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Análisis de citometría de flujo de subconjuntos de células inmunitarias dentro del bazo murino, médula ósea, ganglios linfáticos y tejido sinovial en un modelo de osteoartritis

Published: April 24, 2020 doi: 10.3791/61008
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1, 1, 1
1Raymond Purves Bone and Joint Research Laboratory, Institute of Bone and Joint Research, Kolling Institute, Royal North Shore Hospital, University of Sydney, 2HTRG - Heidelberg Trauma Research Group, Center for Orthopedics, Trauma Surgery and Spinal Cord Injury, Trauma and Reconstructive Surgery, Heidelberg University Hospital, 3Department of Large Animal Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Michigan State University

Summary

Aquí, describimos un protocolo de citometría de flujo detallado y reproducible para identificar subconjuntos de monocitos/macrofagos y células T utilizando ensayos de tinción extra e intracelular dentro del bazo murino, médula ósea, ganglios linfáticos y tejido sinovial, utilizando un modelo quirúrgico establecido de osteoartritis murina.

Abstract

La osteoartritis (OA) es una de las enfermedades musculoesqueléticas más frecuentes, que afecta a los pacientes que sufren de dolor y limitaciones físicas. La evidencia reciente indica un componente inflamatorio potencial de la enfermedad, con células T y monocitos/macrófagos potencialmente asociados con la patogénesis de OA. Otros estudios postularon un papel importante para subconjuntos de linajes celulares inflamatorios, como Th1, Th2, Th17 y linfocitos reguladores de T, y M1, M2 y macrófagos residentes en tejidos sinovium. Sin embargo, se desconoce la interacción entre la respuesta celular inflamatoria sinovial y sistémica local y los cambios estructurales en la articulación. Para entender completamente cómo las células T y los monocitos/macrofagos contribuyen hacia el OA, es importante ser capaz de identificar cuantitativamente estas células y sus subconjuntos simultáneamente en el tejido sinovial, los órganos linfáticos secundarios y sistémicamente (el bazo y la médula ósea). Hoy en día, los diferentes subconjuntos de células inflamatorias se pueden identificar mediante una combinación de marcadores de superficie celular haciendo de la citometría de flujo multicolor una técnica poderosa en la investigación de estos procesos celulares. En este protocolo, describimos pasos detallados con respecto a la cosecha de tejido sinovial y órganos linfáticos secundarios, así como la generación de suspensiones de una sola célula. Además, presentamos tanto un ensayo de tinción extracelular para identificar monocitos/macrofagos y sus subconjuntos, así como un ensayo de tinción extra e intracelular para identificar las células T y sus subconjuntos dentro del bazo murino, la médula ósea, los ganglios linfáticos y el tejido sinovial. Cada paso de este protocolo fue optimizado y probado, resultando en un ensayo altamente reproducible que se puede utilizar para otros modelos de ratón OA quirúrgicos y no quirúrgicos.

Introduction

La osteoartritis (OA) es una enfermedad debilitante y dolorosa que involucra diversas patologías de todos los tejidos asociados con la articulación1. Afectando aproximadamente al 3,8% de la población mundial2,OA es una de las enfermedades musculoesqueléticas más prevalentes y se convertirá en la4a causa de discapacidad líder en todo el mundo para 20203. La OA postraumática ocurre después de una lesión articular y representa al menos el 12% de toda la OA y hasta el 25% de la OA en articulaciones susceptibles como la rodilla4,,5. Además, las lesiones articulares aumentan el riesgo de VA por más de cinco veces6. No todas las lesiones con una inestabilidad aparentemente similar desarrollarán OA, y por lo tanto los factores que definen el riesgo de OA a largo plazo sigue siendo difícil. Es crucial para desarrollar tratamientos eficaces para prevenir y/o tratar la OA postraumática, investigar y definir mejor la patología específica de la lesión, las causas y los mecanismos que predisponen a OA1.

OA y su definición de la destrucción del cartílago se atribuyó previamente por completo al estrés mecánico y, por lo tanto, OA se consideró una enfermedad no inflamatoria2. Sin embargo, estudios más recientes han demostrado una infiltración inflamatoria de membranas sinoviales y un aumento de las células inflamatorias en el tejido sinovial en pacientes con OA en comparación con controles saludables2,arrojando luz sobre un componente inflamatorio como una fuerza motriz potencial en OA. Otros estudios indicaron que las anomalías tanto en el perfil de células T CD4+ como en las de CD8+, así como en monocitos/macrofagos del sistema inmunitario innato, pueden contribuir a la patogénesis de OA2,,7. Las investigaciones detalladas sobre estas anomalías revelaron funciones relevantes para varios subconjuntos de células T2,tales como Th18, Th29, Th178 y T poblaciones reguladoras (Treg)10,11. A pesar de esta evidencia convincente, la relación causal entre la alteración de las respuestas de las células T y el desarrollo y progresión de OA todavía se desconoce2.

Además de que las células T específicas que desempeñan un papel en la OA, estudios recientes sugieren que los macrófagos polarizados/activados diferencialmente pueden estar asociados con la patogénesis de OA12. En particular, los macrófagos procedentes de monocitos sanguíneos se acumulan en el sinovium y se polarizan en macrófagos activados clásicamente (M1) o, alternativamente, macrófagos activados (M2) durante el desarrollo de OA, lo que implica una correlación entre los macrófagos derivados de monocitos y OA13. Por el contrario, ciertos subconjuntos de macrófagos pueblan los órganos a tiempo durante el desarrollo y sostenen sus números en una materia independiente de monocitos14. Recientemente, se mostró una función protectora conjunta mediada por una barrera de unión estrecha para estos macrófagos residentes en tejidos sinoviales (STRM)14. Estos hallazgos indican que las anomalías en subconjuntos de macrófagos particulares pueden desempeñar un papel crucial durante el desarrollo de la OA. Sin embargo, se desconocen las interacciones entre esta respuesta celular inflamatoria y los cambios estructurales en la articulación posterior al trauma.

Históricamente, el análisis de células inmunitarias en el tejido sinovial se limitó a la inmunohistoquímica (IHC) o a la expresión de ARNm mediante la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) se aproxima15,,16. Sin embargo, tanto IHC como RT-PCR carecen de la capacidad de identificar varios tipos de células diferentes y sus subconjuntos simultáneamente, limitando así la aplicabilidad de estos métodos. Además, IHC se limita al análisis de pequeñas muestras de tejido y puede perder las acumulaciones de células inflamatorias focales. En los últimos años, se han desarrollado una miríada de marcadores de superficie para varios tipos de células, y los subconjuntos de células inmunitarias ahora se pueden identificar de forma fiable mediante combinaciones distintas de estos marcadores. Debido al progreso técnico constante, los citometros de flujo ahora son capaces de identificar una multitud de fluorocromos diferentes simultáneamente permitiendo el análisis de grandes paneles de anticuerpos multicolores.

La citometría de flujo proporciona a los investigadores una técnica poderosa que permite la identificación y cuantificación simultáneas de una multitud de células inmunitarias y sus subconjuntos a nivel de célula única. Hemos desarrollado y optimizado tanto un ensayo de tinción extracelular para identificar monocitos/macrofagos y sus subconjuntos como un ensayo de tinción extra/intracelular para identificar las células T y sus subconjuntos dentro del bazo murino, la médula ósea, los ganglios linfáticos y el tejido sinovial. Cada paso de este protocolo fue optimizado y probado dando como resultado un ensayo altamente reproducible que se puede utilizar para otros modelos de ratón OA quirúrgicos y no quirúrgicos17.

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Protocol

El Comité de ética animal del Distrito De Salud Local del Norte de Sídney ha aprobado todos los procedimientos mencionados en este protocolo. Los ratones son alojados y cuidados de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica de Australia Revisado 2010). Para todos los experimentos se utilizaron ratones macho C57BL/6 de 10-12 semanas de edad.

NOTA: Para inducir la OA postraumática, se realizó la desestabilización quirúrgica del menisco medial (DMM) en la articulación de la asfixia derecha. La información detallada sobre este modelo animal fue publicada por Glasson et al.18. En resumen, la anestesia general se induce en una cámara de inducción utilizando isoflurano y posteriormente se mantiene usando un cono nasal. La pierna quirúrgica se afeita con una cuchilla de afeitar y el sitio quirúrgico se lava y frota con etanol para minimizar la contaminación. A continuación, el animal se traslada al microscopio de operación y se coloca sobre una toalla estéril y la pierna cubierta con una cortina de papel estéril para aislar el sitio quirúrgico y minimizar la contaminación. Usando el microscopio, se hace una artrotótoma medial de 0,5 cm, la rótula se luxa lateralmente, y la almohadilla de grasa de infra-patella elevada para exponer el ligamento menisco-tibial medial, que es transectado con fórceps disectores. La articulación se enjuaga con solución salina estéril para eliminar cualquier sangre y la herida se cierra en tres capas – cápsula articular, tejido subcutáneo (utilizando material de sutura) y piel (utilizando pegamento de tejido quirúrgico). Los métodos descritos en este protocolo, sin embargo, se pueden aplicar a otros modelos y métodos para inducir OA. OA se puede inducir a ambos lados del animal, y al cosechar tejidos, es importante cosechar los ganglios linfáticos ipsilaterales (drenantes).

1. Aislamiento del bazo, médula ósea contralateral, ganglios linfáticos ipsilaterales que drenan el stifle y el tejido sinovial

  1. Eutanasia el ratón por luxación cervical. Coloque el ratón en una posición supina bajo un microscopio diseccionado y limpie el pecho, el abdomen y las piernas con 70% de etanol. Abra cuidadosamente la piel en la línea media durante la longitud del abdomen usando tijeras rectas dejando intacta la cavidad abdominal.
  2. Tire suavemente de la piel en el lado derecho del animal lejos del músculo subyacente dejando el tejido adiposo subcutáneo unido a la piel. Normalmente, la tracción suave por sí sola separará la piel y el tejido adiposo subyacente del músculo. Las adherencias esporádicas deben cortarse con tijeras finas para reducir al mínimo la tensión necesaria para separar los tejidos y reducir la posibilidad de dañar los ganglios linfáticos. Identifique un cruce de tres vasos burlándose suavemente del tejido adiposo situado en el muslo utilizando dos fórceps finos curvados. El ganglio linfático inguinal se encuentra en el cruce y se puede identificar por su forma ovoide y color ligeramente más oscuro.
  3. Retire el ganglio linfático inguinal utilizando fórceps de disección fina. Tenga cuidado de no romper la cápsula. Retire la grasa restante en la superficie del ganglio linfático con los fórceps.
  4. Abra la cavidad abdominal e identifique el bazo. Corta el bazo con tijeras finas. Tire suavemente de los intestinos a un lado para exponer la aorta y su bifurcación teniendo cuidado de no dañarlos, con el fin de minimizar el riesgo de contaminación. El ganglio linfático ilíaco se encuentra en el segmento terminal de la aorta abdominal y el origen de la arteria ilíaca común. Retire el ganglio linfático ilíaco derecho y proceda como se describe en 1.3.
  5. Retire suavemente la piel de ambas extremidades posteriores. Disecciona el fémur izquierdo limpiándolo del tejido muscular usando la cuchilla y las tijeras finas. Desconecte cuidadosamente la sofocación y la articulación de la cadera dejando todo el hueso intacto y retire el fémur.
  6. Identifique el tendón de la rótula de la articulación de la asfixia derecha, luego retire el tejido muscular adyacente proximal a esto usando tijeras finas hasta que se exponga aproximadamente 5 mm de tendón de cuádriceps proximal a la rótula. A partir de entonces, cortar a través del tendón del cuádriceps aproximadamente 3-4 mm proximal a la rótula para formar un mango y el uso de fórceps finos suavemente tire de la articulación. Esto hará visibles los bordes de la unión de la cápsula articular al fémur, y usando una hoja de bisturí cuidadosamente cortada a lo largo de los bordes de la cápsula articular en ambos lados, comenzando en el fémur que va hacia la tibia, con el fin de maximizar la cantidad de membrana sinovial que se cosecha. Mientras que el corte es importante mantener una tracción suave en el tendón del cuádriceps y hacer una pausa cuando el bloque de tejido sinovial sólo está unido a la tibia. En esta etapa, la almohadilla de grasa intraarticular es ahora claramente visible distal a la rótula y se puede separar suavemente de la articulación y el aspecto anterior de los meniscos utilizando la hoja. A partir de entonces, corte a lo largo de la parte restante de la cápsula articular (porción tibial) para eliminar el bloque de tejido sinovial.
    NOTA: Este paso tiene que hacerse con mucha precisión para permitir resultados fiables. Después de completar la disección, el "bloque de tejido sinovial" debe consistir en la rótula, tendón de rótula, almohadilla de grasa infrapatelar, revestimiento sinovial supra- e infrapatllar receso y cápsula articular asociada anterior a los ligamentos colaterales. Mantenga todos los tejidos húmedos durante la disección utilizando una solución salina al 0,9%.
    NOTA: Coloque cada muestra de bloque de tejido sinovial en un pozo separado de una placa etiquetada de 24 pozos que contenga 1,5 ml de RPMI 1640 medio. Combina tanto el ilíaco como el ganglio linfático inguinal en un pozo y agrupa los tejidos de dos ratones.

2. Generación de suspensiones de una sola célula a partir de cada tejido

NOTA: Para garantizar que los números de celda suficientes para el análisis de flujo de tejidos sinoviales de dos ratones necesitan ser agrupados. En el protocolo actual, acomoda todos los tejidos de los mismos dos ratones para mantener la analogía. Además, se combinaron ganglios linfáticos ilíacos e inguinales para cada animal, lo que resultó en un total de 4 ganglios linfáticos para cada muestra. En general, los números de células en el bazo, la médula ósea y los ganglios linfáticos de un animal son suficientes para realizar análisis de flujo y se puede aplicar el protocolo. Sin embargo, cuando se utilizan tejidos de un solo animal tiempos de lesing puede necesitar ser ajustado.

  1. El bazo
    1. Coloque los dos bazos agrupados en un colador celular de 70 m encima de un tubo de 15 ml. Macerar suavemente el bazo a través del filtro de malla utilizando un émbolo estéril de jeringa de 3 ml. Lavar el colador con frecuencia con un total de 6 ml de RPMI 1640 medio complementado con 10% FBS.
    2. Girar las células (500 x g, 5 min, RT) y resuspender el pellet en 5 ml de tampón de lysis de glóbulos rojos (RBC). Incubar durante 5 minutos en RT y detener la reacción diluyendo el tampón de lelisis con 10 ml de PBS. Gire las células (500 x g,5 min, RT) y repita este paso una o hasta que no haya más RBC en el pellet.
      NOTA: Vuelva a filtrar la suspensión con un colador celular de 30 m en un nuevo tubo de 15 ml entre las dos rondas de lesión para eliminar las células coaguladas.
    3. Una vez completada la lesión, gire las células (500 x g,5 min, RT), deseche el sobrenadante y el pellet resuspend en 1 ml de PBS. Cuente el número de celdas vivas en un hemocicómetro usando la exclusión azul de Trypan.
  2. Los ganglios linfáticos
    1. Coloque los cuatro ganglios linfáticos agrupados en un colador celular de 70 m encima de un tubo de 15 ml. Se puede separar suavemente los ganglios linfáticos en una suspensión de una sola célula presionando con un émbolo estéril de jeringa de 3 ml. Enjuague el colador con frecuencia con un total de 6 ml de RPMI con 10% de FBS.
    2. Girar las células (500 x g, 5 min, RT), desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 500 l de PBS. Vuelva a filtrar la suspensión utilizando un colador celular de 30 m en un nuevo tubo de 15 ml para eliminar las células coaguladas. Cuente el número de celdas vivas en un hemocicómetro usando la exclusión azul de Trypan.
  3. La médula ósea
    1. Agarre cuidadosamente el fémur intacto usando un fórceps de pulgar de tejido sin fracturarlo. Cortar el extremo mismo del fémur proximal con una tijera afilada con el fin de facilitar el lavado del hueso. Gire el fémur y coloque una aguja de 23 G en el centro de la muesca intercondylar del fémur. Mientras aplica una presión suave, gire la aguja entre el pulgar y el dedo índice para perforar un agujero en la muesca intercondyar para entrar en la cavidad ósea.
      NOTA: A veces las partículas del hueso pueden obstruir la aguja después de perforar el agujero, para evitar alta presión innecesaria durante el lavado de un cambio de aguja antes de que se recomiende el lavado.
    2. Enjuague el hueso con 6 ml de RPMI con 10% de FBS (o hasta que el lavado se vuelva blanco) utilizando una jeringa de 10 ml con una aguja de 23 G en un colador de células de 70 m que se coloca en un tubo de 15 ml. Presione suavemente la médula ósea a través del colador celular con un émbolo de una jeringa de 3 ml y enjuague el colador con otros 3 ml de RPMI.
      NOTA: Los huesos deben aparecer blancos una vez que toda la médula se haya eliminado por completo.
    3. Girar las células (500 x g, 5 min, RT) y resuspender el pellet en 5 ml de tampón de lylisis RBC. Incubar durante 5 minutos en RT y detener la reacción diluyendo el tampón de lelisis con 10 ml de PBS.
    4. Girar las células (500 x g, 5 min, RT), descartar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 mL de PBS. Vuelva a filtrar la suspensión utilizando un colador celular de 30 m en un nuevo tubo de 15 ml para eliminar las células coaguladas. Cuente el número de celdas vivas en un hemocicómetro usando la exclusión azul de Trypan.
  4. El tejido sinovial
    1. Corta los dos bloques de tejido sinovial en trozos diminutos con una fina tijera quirúrgica. Transfiera las muestras con un medio en un tubo de 15 ml. Enjuagar el pozo antiguo con 0,5 ml adicionales de RPMI para obtener las células restantes y tejidos sinoviales, transferir al tubo de halcón (volumen final 2 ml).
      CONSEJO: Utilice una pipeta de transferencia y corte la punta donde el diámetro se ensancha en este paso.
    2. Reconstituir enzimas y alícuotas según las instrucciones del fabricante (p. ej., Liberase). Añadir suficiente enzima para dar lugar a una concentración final de 1 unidad/ml (un total de 2 unidades por muestra). Digerir a 37oC durante 2 h usando un rotador MACS.
    3. Detenga la digestión añadiendo 8 ml de RPMI con 10% de FBS y filtrar la suspensión celular a través de un colador celular de 70 m en un nuevo tubo de 15 ml. Enjuague el tubo viejo de 15 ml con otros 5 ml de RPMI con 10% de media FCS y filtre la suspensión celular a través del mismo colador celular en el nuevo tubo (15 ml de volumen final).
    4. Girar las células (500 x g, 10 min, RT), desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 500 l de PBS. Cuente el número de celdas vivas en un hemocicómetro usando la exclusión azul de Trypan.

3. Asignación de celdas

  1. Etiquete dos placas de 96 pozos (forma de fondo U) con el tipo de tejido, la identificación de animales y el panel de anticuerpos designado. En este protocolo se utilizan un total de dos paneles de anticuerpos: panel de subconjuntos de monocitos (tinción extracelular) y panel de subconjuntos de células T (tinción extra e intracelular).
  2. Proporcione 5 x 105 celdas por pozo usando las respectivas suspensiones de una sola célula.
    NOTA: Al configurar el experimento, evalúe el número absoluto de células que se espera por grupo y tipo de tejido (los animales tratados tienen un recuento de células más alto en los tejidos que los animales de control). Al resuspender el pellet celular durante el último paso de la generación de suspensiones de una sola célula, elija una cantidad adecuada de PBS para terminar con una concentración de 5 x 105 por 200 l. La placa de 96 pocillos utilizada aquí puede contener un máximo de 300 l y, por lo general, 200 l es ideal para minimizar el riesgo de contaminación cruzada debido a derrames.
  3. Para cada panel y tipo de tejido, distribuya al menos 5 x 105 células como controles no manchados en pozos que hayan sido claramente marcados.

4. Panel de subconjuntos monocitos

  1. Realizar la tinción de viabilidad: Células de giro (500 x g, 5 min, 4 oC) utilizando un hilandero de placa y lavar las células una vez con 200 l de 1x PBS. Preparar una solución de amina reactiva de amina impermeante celular (mancha de viabilidad) diluida 1:50 en 1x PBS. A partir de entonces, resuspender los gránulos celulares con 100 l de esta solución en stock, lo que resulta en un volumen absoluto de 2 l de mancha de viabilidad por pozo. Incubar durante 15 min a 4oC protegido de la luz.
    NOTA: La cantidad óptima de mancha de viabilidad necesaria debe determinarse mediante la realización de una curva de valoración de la dosis. Además, la solución de material de manchas de viabilidad diluida debe utilizarse en un solo día y no almacenarse. Consulte las instrucciones del fabricante para obtener más información sobre cómo reconstituir, diluir y almacenar la mancha de viabilidad.
  2. Durante la incubación, preparar el cóctel de anticuerpos en un volumen adecuado de tampón FACS (CA2+ y Mg+ PBS libre que contiene 0.1%BSA y 0.02% azida sódica). Lavar las células dos veces con 200 ml de tampón FACS, centrífuga (500 x g, 5 min, 4 oC) y resuspender cada pellet con 100 l de la mezcla de anticuerpos o mezcla de control adecuada. Incubar durante 30 min a 4oC protegido de la luz.
    NOTA: Tenga en cuenta que el azida sódica es tóxico para las células. En el protocolo actual la concentración de azida sódica en el tampón de flujo es muy baja (0,02%) y las muestras se ejecutan inmediatamente después de la tinción por lo tanto, sin causar ningún problema. Si se planifican ensayos funcionales aguas abajo de células ordenadas, podría ser beneficioso inventar un tampón FACS fresco cada día de experimentos y no usar azida sódica. Cuando se utiliza una multitud de anticuerpos, se aconseja añadir una cantidad adecuada de "Tampón de manchas brillantes" al cóctel de anticuerpos para mejorar los resultados.
  3. Lavar las células dos veces con 200 l de tampón FACS y resuspender las células en 250 l de búfer FACS + EDTA (buffer FACS que contiene 1 mM EDTA). Transfiera las muestras a tubos FACS etiquetados. Mantener las muestras a 4oC y protegidas de la luz hasta su adquisición.
    NOTA: Las células inmunitarias tienden a ser pegajosas. Para minimizar el riesgo de bloqueo y número de dobletes se recomienda agregar 1 mM EDTA al búfer de flujo final.

5. Panel de subconjuntos de células T

  1. Realizar la tinción de viabilidad: Células de giro (500 x g, 5 min, 4 oC) utilizando un hilandero de placa y lavar las células una vez con 200 l de 1x PBS. Preparar una solución de amina reactiva de amina impermeante celular (mancha de viabilidad) diluida 1:50 en 1x PBS. A partir de entonces, resuspender los gránulos celulares con 100 l de esta solución en stock, lo que resulta en un volumen absoluto de 2 l de mancha de viabilidad por pozo. Incubar durante 15 min a 4oC protegido de la luz.
  2. Mientras incuba las muestras, prepare el cóctel de anticuerpos de tinción extracelular en un volumen adecuado de 1x tampón FACS. Lavar las células dos veces con 200 ml de 1x tampón FACS, girarlas hacia abajo (500 x g, 5 min, 4 oC) y resuspend cada pellet con 100 l de la mezcla de anticuerpos o la mezcla de control adecuada. Incubar durante 30 min a 4oC protegido de la luz.
  3. Realice la tinción intracelular con un kit de fijación y permeabilización siguiendo las instrucciones del fabricante. Lave las células dos veces con 200 ml de 1x tampón FACS y resuspend en 200 l de tampón de fijación. Incubar durante 40 min a 4oC protegido de la luz.
  4. Durante la incubación, preparar el cóctel de anticuerpos (manchación intracelular) en un volumen adecuado de 1x permeabilización y tampón de lavado. Recoger las células girando (750 x g, 5 min, 4 oC) y lavar las células dos veces con 200 l de 1x tampón de perm/lavado.
    NOTA: La fijación y la permeabilización dan como resultado células que tienden a ser un poco más difíciles de peletizar correctamente. Para minimizar la pérdida celular durante los siguientes pasos de lavado, aumente la fuerza centrífuga a 750 x g. Alternativamente, también se podría aplicar un ciclo de hilado más largo. Sin embargo, esto resultaría en un tiempo considerablemente más largo que se necesita para preparar las células.
  5. Células de giro (750 x g,5 min, 4oC) y resuspender cada pellet con 100 l de la mezcla de anticuerpos o mezcla de control adecuada. Incubar durante 40 min a 4oC protegido de la luz.
  6. Lavar las células dos veces con 200 l de 1x tampón de perm/lavado y resuspender las células en 250 l de tampón FACS + EDTA. Transfiera las muestras a tubos FACS etiquetados. Mantener las muestras a 4oC y protegidas de la luz hasta su adquisición.
    NOTA: Para cada anticuerpo, la concentración óptima debe determinarse mediante la realización de una curva de valoración de la dosis. La concentración entre anticuerpos puede diferir drásticamente: se utilizó CD3 y CD80 con un factor de dilución de 1:1, mientras que CD11b y CD4 se utilizaron con un factor de dilución de 1:6400. Al valorar la concentración de anticuerpos, utilice el mismo número de células que se utilizarán durante los experimentos.

6. Compensación, controles adecuados y gating

  1. Configuración del experimento
    1. Una vez que se ha determinado la concentración óptima de anticuerpos, se ejecutan controles no manchados y de una sola mancha para que la compensación se ajuste a la superposición espectral.
      NOTA: Ejecute todos los controles de compensación con celdas y cuentas de compensación. Utilice lo que genere los resultados más brillantes (la IMF más alta de los eventos positivos) para la compensación. La IMF significa intensidad media de fluorescencia y a menudo se utiliza para describir y definir la intensidad media de la señal generada y, por lo tanto, el nivel de expresión de anticuerpos.
    2. Ejecute controles de fluorescencia menos uno (FMO) y controles de isotipo al iniciar un nuevo experimento multicolor. Más detalles sobre FMO se han publicado previamente19.
    3. Determine el voltaje óptimo del área de dispersión hacia adelante (FSC-A) y el voltaje del área de dispersión lateral (SSC-A) para detectar la población de leucocitos en controles no manchados de cada tipo de tejido.
      NOTA: El proceso de fijación y permeabilización altera las dimensiones de la celda. Por lo tanto, los voltajes FSC-A y SSC-A para el Panel de Subconjuntos de Monocitos y el Panel de Subconjuntos de Células T difieren considerablemente. Para encontrar los voltajes óptimos para el Panel de Subconjuntos de Células T, utilice celdas que hayan sido manchadas individualmente con CD3 y puerta trasera hacia las poblaciones de leucocitos mientras ajusta los valores FSC-A y SSC-A.
  2. Estrategia de gating
    1. Una vez que se haya determinado el voltaje óptimo FSC-A y SSC-A, configure una puerta primaria en la población de leucocitos.
      NOTA: Antes de cada experimento, calibrar el citómetro utilizando perlas de calibración según las instrucciones del fabricante y ejecutar perlas sin manchar. Las poblaciones de leucocitos de diferentes puntos de tiempo deben tener propiedades FSC y SSC comparables (se esperan ligeras diferencias entre los tipos de tejido y normales). Si el FSC y el SSC varían considerables problemas para disparar el citómetro y la generación de muestras.
    2. Excluir dobletes: Trazar FSC-A (eje y) y FSC-H (eje x). Los singlets aparecen como una diagonal de esta gráfica. Puerta en singlets.
    3. Excluir celda muerta: Gráfica FVS510 (mancha de viabilidad) (eje X) y FSC-A (eje Y). Las células muertas aparecerán como eventos positivos, por lo que la puerta en las celdas vivas.
      NOTA: Las celdas negativas verdaderas serán visibles en controles no detectados. Por lo tanto, ajuste esta puerta para cada conjunto de muestras cuando ejecute los controles no manchados antes de las muestras manchadas. El panel de anticuerpos y el tipo de célula que se investigan dependen más de la medición adicional. Las estrategias de medición para cada panel utilizado en este protocolo se pueden encontrar en la Figura 1 y la Figura 4,respectivamente.

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Representative Results

A continuación se describen los resultados representativos del panel de subconjuntos de monocitos y del panel de subconjuntos de células T.

La Figura 1 ilustra la estrategia jerárquica de gating para el panel de subconjuntos de monocitos en células inmunitarias recogidas de la médula ósea de animales tratados con DMM. La misma estrategia fue utilizada y verificada en todos los demás tipos de tejido. Al configurar el experimento, se determinó la tensión de área de dispersión hacia delante (FSC-A) y área de dispersión lateral (SSC-A) para cada tipo de tejido para identificar monocitos/macrofagos y excluir células T y desechos (G1). Durante cada experimento, se analizaron los controles no mantenidos de cada tipo de tejido, y se ajustó el voltaje FSC-A y SSC-A cuando fue necesario. Se espera que los voltajes permanezcan similares con el tiempo, si los parámetros cambian drásticamente es probable que se bloquee el citómetro. Además, se utilizaron controles no mantenidos para determinar los verdaderos negativos para la mancha muerta/viva y las puertas se ajustaron cada vez que el experimento se llevó a cabo en consecuencia(Figura 2A). Al diseñar el experimento, los fluorocromos deben elegirse cuidadosamente, y normalmente los marcadores de superficie con baja expresión se emparejan con fluorocromos brillantes (por ejemplo, aquí Alexa Fluor 647 se utilizó para CD206). Existen varias manchas muertas/vivas que pueden ser detectadas por diferentes longitudes de onda; aquí, se utilizó FVS510.

La Figura 3 ilustra los datos de muestra de células inmunitarias aisladas de los tejidos sinoviales y manchadas con marcadores de superficie extracelulares 6 semanas después de que los animales recibieran DMM o cirugía de control de simulación. Todos los subconjuntos se pueden identificar fácilmente utilizando el protocolo tanto en animales de estudio como de control. En particular, se pueden observar diferencias entre grupos para subconjuntos de macrófagos (mayor porcentaje de macrófagos Ly-6C+/MHC-II- (G7) en el grupo DMM) y la expresión de macrófagos M1 y M2 (mayor porcentaje de macrófagos M2 en el grupo DMM).

La Figura 4 visualiza la estrategia jerárquica de gating para el panel de células T extra e intracelulares en células inmunitarias aisladas del bazo de los animales tratados con DMM. Los principios son idénticos a los utilizados para el panel de monocitos. Sin embargo, el proceso de fijación y permeabilización cambia el tamaño y la densidad de las células. Por lo tanto, los parámetros típicos FSC y SSC deben determinarse mediante un proceso de back-gating de celdas CD3+ al configurar por primera vez el experimento para cada tipo de celda. Algunos fluorocromos tienden a acumularse con el tiempo (por ejemplo, PE que se utilizó con FoxP3 aquí). Los agregados pueden modificar potencialmente los resultados debido al alto brillo que influye en la superposición espectral y la compensación. Por lo tanto, todos los anticuerpos fueron vórtices y hilados cada vez antes de su uso con el fin de disminuir los agregados. Además, se utilizó una estrategia de medición para reducir aún más la influencia de los agregados (G2). Durante la configuración de los experimentos se realizó fluorescencia menos uno de los controles (GENES) para cada anticuerpo. Los datos de muestra se muestran en la figura 2B,2C.

La Figura 5 y la Figura 6 muestran las células inmunitarias que fueron aisladas de los ganglios linfáticos (Figura 5) y el tejido sinovial (Figura 6) y se tiñen utilizando el protocolo del panel de células T 4 semanas después de que los animales recibieran cirugía de control de DMM o de simulación. Los datos muestran un mayor porcentaje de células Th1 en animales DMM (G9) en ambos tejidos. Además, la tinción intracelular para células reguladoras T (G11) y células Th17 (G12) es exitosa utilizando el protocolo y se pueden detectar diferencias entre grupos.

Figure 1
Figura 1: Estrategia jerárquica de gating de citometría de flujo utilizando tinción extracelular para identificar monocitos/macrófagos y sus subconjuntos. Las células mieloides se identifican principalmente mediante una gráfica de puntos (G1) de dispersión hacia delante/lado (FSC-A y SSC-A). A partir de entonces, los singlets se detectan utilizando FSC-A y FSC-H (G2) y después se seleccionan las células vivas (G3). Las células de G3 se clasifican además utilizando Ly-6G para identificar neutrófilos (G4) y CD11b para monocitos/macrofagos (G5a). MHC-II se utiliza para identificar células dendríticas (G5b) entre las células positivas CD11b y F4/80 se utiliza para seleccionar entre macrófagos (G6) y monocitos (G12). Los macrófagos se clasifican además en sus subconjuntos utilizando Ly-6C y MHC-II (Ly-6C+/MHC-II- macrófagos (G7); Ly-6C-/MHC-II- macrófagos residentes en tejido (G8); Ly-6C-/MHC-II+ se originaron macrófagos (G9)). Se pueden seleccionar más subconjuntos de la totalidad de los macrófagos y sus respectivos subconjuntos utilizando CD206 y CD80 (M1: CD80+/CD206- (G10); M2: CD80-/CD206+ (G11)). Los monocitos se clasifican además utilizando monocitos MHC-II y CD11c (MHC-II-/CD11c- monocitos (G13); MHC-II+/CD11c- monocitos (G14)). A continuación, el nivel de activación se clasifica utilizando la expresión de Ly-6C y se divide en bajo (G15), medio (G16) y alto (G17). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Datos de muestra que ilustran los controles adecuados tanto en el panel de monocitos como en el panel de células T. (A) El tejido sinovial se extracó 6 semanas después de la cirugía DMM (DMM) o la cirugía de control simulado (sham) y una sola suspensión celular se tiñó utilizando marcadores de superficie extracelulares. Durante cada experimento se utilizaron células no manchadas para determinar verdaderos negativos para la mancha muerta/viva y para establecer puertas (Control). El establecimiento de compuertas utilizando células no manchadas se muestra en el panel A. (B+C) Células del bazo fueron cosechadas de animales de control no tratados, una suspensión de una sola célula generada y teñida utilizando marcadores extra e intracelulares. Los controles fluorescentes menos uno (FMO) se generaron mediante la tinción de células con todo el panel de anticuerpos sin un solo anticuerpo. Se muestran datos de muestra para ambos anticuerpos intracelulares. (B) FMO -RORgt y (C) FMO -Fox-P3. Se realizaron FMOs para ambos paneles y se utilizaron para ajustar cada puerta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Tinción extracelular de monocitos/macrófagos aislados del sinovium de ratones. Los tejidos de la muestra se recogieron 6 semanas después de que los ratones recibieran cirugía de DMM (DMM) o cirugía de control simulado (falso). Puede encontrar más información sobre las puertas utilizadas en la Figura 1. Los datos de ejemplo muestran que todos los subconjuntos se pueden identificar de forma fiable y las diferencias se pueden ver entre grupos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Estrategia jerárquica de gating de citometría de flujo utilizando manchas extra e intracelulares para identificar las células T y sus subconjuntos. Las células T se identifican principalmente mediante una gráfica de puntos (G1) de dispersión hacia delante/lado (FSC-A y SSC-A). Debido a la naturaleza de los agregados de anticuerpos utilizados deben excluirse utilizando CD3 y CD4 (G2). A partir de entonces, los singlets se detectan utilizando FSC-A y FSC-H (G3) y después se seleccionan las células vivas (G4). Las células de G4 se clasifican además utilizando NK1.1 para identificar células asesinas naturales (G5) y CD3 para identificar células T (G6). El nivel de activación se determina mediante CD69 (G6b). A partir de entonces, CD4 y CD8 se utilizan para identificar células de asesino en T (CD4-/CD8+ (G7)) y células T-helper (CD4+/CD8- (G8)). Las células T-helper se clasifican en celdas Th-1 (C-X-CR3+/CCR4- (G9)) y Th-2 (C-X-CR3-/CCR4+ (G10)) utilizando C-X-CR3 (CD183) y CCR4 (CD194). Además, las células Th-17 (CD25+/RORgt+ (G11)) y las células reguladoras T (CD25+/Fox-P3+ (G12)) se identifican mediante marcadores intracelulares. Además, los subconjuntos de celdas de memoria se identifican desde celdas T-helper mediante CD44 y CD62L (CD44-/CD62L+ ingenuas celdas de memoria T (G13); Células de memoria T central CD44+/CD62L+ (G14); CD44+/CD62L- efecto de celdas de memoria T (G15)). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Tinción extracelular e intracelular de células T aisladas de ganglios linfáticos drenantes de ratones. Los tejidos de la muestra se recogieron 4 semanas después de que los ratones recibieran cirugía de DMM (DMM) o cirugía de control simulado (falso). Puede encontrar más información sobre las puertas utilizadas en la Figura 4. Los datos de ejemplo muestran que todos los subconjuntos se pueden identificar de forma fiable y las diferencias se pueden ver entre grupos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Tinción extracelular e intracelular de células T aisladas del tejido sinovial de ratones. Los tejidos de la muestra se recogieron 4 semanas después de que los ratones recibieran cirugía de DMM (DMM) o cirugía de control simulado (falso). Puede encontrar más información sobre las puertas utilizadas en la Figura 4. Los datos de ejemplo muestran que todos los subconjuntos se pueden identificar de forma fiable y las diferencias se pueden ver entre grupos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los métodos descritos en este protocolo han sido diseñados y probados para identificar de forma fiable varios subconjuntos tanto de monocitos/macrofagos como de células T dentro del bazo murino, médula ósea, ganglios linfáticos y tejido sinovial en un modelo murino de osteoartritis (OA). El protocolo actual se puede modificar fácilmente para investigar diferentes tipos de tejido u otros tipos de células mediante el intercambio de anticuerpos, y se puede utilizar para modelos murinos alternativos de OA. Al analizar otros tipos de tejido, es fundamental probar la especificidad de cada anticuerpo, ya que la expresión de marcadores superficiales de células inmunitarias varía en cada tejido20. Además, al intercambiar anticuerpos, es necesario realizar una curva de valoración de la dosis para establecer la concentración óptima de anticuerpos, así como repetir el proceso de compensación para abordar los cambios en la superposición espectral.

En el protocolo actual, OA se indujo utilizando el ratón DMM modelo18. Los modelos animales más utilizados y establecidos están en el ratón, porque esta especie proporciona múltiples ventajas en la investigación de la fisiopatología de la OA postraumática17. En el ratón en particular, se han descrito modelos quirúrgicos y no quirúrgicos de OA17:el más común es la desestabilización del menisco medial (DMM), la transección quirúrgica del ligamento cruzado anterior (ACLT) y la ruptura no quirúrgica del ACL (ACLR), respectivamente21. Todos estos modelos animales son adecuados para la investigación sobre el papel de la inflamación celular en la patología de la OA postraumática y el protocolo actual ha sido probado con éxito para todos los modelos animales mencionados anteriormente en el laboratorio. Aunque todos los modelos animales anteriores están establecidos y se han descrito en la literatura, cada uno tiene sus propias fortalezas y limitaciones que se han discutido en detalle en otroslugares 17 y por lo tanto se discuten sólo brevemente a continuación. Todos los modelos quirúrgicos están sujetos al enfoque quirúrgico, al proceso de cicatrización de heridas y a su respuesta inflamatoria asociada. Al evaluar la contribución de las células inflamatorias al desarrollo de la OA postraumática, esta respuesta inflamatoria de cicatrización de heridas podría servir como un confundidor, especialmente durante los primeros momentos después de la intervención. Además, los procedimientos DMM y ACLT deben llevarse a cabo de manera muy estandarizada para minimizar la variabilidad entre los animales. La cirugía ACLT es mucho más difícil de aprender que la cirugía DMM y requiere una mayor exposición quirúrgica que DMM para identificar definitivamente y asegurar la lesión sólo al LCA y evitar el daño iatrogénico a otros tejidos articulares18. La ruptura de LCA no quirúrgica es una forma estandarizada y muy eficiente de inducir OA postraumático. Sin embargo, es necesario un dispositivo especializado que aplique una sola carga de compresión controlada a la tibia de la rodilla flexionada. Este dispositivo tiene que ser calibrado y probado con el fin de obtener resultados comparables y confiables. Además, el modelo ACLR induce daños articulares muy graves y progresivos en ratones con marcada erosión de la meseta tibial medial posterior22 que no se observa con lesión de LCA en otras especies incluyendo humanos.

Con el fin de caracterizar de forma integral el proceso inflamatorio y su componente celular durante el desarrollo de la OA, es deseable no sólo investigar el tejido sinovial, sino también los ganglios linfáticos locales, así como los órganos linfoides secundarios, como el bazo y la médula ósea. Los patrones de drenaje linfático de la articulación de la rodilla se han caracterizado en ratones y líquido linfático de los drenajes articulares de la rodilla a través del ganglio linfático ilíaco e inguinal en una dispersión variable23,,24. Con el fin de facilitar la comparabilidad entre los animales, decidimos en este protocolo agrupar el ganglio linfático inguinal e ilíaco. Por el contrario, mientras que cerca de la rodilla, el ganglio linfático popliteal drena el pie trasero y no desempeña un papel durante los procesos inflamatorios de la rodilla.

Los ratones tienen un pequeño volumen de tejidos sinoviales intraarticulares25 y el aislamiento de las células inmunitarias aquí sigue siendo difícil. En el protocolo actual, se adaptaron técnicas de recolección de tejidos sinoviales para permitir el aislamiento del número máximo de células inmunitarias. Por lo tanto, la técnica de recolección incluye los huecos supra e infrapatelares, así como la almohadilla de moda infrapatelar, debido a su alto número de células inmunitarias26. El proceso de digestión y la elección de la enzima se optimizaron para digerir completamente la membrana sinovial y el tejido graso, dejando el tendón, y la rótula y su cartílago sin aire. Por lo tanto, el protocolo actual introduce un método reproducible de recolección de células inmunitarias del tejido sinovial.

El análisis de citometría de flujo tiene múltiples ventajas al investigar procesos inmunes celulares durante el desarrollo de OA; sin embargo, esta técnica tiene limitaciones. Debido al pequeño número de células inmunitarias en el tejido sinovial, es necesario agrupar muestras de tejido de al menos dos animales para obtener una muestra. Debido al gran número de fluorocromos y colores utilizados en este protocolo, se debe prestar especial atención a una compensación meticulosa de una posible superposición espectral para cada tipo de tejido y la compensación debe ser reevaluada consistentemente a lo largo del uso de esta técnica. Debido al gran número de marcadores disponibles y a la considerable variación entre los estudios para identificar una determinada población, otra posible limitación es la elección de los marcadores utilizados para identificar las células19. La citometría de flujo permite cuantificar "eventos", que no necesariamente se coordina con el total de celdas. Con el fin de obtener un análisis verdaderamente cuantitativo, uno necesita adquirir cuentas al mismo tiempo al ejecutar el análisis de flujo o contar celdas en suspensiones de celda única de antemano para obtener números absolutos (como se hace aquí). En general, los principios de este protocolo (por ejemplo, cómo diseñar y configurar un panel de flujo o técnicas utilizadas para preparar suspensiones de una sola célula) podrían adaptarse potencialmente para muestras humanas. Sin embargo, los marcadores superficiales de las células inmunitarias humanas difieren de las células murinas y, por lo tanto, es necesario seleccionar y probar los anticuerpos adecuados. Además, la duración de la lysis RBC y el volumen adecuado de búfer deben determinarse, ya que es muy probable que sea diferente. Antes de adaptar los métodos de este protocolo a otras especies o tejidos es necesario realizar pruebas meticulosas de cada paso para garantizar que los métodos funcionen según lo previsto.

A pesar de sus limitaciones, el análisis de citometría de flujo de células inmunitarias sigue siendo una técnica poderosa que permite identificar subconjuntos de células monocíticas y células T a nivel de célula única. En particular, el protocolo actual introduce una técnica fiable y reproducible que puede identificar y cuantificar la respuesta inmune celular durante el desarrollo de OA en el tejido sinovial y órganos linfáticos secundarios. En el futuro, esta técnica puede ayudar a caracterizar la respuesta inmune en varios modelos animales que inducen la osteoartritis y en lo sucesivo evaluar la eficacia de los fármacos moduladores inmunes en esta enfermedad debilitante.

En conclusión, este protocolo de citometría de flujo describe un método detallado y reproducible para identificar monocitos/macrofagos y subconjuntos de células T utilizando ensayos de tinción extra e intracelular dentro del bazo murino, médula ósea, ganglios linfáticos y tejido sinovial utilizando un ratón modelo de osteoartritis quirúrgica establecido.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer a Andrew Lim, Ph.D. y Giles Best, Ph.D. por su ayuda en la configuración del citómetro de flujo. Este proyecto fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG-HA 8481/1-1) adjudicada a PH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC anti-mouse CD194 (CCR4) BioLegend 131212 T-Cell Panel
Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst BD 566385 Buffers
Fixable Viability Stain 510, 100 µg BD 564406 T-Cell Panel
Fixable Viability Stain 510, 100 µg BD 564406 Monocyte Panel
Liberase, Research Grade Roche 5401127001 Enzyme for synovial tissue
Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg BD 564985 Monocyte Panel
Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg BD 562454 Monocyte Panel
Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg BD 742274 T-Cell Panel
Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg BD 565250 Monocyte Panel
Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg BD 563061 T-Cell Panel
Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg BD 557596 T-Cell Panel
Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg BD 552775 T-Cell Panel
Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg BD 565480 T-Cell Panel
Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg BD 565261 T-Cell Panel
Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg BD 740664 T-Cell Panel
Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg BD 563687 Monocyte Panel
Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg BD 563332 T-Cell Panel
Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg BD 565411 Monocyte Panel
Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg BD 560408 T-Cell Panel
Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg BD 563414 Monocyte Panel
Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg BD 560593 Monocyte Panel
Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg BD 560600 Monocyte Panel
Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg BD 564143 T-Cell Panel
Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg BD 562894 T-Cell Panel
Red Blood Cell Lysing Buffer N/A N/A Buffers
Transcription Factor Buffer Set 100Tst BD 562574 Buffers

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References

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Haubruck, P., Colbath, A. C., Liu, Y., Stoner, S., Shu, C., Little, C. B. Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model. J. Vis. Exp. (158), e61008, doi:10.3791/61008 (2020).

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