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Bioengineering

ड्रॉपलेट-आधारित आरएनए अनुक्रमण के साथ उच्च थ्रूपुट खमीर तनाव फेनोटाइपिंग

Published: May 21, 2020 doi: 10.3791/61014
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3,5, 1,4,5
1Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California San Francisco, 2University of California Berkeley-UCSF Graduate Program in Bioengineering, University of California San Francisco, 3Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco, 4California Institute for Quantitative Biosciences, University of California San Francisco, 5Chan Zuckerberg Biohub

Summary

माइक्रोबियल इंजीनियरिंग के 'डिजाइन-बिल्ड-टेस्ट' चक्र में एक अड़चन वह गति है जिस पर हम उपभेदों की कार्यात्मक स्क्रीन कर सकते हैं। हम प्रति प्रयोग सैकड़ों से हजारों खमीर कोशिकाओं पर लागू तनाव स्क्रीनिंग के लिए एक उच्च-थ्रूपुट विधि का वर्णन करते हैं जो ड्रॉपलेट-आधारित आरएनए अनुक्रमण का उपयोग करता है।

Abstract

खमीर जीनोम को संपादित करने के लिए उपलब्ध शक्तिशाली उपकरणों ने इस माइक्रोब को इंजीनियरिंग के लिए एक मूल्यवान मंच बना दिया है। हालांकि अब लाखों आनुवंशिक रूप से अलग उपभेदों के पुस्तकालयों का निर्माण संभव है, एक वांछित फेनोटाइप के लिए स्क्रीनिंग एक महत्वपूर्ण बाधा बनी हुई है। मौजूदा स्क्रीनिंग तकनीकों के साथ, सूचना उत्पादन और थ्रूपुट के बीच एक ट्रेडऑफ है, जिसमें उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग आमतौर पर ब्याज के एक उत्पाद पर की जा रही होती है। इसलिए, हम आनुवंशिक रूप से इंजीनियर खमीर उपभेदों के आइसोजेनिक पिकोटर कालोनियों के लिए एकल सेल आरएनए अनुक्रमण को अनुकूलित करके तनाव स्क्रीनिंग में तेजी लाने के लिए एक दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं। खमीर कोशिकाओं पर आरएनए अनुक्रमण प्रदर्शन की अनूठी चुनौतियों का समाधान करने के लिए, हम आरएनए अनुक्रमण करने से पहले हाइड्रोगेल और स्फेरोप्लास्ट के भीतर आइसोजेनिक खमीर कालोनियों को संस्कृति देते हैं। आरएनए अनुक्रमण डेटा का उपयोग खमीर फेनोटाइप का अनुमान लगाने और इंजीनियर रास्तों को सुलझाने के लिए किया जा सकता है। हमारी विधि की स्केलेबिलिटी माइक्रोबियल इंजीनियरिंग में एक महत्वपूर्ण बाधा को संबोधित करती है।

Introduction

माइक्रोबियल इंजीनियरिंग का एक प्राथमिक लक्ष्य रोगाणुओं को संशोधित करना है ताकि उन्हें मूल्यवान यौगिकों का उत्पादन करने के लिए प्रेरित किया जा सके1,2. एस सेरेविसिया अपनी संस्कृति में आसानी और इंजीनियरिंग के लिए उपलब्ध उपकरणों की चौड़ाई के3,4,5कारण माइक्रोबियल इंजीनियरिंग के लिए प्राथमिक जीव रहा है । हालांकि, संशोधित खमीर पर कार्यात्मक स्क्रीन प्रदर्शन करने में एक बाधा बनी हुई है: स्क्रीनिंग थ्रूपुट परिमाण के आदेशों से जीनोम इंजीनियरिंग से पीछे है। स्क्रीनिंग में आमतौर पर माइक्रोवेल प्लेटों में उपभेदों को अलग करना और एक विशिष्ट यौगिक6,7के उत्पादन को मापने के द्वारा उन्हें फेनोटाइप करना शामिल होता है । इस प्रक्रिया का थ्रूपुट सौ माइक्रोलीटर प्रतिक्रियाओं में व्यक्तिगत उपभेदों को पर्ण करने के लिए आवश्यक बड़ी मात्रा में रिएजेंट द्वारा सीमित है। ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लूइडिक्स सामान्य रूप से अच्छी प्लेटों8में किए गए प्रतिक्रियाओं को डाउनस्केलिंग करके परिमाण के आदेशों द्वारा खमीर स्क्रीनिंग के थ्रूपुट को बढ़ाने के लिए एक आकर्षक समाधान प्रदान करता है। हालांकि, प्लेट स्क्रीन के साथ, ड्रॉपलेट स्क्रीन आमतौर पर एकल उत्पाद यौगिकों का पता लगाती है, जो इंजीनियर मार्ग9,,10,,11के वैश्विक कार्य में सीमित जानकारी प्रदान करती है।

आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सीक्यू) सभी प्रासंगिक जीनों की अभिव्यक्ति के स्तर को12,,13के साथ मूल्यांकन करने की अनुमति देकर मार्ग संचालन के अधिक व्यापक लक्षण वर्णन को सक्षम कर सकता है। इसके अलावा, ड्रॉपलेट विधियां हजारों कोशिकाओं को प्रति प्रयोग प्रोफाइल करने की अनुमति देती हैं, जो इंजीनियर वेरिएंट14,,15के पुस्तकालयों को स्क्रीन करने के लिए आवश्यक थ्रूपुट प्रदान करती हैं। हालांकि, आरएनए-सेक विधियों को स्तनधारी कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जाता है; खमीर, तुलना करके, प्रति सेल कम एमआरएनए और एक सेल दीवार होती है जिसे16को हटाना मुश्किल होता है, मौजूदा तरीकों से उनके अनुक्रमण को रोकना पड़ता है। यदि खमीर आरएनए-सीक्यू को सक्षम करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट ड्रॉपलेट विधि तैयार की जा सकती है, तो यह खमीर इंजीनियरिंग के लिए एक स्केलेबल, लागत प्रभावी और सूचना युक्त फेनोटाइपिंग प्लेटफॉर्म प्रदान करेगा।

हम उच्च थ्रूपुट ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लूइडिक्स17का उपयोग करके खमीर कोशिकाओं को अनुक्रमित करने के लिए हमारी हाल ही में विकसित विधि का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। सीमित आरएनए की चुनौती को दूर करने के लिए, हम पिकोटर हाइड्रोगेल क्षेत्रों में एकल खमीर कोशिकाओं को समझाते हैं और संस्कृति करते हैं। संस्कृति कोशिकाओं को डुप्लिकेट करती है, एक ही इंजीनियर मार्ग साझा करने वाली सैकड़ों प्रतियां देती है; यह एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति के कारण भिन्नता को कम करता है, जबकि अनुक्रमण के लिए उपलब्ध आरएनए की मात्रा में काफी वृद्धि करता है। संस्कृति आधारित प्रवर्धन के बाद, हम कोशिकाओं को स्गोला, थोक एंजाइमैटिक पाचन के माध्यम से सेल की दीवार को हटाने। कोशिका झिल्ली बरकरार रहती है, ताकि प्रत्येक आइसोजेनिक कॉलोनी और उससे जुड़े एमआरएनए अपने हाइड्रोगेल क्षेत्रों में समाहित रहें। यह हमें MRNA कैप्चर रिएजेंट्स और लिसिस बफर के साथ व्यक्तिगत उपनिवेशों को जोड़ी बनाने की अनुमति देता है, और एमआरएनए को ड्रॉप-एसईक्यू वर्कफ्लो14के बाद कैप्चर, बारकोड और अनुक्रमित करने की अनुमति देता है। हमारी विधि प्रति प्रयोग हजारों आइसोजेनिक खमीर कालोनियों की प्रतिलेखन-व्यापी स्क्रीनिंग की अनुमति देती है।

Protocol

1. माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस फैब्रिकेशन

  1. एसयू-8 मास्टर निर्माण
    1. कंप्यूटर की सहायता से डिजाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डिवाइस ए और बी(पूरक फ़ाइल 1 और 2)के लिए माइक्रोफ्लूइडिक चैनलों के लिए नकारात्मक मुखौटा डिजाइन और उन्हें कम से 10 माइक्रोन संकल्प के साथ सर्किट बोर्ड फिल्म पर मुद्रित किया है।
    2. एक स्पिन कोटर पर एक साफ 75 मिमी सिलिकॉन वेफर रखें और अपने केंद्र पर एसयू-8 के बारे में 1 मिलील डालें। चक के लिए वेफर सुरक्षित करने के लिए वैक्यूम चालू करें।
    3. डिवाइस ए के लिए स्पिन कोट एसयू-8 2150 पर 500 आरपीएम पर 30 एस के लिए, इसके बाद 30 एस पर 2,750 आरपीएम। डिवाइस बी के लिए, स्पिन कोट एसयू-8 २१०० पर 500 आरपीएम पर 30 एस के लिए, इसके बाद 30 एस पर 2,500 आरपीएम पर। इससे क्रमशः मोटाई 200 माइक्रोन और 120 माइक्रोन की एसयू-8 लेयर निकलेगी।
    4. स्पिन-कोटर से वेफर निकालें और नरम सेंकना करने के लिए 60 किमी के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर हॉटप्लेट पर रखें।
    5. हॉटप्लेट से वेफर निकालें और इसे कमरे के तापमान तक ठंडा होने दें। वेफर के शीर्ष पर मुखौटा रखें, और 2 मिन के लिए एक कोलिमेटर 190 मीटर, 365 एनएम यूवी एलईडी के तहत बेनकाब करें।
    6. पोस्टएक्सपोजर बेकिंग के लिए 5 मिन के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर सेट हॉटप्लेट पर वेफर रखें।
    7. वेफर निकालें और इसे कमरे के तापमान में ठंडा होने दें। वेफर को 20 मिन के लिए प्रोपलीन ग्लाइकोल मोनोमेथिल ईथर एसीटेट (पीजीएमईए) के स्नान में रखें।
    8. इसके बाद पीजीएमईए के साथ वेफर को कुल्ला करें। यदि इस प्रक्रिया के दौरान कोई अपारदर्शी अवशेष दिखाई देता है, तो पीजीएमईए और आइसोप्रोपेनॉल के साथ रिंसिंग दोहराएं। हवा वेफर को सुखा दे।
    9. वेफर को 3 मिन के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर हॉटप्लेट पर रखें।
    10. वेफर को 90 मिमी व्यास पेट्री डिश में निकालें और रखें।
  2. एसयू-8 मास्टर पर पॉलीडिमिथाइलसिलिक्सने (पीडीएम) कास्टिंग
    1. एक साथ इलाज एजेंट के लिए सिलिकॉन बेस के एक 10:1 जन अनुपात मिश्रण । लगभग 30 मिन के लिए मिश्रण करने के बाद पीडीएफ एस डीगास।
    2. एसयू-8 मास्टर के शीर्ष पर degassed PDMS डालो जब तक कम से कम एक 5 मिमी मोटी परत वेफर के शीर्ष पर गठन किया है ।
    3. लगभग 30 मिन के लिए वेफर के शीर्ष पर पीडीएम डेगास।
    4. पीडीएम को ठीक करने के लिए कम से कम 80 मिन के लिए वेफर को 65 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें।
    5. वेफर से ठीक हुए पीडीएम स्लैब को काट लें।
    6. ऊपर की ओर सामना कर रहे माइक्रोफ्लूइडिक सुविधाओं के साथ पीडीएम स्लैब रखें, और 0.75 मिमी बायोप्सी पंच के साथ पंच इनलेट और आउटलेट छेद।
    7. आइसोप्रोपेनॉल के साथ 50 मिमी x 75 मिमी ग्लास स्लाइड साफ करें और टेप के साथ पीडीएम स्लैब के माइक्रोफ्लूइडिक फीचर्स साइड से सभी धूल को हटा दें।
    8. साफ ग्लास स्लाइड और माइक्रोफ्लूइडिक सुविधाओं के साथ पीडीएम स्लैब को 1 00 पीए (1 mbar O2)प्लाज्मा 1 मिन के लिए चेहरा बेनकाब करें।
    9. सुविधाओं के साथ पीडीएम स्लैब रखें जो बॉन्डिंग के लिए अनुमति देने के लिए ग्लास स्लाइड पर नीचे का सामना करते हैं। बॉन्डिंग पूरी करने के लिए स्लाइड को कम से कम 30 मिन के लिए 65 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें।
    10. फ्लोरिनेट सतह उपचार तरल पदार्थ के साथ फ्लश करके सभी माइक्रोफ्लूइडिक चैनलों का इलाज करें। तरल पदार्थ को वाष्पित करने के लिए कम से कम 10 डिग्री सेल्सियस ओवन में डिवाइस को बेक करें।

2. डिवाइस ए का उपयोग करहाइड्रोगेल में खमीर encapsulation

  1. एक निलंबन संस्कृति में बढ़ रही खमीर ले लो और एक हीमोसाइटोमीटर पर भरोसा करते हैं ।
  2. फॉस्फेट बफर्ड लवकुश (पीबीएस) में कोशिकाओं को लगभग 750 k/mL की एकाग्रता के लिए फिर से निलंबित करें। यह सुनिश्चित करता है कि 30% हाइड्रोगेल में एक खमीर सेल होगा। खमीर कोशिकाओं के बारे में केवल आधे कालोनियों में विकसित होते हैं, जिससे खमीर कालोनियों वाले हाइड्रोगेल का ~ 15% होता है।
  3. पीबीएस में 2% w/v पर अल्ट्रालो गलन बिंदु अगारोज मिलाएं और पिघलने तक 90 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी। इसमें ~ 10 मिन लगता है।
  4. एक संलग्न 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ एक सिरिंज में अगारोज मिश्रण लोड अंतरिक्ष हीटर के सामने एक सिरिंज पंप में 80 डिग्री सेल्सियस सेट.
  5. खमीर निलंबन से भरी एक सिरिंज और सिरिंज पंपों में 2% w/v आयनिक फ्लोरोसर्फेक्टेंट18 के साथ फ्लोरिनेट तेल युक्त सिरिंज लोड करें ।
  6. सेक्शन 1 में बने कॉफ्लो ड्रॉप स्प्लिटर डिवाइस लें और सीरिंज से ट्यूबिंग को डिवाइस में कनेक्ट करें । ड्रॉप संग्रह के लिए एक बर्फ बाल्टी में एक 15 mL शंकुट्यूब में आउटलेट से ट्यूबिंग गाइड ।
  7. निम्नलिखित प्रवाह दरों के साथ डिवाइस में तीन समाधानों में प्रवाह:
    1. खमीर निलंबन को 3 mL/h की प्रवाह दर के साथ प्रवाहित करें ।
    2. अगारोज मिश्रण को 3 mL/h की प्रवाह दर पर प्रवाहित करें ।
    3. फ्लोरिनेट तेल को 15 मिली/घंटा की प्रवाह दर पर प्रवाहित करें।
  8. पायस के बारे में 1 mL लीजिए। अगारोज को पूरी तरह से सेट करने की अनुमति देने के लिए एक अतिरिक्त 5 मिन रुको।

3. संस्कृति के लिए जेल को तोड़ना और धोना

  1. पायस में फ्लोरिनेड तेल में 20% परफ्लोरोऑक्टेनॉल (पीएफओ) की बराबर मात्रा जोड़ें। मिश्रण के लिए अनुमति देने के लिए कई बार शंकुली ट्यूब उलटा।
  2. 2 मिन के लिए 2,000 x ग्राम पर टूटे पायस को स्पिन करें। जैल तेल और पीएफओ चरणों के ऊपर गोली होगी।
  3. तेल चरण को हटा दें और जैल को फिर से निलंबित करने के लिए TE-TW बफर (10 mM Tris पीएच = 8.0, 1 mM EDTA, 0.01% ट्वीन-20) के 2 मिलील जोड़ें। निलंबन को एक नई 15 mL शंकुट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. चरण 3.2 के रूप में जैल नीचे गोली मार और दो वॉश की कुल के लिए TE-TW में एक और समय धोने।
  5. सुपरनेटेंट निकालें और मीडिया के 2 mL में जैल को फिर से निलंबित करें। 5 मिलीआर संस्कृति ट्यूब पर स्थानांतरित करें।
  6. झटकों के तहत रात भर 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    नोट: रात भर इनक्यूबेशन के बाद, खमीर हाइड्रोगेल को कई दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।

4. खमीर कॉलोनी lysis

  1. 2 मिन के लिए 2,000 x ग्राम पर 15 mL शंकुई ट्यूब और पैलेट हाइड्रोगेल में जैल स्थानांतरित करें।
  2. पीबीएस 2x में हाइड्रोगेल धोएं।
  3. 1x स्फेरोप्लान्टी बफर 1x में धोलें।
  4. स्फेरोप्लाटिन बफर में स्हेरोप्लेन्टिअनएंजाइम का 2-50x कमजोर प्रदर्शन करें और हाइड्रोगेल में 1 mL जोड़ें।
  5. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। इलाज खमीर अधिक पारदर्शी दिखेगा(चित्रा 3A)।
  6. हाइड्रोजेल निलंबन के नीचे 0.8 मिलील लें और 1 मिलील अनकैप्ड सिरिंज में स्थानांतरित करें।
  7. सिरिंज को 3डी प्रिंटेड सिरिंज होल्डर(सप्लीमेंट्री फाइल 3)में रखें और 2 मिन के लिए 2,000 एक्स जी पर स्पिन करें। इसकी वजह से हाइड्रोगेल ्स को सिरिंज हेड में पैक बंद करना होगा।

5. डिवाइस बी का उपयोग कर के lysed खमीर कालोनियों से mRNA कब्जा

  1. 240,000 ड्रॉप-सेक मोतियों को लें और 15 मीटर शंकुई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. 1 मिन के लिए 1,000 x ग्राम पर नीचे कताई द्वारा पैलेट ड्रॉप-सीक मोती।
  3. 120,000 मोतियों/एमएल की मनका निलंबन एकाग्रता के लिए 500 मीटर सोडियम क्लोराइड के साथ 0.9x खमीर लिसिस बफर के 2 एमएल में सुपरनेटेंट और रीसस्पेंड मोतियों को हटा दें।
  4. एक हलचल बार डाला के साथ एक 3 mL सिरिंज के लिए बीड निलंबन स्थानांतरण।
  5. फ्लोरिनेट तेल में 2% w/v perfluoropolyether-पॉलीथीन ग्लाइकोल (PFPE-PEG) सर्फेक्टेंट के कई मिलीलीटर युक्त सिरिंज तैयार करें ।
  6. सिरिंज के सभी जलीय सिर को खाली करें जिसमें क्लोज-पैक हाइड्रोगेल होते हैं और सिरिंज को कैप करें।
  7. हाइड्रोजेल, माड निलंबन, और सिरिंज पंपों में तेल सिरिंज डालें और धारा 1 में बने एनकैप्सुलेशन डिवाइस में ट्यूबिंग के माध्यम से कनेक्ट करें।
  8. बर्फ पर एक 50 mL शंकुट्यूब में आउटलेट ट्यूबिंग से कनेक्ट करें।
  9. निम्नलिखित प्रवाह दरों के साथ डिवाइस में तीन समाधानों में प्रवाह:
    1. 0.4 mL/h पर हाइड्रोगेल प्रवाहित करें।
    2. 0.4 mL/h पर मनका निलंबन प्रवाह।
    3. फ्लोरिनेट तेल को १.६ मीटर/घंटा पर प्रवाहित करें ।
  10. पायस के ~ 1 mL लीजिए या डिवाइस चलाने के लिए जब तक वहां कोई और अधिक हाइड्रोगेल छोड़ दिया है ।

6. सीडीएनए पीढ़ी, अनुक्रमण पुस्तकालय की तैयारी, और अनुक्रमण

  1. ड्रॉप-सीक्यू प्रोटोकॉल14में कहा गया है कि एकत्र किए गए पायस में 6x एसएससी बफर और पीएफओ के 1 एमएल के 30 मिलीएल जोड़ें।
  2. मोतियों पर कैप्चर किए गए एमआरएनए से सीडीएनए उत्पन्न करने, पुस्तकालय तैयार करने और डेटा विश्लेषण अनुक्रमण करने के लिए ड्रॉप-सीक्यू प्रोटोकॉल का पालन करना जारी रखें।

Representative Results

हमने आइसोजेनिक खमीर कालोनियों की जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग करने के लिए आइसोजेनिक कॉलोनी अनुक्रमण (आईसीओ-सीक्यू) के लिए पहले प्रकाशित ड्रॉप-सीक्यू वर्कफ्लो14 को अनुकूलित किया। हमने एकल खमीर कोशिकाओं को अलग किया और उन्हें अगारोज माइक्रोगेल(चित्र 1A)में समझाया। माइक्रोगेल के इनक्यूबेशन रातोंरात बाद, ये एन्कैपेटेड यीस्ट कोशिकाएं आइसोजेनिक कॉलोनियों में बढ़ी। एमआरएनए कैप्चर के लिए एक दूसरे माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस में जैल लोड करने से पहले, हमने एमआरएनए को अधिक सुलभ बनाने के लिए खमीर सेल दीवार को पचा लिया(चित्र1 B,बाएं)। हमने इन माइक्रोगेल को बंद कर दिया और एमआरएनए कैप्चर मोतियों और लिसिस बफर को मिला दिया। कुछ बूंदों में एक लायसेड खमीर कॉलोनी के साथ जोड़ा गया एक बीड था। पायस में सभी मोतियों को एकत्र किया गया था और ड्रॉप-एसईक्यू प्रोटोकॉल का पालन करते हुए सीडीएनए संश्लेषित और अनुक्रमित किया गया था।

हमने आठ ड्रॉप स्प्लिटर(चित्रा 2A)के साथ एक कोएनकैप्सुलेशन माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस का उपयोग करके अगारोज माइक्रोगेल के भीतर एकल खमीर सेल एनकैप्सुलेशन के माध्यम से आइसोजेनिक खमीर उपनिवेशों का उत्पादन किया। हमने इनपुट खमीर निलंबन को ~ 750,000/mL की एकाग्रता से पतला कर दिया ताकि ~ 30% माइक्रोगेल में बिल्कुल एक खमीर हो। डिवाइस में अल्ट्रालो पिघलने वाले तापमान को डालने से पहले, हमने इसे एक ऊंचा तापमान पर भंग कर दिया और समय से पहले जेलेशन को रोकने के लिए इस तापमान पर सिरिंज बनाए रखा। ड्रॉप-जेनरेशन जंक्शन(चित्रा 2 बी)में, खमीर कोशिकाओं को शुरू में 160 माइक्रोन बूंदों में समझाया गया था। ड्रॉप-जेनरेशन जंक्शन के बाद एक आठ गुना स्प्लिटर ने इन बूंदों को आठ 80 माइक्रोन बूंदों(चित्रा 2 C)में विभाजित किया। चैनलों के भीतर मोज़री को बनाने से रोकने के लिए पिघला हुआ एगारोज से एक सिरिंज फ़िल्टर जुड़ा हुआ था, जो ड्रॉप-बंटवारे के दौरान 37 माइक्रोन जितना संकीर्ण हो सकता है। हमने बर्फ पर पायस एकत्र किया, जिसने तुरंत अगारोज जेलेशन प्रक्रिया शुरू की। हमने ~ 6%(पूरक चित्रा 1)होने के लिए एक विशिष्ट पायस की बहुलता की गणना की, हालांकि 10% तक पॉलीफैलाव मूल्य स्वीकार्य हैं। एक बार अगारोज जैल सेट, हम पायस तोड़ दिया और तेल चरण हटा दिया । विकास मीडिया में विसर्जन से पहले जैल को जलीय बफर में धोया गया था। माइक्रोगेल के रातोंरात इनक्यूबेशन के परिणामस्वरूप आइसोजेनिक उपनिवेशकुछ माइक्रोजेल(चित्रा 2डी)के भीतर बढ़ रहे थे। कम से कम 20 कोशिकाओं की उपनिवेशों वाले हाइड्रोगेल का प्रतिशत इनक्यूबेशन समय और मीडिया संरचना सहित संस्कृति की स्थिति पर निर्भर करता था। सी एल्बिकानका उपयोग करके हमारे प्रदर्शन में, हमने निर्धारित किया कि लगभग 15% हाइड्रोगेल में 20 घंटे की निलंबन संस्कृति के बाद एक उपनिवेश निहित है।

एक दूसरे कोएनकैप्सुलेशन डिवाइस ने आइसोजेनिक कॉलोनियों(चित्रा 3ए)से एमआरएनए निकाला। खमीर माइक्रोगेल को माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस में लोड करने से पहले, हमने खमीर सेल की दीवारों को पचाने के समाधान में जैल को धोया और डुबोया। खमीर कोशिकाओं के उचित पाचन माइक्रोस्कोपी द्वारा सत्यापित किया गया था, इलाज खमीर के साथ एक अधिक चिंतनशील आकृति विज्ञान(चित्रा 3B)। हमने माइक्रोगेल को एक सिरिंज में बंद कर दिया और जेल इनपुट प्रवाह दर को देखते हुए इस तरह से किया कि एक जेल प्रत्येक बूंद में था। एमआरएनए कैप्चर मोतियों की एक धारा लीसिस बफर में मोतियों को ड्रॉप-मेकिंग जंक्शन(चित्रा 3 C)से पहले क्लोज-पैक जेल स्ट्रीम के साथ मिश्रित करती है। हमने 160 माइक्रोन बूंदों का एक परिणामी पायस एकत्र किया, और उपनिवेशों ने अपनी सेलुलर सामग्री को छोड़ना शुरू कर दिया। हमने कई मोतियों वाली बूंदों की संख्या को कम करने के लिए एक सीमित कमजोर पड़ने पर मोतियों को लोड किया, लेकिन ड्रॉप-मेकिंग के दौरान जैल की क्लोज-पैकिंग के परिणामस्वरूप लगभग 10% एकत्रित बूंदों में एक लाइसेड कॉलोनी(चित्रा 3 डी)के साथ एक मनका युक्त होता है।

हमने आईसीओ-सीक्यू वर्कफ्लो का उपयोग करके मानव आंत माइक्रोबायोम में मौजूद खमीर की एक प्रजाति सी एल्बिकानकी जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया। सी एल्बिकान दो अलग-अलग सेल राज्यों के बीच स्विच करने की क्षमता के लिए विख्यात है, जिसका उल्लेख सफेद और अपारदर्शी19कहा जाता है। हम एक इंजीनियर सी एल्बिकान स्ट्रेन, स्ट्रेन RZY122 का उपयोग करते हैं, जो WH11 जीन की एक प्रति की जगह लेते हैं, केवल वाईएफपी20के साथ सफेद कोशिकाओं में सक्रिय होते हैं। हमने कार्यप्रवाह का उपयोग करके जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल का एक सेट प्राप्त किया और कम से कम 300 अद्वितीय जीन व्यक्त करने वाली उपनिवेशों के विश्लेषण के लिए उनका उपयोग किया। एक संदर्भ डेटासेट के रूप में, हमने पहले प्रकाशित अध्ययन17 से प्राप्त सी एल्बिकान अभिव्यक्ति डेटा का उपयोग किया और 600 से कम अद्वितीय जीन व्यक्त करने वाली उपनिवेशों को फ़िल्टर किया। प्रमुख घटक (पीसी) विश्लेषण और एक टी-स्टोचेस्टिक पड़ोसी एम्बेडिंग (tSNE) आयामीता में कमी21प्रदर्शन करने के बाद, हमें अपने नमूना डेटासेट और संदर्भ(चित्रा 4A)के बीच सामान्य सामंजस्य मिला। पीसी विश्लेषण से पता चला है कि YFP और WH11 महत्वपूर्ण पहले दो पीसी के लिए योगदान दिया है । इसके अलावा, tSNE विश्लेषण तीन समूहों(चित्रा 4B)से पता चला । जबकि क्लस्टर 2 मुख्य रूप से नमूना डेटासेट से कोशिकाओं के शामिल थे, क्लस्टर 0 और 1 दोनों नमूनों से कोशिकाओं के शामिल थे । TSNE(चित्रा 4C,ऊपरी पैनल) पर WH11 अभिव्यक्ति ओवरलेव करके, हमने निर्धारित किया है कि क्लस्टर 1 की संभावना सफेद कालोनियों निहित । हमने यह भी पाया कि एसटीएफ 2 अभिव्यक्ति क्लस्टर 1(चित्रा 4सी,लोअर पैनल) में बढ़ी, जो पहले प्राप्त डेटा17के अनुरूप है । क्लस्टर 0 और 2 में, WH11 और STF2 क्लस्टर 1(चित्रा 4D)की तुलना में काफी डाउनरेकेशन किया गया । एडीएचडी1जैसे किण्वन में शामिल जीन को क्लस्टर 0 में अपरेच किया गया था, जो अपारदर्शी कोशिकाओं22के पिछले अध्ययनों के अनुरूप था। हमने पाया कि क्लस्टर 2 में कालोनियों ने क्लस्टर 0 और 1 में कॉलोनियों की तुलना में राइबोसोमल आरएनए में कमी की थी । हालांकि नमूना और संदर्भ डेटासेट कोशिकाओं के एक ही स्टॉक का उपयोग कर प्राप्त किए गए थे, इस परिणाम से पता चलता है कि प्रयोगात्मक हैंडलिंग में भी सूक्ष्म मतभेद जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: आईसीओ-सीक्यू वर्कफ्लो का अवलोकन। (क)निलंबन संस्कृति में बढ़ रहे खमीर को बफर में पतला किया गया था और प्रवाह-फोकसिंग ड्रॉपलेट जनरेटर डिवाइस में पिघला हुआ अगारोज के साथ कोएन्सेक्शुअल किया गया था ताकि एकल खमीर कोशिकाओं के साथ अगारोज माइक्रोगेल की पॉइसन लोडिंग को सक्षम किया जा सके । जैल सेट जब अगारोज ठंडा, तेल/पानी निलंबन टूट गया था, और तेल हटा दिया गया था, पानी में जेल मोतियों के निलंबन उपज । रातोंरात संस्कृति के बाद, खमीर कोशिकाएं माइक्रोगेल के भीतर आइसोजेनिक उपनिवेशों में बढ़ी। (ख)कालोनियों को सेल वॉल डिग्रेडेशन बफर के अधीन किया गया था, जिसके बाद वे एक दूसरे माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस में एमआरएनए कैप्चर मोतियों के साथ क्लोज-पैक और कोएन्सेस्ड थे । माइक्रोगेल की क्लोज पैकिंग सुनिश्चित प्रत्येक बूंद में एक जेल थी, जबकि मोतियों की पॉइसन लोडिंग ने एक बूंद के भीतर कई मोतियों की संभावना को कम कर दिया। एकत्र की गई बूंदों को सीडीएनए संश्लेषण और अनुक्रमण पुस्तकालय की पीढ़ी के लिए संसाधित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: डिवाइस ए का उपयोग करके अगारोज माइक्रोगेल के भीतर आइसोजेनिक खमीर उपनिवेशों की पीढ़ी। (A)माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस की योजनाबद्ध, तीन आदानों और आउटपुट बंदरगाहों के स्थानों को दिखाता है। ड्रॉप बनाने वाले जंक्शन को लाल रंग में हाइलाइट किया गया है । (ख)सामान्य डिवाइस संचालन के दौरान ड्रॉप बनाने वाले जंक्शन को बंद करना । (ग)एकत्र की गई बूंदों का माइक्रोग्राफ, एक क्लोज-अप के साथ एक बूंद जिसमें एक एन्सोसेल्यूटेड सेल (इनसेट) होता है। (D)24 घंटे की इनक्यूबेशन के बाद अगारोज माइक्रोगेल में आइसोजेनिक खमीर कॉलोनियों का माइक्रोग्राफ, दो कॉलोनियों (इनसेट) के करीब ी के साथ। सभी स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: डिवाइस बी का उपयोग करआइजेनिक कॉलोनियों से Lysis और mRNA कब्जा । (A)माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस की योजनाबद्ध, तीन आदानों और आउटपुट बंदरगाहों के स्थानों को दिखाता है। ड्रॉप बनाने वाले जंक्शन को लाल रंग में हाइलाइट किया गया है । (ख)सेल वॉल पाचन के बाद खमीर उपनिवेशों का माइक्रोग्राफ, एक कॉलोनी (इनसेट) के करीब ी के साथ। }Cसामान्य डिवाइस ऑपरेशन के दौरान ड्रॉप बनाने वाले जंक्शन को बंद करना । (D)माइक्रोजेल और बीड पेयरिंग के बाद एकत्र किए गए पायस का माइक्रोग्राफ, एक बंद के साथ एक बीड और एक लाइसेड कॉलोनी (इनसेट) के साथ एक बूंद दिखा रहा है। सभी स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: सी एल्बिकानमें सफेद अपारदर्शी स्विचिंग प्रतिक्रिया का विश्लेषण । (क)एक नमूना डेटासेट का टीएसएनई प्लॉट जो लियू17से एक संदर्भ डेटासेट के साथ संयुक्त है । (ख)ट्रांसक्रिप्टोम के क्लस्टरिंग से पता चलता है कि एक tSNE भूखंड पर तीन समूहों की कल्पना की गई है । (ग)सफेद अपारदर्शी स्विचिंग प्रतिक्रिया में शामिल प्रमुख जीन ने प्रमुख घटक विश्लेषण के माध्यम से निर्धारित भिन्नता में योगदान दिया । (डी)टीएसईईई प्लॉट पर चिह्नित समूहों द्वारा वाईएफपी और WH11 के सामान्यीकृत अभिव्यक्ति स्तरों के वायलिन भूखंड। * * पी एंड एलटी एंड एलटी; 0.05 और * को इंगित करता है पी एंड एलटी;एंड एलटी; 0.05। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक आंकड़े 1 और 2। कृपया इन फिलगुर को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइलें 1-3। इन फाइलों को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

आइसोजेनिक खमीर कॉलोनी आरएनए अनुक्रमण (आईसीओ-सीक्यू) के लिए हमारी विधि इंजीनियर खमीर उपभेदों की उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए एक प्रकाशित एकल सेल आरएनए अनुक्रमण मंच, ड्रॉप-सीक्यू को अनुकूलित करती है। खमीर कोशिकाओं में एक विशिष्ट स्तनधारी कोशिका की एमआरएनए की प्रतियों का 10% से कम होता है और इसमें एक कोशिका दीवार होती है जिसे एमआरएनए कैप्चर16से पहले अपमानित करने की आवश्यकता होती है। ये दो कारक ड्रॉप-सेक या अन्य बूंद-आधारित स्क्आरएनए-सीक्यू प्लेटफार्मों पर खमीर के प्रत्यक्ष आवेदन को रोकना। इन मुद्दों के समाधान के लिए, हम हाइड्रोगेल के भीतर एकल कोशिकाओं को समझाते हैं और आरएनए अनुक्रमण के लिए पर्याप्त इनपुट सामग्री प्रदान करने के लिए उन्हें उपनिवेशों में विकसित करते हैं और हम lysis और mRNA कैप्चर से पहले स्फेरोप्लास्ट उत्पन्न करने के लिए खमीर सेल दीवार को पचाते हैं। ये परिवर्तन मूल ड्रॉप-सीक्यू वर्कफ़्लो की तुलना में आईसीओ-सीक्यू कार्यप्रवाह में अतिरिक्त जटिलता जोड़ते हैं और महत्वपूर्ण कदम हैं जिन्हें उपयोगकर्ताओं को सुचारू रूप से आगे बढ़ना सुनिश्चित करना चाहिए।

अगारोज हाइड्रोगेल के भीतर एकल खमीर कोशिकाओं को एन्कैप्सुलेट करने के लिए डिवाइस ए का उचित संचालन आवश्यक है। एक से अधिक खमीर सेल के साथ हाइड्रोगेल की संख्या को कम करने के लिए इनपुट खमीर निलंबन की उचित गिनती का पालन किया जाना चाहिए, जबकि यह सुनिश्चित करना है कि पर्याप्त हाइड्रोगेल में एमआरएनए कैप्चर के दौरान उचित सेल कैप्चर दक्षता सुनिश्चित करने के लिए एक ही सेल हो। माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस ऑपरेशन के दौरान, अगारोज जेल मिश्रण को अच्छी तरह से भंग किया जाना चाहिए और डिवाइस क्लोजिंग की संभावना को कम करने के लिए सिरिंज फिल्टर के माध्यम से पारित किया जाना चाहिए। अगारोज जेल मिश्रण चिपचिपा है और जिस क्षेत्र में एक चैनल आठ में विभाजित होता है, विशेष रूप से क्लोजिंग से ग्रस्त होता है। डिवाइस के उस क्षेत्र में डिवाइस ऑपरेशन की कल्पना करने के लिए एक उच्च गति कैमरा केंद्रित करके, उपयोगकर्ता आठ चैनलों में से प्रत्येक से उभरने वाली बूंदों की एकरूपता की निगरानी कर सकते हैं और किसी भी चैनल में क्लॉग के कारण एकरूपता परिवर्तन होने पर जल्दी से प्रतिक्रिया कर सकते हैं। माइक्रोस्कोप के तहत एकत्र पायस की एक छोटी मात्रा का निरीक्षण उच्च गुणवत्ता वाले पायस की पुष्टि करने के लिए एक माध्यमिक विधि प्रदान करता है।

हाइड्रोगेल के भीतर खमीर कालोनियों के विकास के बाद, एकल कॉलोनी स्तर पर गुणवत्ता mRNA निष्कर्षण सुनिश्चित करने के लिए कई सावधानियां आवश्यक हैं। खमीर हाइड्रोगेल संस्कृति में होने के समय को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यदि खमीर बहुत लंबे समय तक संस्कृति में छोड़ दिया जाता है, तो कई हाइड्रोगेल के दायरे से बच जाएंगे, जिससे सेल प्रकारों के बीच भेदभाव करते समय आरएनए अनुक्रमण और कम संवेदनशीलता के दौरान उच्च पृष्ठभूमि संकेत होगा। ज़िमोलिज का उपयोग करके स्हेरोप्लास्ट की उचित पीढ़ी यह सुनिश्चित करती है कि एमआरएनए को लिसिस बफर के सेल एक्सपोजर के बाद जारी किया जाएगा। ज़िमोलिज़ के बाद खमीर उपनिवेशों के दृश्य निरीक्षण में शिनियर खमीर कोशिकाओं को प्राप्त करना चाहिए। अनुचित सेल वॉल पाचन कम आरएनए कैप्चर दक्षता का कारण बनेगा। अंत में, हाइड्रोगेल को बंद पैक किया जाना चाहिए क्योंकि उन्हें डिवाइस बी में इंजेक्ट किया जाता है। उच्च गति वाले कैमरे के साथ हाइड्रोगेल इनपुट की निगरानी करने से पायस संग्रह की समाप्ति के लिए अनुमति मिलेगी एक बार हाइड्रोगेल डिवाइस में इनपुट पर बंद नहीं होंगे, अन्यथा कैप्चर दक्षता प्रभावित होगी।

हमारी विधि के साथ एक संभावित चिंता यह है कि खमीर की माइक्रोजेल संस्कृति जीन अभिव्यक्ति को काफी बदल सकती है। पिछले माइक्रोगेल में खमीर जीन अभिव्यक्ति की जांच और आगर पर काम जीन अभिव्यक्ति औसत में मतभेदों को प्रदर्शित करता है, लेकिन कुल मिलाकर एक सकारात्मक संबंध17,हालांकि खमीर उपभेदों की एक किस्म पर इस दावे की आगे की जांच विवेकपूर्ण है । इस विधि में पॉइसन स्टैटिस्टिक्स14के बाद एमआरएनए कैप्चर मोतियों की स्टोकस्टिक लोडिंग के कारण सीमित सेल कैप्चर दक्षता भी होती है । वर्तमान में लगभग 10% बूंदों में एक बीड और एक कॉलोनी होती है, और डबल एनकैप्सुलेशन की दर 1% से कम होने की उम्मीद है। डबल एनकैप्सुलेशन आरएनए-सीक्यू डेटा विश्लेषण के दौरान भ्रमित तत्वों को जन्म देते हैं और उनका फ़िल्टरिंग23को चुनौतीपूर्ण बना हुआ है ; 25% की कैप्चर दर से डबल एनकैप्सुलेशन की इसी वृद्धि को 5%(पूरक चित्रा 2)तक ले जाया जाएगा। यद्यपि हम ड्रॉप-सीक्यू प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके आईसीओ-सीक्यू का प्रदर्शन करते हैं, अन्य बूंद आरएनए-सीक्यू प्लेटफ़ॉर्म हैं जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 10x जीनोमिक्स क्रोमियम प्लेटफॉर्म15,,24जैसे सांख्यिकीय रूप से निर्धारित रूप से एमआरएनए कैप्चर मोतियों को लागू करते हैं। आईसीओ-सीक्यू के साथ उन प्लेटफार्मों का एकीकरण क्या Poisson आंकड़े अनुमति से परे कब्जा क्षमता को बढ़ावा दे सकता है । अंत में, ड्रॉपलेट आरएनए-सीक्यू की एक मौलिक सीमा अनुक्रमण के बाद ब्याज की कोशिकाओं को ठीक करने में असमर्थता है। इस विधि का उपयोग करके विश्लेषण करने के लिए खमीर पुस्तकालयों के प्रकारों पर विचार करते समय इस सीमा को ध्यान में रखा जाना चाहिए।

ई कोलाई25 और एसजैसे रोगाणुओं के लिए क्लोनल स्तर पर सेल-टू-सेल विषमता का प्रदर्शन किया गया है । cerevisiae26 खुलासा नई सेल में कहा गया है कि एक थोक स्तर के विश्लेषण अंयथा मुखौटा होगा । सी एल्बिकान पर किए गए बल्क आरएनए-सीक्यू विश्लेषण या तो जनसंख्या-व्यापी प्रतिलेखन परिवर्तन, या सफेद और अपारदर्शी कोशिकाओं को दो अलग-अलग आबादी27,,28के रूप में देखते हैं। आईसीओ-सीक्यू का आवेदन अतिरिक्त उपराज्यों की खोज का कारण बन सकता है और अन्य खमीर प्रजातियों के भीतर नए सेल राज्यों की खोज के लिए एक विश्लेषणात्मक ढांचा प्रदान कर सकता है। हालांकि, हाइड्रोगेल के भीतर कोशिकाओं का विकास खमीर तक सीमित नहीं है: अन्य सेल प्रकार, जैसे स्तनधारी, बैक्टीरियल, और अन्य फंगल कोशिकाओं को हाइड्रोगेल29,,30के भीतर भी उगाया जा सकता है। एकल कोशिकाओं बनाम आइसोजेनिक उपनिवेशों के अनुक्रमण से सेल-टू-सेल भिन्नता के कारण जैविक शोर से औसत बाहर हो जाता है, सेल प्रकारों के बीच भेदभाव में सुधार होता है। यह उन कोशिकाओं का विश्लेषण करते समय मदद कर सकता है जहां विशिष्ट संश्लेषण मार्गों पर आनुवंशिक विविधता केंद्र होती है। आईसीओ-सीक्यू के लिए सेल प्रकार इनपुट की विस्तारित संभावनाएं और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ड्रॉपलेट आरएनए-सीक्यू प्लेटफार्मों के साथ इसके संभावित एकीकरण आनुवंशिक स्तर पर सेलुलर विषमता को विच्छेदन के लिए एक आशाजनक मंच के रूप में आईसीओ-सीक्यू की स्थिति है।

Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते ।

Acknowledgments

इस परियोजना को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन कैरियर पुरस्कार DBI-1253293, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान ों के नए प्रर्वतक पुरस्कार DP2AR068129 और अनुदान R01HG008978, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन प्रौद्योगिकी केंद्र अनुदान DBI-1548297, और सेलुलर निर्माण के लिए UCSF केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था । आरा और जेडजेजी चान-जुकरबर्ग बायोहब जांचकर्ता हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 um syringe filter Milipore Sigma SLGP033RS
0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo-Fisher 15575020 Used to make TE-TW buffer
0.75 mm biopsy punch World Precision Instruments 504529
1 mL syringes BD 309628
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) Sigma-Aldrich 370533
1M Tris-HCI, pH 8.0 Thermo-Fisher 15568025 Used to make TE-TW buffer
27 gauge needles BD 305109
3 mL syringes BD 309657
3" silicon wafers, P type, virgin test grade University Wafers 447
3D-printed centrifuge syringe holder (custom) (custom) See Supplemental Files for 3D print file
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich a9414
Aquapel (hydrophobic glass treatment) Pittsburgh Glass Works 47100
Drop-Seq Beads ChemGenes MACOSKO-2011-10
Glass microscope slides (75 mm x 50 mm) Corning 294775X50
Ionic Krytox Surfactant Synthesis instructions in ref 14. Can substitute with PEG-PFPE surfactant.
Isopropanol Sigma-Aldrich 109827
NaCl Sigma-Aldrich S9888
Novec 7500 3M 98-0212-2928-5 Commonly knowns as HFE 7500
PBS Fisher Scientific BP243820
PE-2 polyethylene tubing Scientific Commodities B31695-PE/2
PEG-PFPE surfactant Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant
PGMEA developer Sigma-Aldrich 484431
Photomasks CadArt Servcies (custom) See Supplemental Files for mask designs
Spin coater Specialty Coating Systems G3P-8
SSC Buffer Sigma-Aldrich S6639
SU-8 2100 MicroChem Y111075
SU-8 2150 MicroChem Y111077
Sylgard 184 silicone elastomer kit Krayden 4019862
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379 Used to make TE-TW buffer
YR Digestion buffer Zymo Research R1001-1 Spheroplasting buffer
YR Lysis Buffer Zymo Research R1001-2
Zymolyase Zymo Research E1005 Spheroplasting enzyme mixture

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References

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ड्रॉपलेट-आधारित आरएनए अनुक्रमण के साथ उच्च थ्रूपुट खमीर तनाव फेनोटाइपिंग
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Zhang, J. Q., Chang, K. C., Liu, L., Gartner, Z. J., Abate, A. R. High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (159), e61014, doi:10.3791/61014 (2020).

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