Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Flödescytometrianalys av immuncellsdelmängder inom Murine Mjälte, Benmärg, Lymfkörtlar och synovial vävnad i en artrosmodell

Published: April 24, 2020 doi: 10.3791/61008
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1, 1, 1
1Raymond Purves Bone and Joint Research Laboratory, Institute of Bone and Joint Research, Kolling Institute, Royal North Shore Hospital, University of Sydney, 2HTRG - Heidelberg Trauma Research Group, Center for Orthopedics, Trauma Surgery and Spinal Cord Injury, Trauma and Reconstructive Surgery, Heidelberg University Hospital, 3Department of Large Animal Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Michigan State University

Summary

Här beskriver vi en detaljerad och reproducerbara flöde cytometry protokollet för att identifiera monocyte/macrophage och T-cells delmängder med hjälp av både extra- och intracellulära färgning assays inom murine mjälte, benmärg, lymfkörtlar och synovial vävnad, utnyttja en etablerad kirurgisk modell av murine artros.

Abstract

Artros (OA) är en av de vanligaste muskuloskeletala sjukdomar, som drabbar patienter som lider av smärta och fysiska begränsningar. Nya bevis tyder på en potentiell inflammatorisk komponent av sjukdomen, med både T-celler och monocyter/makrofager potentiellt samband med patogenesen vid OA. Ytterligare studier postulerade en viktig roll för undergrupper av både inflammatoriska cell härstamningar, såsom Th1, Th2, Th17, och T-reglerande lymfocyter, och M1, M2, och synovium-vävnad-resident makrofager. Men interaktionen mellan den lokala synovial och systemiska inflammatoriska cellulära svar och de strukturella förändringarna i leden är okänd. För att till fullo förstå hur T-celler och monocyter/makrofager bidrar mot OA är det viktigt att kunna identifiera dessa celler och deras undergrupper på ett quantitively sätt att identifiera dessa celler och deras undermängder samtidigt i synovial vävnad, sekundära lymfatiska organ och systemiskt (mjälten och benmärgen). Numera kan de olika inflammatoriska cell delmängderna identifieras genom en kombination av cell-ytan markörer gör multi-color flow cytometry en kraftfull teknik för att undersöka dessa cellulära processer. I detta protokoll beskriver vi detaljerade steg angående skörden av synovial vävnad och sekundära lymfatiska organ samt generering av single cell suspensioner. Vidare presenterar vi både en extracellulära färgning assay att identifiera monocyter/makrofager och deras undergrupper samt en extra- och intra-cellulära färgning assay att identifiera T-celler och deras undergrupper inom murin mjälte, benmärg, lymfkörtlar och synovial vävnad. Varje steg i detta protokoll var optimerad och testade, vilket resulterar i en mycket reproducerbar analys som kan utnyttjas för andra kirurgiska och icke-kirurgiska OA mus modeller.

Introduction

Artros (OA) är en försvagande och smärtsam sjukdom som involverar olika patologier av alla vävnader som är associerade med leden1. Påverkar cirka 3,8% av den globalabefolkningen 2, OA är en av de vanligaste muskuloskeletala sjukdomar och det är att bliden 4 ledande orsaken till funktionshinder i världen 20203. Posttraumatisk OA inträffar efter en ledskada och svarar för minst 12% av alla OA och upp till 25% av OA i mottagliga leder såsomknäet 4,5. Vidare ökar ledskadan livstidsrisken för OA med mer än fem gånger6. Inte alla skador med till synes liknande instabilitet kommer att fortsätta att utveckla OA, och därför definiera faktorer som driver den långsiktiga OA-risken är fortfarande utmanande. Det är avgörande för att utveckla effektiva behandlingar för att förebygga och/eller behandla posttraumatisk OA, att undersöka och bättre definiera de skadespecifika patologi, orsaker, och mekanismer som predisponerar för OA1.

OA och dess definierande brosk förstörelse var tidigare helt tillskrivas mekanisk stress och, därmed, OA ansågs vara en icke-inflammatorisk sjukdom2. Emellertid, nyare studier har visat en inflammatorisk infiltration av synovial membran och en ökning av inflammatoriska celler i synovial vävnad hos patienter med OA jämfört med friska kontroller2, sprider ljus på en inflammatorisk komponent som en potentiell drivkraft i OA. Ytterligare studier indikerade att avvikelser i både CD4+ och CD8+ T-cellprofilen samt monocyter/makrofager i det medfödda immunsystemet kan bidra till patogenesen vid OA2,7. Detaljerade undersökningar av dessa avvikelser visade relevanta roller för olika T-cell delmängder2, såsom Th18, Th29, Th178 och T reglerande (Treg)populationer 10,11. Trots detta övertygande bevis, orsakssamband mellan förändringen av T-cells svar och utveckling och progression av OA är fortfarande okänd2.

Förutom specifika T-celler som har en roll i OA, aktuella studier tyder på att differentially polariserade / aktiverade makrofager kan vara förknippade med patogenes av OA12. I synnerhet makrofager som härrör från blodmonocyter ackumuleras i synovium och polarisera till antingen klassiskt aktiverade makrofager (M1) eller alternativt aktiverade makrofager (M2) under OA utveckling, vilket innebär en korrelation mellan monocyter härledda makrofager och OA13. Däremot vissa undergrupper av makrofager befolka organ tidigt under utveckling och själv upprätthålla deras antal i en monocyt oberoende fråga14. Nyligen visades en gemensam skyddsfunktion som förmedlades av en tät korsning barriär för dessa synovial-vävnad-resident makrofager (STRMs)14. Dessa resultat tyder på att avvikelser i synnerhet makrofag delmängder kan spela en avgörande roll under utvecklingen av OA. Men, samspelet mellan denna inflammatoriska cellulära svar och de strukturella förändringarna i den gemensamma efter trauma är okänd.

Historiskt, analys av immunceller i synovialvävnaden var begränsad till immunohistokemi (IHC) eller mRNA uttryck genom omvänd transkription polymeras kedjereaktion (RT-PCR)närmar 15,16. Men, både IHC och RT-PCR saknar förmågan att identifiera flera olika celltyper och deras underuppsättningar samtidigt, alltså, begränsa tillämpligheten av dessa metoder. Vidare, IHC är begränsad till analys av små prover av vävnad och kan missa fokala inflammatoriska cell ansamlingar. Under de senaste åren har en myriad av ytmarkörer för olika celltyper utvecklats, och delmängder av immunceller kan nu identifieras på ett tillförlitligt sätt genom distinkta kombinationer av dessa markörer. På grund av stadiga tekniska framsteg, flöde cytometrar är nu kan identifiera en mängd olika fluorokromer samtidigt möjliggöra analys av stora multicolor antikroppar paneler.

Flödescytometri ger utredarna en kraftfull teknik som möjliggör samtidig identifiering och kvantifiering av en mängd immunceller och deras undergrupper på singelcellsnivå. Vi har utvecklat och optimerat både en extracellulär färgningsanalys för att identifiera monocyter/makrofager och deras undergrupper samt en extra/intracellulär fläckningsanalys för att identifiera T-celler och deras undergrupper inom murin mjälte, benmärg, lymfkörtlar och synovial vävnad. Varje steg i detta protokoll var optimerad och testade resulterar i en mycket reproducerbar analys som kan utnyttjas för andra kirurgiska och icke-kirurgiska OA mus modeller17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Northern Sydney Local Health District Animal Ethics Committee har godkänt alla förfaranden som nämns i detta protokoll. Möss är inhyst och omhändertaget i enlighet med Guide för vård och användning av laboratoriedjur (National Health and Medical Research Council of Australia Reviderad 2010). För alla experiment 10-12 veckor gamla, var manliga C57BL/6 möss utnyttjas.

OBS: Att inducera posttraumatiska OA, kirurgiska destabilisering av den mediala menisken (DMM) i rätt kväva gemensamma utfördes. Detaljerad information angående denna djurmodell publicerades av Glasson et al.18. I kort, narkos induceras i en induktionskammare med hjälp av isofluran och därefter bibehålls med hjälp av en näsa kon. Operationsbenet är rakat med ett rakblad och operationsstället tvättas och svabb med etanol för att minimera kontaminering. Djuret flyttas sedan till driftmikroskopet och placeras på en steril handduk och benet draperat med sterilt pappersdrape för att isolera operationsområdet och minimera kontaminering. Med hjälp av mikroskopet, en 0,5 cm mediala para-patella arthrotomy görs, patella luxated i stort sett, och infra-patella fett pad förhöjd för att exponera den mediala menisco-tibial ligament, som är transected med dissekering tlyckor. Leden spolas med steril koksaltlösning för att avlägsna eventuellt blod och såret är stängt i tre lager – ledkapsel, subkutan vävnad (med hjälp av suturmaterial) och hud (med hjälp av kirurgiskt vävnadslim). Metoder som beskrivs i detta protokoll, kan dock tillämpas på andra modeller och metoder för att inducera OA. OA kan induceras i vardera sidan av djuret, och vid skörd av vävnader, Är det viktigt att skörda den ipsilaterala (dränerande) lymfkörtlar.

1. Isolering av mjälte, kontralateral benmärg, ipsilateral lymfkörtlar dränerar stifle och synovial vävnad

  1. Avliva musen genom livmoderhalscancer förskjutning. Placera musen i ryggläge under ett dissekerande mikroskop och torka av bröst, buk och ben med 70% etanol. Öppna försiktigt huden på mittlinjen för bukens längd med hjälp av rak sax som lämnar bukhålan intakt.
  2. Dra försiktigt huden på höger sida av djuret bort från den underliggande muskeln lämnar subkutan fettvävnaden fäst vid huden. Normalt, mild dragkraft ensam kommer att separera huden och underliggande fettvävnad från muskeln. Sporadiska adherences bör skäras igenom med fin sax för att hålla spänningen som är nödvändig för att separera vävnader till ett minimum och minska risken för att skada lymfkörtlarna. Identifiera en korsning av tre fartyg genom att försiktigt reta ut fettvävnaden som ligger vid låret med hjälp av två böjda fina tyckor. Den inguinal lymfkörtdel är belägen vid korsningen och kan identifieras genom sin äggformade form och något mörkare färg.
  3. Ta bort inguinal lymfkörtdel med hjälp av fina dissekera tlysen. Var försiktig så att kapseln inte spricker. Ta bort det återstående fettet på ytan av lymfkörten med tlysena.
  4. Öppna bukhålan och identifiera mjälten. Skär ut mjälten med fin sax. Dra försiktigt tarmarna åt sidan för att exponera aorta och dess bifurkation vara noga med att inte skada dem, för att minimera risken för kontaminering. Iliaca lymfkörtknuten är belägen vid den terminala segmentet av bukaortan och ursprunget till den gemensamma höftartären. Ta bort höger höftben lymfkörtel och fortsätt enligt beskrivningen i 1.3.
  5. Ta försiktigt bort huden på båda bakbenen. Dissekera vänster lårbenet genom att rengöra den från muskelvävnad med hjälp av bladet och fin sax. Koppla försiktigt bort både kvävande och höftleden lämnar hela benet intakt och ta bort lårbenet.
  6. Identifiera patella sena av höger kväva gemensamma, ta sedan bort angränsande muskelvävnad proximala till detta med hjälp av fina sax tills cirka 5mm av quadriceps senan proximala till patella är utsatt. Därefter skär genom quadriceps sena ungefär 3-4mm proximala till patella att bilda ett handtag och med hjälp av fina tlysnare försiktigt dra bort den från leden. Detta kommer att göra kanterna på ledkapseln fastsättning till lårbenet synlig, och med hjälp av en skalpell blad försiktigt skära längs kanterna på ledkapseln på båda sidor, med början vid lårbenet går mot skenbenet, för att maximera mängden synovial membran som skördas. Medan styckning är det viktigt att upprätthålla en mild dragkraft på quadriceps sena och paus när synovialvävnad blocket endast är ansluten till skenbenet. I detta skede intraartikulär fett pad är nu tydligt synlig distala till patella och kan försiktigt lossna från leden och främre aspekten av menisci med hjälp av bladet. Därefter, skär längs den återstående delen av ledkapseln (tibial portion) för att ta bort synovial vävnad blocket.
    OBS: Detta steg måste göras mycket exakt för att möjliggöra tillförlitliga resultat. Efter avslutad dissekering, "synovial vävnad block" bör bestå av patella, patella sena, infrapatellar fett pad, supra- och infrapatellar recesse synovial foder och tillhörande gemensamma kapsel främre till säkerheterna ligament. Håll alla vävnader fuktiga under dissekering med hjälp av 0,9% saltlösning.
    OBS: Placera varje synovialt vävnadsblockprov i en separat brunn av en märkt 24-brunnsplatta som innehåller 1,5 ml RPMI 1640 medium. Kombinera både iliaca och inguinal lymfkörtel i en brunn och pool vävnader från två möss.

2. Generering av encellsupphängningar från varje vävnad

OBS: För att säkerställa tillräckligt celltal för flödesanalys synovial vävnader från två möss måste poolas. I det aktuella protokollet, pool alla vävnader från samma två möss för att upprätthålla analogi. Vidare kombinerades iliaca- och inguinal lymfkörtlar för varje djur vilket resulterade i totalt 4 lymfkörtlar för varje prov. I allmänhet är celltal i mjälte, benmärg och lymfkörtlar från ett djur tillräckliga för att genomföra flödesanalys och protokollet kan tillämpas. Men när du använder vävnader från endast ett djur lysning gånger kan behöva justeras.

  1. Mjälten
    1. Placera de två poolade mjältarna på en 70 μm cellsiler ovanpå ett 15 mL-rör. Försiktigt macerate mjälten genom nätfiltret med hjälp av en steril 3 mL spruta kolven. Spola silen ofta med totalt 6 mL RPMI 1640 medium kompletterat med 10% FBS.
    2. Snurra i cellerna (500 x g, 5 min, RT) och resuspend pelleten i 5 mL av röd blodkropp (RBC) lysbuffert. Inkubera i 5 min vid RT och stoppa reaktionen genom att späda lysbufferten med 10 mL PBS. Snurra i cellerna (500 x g, 5 min, RT) och upprepa detta steg en gång eller tills ingen mer RBC är i pelleten.
      OBS: Återttrera suspensionen med hjälp av en 30 μm cellsil till ett nytt 15 mL-rör mellan de två omgångarna av lysning för att avlägsna koagulerade celler.
    3. Efter att lysningen är klar, snurra cellerna (500 x g, 5 min, RT), kassera supernatant och resuspend pellet i 1 mL pbs. Räkna antalet levande celler på en hemocytometer med trypanblå uteslutning.
  2. Lymfkörtlarna
    1. Placera de fyra poolade lymfkörtlarna på en 70 μm cellsilv ovanpå ett 15 mL-rör. Reta försiktigt lymfkörtlarna isär till en enda cell suspension genom att trycka med en steril 3 mL spruta kolven. Spola silen ofta med totalt 6 mL RPMI med 10% FBS.
    2. Snurra i cellerna (500 x g, 5 min, RT), kassera supernatant och resuspend pelleten i 500 μL pbs. Återttrera suspensionen med hjälp av en 30 μm cellsil i ett nytt 15 mL-rör för att avlägsna koagulerade celler. Räkna antalet levande celler på en hemocytometer med trypanblå uteslutning.
  3. Benmärgen
    1. Ta försiktigt tag i det intakta lårbenet med hjälp av en vävnad tummen tärningar utan att spräcka den. Skär av själva änden av det proximala lårbenet med en vass sax för att underlätta spolning av benet. Vänd lårbenet runt och placera en 23 G nål i mitten av den intercondylar hack av lårbenet. Samtidigt som du applicerar försiktigt tryck rotera nålen mellan tummen och pekfingret för att borra ett hål i intercondylar skåran för att komma in i benhåligheten.
      OBS: Ibland kan partiklar av benet hindra nålen efter att hålet borrats, för att undvika onödigt högt tryck under spolning av ett nålbyte innan spolning rekommenderas.
    2. Spola benet med 6 mL RPMI med 10% FBS (eller tills spolningen blir vit) med hjälp av en 10 mL-spruta med en 23 G-nål på en 70 μm cellsil som placeras på ett 15 mL-rör. Tryck försiktigt benmärgen genom cellsilen med en kolv av en 3 mL-spruta och skölj silen med ytterligare 3 mL RPMI.
      OBS: Benen ska visas vita när all märg har spolats ut helt.
    3. Snurra i cellerna (500 x g, 5 min, RT) och resuspend pelleten i 5 mL AV RBC lysbuffert. Inkubera i 5 min vid RT och stoppa reaktionen genom att späda lysbufferten med 10 mL PBS.
    4. Snurra i cellerna (500 x g, 5 min, RT), kassera supernatant och resuspend pelleten i 1 mL pbs. Återttrera suspensionen med hjälp av en 30 μm cellsil i ett nytt 15 mL-rör för att avlägsna koagulerade celler. Räkna antalet levande celler på en hemocytometer med trypanblå uteslutning.
  4. Synovialvävnaden
    1. Tärna de två synovialvävnadsblocken i små bitar med en fin kirurgisk sax. Överför proverna med medium till ett 15 mL-rör. Skölj den gamla brunnen med ytterligare 0,5 mL RPMI för att få återstående celler och synovialvävnader, överföring till falcon-röret (slutlig volym 2 mL).
      TIPS: Använd en överföringspipett och skärning av spetsen där diametern vidgas i detta steg.
    2. Rekonstruerat enzym och alikvot enligt tillverkarens instruktioner (t.ex., Liberase). Tillsätt tillräckligt enzym för att resultera i en slutkoncentration på 1 Enhet/mL (totalt 2 Enheter per prov). Digest vid 37 °C i 2 h med hjälp av en MACS-rotator.
    3. Stoppa matsmältningen genom att tillsätta 8 mL RPMI med 10% FBS och filtrera cell suspension genom en 70 μm cell sil i en ny 15 mL rör. Skölj det gamla 15 mL-röret med ytterligare 5 mL RPMI med 10 % FCS medium och filtercellsupphängning genom samma cellsil in i det nya röret (15 mL slutvolym).
    4. Snurra i cellerna (500 x g, 10 min, RT), kassera supernatant och resuspend pelleten i 500 μL pbs. Räkna antalet levande celler på en hemocytometer med trypanblå uteslutning.

3. Fördelning av celler

  1. Märk två 96-brunnsplattor (U-bottenform) med typ av vävnad, djur-ID och den utsedda antikroppspanelen. Totalt två antikroppspaneler används i detta protokoll: Monocyte subset panel (extracellulär färgning) och T-cell delmängd panel (extra- och intracellulära färgning).
  2. Ge 5 x 105 celler per brunn med hjälp av respektive encellsupphängningar.
    OBS: Vid inrättandet av experimentet, bedöm absoluta antalet celler som förväntas per grupp och vävnadstyp (behandlade djur har ett högre cellantal i vävnader än kontrolldjur). När cellpelleten återtutnytnas under det sista steget för att generera encellsupphängningar ska du välja en lämplig mängd PBS för att sluta med en koncentration på 5 x 105 per 200 μL. Den 96-brunnsplatta som används här kan rymma maximalt 300 μL och typiskt, 200 μL är idealisk för att minimera risken för korskontaminering på grund av spill.
  3. För varje panel och vävnadstyp, fördela minst 5 x 105 celler som obefläckade kontroller i brunnar som har markerats tydligt.

4. Monocyte delmängd panel

  1. Utför viabilitetsfärgning: Spinnceller (500 x g, 5 min, 4 °C) med hjälp av en tallrikspinnare och tvätta cellerna en gång med 200 μL av 1x PBS. Bered en stamlösning av cell-impermeant aminreaktivt färgämne (livsduglig fläck) utspädd 1:50 i 1x PBS. Därefter återanvänd cellpelletsen med 100 μL av denna stamlösning vilket resulterar i en absolut volym på 2 μL av vibilitetsfläck per brunn. Inkubera i 15 min vid 4 °C skyddad mot ljus.
    OBS: Den optimala mängd viabilitetsfläck som behövs bör bestämmas genom att en dostitreringskurva ska göras. Dessutom bör utspädd injektionsflaska fläck stamlösning användas på en enda dag och inte lagras. Se tillverkarens instruktioner för mer information om hur man rekonstruera, späda ut och lagra livsdugligheten fläcken.
  2. Under inkubationen, bered cocktail av antikroppar i en lämplig volym AVSECS buffert (Ca2+ och Mg+ fria PBS innehållande 0,1%BSA och 0,02% natriumazid). Tvätta cellerna två gånger med 200 μL FACS-buffert, centrifug (500 x g, 5 min, 4 °C) och resuspend varje pellet med 100 μL av antikroppsblandningen eller lämplig kontrollblandning. Inkubera i 30 min vid 4 °C skyddad mot ljus.
    OBS: Var medveten om att natriumazid är giftigt för celler. I det aktuella protokollet koncentrationen av natriumazid i flödesbufferten är mycket låg (0,02%) och prover körs omedelbart efter färgning alltså, inte orsakar något problem. Om nedströms funktionella analyser av sorterade celler planeras, kan det vara fördelaktigt att göra upp färska FACS buffert varje dag av experiment och inte använda någon natriumazid. När du använder en mängd antikroppar, rekommenderas det att lägga till en lämplig mängd "Brilliant Stain Buffer" till cocktail av antikroppar för att förbättra resultaten.
  3. Tvätta cellerna två gånger med 200 μL FACS-buffert och resuspend cellerna i 250 μL FACS + EDTA buffert (FACS buffert som innehåller 1 mM EDTA). Överför prover till märkta FACS-rör. Förvara prover vid 4 °C och skyddas mot ljus fram till förvärvet.
    OBS: Immunceller har tendensen att vara klibbig. För att minimera både risken för blockering och antal dubbletar rekommenderas att lägga till 1 mM EDTA till den slutliga flödesbufferten.

5. T Cell delmängd panel

  1. Utför viabilitetsfärgning: Spinnceller (500 x g, 5 min, 4 °C) med hjälp av en tallrikspinnare och tvätta cellerna en gång med 200 μL av 1x PBS. Bered en stamlösning av cell-impermeant aminreaktivt färgämne (livsduglig fläck) utspädd 1:50 i 1x PBS. Därefter återanvänd cellpelletsen med 100 μL av denna stamlösning vilket resulterar i en absolut volym på 2 μL av vibilitetsfläck per brunn. Inkubera i 15 min vid 4 °C skyddad mot ljus.
  2. Medan inkubering av proverna, förbereda extracellulära färgning antikroppar cocktail i en lämplig volym av 1x FACS buffert. Tvätta cellerna två gånger med 200 μL 1x FACS buffert, snurra ner dem (500 x g, 5 min, 4 °C) och resuspend varje pellet med 100 μL av antikroppsblandningen eller lämplig kontrollblandning. Inkubera i 30 min vid 4 °C skyddad mot ljus.
  3. Utför den intracellulära färgningen med en fixerings- och permeabiliseringssats enligt tillverkarens anvisningar. Tvätta cellerna två gånger med 200 μL 1x FACS buffert och resuspend i 200 μL fixeringsbuffert. Inkubera i 40 min vid 4 °C skyddad mot ljus.
  4. Under inkuberingen, förbereda cocktail av antikroppar (intracellulära färgning) i en lämplig volym av 1x permeabilization och tvätt buffert. Samla celler genom att snurra (750 x g, 5 min, 4 °C) och tvätta celler två gånger med 200 μL på 1x perm/tvättbuffert.
    OBS: Fixering och permeabilisering resulterar i celler som tenderar att vara lite svårare att korrekt pellet. För att minimera cellförlust under de efterföljande tvättstegen, öka centrifugalkraften till 750 x g. Alternativt kunde en längre spinningcykel också tillämpas. Detta skulle dock resultera i en betydligt längre tid som behövs för att förbereda cellerna.
  5. Spinnceller (750 x g, 5 min, 4 °C) och resuspend varje pellet med 100 μL av antikroppsblandningen eller lämplig kontrollblandning. Inkubera i 40 min vid 4 °C skyddad mot ljus.
  6. Tvätta cellerna två gånger med 200 μL av 1x perm/tvättbuffert och resuspend cellerna i 250 μL FACS + EDTA buffert. Överför prover till märkta FACS-rör. Förvara prover vid 4 °C och skyddas mot ljus fram till förvärvet.
    OBS: För varje antikropp behöver den optimala koncentrationen bestämmas genom att utföra en dostitreringskurva. Koncentration mellan antikroppar kan skilja drastiskt: CD3 och CD80 användes med en spädningsfaktor på 1:1, medan CD11b och CD4 användes med en utspädningsfaktor på 1:6400. Vid titrering av antikroppskoncentrationen använder samma antal celler som kommer att användas under experimenten.

6. Ersättning, lämpliga kontroller och gating

  1. Ställa in experimentet
    1. När den optimala antikroppskoncentrationen har bestämts köras obefläckade och enda färgade kontroller för ersättning för att justera för spektral överlappning.
      OBS: Kör alla kompensationskontroller med både celler och kompensationspärlor. Använd oavsett genererar de ljusaste resultaten (högsta MFI av positiva händelser) för ersättning. MFI står för medelfluorescensintensitet och används ofta för att beskriva och definiera medelintensiteten hos den genererade signalen och därmed, nivå av antikroppsuttryck.
    2. Kör fluorescens minus en (FMO) kontroller och isotype kontroller när du startar ett nytt multicolor experiment. Ytterligare detaljer angående FMO har tidigare publicerats19.
    3. Bestäm den optimala FSC-A-spänningen (Forward Scatter Area) och SSC-A-spänningen (Side Scatter Area) för att upptäcka leukocytpopulationen i ouppnåeliga kontroller av varje vävnadstyp.
      OBS: Fixerings- och permeabiliseringsprocessen förändrar cellens dimensioner. Således skiljer sig FSC-A- och SSC-A-spänningarna för monocytens delmängdspanel och T-celldelspanel avsevärt. För att hitta de optimala spänningarna för T Cell Subset Panel, använd celler som har enstaka färgats med CD3 och bakgrind mot leukocytpopulationerna samtidigt som du justerar värdena FSC-A och SSC-A.
  2. Gating-strategi
    1. När den optimala FSC-A- och SSC-A-spänningen har fastställts, sätt upp en primär grind på leukocytpopulationen.
      OBS: Före varje experiment kalibrera cytometern med hjälp av kalibreringspärlor enligt tillverkarens instruktioner och kör ofläckade pärlor. Leukocytpopulationer med olika tidspunkter bör ha jämförbara FSC- och SSC-egenskaper (små skillnader mellan vävnadstyper förväntas och är normala). Om FSC och SSC varierar avsevärda problem skjuta cytometer och prov generation.
    2. Uteslut dubbletar: Plot FSC-A (y-axeln) och FSC-H (x-axeln). Singlets visas som en diagonal av denna tomt. Grind på undertorna.
    3. Uteslut död cell: Plot FVS510 (livsduglighetsfläck) (x-axel) och FSC-A (y-axeln). Döda celler kommer att visas som positiva händelser, alltså gate på levande celler.
      OBS: True negativa celler kommer att vara synlig i obefläckade kontroller. Justera således denna grind för varje uppsättning prover när du kör de obefläckade kontrollerna före färgade prover. Ytterligare gating beror på antikroppspanelen och celltyp som undersöks. Gating strategier för varje panel som används i detta protokoll finns i figur 1 och figur 4, respektive.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representativa resultat från både monocyte undergrupp panel och T-cell delmängd panel beskrivs nedan.

Figur 1 illustrerar den hierarkiska gating-strategin för undergruppspanelen för monocyter på immunceller som samlats in från benmärg av DMM-behandlade djur. Samma strategi användes och verifierades i alla andra vävnadstyper. När du ställer in experimentet bestämdes FSC-A-spänningen (Forward Scatter Area) och SSC-A (Side Scatter Area) för varje vävnadstyp för att identifiera monocyter/makrofager och utesluta T-celler och skräp (G1). Under varje experiment analyserades ouppnåeliga kontroller av varje vävnadstyp, och FSC-A och SSC-A-spänning justeras vid behov. Spänningar förväntas förbli liknande över tiden, om parametrar ändras drastiskt en blockering av cytometern är sannolikt. Vidare användes obefläckade kontroller för att fastställa de verkliga negativen för de döda/levande fläcken och grindarna justerades varje gång försöket genomfördes i enlighet med detta (Figur 2A). Vid utformningen av experimentet bör fluorokromer väljas noggrant, och normalt ytmarkörer med lågt uttryck paras ihop med ljusa fluorokromer (t.ex. här användes Alexa Fluor 647 för CD206). Olika döda/levande fläckar finns som kan detekteras av olika våglängder; här användes FVS510.

Figur 3 illustrerar provdata från immunceller som isolerats från synovialvävnader och färgas med extracellulära ytmarkörer 6 veckor efter det att djur fått antingen DMM eller skenkontrollkirurgi. Alla delmängder kan lätt identifieras med hjälp av protokollet både i studie- och kontrolldjur. I synnerhet kan skillnader mellan grupper ses för makrofag delmängder (högre andel av Ly-6C+/MHC-II- makrofager (G7) i DMM-gruppen) och uttrycket av M1 och M2 makrofager (högre andel M2-makrofager i DMM-gruppen).

Figur 4 visualiserar den hierarkiska gating strategin för extra- och intracellulära T-cell panel på immunceller isolerade från mjälte av DMM behandlade djur. Principer är identiska med de som används för monocytepanelen. Men fastställande och permeabilisering processen ändrar storlek och densitet av celler. Således måste typiska FSC och SSC parametrar fastställas med hjälp av en back-gating process från CD3 + celler när först ställa in experimentet för varje celltyp. Vissa fluorokromer tenderar att aggregera över tiden (t.ex. PE som användes med FoxP3 här). Aggregat kan potentiellt ändra resultaten på grund av den höga ljusstyrkan som påverkar den spektrala överlappningen och kompensationen. Således var alla antikroppar virveled och snurrade ner varje gång före deras användning för att minska aggregat. Dessutom användes en gating-strategi för att ytterligare minska påverkan av aggregat (G2). Medan inrätta experimenten fluorescens minus en kontroller (FMOs) utfördes för varje antikropp. Exempeldata visas i figur 2B,2C.

Figur 5 och figur 6 visar immunceller som var isolerade från lymfkörtlar (figur 5) och synovialvävnad (figur 6) och färgas med hjälp av T-cellspanelprotokollet 4 veckor efter att djur fått antingen DMM eller skenkontrollkirurgi. Uppgifterna visar en högre andel Th1-celler i DMM-djur (G9) i båda vävnaderna. Vidare är intracellulära färgning för T-reglerande celler (G11) och Th17 celler (G12) framgångsrikt med hjälp av protokollet och skillnader kan upptäckas mellan grupper.

Figure 1
Figur 1: Flödescytometri hierarkisk gating strategi med hjälp av extracellulära färgning för att identifiera monocyter / makrofager och deras undergrupper. Myeloida celler identifieras främst med hjälp av en framåt/sida scatter (FSC-A och SSC-A) punkt plot (G1). Därefter upptäcks undertettor med hjälp av FSC-A och FSC-H (G2) och efteråt väljs levande celler (G3). Celler från G3 klassificeras vidare med hjälp av Ly-6G för att identifiera neutrofiler (G4) och CD11b för monocyte/makrofager (G5a). MHC-II används för att identifiera dendritiska celler (G5b) bland CD11b positiva celler och F4/80 används för att välja mellan makrofager (G6) och monocyter (G12). Makrofager klassificeras vidare i sina delmängder med hjälp av Ly-6C och MHC-II (Ly-6C+/MHC-II- makrofager (G7); Ly-6C-/MHC-II- vävnad bosatt makrofager (G8); Ly-6C-/MHC-II+ blod har sitt ursprung makrofager (G9)). Fler delmängder kan väljas från hela makrofager och dess respektive delmängder med cd206 och cd80 (M1: CD80+/CD206- (G10); M2: CD80-/CD206+ (G11)). Monocyter klassificeras vidare med hjälp av MHC-II och CD11c (MHC-II-/CD11c- monocyter (G13); MHC-II+/CD11c- monocyter (G14)). Nivån på aktivering klassificeras sedan med hjälp av uttrycket av Ly-6C och delas upp i låg (G15), medium (G16) och hög (G17). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Bild 2: Provdata som illustrerar lämpliga kontroller i både monococytan och T-cellpanelen. (A) Synovial vävnad skördades 6 veckor efter antingen DMM-kirurgi (DMM) eller sham-control-kirurgi (sham) och en enda cell suspension var färgas med hjälp av extracellulära ytmarkörer. Under varje experiment användes obefläckade celler för att fastställa sanna negativ för den döda / levande fläcken och för att ställa in grindar (Control). Inställning av grindar med hjälp av obefläckade celler visas i panel A. (B + C) Mjälte celler skördades från obehandlade kontroll djur, en enda cell suspension genereras och färgas med hjälp av både extra- och intracellulära markörer. Fluorescents-minus-one (FMO) kontroller genererades av färgning celler med hela antikroppspanelen saknas endast en antikropp. Exempeldata visas för båda intracellulära antikropparna. (B) FMO -RORgt och (C) FMO -Fox-P3. FMOs utfördes för båda panelerna och används för att ställa in varje grind. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Extracellulär färgning av monocyter/makrofager som isolerats från synovium av möss. Provvävnader samlades in 6 veckor efter möss fick antingen DMM-kirurgi (DMM) eller sham-control-kirurgi (sham). Ytterligare information angående de utnyttjade portarna finns i figur 1. Exempeldata visar att alla delmängder kan identifieras på ett tillförlitligt sätt och skillnader kan ses mellan grupper. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Flödescytometrihierarkisk gatingstrategi med hjälp av både extra- och intracellulär färgning för att identifiera T-celler och deras delmängder. T-celler identifieras främst med hjälp av en framåt /side scatter (FSC-A och SSC-A) punkt plot (G1). På grund av arten av de utnyttjade antikroppar aggregat bör uteslutas med hjälp av CD3 och CD4 (G2). Därefter upptäcks undertettor med hjälp av FSC-A och FSC-H (G3) och efteråt väljs levande celler (G4). Celler från G4 klassificeras vidare med hjälp av NK1.1 för att identifiera naturliga mördarceller (G5) och CD3 för att identifiera T-celler (G6). Aktiveringsnivån bestäms med hjälp av CD69 (G6b). Därefter används CD4 och CD8 för att identifiera T-killer-celler (CD4-/CD8+ (G7)) och T-helper-celler (CD4+/CD8- (G8)). T-hjälparceller klassificeras i Th-1 (C-X-CR3+/CCR4- (G9)) och Th-2-celler (C-X-CR3-/CCR4+ (G10)) med C-X-CR3 (CD183) och CCR4 (CD194). Dessutom identifieras Th-17-celler (CD25+/RORgt+ (G11)) och T-reglerande celler (CD25+/Fox-P3+ (G12)) med hjälp av intracellulära markörer. Vidare identifieras minnescelldelsmängder från T-hjälparceller med hjälp av CD44 och CD62L (CD44-/CD62L+ naiva T-minnesceller (G13); CD44+/CD62L+ centrala T-minnesceller (G14); CD44+/CD62L- effektor T-minnesceller (G15)). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Extracellulär och intracellulär färgning av T-celler som isolerats från dränerande lymfkörtlar av möss. Provvävnader samlades in 4 veckor efter möss fick antingen DMM-kirurgi (DMM) eller sham-control-kirurgi (sham). Ytterligare information angående de utnyttjade portarna finns i figur 4. Exempeldata visar att alla delmängder kan identifieras på ett tillförlitligt sätt och skillnader kan ses mellan grupper. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Extracellulär och intracellulär färgning av T-celler som isolerats från synovial vävnad hos möss. Provvävnader samlades in 4 veckor efter möss fick antingen DMM-kirurgi (DMM) eller sham-control-kirurgi (sham). Ytterligare information angående de utnyttjade portarna finns i figur 4. Exempeldata visar att alla delmängder kan identifieras på ett tillförlitligt sätt och skillnader kan ses mellan grupper. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De metoder som beskrivs i detta protokoll har utformats och testats för att på ett tillförlitligt sätt identifiera olika undergrupper från både monocyter/makrofager och T-celler inom murin mjälte, benmärg, lymfkörtlar och synovial vävnad i en murin modell av artros (OA). Det aktuella protokollet kan enkelt modifieras för att undersöka olika vävnadstyper, eller andra celltyper genom att utbyta antikroppar, och kan användas för alternativa murinmodeller av OA. Vid testning av andra vävnadstyper är det viktigt att testa varje antikropps specificitet som uttryck för ytmarkörer av immunceller varierar i varje vävnad20. Dessutom, vid utbyte av antikroppar, är det nödvändigt att utföra en dos titreringskurva för att fastställa den optimala koncentrationen av antikropp samt upprepa kompensationsprocessen för att åtgärda förändringar i spektral överlappning.

I det aktuella protokollet inducerades OA med hjälp av DMM-musmodellen18. De mest använda och etablerade djurmodellerna finns i musen, eftersom denna art ger multifold fördelar i att undersöka patofysiologi av posttraumatiska OA17. I musen i synnerhet, kirurgiska och icke-kirurgiska OA modeller har beskrivits17: den vanligaste är destabilisering av den mediala menisken (DMM), kirurgisk transection av främre korsbandet (ACLT) och icke-kirurgiska ACL rupture (ACLR), respektive21. Alla dessa djurmodeller är väl lämpade för undersökningen av den cellulära inflammationens roll i patologin av posttraumatisk OA och det aktuella protokollet har framgångsrikt testats för alla tidigare nämnda djurmodeller i laboratoriet. Även om alla ovanstående djurmodeller är etablerade och har beskrivits i litteraturen, har var och en sina egna styrkor och begränsningar som har diskuterats i detalj på andraställen 17 och så diskuteras endast kortfattat nedan. Alla kirurgiska modeller är föremål för den kirurgiska metoden, sårläkningsprocessen och dess associerade inflammatoriska svar. Vid bedömningen av bidraget från inflammatoriska celler till utvecklingen av posttraumatiska OA, kan detta inflammatoriska sårläkning svar fungera som en confounder, särskilt under de tidiga tidpunkterna efter ingripandet. Dessutom måste DMM och ACLT förfaranden genomföras på ett mycket standardiserat sätt för att minimera variabiliteten mellan djur. Den ACLT kirurgi är mycket svårare att lära än DMM kirurgi och kräver en större kirurgisk exponering än DMM att slutgiltigt identifiera och säkerställa skada endast till ACL och undvika iatrogen skada på andra gemensamma vävnader18. Icke-kirurgiska ACL sprängning är ett standardiserat och mycket effektivt sätt att förmå posttraumatiska OA. En specialiserad enhet som applicerar en kontrollerad enda tryckbelastning på skenbenet i det böjda knät är dock nödvändig. Denna enhet måste kalibreras och testas för att få jämförbara och tillförlitliga resultat. Dessutom inducerar ACLR-modellen mycket allvarliga och progressiva ledskador hos möss med markant erosion av den bakre mediala tibialplatån22 som inte ses med ACL-skada hos andra arter inklusive människor.

För att omfattande karakterisera den inflammatoriska processen och dess cellulära komponent under utvecklingen av OA, är det önskvärt att inte bara undersöka synovialvävnaden utan även de lokala lymfkörtlarna samt sekundära lymfoida organ, såsom mjälte och benmärg. Lymfdränagemönster i knäleden har karakteriserats hos möss och lymfvätska från knäledens avlopp genom både höftbens- och inguinal lymfkörtel vid en varierande dispersion23,24. För att underlätta jämförbarheten mellan djur bestämde vi oss i detta protokoll för att slå samman inguinal- och iliac-lymfkörtknuten. I kontrast, medan i närheten av knäet, den popliteal lymfkörtroll dränerar hindfoot och spelar inte en roll under inflammatoriska processer i knät.

Möss har en liten volym intrasaliska synovialvävnader25 och isolering av immuncellerna häri är fortfarande utmanande. I det aktuella protokollet anpassades avverkningstekniker för synovialvävnader för att möjliggöra isolering av det maximala antalet immunceller. Därför omfattar skördetekniken supra- och infrapatellarstagen samt infrapatellar-faddynan, på grund av dess höga antal immunceller26. Matsmältningen processen och val av enzym var optimerad för att helt smälta synoviet membran och fettvävnad, samtidigt som senan, och patella och dess brosk felfri. Således införs det nuvarande protokollet en reproducerbar metod för att skörda immunceller från synovial vävnad.

Flödescytometrianalys har flera fördelar vid undersökning av cellulära immunprocesser under utvecklingen av OA; icke desto mindre har denna teknik begränsningar. På grund av det ringa antalet immunceller i synovialvävnaden är det nödvändigt att slå samman vävnadsprover från minst två djur för att få ett prov. På grund av det stora antalet fluorokromer och färger som används i detta protokoll, måste särskild uppmärksamhet ägnas åt en noggrann ersättning av en eventuell spektral överlappning för varje vävnadstyp och ersättning måste omvärderas konsekvent under hela användningen av denna teknik. På grund av det stora antalet tillgängliga markörer och avsevärd variation bland studier för att identifiera en viss population, är en annan möjlig begränsning valet av markörer som används för att identifiera cellerna19. Flödescytometri tillåter kvantifiering av "händelser", som inte nödvändigtvis samordnar till totala celler. För att få en verkligt kvantitativ analys, behöver man antingen förvärva räkna pärlor samtidigt när du kör flödesanalys eller räkna celler i encell suspensioner i förväg för att få absoluta tal (som gjort här). I allmänhet skulle principerna i detta protokoll (t.ex. hur man utformar och inrättar en flödespanel eller tekniker som används för att förbereda encellsupphängningar) kunna anpassas för mänskliga prover. Ytmarkörer av humana immunceller skiljer sig dock från murinceller och därför måste lämpliga antikroppar väljas och testas. Dessutom måste varaktigheten av RBC-lys och lämplig buffertvolym fastställas eftersom den är mest sannolikt annorlunda. Innan anpassning metoder från detta protokoll till andra arter eller vävnader minutiös testning av varje steg är nödvändigt att säkerställa att metoderna fungerar som avsett.

Trots sina begränsningar, flöde cytometry analys av immunceller förblir en kraftfull teknik som gör det möjligt att identifiera både monocytic cell och T-cells delmängder på encellsnivå. I synnerhet införs det nuvarande protokollet en tillförlitlig och reproducerbar teknik som kan identifiera och kvantifiera det cellulära immunsvaret under utvecklingen av OA i synovialvävnaden och sekundära lymfatiska organ. I framtiden kan denna teknik bidra till att karakterisera immunsvaret i olika artros inducerande djurmodeller och hädanefter utvärdera effekten av immun modulerande läkemedel på denna försvagande sjukdom.

Sammanfattningsvis beskriver detta flöde cytometry protokollet en detaljerad och reproducerbar metod för att identifiera monocyter/makrofager och T-cell delmängder med hjälp av både extra- och intracellulära färgning assays inom murin mjälte, benmärg, lymfkörtlar och synovial vävnad utnyttja en etablerad kirurgiska artros mus modell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka Andrew Lim, Ph.D. och Giles Best, Ph.D. för deras hjälp med att inrätta flödescytometern. Detta projekt fick stöd av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG-HA 8481/1-1) som tilldelats PH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC anti-mouse CD194 (CCR4) BioLegend 131212 T-Cell Panel
Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst BD 566385 Buffers
Fixable Viability Stain 510, 100 µg BD 564406 T-Cell Panel
Fixable Viability Stain 510, 100 µg BD 564406 Monocyte Panel
Liberase, Research Grade Roche 5401127001 Enzyme for synovial tissue
Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg BD 564985 Monocyte Panel
Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg BD 562454 Monocyte Panel
Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg BD 742274 T-Cell Panel
Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg BD 565250 Monocyte Panel
Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg BD 563061 T-Cell Panel
Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg BD 557596 T-Cell Panel
Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg BD 552775 T-Cell Panel
Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg BD 565480 T-Cell Panel
Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg BD 565261 T-Cell Panel
Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg BD 740664 T-Cell Panel
Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg BD 563687 Monocyte Panel
Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg BD 563332 T-Cell Panel
Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg BD 565411 Monocyte Panel
Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg BD 560408 T-Cell Panel
Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg BD 563414 Monocyte Panel
Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg BD 560593 Monocyte Panel
Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg BD 560600 Monocyte Panel
Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg BD 564143 T-Cell Panel
Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg BD 562894 T-Cell Panel
Red Blood Cell Lysing Buffer N/A N/A Buffers
Transcription Factor Buffer Set 100Tst BD 562574 Buffers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).
  2. Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond. Frontiers in Immunology. 8, 356 (2017).
  3. Woolf, A. D., Pfleger, B. Burden of major musculoskeletal conditions. Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).
  4. Little, C. B., Hunter, D. J. Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials. Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).
  5. Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention. Best Practice & Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).
  6. Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).
  7. Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis. Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).
  8. Yamada, H., et al. Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints. Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).
  9. Sakkas, L. I., et al. T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis. Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).
  10. Guo, S. Y., et al. Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis. Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).
  11. Moradi, B., et al. CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints--analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood. Arthritis Research & Therapy. 16 (2), 97 (2014).
  12. Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees. Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).
  13. Zhang, H., et al. Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2. Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).
  14. Culemann, S., et al. Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint. Nature. 572, 670-675 (2019).
  15. Mocellin, S., et al. Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment. Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).
  16. Ward, J. M., et al. Immunohistochemical markers for the rodent immune system. Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).
  17. Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).
  18. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  19. Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
  20. Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
  21. Lorenz, J., Grassel, S. Experimental osteoarthritis models in mice. Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).
  22. Christiansen, B. A., et al. Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).
  23. Shi, J., et al. Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice. Arthritis & Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).
  24. Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).
  25. Zhao, J., et al. A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts. Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).
  26. Belluzzi, E., et al. Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain. BioMed Research International. 2019, 18 (2019).

Tags

Medicin Artros immunologi flödescytometri lymfocytundergrupper T-celler monocyter makrofager ortopedi posttraumatisk artros
Flödescytometrianalys av immuncellsdelmängder inom Murine Mjälte, Benmärg, Lymfkörtlar och synovial vävnad i en artrosmodell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haubruck, P., Colbath, A. C., Liu,… More

Haubruck, P., Colbath, A. C., Liu, Y., Stoner, S., Shu, C., Little, C. B. Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model. J. Vis. Exp. (158), e61008, doi:10.3791/61008 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter