Summary
En flaskehals i den "design-build-test" cyklus af mikrobiel teknik er den hastighed, hvormed vi kan udføre funktionelle skærme af stammer. Vi beskriver en høj-throughput metode til stamme screening anvendes til hundreder til tusindvis af gær celler pr eksperiment, der udnytter dråbe-baserede RNA sekventering.
Abstract
De kraftfulde værktøjer til rådighed til at redigere gær genomer har gjort denne mikrobe en værdifuld platform for teknik. Selv om det nu er muligt at konstruere biblioteker med millioner af genetisk adskilte stammer, er screening for en ønsket fænotype fortsat en væsentlig hindring. Med eksisterende screeningsteknikker er der en afvejning mellem informationsoutput og gennemløb, hvor screening med høj overførselsmængde typisk udføres på ét produkt af interesse. Derfor præsenterer vi en tilgang til at fremskynde stamme screening ved at tilpasse enkelt celle RNA sekventering til isogene picoliter kolonier af genetisk manipuleret gær stammer. For at løse de unikke udfordringer ved at udføre RNA-sekvensering på gærceller, dyrker vi isogene gærkolonier i hydrogels og spheroplast, før vi udfører RNA-sekvensering. RNA-sekventeringsdata kan bruges til at udlede gærfænotyper og sortere manipulerede veje. Skalerbarheden af vores metode adresserer en kritisk obstruktion inden for mikrobiel teknik.
Introduction
Et primært mål for mikrobiel teknik er at ændre mikrober for at få dem til at producere værdifulde forbindelser1,2. S. cerevisiae har været den primære organisme for mikrobiel teknik på grund af sin lethed af kultur og bredden af værktøjer til rådighed til engineering af sit genom3,4,5. Men en forhindring forbliver i at udføre funktionelle skærme på den modificerede gær: screening gennemløb halter bagefter genom teknik ved størrelsesordener. Screening indebærer typisk isolering af stammer i mikrobrøndplader og fænotypebestemmelse ved måling af produktionen af en bestemt forbindelse6,7. Gennemløbet af denne proces er begrænset af de store mængder reagens, der er nødvendige for at beregne individuelle stammer i hundrede mikroliterreaktioner. Dråbemikrofluidics giver en attraktiv løsning til at øge gennemløbet af gærscreening ved størrelsesordener ved nedskaleringsreaktioner, der normalt udføres i godt plader8. Men, som med godt plade skærme, dråbe skærme typisk opdage enkelt produkt forbindelser, som giver begrænset information i den globale funktion af manipuleret vej9,10,11.
RNA-sekventering (RNA-seq) kan muliggøre en mere omfattende karakterisering af vejdriften ved at tillade, at udtryksniveauer for alle relevante gener vurderessamtidigt 12,13. Desuden tillader dråbemetoder, at tusindvis af celler profileres pr. eksperiment, hvilket giver det nødvendige gennemløb til at screene biblioteker af manipulerede varianter14,15. RNA-seq-metoder er dog optimeret til pattedyrceller; gær, til sammenligning, har mindre mRNA per celle og en celle væg, der er vanskeligt at fjerne16,udelukker deres sekventering af eksisterende metoder. Hvis en høj-gennemløb dråbe metode kunne udformes for at aktivere gær RNA-seq, ville det give en skalerbar, omkostningseffektiv, og informations-rige fænotastering platform for gær engineering.
Vi præsenterer en detaljeret protokol over vores nyligt udviklede metode til sekventering gær celler ved hjælp af høj-throughput dråbe microfluidics17. For at overvinde udfordringen fra begrænset RNA indkapsler vi og kulturerer enkelte gærceller i picoliter hydrogelkugler. Kultur duplikerer cellerne og giver hundredvis af kopier, der deler den samme manipulerede vej; dette reducerer variationen på grund af encellede genekspression, samtidig med at mængden af RNA, der er tilgængelig til sekvensering, øges betydeligt. Efter kulturbaseret forstærkning spheroplast vi cellerne, fjerne cellevæggen via bulk enzymatisk fordøjelse. Cellemembraner forbliver intakte, således at hver isogen koloni og dens tilknyttede mRNA forbliver indkapslet i deres hydrogel kugler. Dette giver os mulighed for at parre de enkelte kolonier med mRNA capture reagenser og lysis buffer, og mRNA, der skal fanges, stregkodet, og sekvenseret efter Drop-Seq workflow14. Vores metode tillader transskription-dækkende screening af tusindvis af isogene gær kolonier pr eksperiment.
Protocol
1. Fremstilling af mikrofluidisk enhed
- SU-8 master fabrikation
- Den negative maske udformes for de mikrofluidiske kanaler for enhed A og B (Supplerende fil 1 og 2) ved hjælp af computerassisteret designsoftware, og få dem trykt på printkortfilm med en opløsning på mindst 10 μm.
- Placer en ren 75 mm silicium wafer på en spin coater og hæld omkring 1 ml SU-8 på sit centrum. Tænd for vakuum for at fastgøre waferen til borepatronen.
- For enhed A, spin coat SU-8 2150 ved 500 rpm for 30 s, efterfulgt af 30 s ved 2.750 rpm. For enhed B, spin-coat SU-8 2100 ved 500 rpm for 30 s, efterfulgt af 30 s på 2.500 rpm. Dette vil give SU-8 lag af tykkelse 200 μm og 120 μm, hhv.
- Fjern waferen fra spin-coater og sted på en kogeplade ved 95 °C i 60 min til blød bagning.
- Fjern waferen fra kogezonen, og lad den køle af til stuetemperatur. Placer masken på toppen af wafer, og eksponere under en kollimator 190 mW, 365 nm UV LED i 2 min.
- Vafer waferen anbringes på en kogeplade, der er indstillet til 95 °C i 5 minutter, til bagning efter eksponering.
- Fjern waferen, og lad den køle af til stuetemperatur. Stil waferen i et bad af propylenglycol monomethylether acetat (PGMEA) i 20 min.
- Skyl waferen med PGMEA efterfulgt af isopropanol. Hvis der er uigennemsigtige rester under denne proces, gentages skylningen med PGMEA og isopropanol. Lufttørre rafer.
- Waferen anbringes på en kogeplade ved 95 °C i 3 min.
- Fjern og placer waferen i en petriskål med en diameter på 90 mm.
- Polydimethylsiloxan (PDMS) støbning på SU-8 master
- Bland et 10:1 masseforhold mellem silikonebase og hærdningsmiddel sammen. Degas PDMS efter blanding i ca 30 min.
- Hæld afgassede PDMS oven på SU-8 master, indtil mindst en 5 mm tyk tår er dannet på toppen af wafer.
- Degas PDMS på toppen af wafer i ca 30 min.
- Vågederen anbringes i en 65 °C-ovn i mindst 80 minutter for at hærde PDMS.
- Skær den hærdede PDMS plade ud af waferen.
- Placer PDMS-pladen med de mikrofluidiske funktioner opad, og punch indløb og udløbhuller med en 0,75 mm biopsipunch.
- Rengør en 50 mm x 75 mm glasrutsjebane med isopropanol, og fjern alt støv fra den mikrofluidiske funktionsside af PDMS-pladen med tape.
- Udsæt det rensede glasglasdias og PDMS-pladen med de mikrofluidiske funktioner med et modpåstil 100 Pa(1 mbar O2)plasma i 1 min.
- Placer PDMS-pladen med funktionerne med forsiden nedad på glasslidsen for at give mulighed for limning. Stil slæden i en 65 °C ovn i mindst 30 minutter for at fuldføre limningen.
- Alle mikrofluidiske kanaler behandles ved at skylle med en fluorholdig overfladebehandlingsvæske. Enheden bages i en 65 °C ovn i mindst 10 minutter for at fordampe væsken.
2. Gærindkapsling i hydrogels ved hjælp af anordning A
- Tag gær vokser i en suspension kultur og regne med en hæmocytometer.
- Resuspender cellerne i fosfatbufferet saltvand (PBS) til en koncentration på ca. 750 k/ml. Dette sikrer, at 30% af hydrogels vil have en gær celle i dem. Kun omkring halvdelen af gærceller vokser til kolonier, hvilket fører til ~ 15% af hydrogels indeholdende gær kolonier.
- Der blandes et ultralavt smeltepunkt ved 2% w/v i PBS og opvarmes ved 90 °C, indtil det smeltes. Dette tager ~ 10 min.
- Lad agarose-blandingen i en sprøjte med et påsatte filter på 0,22 μm i en sprøjtepumpe foran rumvarmeren indstillet til 80 °C.
- Læg en sprøjte fyldt med gærsuspensionen og en sprøjte, der indeholder fluorholdig olie med 2% w/v ionisk fluorosurfactant18, i sprøjtepumper.
- Tag coflow drop splitter enheden i afsnit 1 og tilslut slangen fra sprøjterne ind i enheden. Før slangen fra stikkontakten ind i et konisk rør på 15 ml i en isspand til opsamling af dr.
- Flow i de tre løsninger ind i enheden med følgende strømningshastigheder:
- Før gærsuspensionen med strømningshastigheden på 3 ml/h.
- Gasagaroseblandingen flower med en strømningshastighed på 3 ml/h.
- Fluorholdig olie omstilflydes med en strømningshastighed på 15 ml/h.
- Saml ca. 1 ml emulsion. Vent yderligere 5 minutter, så agarose kan indstilles helt.
3. Breaking og vask gel til kultur
- Der tilsættes et tilsvarende volumen på 20% perfluoroctanol (PFO) i fluorholdig olie til emulsionen. Inverter det koniske rør et par gange for at give mulighed for blanding.
- Spin ned den brudte emulsion på 2.000 x g i 2 min. Gelerne vil pellet over olie og PFO faser.
- Oliefasen fjernes, og der tilsættes 2 ml TE-TW-buffer (10 mM Tris pH = 8,0, 1 mM EDTA, 0,01% Tween-20) for at suspendere gelerne igen. Overfør suspensionen til et nyt konisk 15 ml rør.
- Pellet ned geler som i trin 3.2 og vask endnu en gang i TE-TW for i alt to vasker.
- Fjern supernatant og resuspendgels i 2 ml medier. Overførsel til et 5 ml kulturrør.
- Inkuber ved 30 °C natten over under omrystning.
BEMÆRK: Efter nattens inkubation kan gærhydrogels holdes ved 4 °C i flere dage.
4. Gær koloni lysis
- Geler overføres til et konisk rør og pellet hydrogels på 15 ml ved 2.000 x g i 2 min.
- Hydrogels vaskes i PBS 2x.
- Vask i 1x sfærisk buffer 1x.
- Udfør en 2-50x fortynding af sfærisk enzym i sfærisk buffer og tilsæt 1 ml til hydrogels.
- Inkuber ved 37 °C i 1 time. Den behandlede gær vil se mere gennemsigtig (Figur 3A).
- Tag den nederste 0,8 ml hydrogel suspension og overfør til en 1 ml uncapped sprøjte.
- Sprøjten anbringes i den 3D-printede sprøjteholder (Supplerende fil 3) og drej ved 2.000 x g i 2 min. Dette vil få hydrogels til at lukke pack i sprøjten hovedet.
5. mRNA-indfangning fra lysed gærkolonier ved hjælp af anordning B
- Tag 240.000 Drop-Seq perler og overfør til et konisk 15 ml rør.
- Pellet Drop-Seq perler ved at dreje ned på 1.000 x g i 1 min.
- Supernatanten fjernes, og perlerne resuspenderes i 2 ml 0,9 x gærlysisbuffer med 500 mM natriumchlorid for en perlesuspensionskoncentration på 120.000 perler/ml.
- Perlesuspensionen overføres til en 3 ml sprøjte med en omrøresbar indsat.
- Der fremstilles en sprøjte, der indeholder flere milliliter 2% w/v perfluorpolyether-polyethylenglycol (PFPE-PEG) overfladeaktivt stof i fluorholdig olie.
- Evakuer alt vandigt hoved af sprøjten, der indeholder tætpakkede hydrogels, og tildæk sprøjten.
- Sæt hydrogel, perlesuspension og oliesprøjter i sprøjtepumper og tilslut via slange i indkapslingsanordningen i afsnit 1.
- Tilslut fra udløbsslangen til et 50 ml konisk rør på is.
- Flow i de tre løsninger ind i enheden med følgende strømningshastigheder:
- Hydrogels en dertil på 0,4 ml/h.
- Flyt perlesuspensionen ved 0,4 ml/h.
- Fluorholdig olie flød ved 1,6 ml/h.
- Saml ~ 1 ml emulsion eller køre enheden, indtil der ikke er flere hydrogels tilbage.
6. cDNA-generation, udarbejdelse af sekventeringsbibliotek og sekvensering
- Der tilsættes 30 ml 6x SSC-buffer og 1 ml PFO til den indsamlede emulsion som angivet i Drop-Seq-protokol14.
- Fortsæt med at følge Drop-Seq-protokollen for at generere cDNA fra mRNA fanget på perler, sekventering bibliotek forberedelse, og sekventering data analyse.
Representative Results
Vi tilpassede den tidligere offentliggjorte Drop-Seq workflow14 til isogen kolonisekventering (ICO-seq) til at udføre genekspressionsprofilering af isogene gærkolonier. Vi isolerede enkelte gærceller og indkapslede dem i agarose microgels (Figur 1A). Efter natten inkubation af microgels, disse indkapslet gær celler voksede til isogene kolonier. Før du lægger geler i en anden mikrofluidisk enhed til mRNA-opsamling, fordøjede vi gærcellevæggen for at gøre mRNA mere tilgængelig(Figur 1B,venstre). Vi tætpakkede disse microgels og fusionerede mRNA capture perler og lysis buffer. Nogle dråber indeholdt præcis en perle parret med en lysed gær koloni. Alle perler i emulsionen blev indsamlet og cDNA syntetiseret og sekvenseret efter Drop-Seq protokollen.
Vi genererede isogene gærkolonier gennem en enkelt gærcelleindkapsling i agarose microgels ved hjælp af en koencapsulation mikrofluidic enhed med en otte dråbe splitter vedhæftet (Figur 2A). Vi fortyndet input gær suspension til en koncentration på ~ 750.000/ml, således at ~ 30% af microgels har præcis en gær i dem. Før du sætter den ultralave smeltetemperatur agarose ind i enheden, vi opløst det ved en forhøjet temperatur og fastholdt sprøjten ved denne temperatur for at forhindre for tidlig gelation. Ved dråbedannelseskrydset (Figur 2B) blev gærceller oprindeligt indkapslet i 160 μmdråber. Efter dråbedannelseskrydset inddelte en ottegange splitter disse dråber i otte 80 μmdråber (figur 2C). Der blev fastgjort et sprøjtefilter på den smeltede agarose for at forhindre træsko i at danne sig i kanalerne, som kan være så smalle som 37 μm under dråbeopdelingen. Vi indsamlede emulsionen på is, som straks begyndte agarose geleringsprocessen. Vi beregnede polydispersity af en typisk emulsion at være ~ 6%(Supplerende figur 1), selv om polydispersity værdier op til 10% er acceptable. Når agarose geler sæt, vi brød emulsion og fjernet oliefase. Gelerne blev vasket i vandig buffer før nedsænkning i vækstmedier. Nattens inkubation af mikrogelerne resulterede i, at der voksede isogene kolonier inden for nogle af mikrogelerne (figur 2D). Procentdelen af hydrogeler, der indeholdt kolonier på mindst 20 celler, afhang af dyrkningsforholdene, herunder inkubationstid og mediesammensætning. I vores demonstration ved hjælp af C. albicans,besluttede vi, at omkring 15% af hydrogels indeholdt en koloni efter 20 h suspension kultur.
En anden koencapsulationsanordning udvundet mRNA fra isogene kolonier (Figur 3A). Før vi læssede gærmikrogelerne ind i mikrofluidisk enhed, vaskede og nedsænkede vi gelerne i en opløsning til at fordøje gærcellevæggene. Korrekt fordøjelse af gærceller blev verificeret ved mikroskopi, med behandlet gær har en mere reflekterende morfologi (Figur 3B). Vi tætpakkede mikrogelerne i en sprøjte og tunede gelinputflowet, så en gel var i hver dråbe. En strøm af mRNA-opsamlingsperler i lysisbuffer blandet med den tætpakkede gelstrøm før dråbefremstillingskrydset (Figur 3C). Vi indsamlede en resulterende emulsion af 160 μm dråber, og kolonier begyndte at lyse og frigive deres cellulære indhold. Vi læssede perler ved en begrænsende fortynding for at minimere antallet af dråber, der indeholder flere perler, men tæt pakning af gelerne under drop-making resulterede i omkring 10% af indsamlede dråber indeholdende en perle med en lysed koloni (Figur 3D).
Vi analyserede genekspression af C. albicans, en art af gær til stede i den menneskelige tarm mikrobiom, ved hjælp af ICO-seq workflow. C. albicans er kendt for sin evne til at skifte mellem to forskellige celle tilstande, kaldes hvid og uigennemsigtig19. Vi bruger en manipuleret C albicans stamme, stamme RZY122, som erstatter en kopi af WH11 genet, kun aktiv i hvide celler med YFP20. Vi opnåede et sæt genekspressionsprofiler ved hjælp af arbejdsgangen og brugte dem til analyse af kolonier, der udtrykker mindst 300 unikke gener. Som referencedatasæt brugte vi C. Albicans udtryksdata fra et tidligere offentliggjort studie17 og filtrerede kolonier ud, der udtrykker færre end 600 unikke gener. Efter at have udført hovedkomponent (PC) analyse og en t-stokastiske nabo indlejring (tSNE) dimensionalitet reduktion21,fandt vi generel overensstemmelse mellem vores prøve datasæt og referencen (Figur 4A). PC-analyse viste, at YFP og WH11 bidrog væsentligt til de to første pc'er. Desuden afslørede tSNE-analysen tre klynger (figur 4B). Mens klynge 2 overvejende bestod af celler fra prøvedatasættet, bestod clusters 0 og 1 af celler fra begge prøver. Ved at overlejre WH11-udtrykket på tSNE(Figur 4C, øverste panel) konstaterede vi, at klynge 1 sandsynligvis indeholdt hvide kolonier. Vi fandt også, at STF2 udtryk steg i klynge 1(Figur 4C, lavere panel), i overensstemmelse med tidligere opnåede data17. I klynger 0 og 2 blev WH11 og STF2 betydeligt reduceret sammenlignet med cluster 1 (figur 4D). Gener involveret i gæring, såsom ADH1, blev upregulated i klynge 0, i overensstemmelse med tidligere undersøgelser af uigennemsigtige celler22. Vi fandt ud af, at kolonier i klynge 2 havde reduceret ribosomrna sammenlignet med kolonier i klynger 0 og 1. Selv om stikprøve- og referencedatasættene blev opnået ved hjælp af den samme cellemasse, tyder dette resultat på, at selv subtile forskelle i eksperimentel håndtering kan påvirke genekspressionen.
Figur 1: Oversigt over ICO-seq-arbejdsgangen. (A)Gær, der voksede i en suspensionskultur, blev fortyndet i buffer og coencapsuleret med smeltet agarose i en flow-fokuseringsdråbegeneratoranordning, der gjorde det muligt for Poisson-belastningen af agarose mikrogeler med enkeltgærceller. Gelerne indstillet, når agarose afkølet, olie / vand suspension blev brudt, og olien blev fjernet, hvilket giver en suspension af gel perler i vand. Efter natten kultur, gær celler voksede til isogene kolonier i microgels. (B) Kolonier blev udsat for en cellevæg nedbrydningbuffer, hvorefter de var tætpakket og coencapsulated med mRNA capture perler i en anden mikrofluidic enhed. Tæt pakning af microgels sikrede, at hver dråbe havde en gel, mens Poisson lastning af perlerne reducerede chancen for flere perler inden for en dråbe. Indsamlede dråber blev behandlet for cDNA syntese og generering af en sekventering bibliotek. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Generation af isogene gærkolonier i agarose mikrogels ved hjælp af anordning A. (A) Skema af mikrofluidisk enhed, der viser placeringen af de tre ind- og udgangsporte. Drop-making krydset er fremhævet med rødt. (B) Nærbillede af frafaldskrydset under normal brug. (C) Mikrograf af opsamlede dråber med et nærbillede af en dråbe, der indeholder en indkapslet celle (indsat). DD) Mikrograf af isogene gærkolonier i agarose mikrogels efter en 24-timers inkubation med et nærbillede af to kolonier (indsat). Alle skalastænger = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Lysis og mRNA-opsamling fra isogene kolonier ved hjælp af anordning B. (A) Skema af mikrofluidisk enhed, der viser placeringen af de tre ind- og udgangsporte. Drop-making krydset er fremhævet med rødt. (B) Mikrograf af gærkolonier efter cellevægsfordøjelse med et nærbillede af en koloni (indsat). (C) Nærbillede af drop-making-krydset under normal brug. (D) Mikrograf af indsamlede emulsioner efter mikrogel- og perleparring med et nærbillede, der viser et fald med en perle og en lysed koloni (indsat). Alle skalastænger = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Analyse af hvidt-uigennemsigtigt koblingsrespons i C. albicans. (A) tSNE-plot af et eksempeldatasæt kombineret med et referencedatasæt fra Liu17. (B) Klyngedannelse af transskriptioner afslører tre klynger visualiseret på en tSNE plot. (C) De vigtigste gener, der var involveret i det hvid-uigennemsigtige koblingsrespons, bidrog til variation en variation som bestemt ved hovedkomponentanalyse. (D) Violin plots af normaliserede udtryk niveauer af YFP og WH11 af klynger markeret på tSNE plot. **angiver p <<< 0,05 og * angiver p << 0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende tal 1 og 2. Klik her for at downloade disse filgures.
Supplerende filer 1-3. Klik her for at downloade disse filer.
Discussion
Vores metode til isogen gærkoloni RNA-sekvensering (ICO-seq) tilpasser en offentliggjort enkeltcelleRNA-sekventeringsplatform, Drop-Seq, til screening af manipulerede gærstammer med høj gennemløb. Gærceller indeholder mindre end 10% af kopierne af mRNA af en typisk pattedyrcelle og har en cellevæg, der skal nedbrydes før mRNA-opsamling16. Disse to faktorer udelukker direkte anvendelse af gær på Drop-Seq eller andre dråbebaserede scRNA-seq platforme. For at løse disse problemer indkapsler vi enkelte celler i hydrogels og dyrker dem til kolonier for at give nok inputmateriale til RNA-sekventering, og vi fordøjer gærcellevæggen for at generere spheroplasts før lysis og mRNA-opsamling. Disse ændringer tilføjer yderligere kompleksitet i ICO-seq-arbejdsprocessen sammenlignet med den oprindelige Drop-Seq-arbejdsproces og er vigtige trin, som brugerne skal sikre, at de forløber problemfrit.
Korrekt drift af enhed A er nødvendig for indkapsling af enkelte gærceller i agarose hydrogels. Korrekt optælling af input gær suspension skal følges for at minimere antallet af hydrogels med mere end én gær celle, samtidig med at sikre, at nok hydrogels indeholder en enkelt celle for at sikre en rimelig celle opsamling effektivitet under mRNA-opsamling. Under mikrofluidisk anordning ser agarosegelblandingen godt ud i opløsning og føres gennem et sprøjtefilter for at minimere risikoen for tilstopning af enheden. Agarose gel blandingen er tyktflydende og den region, hvor en enkelt kanal deler sig i otte er særligt tilbøjelige til tilstopning. Ved at centrere et højhastighedskamera for at visualisere enhedens drift i denne del af enheden, kan brugerne overvåge ensartetheden af dråber, der kommer ud af hver af de otte kanaler, og reagere hurtigt, hvis ensartetheden ændres på grund af træsko i nogen af kanalerne. Inspektion af en lille mængde indsamlet emulsion under mikroskopet giver en sekundær metode til bekræftelse af en emulsion af høj kvalitet.
Efter vækst af gærkolonier inden for hydrogels er der behov for flere forholdsregler for at sikre kvalitet mRNA-ekstraktion på enkelt koloniniveau. Det er vigtigt at optimere den tid gær er i hydrogel kultur, fordi hvis gæren er tilbage i kulturen for længe, vil mange undslippe rammerne af hydrogels, hvilket fører til en højere baggrundssignal under RNA sekventering og lavere følsomhed, når diskriminere mellem celletyper. Korrekt generering af sfærolaster ved hjælp af Zymolyase sikrer, at mRNA frigives efter celleeksponering for lysisbuffer. Visuel inspektion af gærkolonier efter Zymolyase bør give skinnende gærceller. Forkert cellevæg fordøjelse vil føre til lavere RNA capture effektivitet. Endelig skal hydrogels være tætpakket, da de sprøjtes ind i enhed B. Overvågning af hydrogelindgangen med et højhastighedskamera vil gøre det muligt at afslutte emulsionsindsamlingen, når hydrogelerne ikke længere er tætpakket ved input til enheden, ellers vil opsamlingseffektiviteten blive påvirket.
En potentiel bekymring med vores metode er, at microgel kultur gær kan ændre genekspression. Tidligere arbejde med at undersøge gær genekspression i microgels og på agar vise forskelle i genekspression gennemsnit, men generelt en positiv korrelation17, selv om yderligere undersøgelse af denne påstand på en række gær stammer er klogt. Metoden har også begrænset celleopsamlingseffektivitet på grund af stokastiske indlæsning af mRNA-opsamlingsperler efter Poisson-statistik14. I øjeblikket omkring 10% af dråber indeholder en perle og en koloni, og satsen for dobbelt indkapslinger forventes at være under 1%. Dobbelte indkapslinger fører til konfunderende elementer under RNA-seq dataanalyse og deres filtrering er fortsat udfordrende23; en opsamlingsprocent på 25 % ville føre til en tilsvarende stigning i dobbelt indkapslinger til 5 % (supplerende figur 2). Selv om vi demonstrerer ICO-seq ved hjælp af Drop-Seq platformen, er der andre dråbe RNA-seq platforme, der introducerer mRNA fange perler deterministisk snarere end statistisk, såsom kommercielt tilgængelige 10x Genomics Chrom platform15,24. Integrationen af disse platforme med ICO-seq kunne øge fange effektivitet ud over, hvad Poisson statistikker tillader. Endelig er en grundlæggende begrænsning af dråbeRNA-seq den manglende evne til at inddrive celler af interesse efter sekvensering. Denne begrænsning bør tages i betragtning, når man overvejer de typer af gær biblioteker til at analysere ved hjælp af denne metode.
Celle-til-celle heterogenitet er blevet påvist på klonal niveau for mikrober som E. coli25 og S. cerevisiae26 afslører nye celle hedder det, at en bulk-niveau analyse ellers ville maskere. Bulk RNA-seq analyser udført på C. albicans tendens til enten at se på befolkningen sationom ændringer, eller hvide og uigennemsigtige celler som to separate populationer27,28. Anvendelsen af ICO-seq kan føre til opdagelsen af yderligere understater og skabe en analytisk ramme for at opdage nye celletilstande inden for andre gærarter. Men væksten af celler i hydrogels er ikke begrænset til gær: andre celletyper, såsom pattedyr, bakterielle, og andre svampeceller kan også dyrkes inden hydrogels29,30. Sekvenseringen af isogene kolonier versus enkelte celler fører til et gennemsnit ud af biologisk støj på grund af celle-til-celle variation, hvilket forbedrer forskelsbehandlingen mellem celletyper. Dette kan hjælpe, når man analyserer celler, hvor genetisk mangfoldighed centre på specifikke syntese veje. De udvidede muligheder for celletypeinput til ICO-seq og dens potentielle integration med kommercielt tilgængelige dråbeRNA-seq platforme positionerer ICO-seq som en lovende platform til dissekering af cellulær heterogenitet på det genetiske niveau.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette projekt blev støttet af National Science Foundation Career Award DBI-1253293, National Institutes of Health New Innovator Award DP2AR068129 og tilskud R01HG008978, National Science Foundation Technology Center tilskud DBI-1548297, og UCSF Center for Cellular Construction. ARA og ZJG er Chan-Zuckerberg Biohub Efterforskere.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 um syringe filter | Milipore Sigma | SLGP033RS | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | Used to make TE-TW buffer |
| 0.75 mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 1 mL syringes | BD | 309628 | |
| 1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) | Sigma-Aldrich | 370533 | |
| 1M Tris-HCI, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15568025 | Used to make TE-TW buffer |
| 27 gauge needles | BD | 305109 | |
| 3 mL syringes | BD | 309657 | |
| 3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
| 3D-printed centrifuge syringe holder | (custom) | (custom) | See Supplemental Files for 3D print file |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | a9414 | |
| Aquapel (hydrophobic glass treatment) | Pittsburgh Glass Works | 47100 | |
| Drop-Seq Beads | ChemGenes | MACOSKO-2011-10 | |
| Glass microscope slides (75 mm x 50 mm) | Corning | 294775X50 | |
| Ionic Krytox Surfactant | Synthesis instructions in ref 14. Can substitute with PEG-PFPE surfactant. | ||
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Novec 7500 | 3M | 98-0212-2928-5 | Commonly knowns as HFE 7500 |
| PBS | Fisher Scientific | BP243820 | |
| PE-2 polyethylene tubing | Scientific Commodities | B31695-PE/2 | |
| PEG-PFPE surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant | |
| PGMEA developer | Sigma-Aldrich | 484431 | |
| Photomasks | CadArt Servcies | (custom) | See Supplemental Files for mask designs |
| Spin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| SSC Buffer | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| SU-8 2100 | MicroChem | Y111075 | |
| SU-8 2150 | MicroChem | Y111077 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Krayden | 4019862 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Used to make TE-TW buffer |
| YR Digestion buffer | Zymo Research | R1001-1 | Spheroplasting buffer |
| YR Lysis Buffer | Zymo Research | R1001-2 | |
| Zymolyase | Zymo Research | E1005 | Spheroplasting enzyme mixture |
References
- Peralta-Yahya, P. P., Zhang, F., Del Cardayre, S. B., Keasling, J. D. Microbial engineering for the production of advanced biofuels. Nature. 488 (7411), 320-328 (2012).
- Curran, K. A., Alper, H. S. Expanding the chemical palate of cells by combining systems biology and metabolic engineering. Metabolic Engineering. 14 (4), 289-297 (2012).
- Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
- Mager, W. H., Winderickx, J. Yeast as a model for medical and medicinal research. Trends in Pharmacological Sciences. 26 (5), 265-273 (2005).
- Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. Opportunities for yeast metabolic engineering: Lessons from synthetic biology. Biotechnology Journal. 6 (3), 262-276 (2011).
- Vanella, R., et al. Yeast-based assays for screening 11β-HSD1 inhibitors. Microbial Cell Factories. 15 (1), (2016).
- Zhuang, X., Chappell, J. Building terpene production platforms in yeast. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1854-1864 (2015).
- Agresti, J. J., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4004-4009 (2010).
- Wang, G., et al. RNAi expression tuning, microfluidic screening, and genome recombineering for improved protein production in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9324-9332 (2019).
- Beneyton, T., et al. Droplet-based microfluidic high-throughput screening of heterologous enzymes secreted by the yeast Yarrowia lipolytica. Microbial Cell Factories. 16 (1), 18 (2017).
- Sjostrom, S. L., et al. High-throughput screening for industrial enzyme production hosts by droplet microfluidics. Lab on a Chip. 14 (4), 806-813 (2014).
- Nadal-Ribelles, M., et al. Sensitive high-throughput single-cell RNA-seq reveals within-clonal transcript correlations in yeast populations. Nature Microbiology. 4 (4), 683-692 (2019).
- Gasch, A. P., et al. Single-cell RNA sequencing reveals intrinsic and extrinsic regulatory heterogeneity in yeast responding to stress. PLoS Biology. 15 (12), 2004050 (2017).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- von der Haar, T. A quantitative estimation of the global translational activity in logarithmically growing yeast cells. BMC Systems Biology. 2, 87 (2008).
- Liu, L., Dalal, C. K., Heineike, B. M., Abate, A. R. High throughput gene expression profiling of yeast colonies with microgel-culture Drop-seq. Lab on a Chip. 19 (10), 1838-1849 (2019).
- Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab on a Chip. 12 (5), 882-891 (2012).
- Berman, J., Sudbery, P. E. Candida albicans: A molecular revolution built on lessons from budding yeast. Nature Reviews Genetics. 3 (12), 918-930 (2002).
- Srikantha, T., Soll, D. R. A white-specific gene in the white-opaque switching system of Candida albicans. Gene. 131 (1), 53-60 (1993).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).
- Sun, Y., et al. Deletion of a yci1 domain protein of Candida albicans allows homothallic mating in MTL heterozygous cells. mBio. 7 (2), 00465-00516 (2016).
- McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet Detection in Single-Cell RNA Sequencing Data Using Artificial Nearest Neighbors. Cell Systems. 8 (4), 329-337 (2019).
- Baran-Gale, J., Chandra, T., Kirschner, K. Experimental design for single-cell RNA sequencing. Briefings in Functional Genomics. 17 (4), 233-239 (2018).
- Silander, O. K., et al. A Genome-Wide Analysis of Promoter-Mediated Phenotypic Noise in Escherichia coli. PLoS Genetics. 8 (1), 1002443 (2012).
- Newman, J. R. S., et al. Single-cell proteomic analysis of S. cerevisiae reveals the architecture of biological noise. Nature. 441 (7095), 840-846 (2006).
- Tuch, B. B., et al. The Transcriptomes of Two Heritable Cell Types Illuminate the Circuit Governing Their Differentiation. PLoS Genetics. 6 (8), 1001070 (2010).
- Romo, J. A., et al. Global Transcriptomic Analysis of the Candida albicans Response to Treatment with a Novel Inhibitor of Filamentation. mSphere. 4 (5), 00620 (2019).
- Huang, H., et al. Generation and manipulation of hydrogel microcapsules by droplet-based microfluidics for mammalian cell culture. Lab on a Chip. 17 (11), 1913-1932 (2017).
- Lin, X., Nishio, K., Konno, T., Ishihara, K. The effect of the encapsulation of bacteria in redox phospholipid polymer hydrogels on electron transfer efficiency in living cell-based devices. Biomaterials. 33 (33), 8221-8227 (2012).
