल के प्रकार के साथ दो ९६-अच्छी तरह से प्लेटें (यू-बॉटम आकार) लेबल । इस प्रोटोकॉल में कुल दो एंटीबॉडी पैनलों का उपयोग किया जाता है: मोनोसाइट सबसेट पैनल (एक्सपेरिमेंटल स्टेनिंग) और टी-सेल सबसेट पैनल (अतिरिक्त और इंट्रासेलुलर स्टेनिंग)।
  2. संबंधित एकल कोशिका निलंबन का उपयोग करके प्रति अच्छीतरह 5 x 10 5 कोशिकाएं प्रदान करें।
    नोट: प्रयोग स्थापित करते समय, प्रति समूह और ऊतक प्रकार की अपेक्षा की जाने वाली कोशिकाओं की पूर्ण संख्या का आकलन करें (इलाज किए गए जानवरों में नियंत्रण जानवरों की तुलना में ऊतकों में उच्च कोशिका गणना होती है)। एकल सेल निलंबन पैदा करने के अंतिम चरण के दौरान सेल पेलेट को फिर से खर्च करते समय, 5 x 105 प्रति 200 माइक्रोन की एकाग्रता के साथ समाप्त करने के लिए पीबीएस की उचित मात्रा चुनें। यहां उपयोग की जाने वाली 96-अच्छी प्लेट अधिकतम 300 माइक्रोन पकड़ सकती है और आमतौर पर, 200 माइक्रोन बिखराव के कारण क्रॉस-संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए आदर्श है।
  3. प्रत्येक पैनल और ऊतक प्रकार के लिए, कुओं में अन दाग नियंत्रण के रूप में कम से कम 5 x10 5 कोशिकाओं को वितरित करें जिन्हें स्पष्ट रूप से चिह्नित किया गया है।

4. मोनोसाइट सबसेट पैनल

  1. व्यवहार्यता धुंधला प्रदर्शन करें: प्लेट स्पिनर का उपयोग करके स्पिन कोशिकाएं (500 x ग्राम,5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) और कोशिकाओं को एक बार 1x पीबीएस के 200 माइक्रोन के साथ धोएं। 1x पीबीएस में 1:50 पतला सेल-अभेद्य अमीन-प्रतिक्रियाशील डाई (व्यवहार्यता दाग) का एक स्टॉक समाधान तैयार करें। इसके बाद, इस स्टॉक समाधान के 100 माइक्रोन के साथ सेल छर्रों को फिर से रखें जिसके परिणामस्वरूप प्रति अच्छी तरह से व्यवहार्यता दाग के 2 माइक्रोन की पूर्ण मात्रा होती है। प्रकाश से संरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    नोट: आवश्यक व्यवहार्यता दाग की इष्टतम मात्रा एक खुराक टिटरेशन वक्र प्रदर्शन करके निर्धारित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, पतला व्यवहार्यता दाग स्टॉक समाधान एक ही दिन में इस्तेमाल किया जाना चाहिए और संग्रहीत नहीं किया जाना चाहिए। कैसे पुनर्गठन, पतला और व्यवहार्यता दाग स्टोर करने के बारे में अधिक जानकारी के लिए निर्माता के निर्देशों को देखें ।
  2. इनक्यूबेशन के दौरान, FACS बफर (Ca2 + और Mg + मुक्त PBS जिसमें 0.1% बीएसए और 0.02% सोडियम एजाइड) की उचित मात्रा में एंटीबॉडी का कॉकटेल तैयार करें। कोशिकाओं को 200 माइक्रोन के साथ दो बार धोएं FACS बफर, अपकेंद्रित्र (500 x g, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) और एंटीबॉडी मिश्रण या उचित नियंत्रण मिश्रण के 100 माइक्रोन के साथ प्रत्येक गोली को फिर से ढंढे। प्रकाश से सुरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    नोट: कृपया ध्यान रखें कि सोडियम अज़ाइड कोशिकाओं के लिए विषाक्त है। वर्तमान प्रोटोकॉल में प्रवाह बफर में सोडियम एजाइड की एकाग्रता बहुत कम है (0.02%) और नमूने इस प्रकार धुंधला होने के तुरंत बाद चलाए जाते हैं, जिससे कोई समस्या नहीं होती है। यदि सॉर्ट कोशिकाओं के डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक परख की योजना बनाई जाती है, तो प्रयोगों के प्रत्येक दिन ताजा FACS बफर बनाना फायदेमंद हो सकता है और किसी भी सोडियम अज़ाइड का उपयोग नहीं कर सकता है। एंटीबॉडी की एक भीड़ का उपयोग करते समय, परिणामों को बढ़ाने के लिए एंटीबॉडी के कॉकटेल में "शानदार दाग बफर" की उचित मात्रा जोड़ने की सलाह दी जाती है।
  3. कोशिकाओं को FACS बफर के 200 माइक्रोन के साथ दो बार धोएं और FACS + EDTA बफर (FACS बफर युक्त 1 m EDTA) के 250 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। नमूनों को लेबल किए गए एफएस ट्यूबों में स्थानांतरित करें। नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें और अधिग्रहण तक प्रकाश से सुरक्षित रहें।
    नोट: प्रतिरक्षा कोशिकाओं में चिपचिपा होने की प्रवृत्ति होती है। रुकावट और डबल्स की संख्या दोनों को कम करने के लिए अंतिम प्रवाह बफर में 1 एमएम ईडीटीए जोड़ने की सिफारिश की जाती है।

5. टी सेल सबसेट पैनल

  1. व्यवहार्यता धुंधला प्रदर्शन करें: प्लेट स्पिनर का उपयोग करके स्पिन कोशिकाएं (500 x ग्राम,5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) और कोशिकाओं को एक बार 1x पीबीएस के 200 माइक्रोन के साथ धोएं। 1x पीबीएस में 1:50 पतला सेल-अभेद्य अमीन-प्रतिक्रियाशील डाई (व्यवहार्यता दाग) का एक स्टॉक समाधान तैयार करें। इसके बाद, इस स्टॉक समाधान के 100 माइक्रोन के साथ सेल छर्रों को फिर से रखें जिसके परिणामस्वरूप प्रति अच्छी तरह से व्यवहार्यता दाग के 2 माइक्रोन की पूर्ण मात्रा होती है। प्रकाश से संरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  2. नमूनों को इनक्यूबेटिंग करते समय, 1x एफएएफएस बफर की उचित मात्रा में एक्स्ट्रासेलुलर स्टेनिंग एंटीबॉडी कॉकटेल तैयार करें। कोशिकाओं को 1x FACS बफर के 200 माइक्रोन के साथ दो बार धोएं, उन्हें नीचे स्पिन करें (500 x g,5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) और एंटीबॉडी मिश्रण या उचित नियंत्रण मिश्रण के 100 माइक्रोन के साथ प्रत्येक गोली को फिर से खर्च करें। प्रकाश से सुरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  3. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एक निर्धारण और पारमेबिलाइजेशन किट के साथ इंट्रासेलुलर धुंधला प्रदर्शन करें। कोशिकाओं को 1x FACS बफर के 200 माइक्रोन के साथ दो बार धोएं और 200 माइक्रोन में पुनर्सीमां को पुनर्निर्भर करें। प्रकाश से सुरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  4. इनक्यूबेशन के दौरान, 1x पर्मेबिलाइजेशन और वॉश बफर की उचित मात्रा में एंटीबॉडी (इंट्रासेलुलर स्टेनिंग) का कॉकटेल तैयार करें। कताई (750 x ग्राम,5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) और 1x perm/वॉश बफर के 200 माइक्रोन के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं।
    नोट: निर्धारण और पारशीलता कोशिकाओं में परिणाम है कि थोड़ा ठीक से गोली के लिए कठिन हो जाते हैं । बाद में धोने के चरणों के दौरान सेल हानि को कम करने के लिए, अपकेंद्रित्र बल को 750 x ग्रामतक बढ़ाएं। वैकल्पिक रूप से एक लंबा कताई चक्र भी लागू किया जा सकता है। हालांकि, यह एक काफी लंबे समय है कि कोशिकाओं को तैयार करने की जरूरत है में परिणाम होगा ।
  5. स्पिन कोशिकाएं (750 x ग्राम,5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) और प्रत्येक गोली को एंटीबॉडी मिश्रण या उचित नियंत्रण मिश्रण के 100 माइक्रोल के साथ फिर से व्यतीत करें। प्रकाश से सुरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  6. कोशिकाओं को 1x perm/वॉश बफर के 200 माइक्रोन के साथ दो बार धोएं और FACS + EDTA बफर के 250 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। नमूनों को लेबल किए गए एफएस ट्यूबों में स्थानांतरित करें। नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें और अधिग्रहण तक प्रकाश से सुरक्षित रहें।
    नोट: प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए इष्टतम एकाग्रता को खुराक टिटरेशन वक्र करके निर्धारित करने की आवश्यकता होती है। एंटीबॉडी के बीच एकाग्रता काफी भिन्न हो सकती है: सीडी 3 और सीडी 80 का उपयोग 1:1 के कमजोर पड़ने के कारक के साथ किया गया था, जबकि सीडी 11बी और सीडी 4 का उपयोग 1:6400 के कमजोर पड़ने वाले कारक के साथ किया गया था। एंटीबॉडी एकाग्रता को टिटरिंग करते समय प्रयोगों के दौरान उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं की एक ही संख्या का उपयोग करें।

6. मुआवजा, उचित नियंत्रण और गेटिंग

  1. प्रयोग की स्थापना
    1. एक बार इष्टतम एंटीबॉडी एकाग्रता निर्धारित किया गया है स्पेक्ट्रल ओवरलैप के लिए समायोजित करने के लिए मुआवजे के लिए दाग और एकल दाग नियंत्रण चलाते हैं।
      नोट: दोनों कोशिकाओं और मुआवजा मोती के साथ सभी मुआवजा नियंत्रण चलाएं । मुआवजे के लिए प्रतिभाशाली परिणाम (सकारात्मक घटनाओं के उच्चतम एमएफआई) उत्पन्न करने वाले किसी भी कार्य का उपयोग करें। एमएफआई मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता के लिए खड़ा है और अक्सर उत्पन्न संकेत की औसत तीव्रता का वर्णन और परिभाषित करने के लिए उपयोग किया जाता है और इस प्रकार, एंटीबॉडी अभिव्यक्ति का स्तर।
    2. एक नया बहुरंगी प्रयोग शुरू करते समय फ्लोरेसेंस माइनस वन (एफएमओ) नियंत्रण और आइसोटाइप नियंत्रण चलाएं। एफएमओ के बारे में अधिक जानकारी पहले19प्रकाशित की गई है ।
    3. प्रत्येक ऊतक प्रकार के अन दाग नियंत्रण में ल्यूकोसाइट आबादी का पता लगाने के लिए इष्टतम फॉरवर्ड स्कैटर एरिया (एफएससी-ए) वोल्टेज और साइड स्कैटर एरिया (एसएससी-ए) वोल्टेज का निर्धारण करें।
      नोट: निर्धारण और पारमेबिलाइजेशन प्रक्रिया सेल के आयामों को बदल देती है। इस प्रकार, मोनोसाइट सबसेट पैनल और टी सेल सबसेसेट पैनल के लिए एफएससी-ए और एसएससी-ए वोल्टेज काफी भिन्न होते हैं। टी सेल सबसेट पैनल के लिए इष्टतम वोल्टेज खोजने के लिए, एफएससी-ए और एसएससी-ए मूल्यों को समायोजित करते हुए ल्यूकोसाइट आबादी की ओर सीडी 3 और बैक गेट के साथ एकल दाग वाली कोशिकाओं का उपयोग करें।
  2. गेटिंग रणनीति
    1. एक बार इष्टतम एफएससी-ए और एसएससी-ए वोल्टेज निर्धारित हो जाने के बाद, ल्यूकोसिट आबादी पर एक प्राथमिक गेट स्थापित करें।
      नोट: प्रत्येक प्रयोग से पहले निर्माता के निर्देशों के अनुसार अंशांकन मोतियों का उपयोग करके साइटोमीटर को कैलिब्रेट करें और अन दाग मोती चलाएं। विभिन्न समय बिंदुओं की ल्यूकोसाइट आबादी में तुलनीय एफएससी और एसएससी गुण होने चाहिए (ऊतक प्रकारों के बीच मामूली अंतर अपेक्षित और सामान्य हैं)। यदि एफएससी और एसएससी काफी परेशानी साइटोमीटर और नमूना पीढ़ी को गोली मार बदलता है।
    2. डबल्स को बाहर करें: प्लॉट एफएससी-ए (वाई-एक्सिस) और एफएससी-एच (एक्स-एक्सिस)। सिंगल्स इस साजिश के विकर्ण के रूप में दिखाई देते हैं। सिंगल्स पर गेट।
    3. मृत सेल को बाहर करें: प्लॉट FVS510 (व्यवहार्यता दाग) (एक्स-एक्सिस) और एफएससी-ए (वाई-एक्सिस)। मृत कोशिकाओं सकारात्मक घटनाओं के रूप में दिखाई देगा, इस प्रकार जीवित कोशिकाओं पर गेट ।
      नोट: यह सच है नकारात्मक कोशिकाओं को दाग नियंत्रण में दिखाई देगा । इस प्रकार, दाग नमूनों से पहले दाग नियंत्रण चलाते समय नमूनों के प्रत्येक सेट के लिए इस गेट को समायोजित करें। आगे गेटिंग एंटीबॉडी पैनल और सेल प्रकार पर निर्भर करता है जिसकी जांच की जाती है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक पैनल के लिए गेटिंग रणनीतियां क्रमशः चित्र 1 और चित्रा 4में पाई जा सकती हैं।

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Representative Results

दोनों मोनोसाइट सबसेट पैनल और टी सेल सबसेट पैनल से प्रतिनिधि परिणाम नीचे वर्णित हैं ।

चित्रा 1 डीएमएम इलाज जानवरों के अस्थि मज्जा से इकट्ठे हुए प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर मोनोसाइट सबसेट पैनल के लिए पदानुक्रमित गेटिंग रणनीति दिखाता है। इसी रणनीति का उपयोग अन्य सभी ऊतक प्रकारों में किया और सत्यापित किया गया था। प्रयोग की स्थापना करते समय, प्रत्येक ऊतक प्रकार के लिए मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज की पहचान करने और टी-कोशिकाओं और मलबे (जी1) को बाहर करने के लिए फॉरवर्ड स्कैटर एरिया (एफएससी-ए) और साइड स्कैटर एरिया (एसएससी-ए) वोल्टेज निर्धारित किया गया था । प्रत्येक प्रयोग के दौरान, प्रत्येक ऊतक प्रकार के अन दाग नियंत्रण का विश्लेषण किया गया, और आवश्यक होने पर एफएससी-ए और एसएससी-ए वोल्टेज समायोजित किया गया। वोल्टेज समय के साथ समान रहने की उम्मीद है, अगर मापदंडों में तेजी से गिरावट साइटोमीटर की रुकावट की संभावना है। इसके अलावा, बेसड नियंत्रण मृत के लिए सच नकारात्मक निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया/Figure 2A प्रयोग को डिजाइन करते समय, फ्लोरोक्रोम को सावधानीपूर्वक चुना जाना चाहिए, और सामान्य रूप से कम अभिव्यक्ति वाले सतह मार्कर को उज्ज्वल फ्लोरोक्रोम के साथ जोड़ा जाता है (उदाहरण के लिए, यहां एलेक्सा फ्लोर 647 का उपयोग CD206 के लिए किया गया था)। विभिन्न मृत/जीवित दाग मौजूद हैं जिन्हें विभिन्न तरंगदैर्ध्य द्वारा पता लगाया जा सकता है; यहां, FVS510 का उपयोग किया गया था।

चित्रा 3 प्रतिरक्षा कोशिकाओं से नमूना डेटा दिखाता है जो सिनोवियल ऊतकों से अलग होता है और जानवरों को डीएमएम या नकली-नियंत्रण सर्जरी प्राप्त करने के 6 सप्ताह बाद बाह्य सतह मार्कर के साथ दाग दिया जाता है। सभी सबसेट आसानी से अध्ययन और नियंत्रण जानवरों दोनों में प्रोटोकॉल का उपयोग कर की पहचान की जा सकती है । विशेष रूप से, मैक्रोफेज सबसेट (डीएमएम समूह में Ly-6C+/MHC-II-मैक्रोफेज (G7) का उच्च प्रतिशत और एम 1 और एम 2 मैक्रोफेज (डीएमएम समूह में एम2 मैक्रोफेज का उच्च प्रतिशत) के लिए समूहों के बीच मतभेद देखा जा सकता है।

चित्रा 4 डीएमएम इलाज जानवरों की तिल्ली से अलग प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर अतिरिक्त और इंट्रासेल्युलर टी-सेल पैनल के लिए पदानुक्रमित गेटिंग रणनीति की कल्पना करता है। सिद्धांत मोनोसाइट पैनल के लिए उपयोग किए जाने वाले लोगों के समान हैं। हालांकि, फिक्सिंग और पारमेबिलाइजेशन प्रक्रिया कोशिकाओं के आकार और घनत्व को बदलती है। इस प्रकार, प्रत्येक सेल प्रकार के लिए प्रयोग स्थापित करते समय सीडी 3 + कोशिकाओं से बैक-गेटिंग प्रक्रिया का उपयोग करके विशिष्ट एफएससी और एसएससी मापदंडों का निर्धारण किया जाना चाहिए। कुछ फ्लोरोक्रोम समय के साथ कुल होते हैं (उदाहरण के लिए, पीई जिसका उपयोग फॉक्सपी 3 के साथ किया गया था)। एग्रीगेट्स संभावित रूप से उच्च चमक के कारण परिणामों को संशोधित कर सकते हैं जो स्पेक्ट्रल-ओवरलैप और मुआवजे को प्रभावित करता है। इस प्रकार, सभी एंटीबॉडी को हर बार उनके उपयोग से पहले भंवर में डाले गए थे ताकि एकत्रित होने के लिए उनका उपयोग किया जा सके। इसके अतिरिक्त, एग्रीगेट्स (जी-2) के प्रभाव को और कम करने के लिए एक गेटिंग रणनीति का उपयोग किया गया था। प्रयोगों की स्थापना के दौरान फ्लोरेसेंस माइनस एक नियंत्रण (एफएमओ) प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए किया गया था । नमूना डेटा चित्रा 2बी, 2Cमें दिखाया गया है ।

चित्रा 5 और चित्रा 6 प्रतिरक्षा कोशिकाओं को दिखाते हैं जो लिम्फ नोड्स(चित्रा 5)और सिनोवियल ऊतक(चित्रा 6)से अलग थे और टी-सेल पैनल प्रोटोकॉल का उपयोग करके दाग दिए गए थे 4 सप्ताह बाद जानवरों को या तो डीएमएम या नकली-नियंत्रण सर्जरी प्राप्त हुई। डेटा दोनों ऊतकों में डीएमएम जानवरों (G9) में Th1 कोशिकाओं का एक उच्च प्रतिशत से पता चलता है । इसके अलावा, टी-नियामक कोशिकाओं (G11) और Th17 कोशिकाओं (G12) के लिए इंट्रासेलुलर धुंधला प्रोटोकॉल का उपयोग करके सफल है और समूहों के बीच मतभेदों का पता लगाया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज और उनके सबसेट की पहचान करने के लिए एक्सट्रासेलुलर स्टेनिंग का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्री पदानुक्रमित गेटिंग रणनीति। माइलॉयड कोशिकाओं की मुख्य रूप से एक फॉरवर्ड/साइड स्कैटर (एफएससी-ए और एसएससी-ए) डॉट प्लॉट (जी1) का उपयोग करके पहचाना जाता है । इसके बाद, एफएससी-ए और एफएससी-एच (जी-2) का उपयोग करके सिंगल्स का पता लगाया जाता है और बाद में लाइव कोशिकाओं (जी 3) का चयन किया जाता है। जी 3 से कोशिकाओं को मोनोसाइट/मैक्रोफेज (G5a) के लिए न्यूट्रोफिल (G4) और CD11b की पहचान करने के लिए Ly-6G का उपयोग करके आगे वर्गीकृत किया जाता है । MHC-II का उपयोग CD11b सकारात्मक कोशिकाओं के बीच डेंड्रिटिक कोशिकाओं (G5b) की पहचान करने के लिए किया जाता है और F4/80 का उपयोग मैक्रोफेज (G6) और मोनोसाइट्स (G12) के बीच चयन करने के लिए किया जाता है। मैक्रोफेज को आगे Ly-6C और MHC-II (Ly-6C+/MHC-II-मैक्रोफेज (G7) का उपयोग करके उनके सबसेट में वर्गीकृत किया जाता है; Ly-6C-/MHC-II-ऊतक निवासी मैक्रोफेज (जी-8); Ly-6C-/MHC-II + रक्त की उत्पत्ति मैक्रोफेज (G9)) से हुई । सीडी 206 और सीडी 80 (M1: CD80+/CD206- (G10) का उपयोग करके मैक्रोफेज और इसके संबंधित सबसेट की संपूर्णता से अधिक सबसेट का चयन किया जा सकता है; M2: CD80-/CD206 + (G11)) । मोनोसाइट्स को आगे एमएचसी-II और सीडी 11सी (एमएचसी-II-/CD11c-मोनोसाइट्स (G13) का उपयोग करके वर्गीकृत किया जाता है; MHC-II+/CD11c-मोनोसाइट्स (G14)) । सक्रियण के स्तर को तब Ly-6C की अभिव्यक्ति का उपयोग करके वर्गीकृत किया जाता है और कम (G15), मध्यम (G16) और उच्च (G17) में विभाजित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: मोनोसाइट और टी-सेल पैनल दोनों में उचित नियंत्रण को दर्शाते हुए नमूना डेटा। (क)सिनोवियल ऊतक को 6 सप्ताह बाद काटा गया था या तो डीएमएम-सर्जरी (डीएमएम) या नकली-नियंत्रण-सर्जरी (नकली) और एक एकल सेल निलंबन को बाह्य सतह मार्कर का उपयोग करके दाग दिया गया था। प्रत्येक प्रयोग के दौरान अन दाग कोशिकाओं को मृत/जीवित दाग के लिए सही नकारात्मक निर्धारित करने के लिए और फाटक (नियंत्रण) सेट करने के लिए इस्तेमाल किया गया । अन दाग कोशिकाओं का उपयोग कर फाटकों की स्थापना पैनल ए में दिखाया गया है(बी + सी)तिल्ली कोशिकाओं अनुपचारित नियंत्रण जानवरों से काटा गया था, एक एकल सेल निलंबन उत्पन्न और दोनों अतिरिक्त और इंट्रासेलर मार्कर का उपयोग कर दाग । फ्लोरोसेंट-माइनस-वन (एफएमओ) नियंत्रण केवल एक एंटीबॉडी लापता पूरे एंटीबॉडी पैनल के साथ कोशिकाओं को धुंधला करके उत्पन्न किए गए थे। नमूना डेटा दोनों इंट्रासेलुलर एंटीबॉडी के लिए दिखाया गया है। (B)एफएमओ-आरओआरजीटी और(C)एफएमओ-फॉक्स-पी 3 । एफएमओ दोनों पैनलों के लिए प्रदर्शन किया गया था और प्रत्येक गेट सेट करने के लिए इस्तेमाल किया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: चूहों के सिनोवियम से अलग मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज का एक्सपेरिमेंटल धुंधला। चूहों को या तो डीएमएम-सर्जरी (डीएमएम) या नकली-नियंत्रण-सर्जरी (नकली) प्राप्त होने के 6 सप्ताह बाद नमूना ऊतक एकत्र किए गए थे। उपयोग किए गए द्वारों के बारे में अधिक जानकारी चित्र 1में पाई जा सकती है । नमूना डेटा से पता चलता है कि सभी सबसेट मज़बूती से पहचाना जा सकता है और समूहों के बीच मतभेद देखा जा सकता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: टी-कोशिकाओं और उनके सबसेट की पहचान करने के लिए अतिरिक्त और इंट्रासेलुलर स्टेनिंग दोनों का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्री पदानुक्रमित गेटिंग रणनीति। टी-सेल की मुख्य रूप से फॉरवर्ड/साइड स्कैटर (एफएससी-ए और एसएससी-ए) डॉट प्लॉट (जी1) का उपयोग करके पहचान की जाती है । उपयोग किए गए एंटीबॉडी समुच्चय की प्रकृति के कारण सीडी 3 और सीडी 4 (जी-2) का उपयोग करके बाहर रखा जाना चाहिए। इसके बाद, एफएससी-ए और एफएससी-एच (जी 3) का उपयोग करके सिंगल्स का पता लगाया जाता है और बाद में लाइव कोशिकाओं का चयन किया जाता है (जी 4)। टी-सेल (G6) की पहचान करने के लिए प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं (G5) और CD3 की पहचान करने के लिए NK1.1 का उपयोग करके जी-4 से कोशिकाओं को आगे वर्गीकृत किया जाता है। सक्रियण का स्तर CD69 (G6b) का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है। इसके बाद, सीडी 4 और सीडी 8 का उपयोग टी-किलर कोशिकाओं (सीडी 4-/सीडी8 + (G7)) और टी-हेल्पर कोशिकाओं (CD4+/CD8- (G8)) की पहचान करने के लिए किया जाता है। टी-हेल्पर कोशिकाओं को सी-एक्स-सीआर 3 (सीडी183) और सीसीआर4 (सीडी194) का उपयोग करके टी-1 (सी-एक्स-सीआर3+/सीसीआर4-(जी9)) और टीएच-2 कोशिकाओं (सी-एक्स-सीआर 3-/सीसीआर4+ (जी10)) में वर्गीकृत किया जाता है। इसके अलावा, Th-17 कोशिकाओं (CD25+/RORgt + (G11)) और टी नियामक कोशिकाओं (CD25+/Fox-P3 + (G12)) इंट्रासेलर मार्कर का उपयोग कर की पहचान कर रहे हैं । इसके अलावा, मेमोरी सेल सबसेट की पहचान टी-हेल्पर कोशिकाओं से की जाती है, जिसमें सीडी 44 और सीडी 62एल (सीडी 44-/सीडी62एल + भोले टी-मेमोरी कोशिकाएं (G13); CD44+/CD62L + केंद्रीय टी-मेमोरी कोशिकाएं (G14); CD44+/CD62L-इफेक्टर टी-मेमोरी सेल (G15)) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: चूहों के लिम्फ नोड्स को निकालने से अलग टी-कोशिकाओं का बाह्राश और इंट्रासेलुलर धुंधला। चूहों को या तो डीएमएम-सर्जरी (डीएमएम) या नकली-नियंत्रण-सर्जरी (नकली) प्राप्त होने के 4 सप्ताह बाद नमूना ऊतक एकत्र किए गए थे। उपयोग किए गए द्वारों के बारे में अधिक जानकारी चित्र 4में पाई जा सकती है । नमूना डेटा से पता चलता है कि सभी सबसेट मज़बूती से पहचाना जा सकता है और समूहों के बीच मतभेद देखा जा सकता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: चूहों के सिनोवियल ऊतक से अलग टी-कोशिकाओं के बाह्य और इंट्रासेलर धुंधला। चूहों को या तो डीएमएम-सर्जरी (डीएमएम) या नकली-नियंत्रण-सर्जरी (नकली) प्राप्त होने के 4 सप्ताह बाद नमूना ऊतक एकत्र किए गए थे। उपयोग किए गए द्वारों के बारे में अधिक जानकारी चित्र 4में पाई जा सकती है । नमूना डेटा से पता चलता है कि सभी सबसेट मज़बूती से पहचाना जा सकता है और समूहों के बीच मतभेद देखा जा सकता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में वर्णित तरीकों को डिजाइन किया गया है और मज़बूती से दोनों मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज और टी-कोशिकाओं से मुरीन तिल्ली, अस्थि मज्जा, लिम्फ नोड्स, और ओस्टियोआर्थराइटिस (ओए) के एक मुरीन मॉडल में सिनोवियल ऊतक से विभिन्न सबसेट की पहचान करने के लिए परीक्षण किया गया है । वर्तमान प्रोटोकॉल को एंटीबॉडी का आदान-प्रदान करके विभिन्न ऊतक प्रकारों, या अन्य सेल प्रकारों की जांच करने के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है, और ओए के वैकल्पिक मुरीन मॉडल के लिए उपयोग किया जा सकता है। अन्य ऊतक प्रकारों का परीक्षण करते समय, प्रत्येक एंटीबॉडी की विशिष्टता का परीक्षण करना महत्वपूर्ण है क्योंकि प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सतह मार्कर की अभिव्यक्ति प्रत्येक ऊतक20में भिन्न होती है। इसके अलावा, एंटीबॉडी का आदान-प्रदान करते समय, एंटीबॉडी की इष्टतम एकाग्रता स्थापित करने के साथ-साथ स्पेक्ट्रल ओवरलैप में परिवर्तन को संबोधित करने के लिए क्षतिपूर्ति प्रक्रिया को दोहराने के लिए एक खुराक टिटरेशन वक्र करना आवश्यक है।

वर्तमान प्रोटोकॉल में, ओए को डीएमएम माउस मॉडल18का उपयोग करके प्रेरित किया गया था। सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले और स्थापित पशु मॉडल माउस में हैं, क्योंकि यह प्रजातियां पोस्ट-ट्रॉमेटिक ओए17के रोगविज्ञान की जांच करने में कई गुना लाभ प्रदान करती हैं। विशेष रूप से माउस में, सर्जिकल और गैर-सर्जिकल ओए मॉडल17वर्णित किए गए हैं: औसत दर्जे के मेनिस्कस (डीएमएम) का सबसे आम अस्थिर होना, पूर्वकाल क्रूसिएट स्नायुबंधन (एसीएलटी) का सर्जिकल ट्रांसबेक्शन और गैर-सर्जिकल एसीएल टूटना (एसीएलआर), क्रमशः21। इन सभी पशु मॉडल अच्छी तरह से पोस्ट की विकृति में सेलुलर सूजन की भूमिका में जांच के लिए अनुकूल है दर्दनाक OA और वर्तमान प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक प्रयोगशाला में सभी पहले उल्लेख पशु मॉडल के लिए परीक्षण किया गया है । यद्यपि उपरोक्त सभी पशु मॉडल स्थापित किए गए हैं और साहित्य में वर्णित किए गए हैं, प्रत्येक की अपनी ताकत और सीमाएं हैं जिन पर कहीं और विस्तार से चर्चा की गई है17 और इसलिए केवल संक्षेप में नीचे चर्चा की जाती है। सभी सर्जिकल मॉडल सर्जिकल दृष्टिकोण, घाव भरने की प्रक्रिया और उससे जुड़ी भड़काऊ प्रतिक्रिया के अधीन हैं। पोस्ट-ट्रॉमेटिक ओए के विकास में भड़काऊ कोशिकाओं के योगदान का आकलन करते समय, यह भड़काऊ घाव उपचार प्रतिक्रिया एक भ्रमित के रूप में काम कर सकती है, विशेष रूप से हस्तक्षेप के बाद शुरुआती समय बिंदुओं के दौरान। इसके अलावा, जानवरों के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए डीएमएम और एसीएलटी प्रक्रियाओं को बहुत मानकीकृत तरीके से संचालित करने की आवश्यकता है। एसीएलटी सर्जरी डीएमएम सर्जरी की तुलना में सीखना बहुत अधिक कठिन है और डीएमएम की तुलना में अधिक सर्जिकल एक्सपोजर की आवश्यकता होती है ताकि केवल एसीएल को चोट की पहचान की जा सके और उसे चोट सुनिश्चित की जा सके और अन्य संयुक्तऊतकोंको iatrogenic क्षति से बचा जा सके । गैर-सर्जिकल एसीएल टूटना पोस्ट-ट्रॉमेटिक ओए को प्रेरित करने का एक मानकीकृत और बहुत कुशल तरीका है। हालांकि, एक विशेष उपकरण जो फ्लेक्स घुटने के टिबिया के लिए एक नियंत्रित एकल संपीड़न लोड लागू करता है आवश्यक है। तुलनीय और विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए इस डिवाइस को कैलिब्रेट और परीक्षण किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, एसीएलआर मॉडल चूहों में बहुत गंभीर और प्रगतिशील संयुक्त क्षति को प्रेरित करता है जिसमें पीछे के मध्यीय टिबियल पठार 22 के चिह्नित क्षरण के साथ मनुष्यों सहित अन्य प्रजातियों में एसीएल चोट के साथ नहींदेखा जाता है।

ओए के विकास के दौरान भड़काऊ प्रक्रिया और इसके सेलुलर घटक को व्यापक रूप से चित्रित करने के लिए, न केवल सिनोवियल ऊतक की जांच करना वांछनीय है, बल्कि स्थानीय लिम्फ नोड्स के साथ-साथ तिल्ली और बोन मैरो जैसे माध्यमिक लिम्फाइड अंगों की भी जांच करना वांछनीय है। घुटने के जोड़ों के लिम्फेटिक ड्रेनेज पैटर्न को चूहों और लिम्फ तरल पदार्थ में घुटने के जोड़ नालियों से इलियाक और इंगिनल लिम्फ नोड दोनों के माध्यम से अलग - अलग फैलाव23,24पर चिह्नित किया गया है । जानवरों के बीच तुलनीयता को सुविधाजनक बनाने के लिए, हमने इस प्रोटोकॉल में इंगिनल और इलियाक लिम्फ नोड पूल करने का फैसला किया। इसके विपरीत, घुटने के करीब निकटता में, पॉपलाइटल लिम्फ नोड हिंदफुट को नालियों में छोड़ देता है और घुटने की भड़काऊ प्रक्रियाओं के दौरान भूमिका नहीं निभाता है।

चूहों में इंट्रा-आर्टिकुलर सिनोवियल ऊतकों की एक छोटी मात्रा होती है25 और प्रतिरक्षा कोशिकाओं का अलगाव यहां चुनौतीपूर्ण रहता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, प्रतिरक्षा कोशिकाओं की अधिकतम संख्या के अलगाव की अनुमति देने के लिए सिनोवियल ऊतकों के लिए कटाई तकनीकों को अनुकूलित किया गया था। इसलिए, कटाई तकनीक में26प्रतिरक्षा कोशिकाओं की उच्च संख्या के कारण सुपरा-और इन्फ्रापेटलर अवकाश के साथ-साथ इन्फ्रापेटलर सनक पैड शामिल है। पाचन प्रक्रिया और एंजाइम की पसंद को पूरी तरह से सिनोवियल झिल्ली और फैटी ऊतक को पचाने के लिए अनुकूलित किया गया था, जबकि कण्डरा छोड़, और पटेला और उसके उपास्थि अक्षत । इस प्रकार, वर्तमान प्रोटोकॉल सिनोवियल ऊतक से प्रतिरक्षा कोशिकाओं की कटाई की एक प्रजनन विधि का परिचय देता है।

ओए के विकास के दौरान सेलुलर प्रतिरक्षा प्रक्रियाओं की जांच करते समय फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के कई फायदे हैं; बहरहाल, इस तकनीक की सीमाएं हैं। सिनोवियल ऊतक में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की छोटी संख्या के कारण, एक नमूना प्राप्त करने के लिए कम से कम दो जानवरों से ऊतक के नमूनों को पूल करना आवश्यक है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोक्रोम और रंगों की बड़ी संख्या के कारण, प्रत्येक ऊतक प्रकार के लिए संभावित स्पेक्ट्रल ओवरलैप के सावधानीपूर्वक मुआवजे पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए और इस तकनीक के उपयोग के दौरान लगातार मुआवजे का फिर से मूल्यांकन करने की आवश्यकता है। उपलब्ध मार्कर की बड़ी संख्या और एक निश्चित आबादी की पहचान करने के लिए अध्ययनों के बीच काफी भिन्नता के कारण, एक और संभव सीमा19कोशिकाओं की पहचान करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मार्कर का विकल्प है। फ्लो साइटोमेट्री "घटनाओं" के मात्राकरण की अनुमति देता है, जो आवश्यक रूप से कुल कोशिकाओं के लिए समन्वय नहीं करता है। वास्तव में मात्रात्मक विश्लेषण प्राप्त करने के लिए, पूर्ण संख्या प्राप्त करने के लिए प्रवाह विश्लेषण या एकल कोशिका निलंबन में कोशिकाओं को गिनते समय या तो गिनती मोती प्राप्त करने की आवश्यकता होती है (जैसा कि यहां किया गया है)। सामान्य तौर पर, इस प्रोटोकॉल के सिद्धांतों (उदाहरण के लिए, एकल सेल निलंबन तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रवाह पैनल या तकनीकों को डिजाइन और कैसे स्थापित किया जाए) संभावित रूप से मानव नमूनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। हालांकि, मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं की सतह मार्कर मुरीन कोशिकाओं से भिन्न होती हैं और इसलिए, उचित एंटीबॉडी का चयन और परीक्षण करने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, आरबीसी लाइसिस की अवधि और बफर की उचित मात्रा निर्धारित करने की आवश्यकता है क्योंकि यह सबसे अलग होने की संभावना है। इस प्रोटोकॉल से अन्य प्रजातियों या ऊतकों के लिए तरीकों को अनुकूलित करने से पहले प्रत्येक चरण का सावधानीपूर्वक परीक्षण यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि विधियां अभीष्ट के रूप में काम कर रही हैं।

अपनी सीमाओं के बावजूद, प्रतिरक्षा कोशिकाओं का प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण एक शक्तिशाली तकनीक बनी हुई है जो एकल कोशिका स्तर पर मोनोसाइटिक सेल और टी-सेल सबसेट दोनों की पहचान करने की अनुमति देती है। विशेष रूप से, वर्तमान प्रोटोकॉल एक विश्वसनीय और प्रजनन योग्य तकनीक का परिचय देता है जो सिनोवियल ऊतक और माध्यमिक लिम्फेटिक अंगों में ओए के विकास के दौरान सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की पहचान और मात्रा निर्धारित कर सकता है। भविष्य में, यह तकनीक पशु मॉडल को प्रेरित करने वाले विभिन्न ऑस्टियोआर्थराइटिस में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की विशेषता में मदद कर सकती है और इसके बाद इस दुर्बल रोग पर प्रतिरक्षा मॉड्यूलिंग दवाओं की प्रभावकारिता का मूल्यांकन कर सकती है।

अंत में, यह प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल एक स्थापित सर्जिकल ऑस्टियोआर्थराइटिस माउस मॉडल का उपयोग करते हुए मुरीन तिल्ली, बोन मैरो, लिम्फ नोड्स और सिनोवियल ऊतक के भीतर अतिरिक्त और इंट्रासेलुलर धुंधला परख का उपयोग करके मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज और टी सेल सबसेट की पहचान करने के लिए एक विस्तृत और प्रजनन योग्य विधि का वर्णन करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम एंड्रयू लिम, पीएचडी और Giles सर्वश्रेष्ठ, पीएचडी प्रवाह साइटोमीटर की स्थापना में उनकी मदद के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस परियोजना को पीएच को दिए गए ड्यूश फोर्स्चुंग्सजेमींसचैफ्ट (डीएफजी) (डीएफजी-एचए 8481/1-1) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC anti-mouse CD194 (CCR4) BioLegend 131212 T-Cell Panel
Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst BD 566385 Buffers
Fixable Viability Stain 510, 100 µg BD 564406 T-Cell Panel
Fixable Viability Stain 510, 100 µg BD 564406 Monocyte Panel
Liberase, Research Grade Roche 5401127001 Enzyme for synovial tissue
Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg BD 564985 Monocyte Panel
Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg BD 562454 Monocyte Panel
Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg BD 742274 T-Cell Panel
Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg BD 565250 Monocyte Panel
Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg BD 563061 T-Cell Panel
Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg BD 557596 T-Cell Panel
Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg BD 552775 T-Cell Panel
Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg BD 565480 T-Cell Panel
Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg BD 565261 T-Cell Panel
Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg BD 740664 T-Cell Panel
Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg BD 563687 Monocyte Panel
Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg BD 563332 T-Cell Panel
Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg BD 565411 Monocyte Panel
Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg BD 560408 T-Cell Panel
Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg BD 563414 Monocyte Panel
Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg BD 560593 Monocyte Panel
Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg BD 560600 Monocyte Panel
Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg BD 564143 T-Cell Panel
Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg BD 562894 T-Cell Panel
Red Blood Cell Lysing Buffer N/A N/A Buffers
Transcription Factor Buffer Set 100Tst BD 562574 Buffers

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एक ऑस्टियोआर्थराइटिस मॉडल में मुरीन स्प्लेन, बोन मैरो, लिम्फ नोड्स और सिनोवियल ऊतक के भीतर प्रतिरक्षा सेल सबसेट का प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण
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Haubruck, P., Colbath, A. C., Liu,… More

Haubruck, P., Colbath, A. C., Liu, Y., Stoner, S., Shu, C., Little, C. B. Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model. J. Vis. Exp. (158), e61008, doi:10.3791/61008 (2020).

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