Summary
En flaskehals i "design-build-test" syklus av mikrobiell engineering er hastigheten som vi kan utføre funksjonelle skjermer av stammer. Vi beskriver en høygjennomstrømningsmetode for belastningsscreening brukt på hundrevis til tusenvis av gjærceller per eksperiment som benytter dråpebasert RNA-sekvensering.
Abstract
De kraftige verktøyene som er tilgjengelige for å redigere gjærgenomer har gjort denne mikroben til en verdifull plattform for prosjektering. Mens det nå er mulig å konstruere biblioteker av millioner av genetisk forskjellige stammer, screening for en ønsket fenotype er fortsatt et betydelig hinder. Med eksisterende screeningteknikker er det en avveining mellom informasjonsutgang og gjennomstrømning, med høy gjennomstrømningsscreening som vanligvis utføres på ett produkt av interesse. Derfor presenterer vi en tilnærming til akselerere belastningscreening ved å tilpasse enkeltcelle RNA sekvensering til isogene picoliter kolonier av genmodifiserte gjærstammer. For å løse de unike utfordringene ved å utføre RNA sekvensering på gjærceller, dyrker vi isogene gjærkolonier i hydrogeler og spheroplast før vi utfører RNA-sekvensering. RNA sekvensering serutring data kan brukes til å utlede gjær fenotyper og sortere ut konstruerte veier. Skalerbarheten av vår metode løser en kritisk hindring i mikrobiell engineering.
Introduction
Et primært mål med mikrobiell engineering er å endre mikrober for å indusere dem til å produsere verdifulle forbindelser1,2. S. cerevisiae har vært den primære organismen for mikrobiell engineering på grunn av sin enkle kultur og bredden av verktøy tilgjengelig for å konstruere sitt genom3,4,5. Imidlertid gjenstår et hinder i å utføre funksjonelle skjermer på den modifiserte gjæren: screening gjennomstrømning henger bak genomteknikk etter størrelsesordener. Screening innebærer vanligvis isolere stammer i mikrobrønnplater og fenotyping dem ved å måle produksjonen av en bestemt forbindelse6,7. Gjennomstrømningen av denne prosessen er begrenset av de store mengdene reagens som trengs for å si individuelle stammer i hundre mikroliterreaksjoner. Dråpemikrofluidikk gir en attraktiv løsning for å øke gjennomstrømningen av gjærscreening etter størrelsesorden ved å nedskalere reaksjoner som normalt utføres i brønnplater8. Men, som med godt plateskjermer, droplet skjermer vanligvis oppdage enkelt produkt forbindelser, som gir begrenset informasjon i den globale funksjonen til den konstruerte veien9,10,11.
RNA sekvensering (RNA-seq) kan muliggjøre mer omfattende karakterisering av veidrift ved å tillate uttrykksnivåer av alle relevante gener som skal vurderes samtidig12,13. Videre tillater dråpemetoder tusenvis av celler å bli profilert per eksperiment, noe som gir gjennomstrømningen som er nødvendig for å screene biblioteker av konstruerte varianter14,15. RNA-seq-metoder er imidlertid optimalisert for pattedyrceller; gjær, til sammenligning, har mindre mRNA per celle og en cellevegg som er vanskelig å fjerne16, utelukker deres sekvensering ved eksisterende metoder. Hvis en høy gjennomstrømningsdråpemetode kunne utarbeides for å muliggjøre gjær RNA-seq, ville det gi en skalerbar, kostnadseffektiv og informasjonsrik fenotypingplattform for gjærteknikk.
Vi presenterer en detaljert protokoll av vår nylig utviklede metode for sekvensering av gjærceller ved hjelp av høy gjennomstrømningsdråpemikrofluidics17. For å overvinne utfordringen med begrenset RNA, innkapsler vi og kultur enkeltgjærceller i picoliter hydrogelsfærer. Kultur dupliserer cellene, noe som gir hundrevis av kopier som deler den samme konstruerte veien; dette reduserer variasjonen på grunn av encellede genuttrykk, samtidig som det øker mengden RNA som er tilgjengelig for sekvensering betydelig. Etter kulturbasert forsterkning spheroplast vi cellene, fjerne celleveggen via bulk enzymatisk fordøyelse. Cellemembraner forblir intakte, slik at hver isogene koloni og tilhørende mRNA forblir innkapslet i hydrogelsfærene sine. Dette gjør at vi kan pare de enkelte koloniene med mRNA-fangstreagenser og lysisbuffer, og mRNA som skal fanges, strekkodes og sekvenseres etter Drop-Seq-arbeidsflyten14. Vår metode tillater transkripsjonsomfattende screening av tusenvis av isogene gjærkolonier per eksperiment.
Protocol
1. Mikrofluidisk enhet fabrikasjon
- SU-8 master fabrikasjon
- Design den negative masken for mikrofluidiske kanaler for enhet A og B(Tilleggsfil 1 og 2) ved hjelp av dataassistert designprogramvare og få dem trykt på kretskortfilm med minst 10 μm oppløsning.
- Plasser en ren silisiumwafer på en spincoater og hell ca 1 ml SU-8 på midten. Slå på vakuumet for å feste waferen til chucken.
- For enhet A, spin coat SU-8 2150 på 500 rpm for 30 s, etterfulgt av 30 s på 2750 rpm. For enhet B, spin-coat SU-8 2100 på 500 rpm for 30 s, etterfulgt av 30 s på 2500 rpm. Dette vil gi SU-8 lag tykkelse 200 μm og 120 μm, henholdsvis.
- Fjern waferen fra spincoateren og legg den på en kokeplate ved 95 °C i 60 minutter til myk steking.
- Fjern waferen fra kokeplaten og la den avkjøles til romtemperatur. Plasser masken på toppen av wafer, og eksponere under en collimator 190 mW, 365 nm UV LED i 2 min.
- Plasser wafer på en kokeplate satt ved 95 °C i 5 min for ettereksponering snaut.
- Fjern wafer og la den avkjøles til romtemperatur. Plasser wafer i et bad av propylenglykol monometyleteracetat (PGMEA) i 20 min.
- Skyll wafer med PGMEA etterfulgt av isopropanol. Hvis ugjennomsiktige rester er synlige under denne prosessen, gjentar du salmen med PGMEA og isopropanol. Lufttørk waferen.
- Plasser wafer på en kokeplate ved 95 °C i 3 min.
- Fjern og plasser wafer i en 90 mm diameter Petri skål.
- Polydimethylsiloxane (PDMS) støping på SU-8 master
- Bland sammen et 10:1 masseforhold av silikonbase til herdingsmiddel. Degas PDMS etter blanding i ca 30 min.
- Hell avgasset PDMS på toppen av SU-8-mesteren til minst 5 mm tykt lag dannes på toppen av waferen.
- Degas PDMS på toppen av wafer i ca 30 min.
- Plasser wafer i en 65 °C ovn i minst 80 minutter for å kurere PDMS.
- Klipp ut den herdede PDMS-skiven fra waferen.
- Plasser PDMS-skiven med de mikrofluidiske funksjonene vendt oppover, og punch innløp og utløpshull med et 0,75 mm biopsislag.
- Rengjør et 50 mm x 75 mm glasslysbilde med isopropanol og fjern alt støv fra mikrofluidiske funksjoner på siden av PDMS-platen med tape.
- Utsett det rengjorte glasslysbildet og PDMS-skiven med mikrofluidiske egenskaper med forsiden opp til 100 Pa (1 mbar O2)plasma i 1 min.
- Plasser PDMS-platen med funksjonene med forsiden ned på glasslysbildet for å tillate binding. Plasser skytsen i en 65 °C ovn i minst 30 minutter for å fullføre bindingen.
- Behandle alle mikrofluidiske kanaler ved å skylle med en fluorert overflatebehandlingsvæske. Stek enheten i en 65 °C ovn i minst 10 minutter for å fordampe væsken.
2. Gjærinnkapsling i hydrogeler ved bruk av enhet A
- Ta gjær vokser i en suspensjon kultur og regne med en hemocytometer.
- Resuspender cellene i fosfatbufret saltvann (PBS) til en konsentrasjon på ca. 750 k/ml. Dette sikrer at 30% av hydrogeler vil ha en gjærcelle i dem. Bare omtrent halvparten av gjærceller vokser til kolonier, noe som fører til ~ 15% av hydrogeler som inneholder gjærkolonier.
- Bland ultralavt smeltepunkt agarose ved 2 % m/v i PBS og varme ved 90 °C til smeltet. Dette tar ~ 10 min.
- Legg agaroseblandingen i en sprøyte med et festet 0,22 μm filter i en sprøytepumpe foran romvarmeren satt til 80 °C.
- Legg en sprøyte fylt med gjærsuspensjonen og en sprøyte som inneholder fluorolje med 2 % w/v ionisk fluorosurfactant18 i sprøytepumper.
- Ta sammenstrømsdråpesplitterenheten som er laget i avsnitt 1, og koble slangen fra sprøytene til enheten. Før slangen fra uttaket inn i et 15 ml konisk rør i en isbøtte for dråpesamling.
- Flyt i de tre løsningene inn i enheten med følgende strømningshastigheter:
- Strøm gjærsuspensjonen med strømningshastigheten på 3 ml/t.
- Strøm agaroseblandingen med strømningshastigheten på 3 ml/t.
- Strøm den fluorerte oljen med strømningshastigheten på 15 ml/t.
- Samle ca 1 ml emulsjon. Vent ytterligere 5 min for å la agarose å fullt sett.
3. Bryte og vaske gel for kultur
- Tilsett et likt volum på 20% perfluoroktanol (PFO) i fluorolje til emulsjonen. Inverter det koniske røret et par ganger for å tillate blanding.
- Snurr ned den ødelagte emulsjonen på 2000 x g i 2 min. Gelene vil pellet over olje- og PFO-fasene.
- Fjern oljefasen og tilsett 2 ml TE-TW-buffer (10 mM Tris pH = 8,0, 1 mM EDTA, 0,01 % Tween-20) for å suspendere gelene på nytt. Overfør suspensjonen til et nytt 15 ml konisk rør.
- Pellet ned gelene som i trinn 3.2 og vask en gang til i TE-TW for totalt to vasker.
- Fjern supernatant og resuspendgeler i 2 ml medier. Overfør til en 5 ml kultur tube.
- Inkuber ved 30 °C over natten under risting.
MERK: Etter inkubasjonen over natten kan gjærhydrogeler holdes ved 4 °C i flere dager.
4. Gjær koloni lysis
- Overfør geler til et 15 ml konisk rør og pellethydrogeler ved 2000 x g i 2 min.
- Vask hydrogeler i PBS 2x.
- Vask i 1x spheroplasting buffer 1x.
- Utfør en 2–50x fortynning av spheroplastikkenzymet i spheroplastingbuffer og tilsett 1 ml til hydrogelene.
- Inkuber ved 37 °C i 1 time. Den behandlede gjæren vil se mer gjennomsiktig ut (Figur 3A).
- Ta de nederste 0,8 ml hydrogelfjæring og overfør til en 1 ml uavkortet sprøyte.
- Plasser sprøyten i 3D-trykte sprøyteholderen (Tilleggsfil 3) og snurre med 2000 x gr i 2 min. Dette vil føre til at hydrogelene lukker pakningen i sprøytehodet.
5. mRNA fangst fra lysed gjær kolonier ved hjelp av enhet B
- Ta 240.000 Drop-Seq perler og overføre til en 15 ml konisk rør.
- Pellet Drop-Seq perler ved å spinne ned på 1000 x g i 1 min.
- Fjern supernatanten og resuspender perlene i 2 ml med 0,9 x gjærlysisbuffer med 500 mM natriumklorid for en perlesuspensjonskonsentrasjon på 120 000 perler/ml.
- Overfør perlesuspensjonen til en 3 ml sprøyte med rørestang satt inn.
- Forbered en sprøyte som inneholder flere milliliter på 2 % m/v perfluorpolyeter-polyetylenglykol (PFPE-PEG) overflateaktivt middel i fluorolje.
- Evakuer hele det vandige hodet på sprøyten som inneholder tettpakkede hydrogeler og lokk sprøyten.
- Sett hydrogel, perlesuspensjon og oljesprøyter i sprøytepumper og koble stilm via rør i innkapslingsenheten som er laget i avsnitt 1.
- Koble fra utløpsslangen til et 50 ml konisk rør på isen.
- Flyt i de tre løsningene inn i enheten med følgende strømningshastigheter:
- Strøm hydrogelene ved 0,4 ml/t.
- Strøm perlen suspensjon på 0,4 ml / t.
- Strøm den fluorerte oljen i 1,6 ml/t.
- Samle ~ 1 ml emulsjon eller kjøre enheten til det ikke er flere hydrogeler igjen.
6. cDNA-generering, sekvensering bibliotek forberedelse, og sekvensering
- Legg til 30 ml 6x SSC-buffer og 1 ml PFO i den innsamlede emulsjonen som angitt i Drop-Seq-protokollen14.
- Fortsett å følge Drop-Seq-protokollen for å generere cDNA fra mRNA fanget på perler, sekvensering bibliotek forberedelse, og sekvensering dataanalyse.
Representative Results
Vi tilpasset den tidligere publiserte Drop-Seq arbeidsflyten14 for isogene kolonisekvensering (ICO-seq) for å utføre genuttrykkprofilering av isogene gjærkolonier. Vi isolerte enkelt gjærceller og innkapslet dem i agarose mikrogeler (Figur 1A). Etter over natten inkubasjon av mikrogeler, vokste disse innkapslede gjærcellene til isogene kolonier. Før du laster geler inn i en annen mikrofluidisk enhet for mRNA-fangst, fordøyde vi gjærcelleveggen for å gjøre mRNA mer tilgjengelig (Figur 1B, venstre). Vi pakket disse mikrogelene tett og fusjonerte mRNA-fangstperlene og lysisbufferen. Noen dråper inneholdt nøyaktig en perle sammen med en lysed gjærkoloni. Alle perler i emulsjonen ble samlet inn og cDNA syntetisert og sekvensert etter Drop-Seq-protokollen.
Vi genererte isogene gjærkolonier gjennom enkelt gjærcelleinnkapsling i agarosemikrogeler ved hjelp av en coenkapslingmikrofluidisk enhet med en åtte dråpesplitter festet (Figur 2A). Vi fortynnet inngangsgjærsuspensjonen til en konsentrasjon på ~ 750 000 /ml, slik at ~ 30% av mikrogelene har nøyaktig en gjær i dem. Før du setter inn den ultralave smeltetemperaturen i enheten, oppløste vi den ved en forhøyet temperatur og opprettholdt sprøyten ved denne temperaturen for å forhindre for tidlig gelering. Ved dråpegenereringskrysset (Figur 2B)ble gjærceller i utgangspunktet innkapslet i 160 μm dråper. Etter dråpegenereringskrysset delte en åtte ganger splitter disse dråpene i åtte 80 μm dråper (figur 2C). Et sprøytefilter ble festet til smeltet agarose for å hindre at tresko dannes i kanalene, som kan være så smale som 37 μm under dråpesplittingen. Vi samlet emulsjonen på is, som umiddelbart begynte agarosegelasjonsprosessen. Vi beregnet polydispersiteten til en typisk emulsjon til å være ~ 6% (Supplerende figur 1), selv om polydispersitetsverdier opptil 10% er akseptable. Når agarose gels satt, brøt vi emulsjonen og fjernet oljefasen. Gelene ble vasket i vandig buffer før nedsenking i vekstmedier. Over natten inkubasjon av mikrogelene resulterte i isogene kolonier vokser i noen av mikrogelene (Figur 2D). Prosentandelen av hydrogeler som inneholder kolonier på minst 20 celler var avhengig av kulturforholdene, inkludert inkubasjonstid og mediesammensetning. I vår demonstrasjon ved hjelp av C. albicans,bestemte vi oss for at ca 15% av hydrogelene inneholdt en koloni etter 20 timer med suspensjonskultur.
En annen coencapsulation enhet ekstrahert mRNA fra isogene kolonier (Figur 3A). Før vi lastet gjærmikrogelene inn i den mikrofluidiske enheten, vasket og nedsenket vi gelene i en løsning for å fordøye gjærcelleveggene. Riktig fordøyelse av gjærcellene ble verifisert av mikroskopi, med behandlet gjær som har en mer reflekterende morfologi (Figur 3B). Vi pakket mikrogelene tett i en sprøyte og justerte gelinngangsstrømningshastigheten slik at en gel var i hvert fall. En strøm av mRNA fange perler i lysis buffer blandet med tettpakket gel stream før drop-making junction (Figur 3C). Vi samlet en resulterende emulsjon av 160 μm dråper, og kolonier begynte å lyse og frigjøre sitt cellulære innhold. Vi lastet perler ved en begrensende fortynning for å minimere antall dråper som inneholder flere perler, men tett pakking av gelene under drop-making resulterte i ca 10% av samlede dråper som inneholder en perle med en lysed koloni (Figur 3D).
Vi analyserte genuttrykk for C. albicans, en art av gjær tilstede i humant tarmmikrobiome, ved hjelp av ICO-seq-arbeidsflyten. C. albicans er kjent for sin evne til å bytte mellom to forskjellige celletilstander, betegnet hvit og ugjennomsiktig19. Vi bruker en konstruert C albicans stamme, belastning RZY122, som erstatter en kopi av WH11 genet, bare aktiv i hvite celler med YFP20. Vi fikk et sett med genuttrykksprofiler ved hjelp av arbeidsflyten og brukte dem til analyse av kolonier som uttrykker minst 300 unike gener. Som referansedatasett brukte vi C. Albicans uttrykksdata hentet fra en tidligere publisert studie17 og filtrerte ut kolonier som uttrykker færre enn 600 unike gener. Etter å ha utført hovedkomponentanalyse (PC) og en t-stokastisk naboinnebygging (tSNE) dimensjonalitetsreduksjon21, fant vi generell konkordans mellom vårt prøvedatasett og referansen (figur 4A). PC-analyse viste at YFP og WH11 betydelig bidro til de to første PC-ene. Videre viste tSNE-analyse tre klynger (figur 4B). Mens klynge 2 hovedsakelig besto av celler fra eksempeldatasettet, var klynger 0 og 1 består av celler fra begge prøvene. Ved å overlegge WH11-uttrykket på tSNE (Figur 4C, øvre panel), bestemte vi at klynge 1 sannsynligvis inneholdt hvite kolonier. Vi fant også at STF2-uttrykket økte i klynge 1 (Figur 4C, nedre panel), i samsvar med tidligere innhentet data17. I klynger 0 og 2 ble WH11 og STF2 betydelig nedregulert sammenlignet med klynge 1 (Figur 4D). Gener involvert i gjæring, som ADH1,ble oppregulert i klynge 0, i samsvar med tidligere studier av ugjennomsiktige celler22. Vi fant at kolonier i klynge 2 hadde redusert ribosomal RNA sammenlignet med kolonier i klynger 0 og 1. Selv om prøve- og referansedatasettene ble innhentet ved hjelp av samme lager av celler, tyder dette resultatet på at selv subtile forskjeller i eksperimentell håndtering kan påvirke genuttrykk.
Figur 1: Oversikt over ICO-seq-arbeidsflyt. (A) Gjær vokser i en suspensjon kultur ble fortynnet i buffer og coencapsulated med smeltet agarose i en flow-fokusering droplet generator enhet for å aktivere Poisson lasting av agarose mikrogeler med enkelt gjær celler. Gelene satt da agarose avkjølt, olje / vann suspensjon ble brutt, og oljen ble fjernet, noe som gir en suspensjon av gel perler i vann. Etter nattens kultur vokste gjærceller til isogene kolonier i mikrogelene. (B) Kolonier ble utsatt for en celleveggnedbrytningsbuffer, hvorpå de var tettpakket og coencapsulated med mRNA fange perler i en annen mikrofluidisk enhet. Tett pakking av mikrogelene sørget for at hver dråpe hadde en gel, mens Poisson-lasting av perlene reduserte sjansen for flere perler innenfor en dråpe. Innsamlede dråper ble behandlet for cDNA-syntese og generering av et sekvenseringsbibliotek. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Generasjon av isogene gjærkolonier i agarosemikrogeler ved hjelp av enhet A. (A) Skjematisk mikrofluidisk enhet, som viser plasseringen av de tre innganger og utgangsporter. Drop-making krysset er uthevet i rødt. (B) Nærbilde av drop-making krysset under normal enhet drift. (C) Mikrograf av innsamlede dråper, med et nærbilde av en dråpe som inneholder en innkapslet celle (innfelt). (D) Mikrograf av isogene gjærkolonier i agarosemikrogeler etter en 24-timers inkubasjon, med et nærbilde av to kolonier (innfelt). Alle skala barer = 100 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Lysis og mRNA fange fra isogene kolonier ved hjelp av enhet B. (A) Skjematisk mikrofluidisk enhet, som viser plasseringen av de tre innganger og utgangsporter. Drop-making krysset er uthevet i rødt. (B) Mikrograf av gjærkolonier etter celleveggfordøyelsen, med et nærbilde av en koloni (innfelt). (C) Nærbilde av drop-making krysset under normal enhet drift. (D) Mikrograf av innsamlede emulsjoner etter mikrogel og perleparing, med et nærbilde som viser en dråpe med en perle og en lysed koloni (innfelt). Alle skala barer = 100 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Analyse av hvit-ugjennomsiktig vekslingsrespons i C. albikaner. (A) tSNE-plott av et eksempeldatasett kombinert med et referansedatasett fra Liu17. (B) Gruppering av transkripsjoner avslører tre klynger visualisert på en tSNE-tomt. (C) Nøkkelgener involvert i den hvite ugjennomsiktige vekslingsresponsen bidro til variasjon som bestemt gjennom hovedkomponentanalyse. (D) Fiolinplott av normaliserte uttrykksnivåer av YFP og WH11 av klynger merket på tSNE-plottet. **angir p <<< 0,05 og * angir p << 0,05. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggstall 1 og 2. Vennligst klikk her for å laste ned disse filgures.
Tilleggsfiler 1-3. Vennligst klikk her for å laste ned disse filene.
Discussion
Vår metode for isogene gjærkoloni RNA sekvensering (ICO-seq) tilpasser en publisert enkeltcelle RNA sekvenseringsplattform, Drop-Seq, for høy gjennomstrømning screening av konstruertgjær stammer. Gjærceller inneholder mindre enn 10% av kopiene av mRNA av en typisk pattedyrcelle og har en cellevegg som må degraderes før mRNA-fangst16. Disse to faktorene utelukker direkte bruk av gjær til Drop-Seq eller andre dråpebaserte scRNA-seq-plattformer. For å løse disse problemene innkapsler vi enkeltceller i hydrogeler og vokser dem til kolonier for å gi nok inngangsmateriale til RNA-sekvensering, og vi fordøyer gjærcelleveggen for å generere spheroplast før lysis og mRNA-fangst. Disse endringene legger til ekstra kompleksitet i ICO-seq-arbeidsflyten sammenlignet med den opprinnelige Drop-Seq-arbeidsflyten, og er kritiske trinn som brukerne må sikre at du fortsetter jevnt.
Riktig drift av enhet A er nødvendig for innkapsling av enkeltgjærceller i agarosehydrogeler. Riktig telling av inngangsgjærsuspensjonen må følges for å minimere antall hydrogeler med mer enn én gjærcelle, samtidig som det sikrer at nok hydrogeler inneholder en enkelt celle for å sikre en rimelig cellefangsteffektivitet under mRNA-fangst. Under bruk av mikrofluidiske enheter må agarosegelblandingen være godt oppløst og passert gjennom et sprøytefilter for å minimere sjansen for tilstopping av enheten. Agarose gelblandingen er viskøs og regionen der en enkelt kanal deler seg i åtte er spesielt utsatt for tilstopping. Ved å sentrere et høyhastighetskamera for å visualisere enhetsdrift i den regionen av enheten, kan brukerne overvåke ensartethetav dråper som kommer fra hver av de åtte kanalene og raskt reagere hvis ensartetheten endres på grunn av tresko i noen av kanalene. Inspeksjon av en liten mengde innsamlet emulsjon under mikroskopet gir en sekundær metode for å bekrefte en høy kvalitet emulsjon.
Etter vekst av gjærkolonier i hydrogeler, er det nødvendig med flere forholdsregler for å sikre kvalitet mRNA-ekstraksjon på enkelt koloninivå. Det er viktig å optimalisere tiden gjær er i hydrogelkultur, fordi hvis gjæren blir igjen i kultur for lenge, vil mange unnslippe hydrogelenes begrensninger, noe som fører til et høyere bakgrunnssignal under RNA-sekvensering og lavere følsomhet når de diskriminerer mellom celletyper. Riktig generering av spheroplast ved hjelp av Zymolyase sikrer at mRNA vil bli utgitt etter celleeksponering for lysisbuffer. Visuell inspeksjon av gjærkolonier etter Zymolyase bør gi blankere gjærceller. Feil celleveggfordøyelse vil føre til lavere RNA-fangsteffektivitet. Til slutt bør hydrogelene være tettpakket når de injiseres i enhet B. Overvåking av hydrogelinngangen med et høyhastighetskamera vil tillate opphør av emulsjonsinnsamling når hydrogelene ikke lenger er tettpakket ved inndata i enheten, ellers vil fangsteffektiviteten bli påvirket.
En potensiell bekymring med vår metode er at mikrogelkultur av gjær kan vesentlig endre genuttrykk. Tidligere arbeid med å undersøke gjærgenuttrykk i mikrogeler og agar viser forskjeller i genuttrykksgjennomsnitt, men samlet sett en positiv korrelasjon17, selv om videre utredning av denne påstanden om en rekke gjærstammer er forsvarlig. Metoden har også begrenset cellefangsteffektivitet på grunn av stokastisk lasting av mRNA fange perler etter Poisson statistikk14. For tiden inneholder ca 10% av dråpene en perle og en koloni, og frekvensen av doble innkapslingsmidler forventes å være under 1%. Doble innkapslinger fører til forvirrende elementer under RNA-seq dataanalyse og deres filtrering forblir utfordrende23; en fangstrate på 25 % vil føre til en tilsvarende økning av doble innkapslinger til 5 % (Tilleggstall 2). Selv om vi demonstrerer ICO-seq ved hjelp av Drop-Seq-plattformen, er det andre droplet RNA-seq plattformer som introduserer mRNA fange perler deterministisk snarere enn statistisk, for eksempel kommersielt tilgjengelig 10x Genomics Chromium plattform15,24. Integreringen av disse plattformene med ICO-seq kan øke fangsteffektiviteten utover hva Poisson-statistikk tillater. Til slutt er en grunnleggende begrensning av droplet RNA-seq manglende evne til å gjenopprette celler av interesse etter sekvensering. Denne begrensningen bør tas i betraktning når du vurderer hvilke typer gjærbiblioteker som skal analyseres ved hjelp av denne metoden.
Cell-to-cell heterogenitet har blitt demonstrert på klonalt nivå for mikrober som E. coli25 og S. cerevisiae26 avslører nye celle sier at en bulk-nivå analyse ellers ville maskere. Bulk RNA-seq analyser utført på C. albicans har en tendens til å enten se på populasjonsomfattende transkripsjonsendringer, eller hvite og ugjennomsiktige celler som to separate populasjoner27,28. Anvendelsen av ICO-seq kan føre til oppdagelsen av flere understater og gi et analytisk rammeverk for å oppdage nye cellestater innenfor andre gjærarter. Veksten av celler i hydrogeler er imidlertid ikke begrenset til gjær: andre celletyper, som pattedyr, bakterielle og andre soppceller kan også dyrkes i hydrogeler29,30. Sekvenseringen av isogene kolonier versus enkeltceller fører til at det snittes av biologisk støy på grunn av celle-til-celle-variasjon, noe som forbedrer diskrimineringmellom celletyper. Dette kan hjelpe når du analyserer celler der genetisk mangfold sentrerer seg om spesifikke synteseveier. De utvidede mulighetene for celletypeinngang til ICO-seq og dens potensielle integrasjon med kommersielt tilgjengelige droplet RNA-seq plattformer posisjonerer ICO-seq som en lovende plattform for dissekering av cellulær heterogenitet på genetisk nivå.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble støttet av National Science Foundation Career Award DBI-1253293, National Institutes of Health New Innovator Award DP2AR068129 og gi R01HG008978, National Science Foundation Technology Center gi DBI-1548297, og UCSF Center for Cellular Construction. ARA og ZJG er Chan-Zuckerberg Biohub-etterforskere.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 um syringe filter | Milipore Sigma | SLGP033RS | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | Used to make TE-TW buffer |
| 0.75 mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 1 mL syringes | BD | 309628 | |
| 1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) | Sigma-Aldrich | 370533 | |
| 1M Tris-HCI, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15568025 | Used to make TE-TW buffer |
| 27 gauge needles | BD | 305109 | |
| 3 mL syringes | BD | 309657 | |
| 3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
| 3D-printed centrifuge syringe holder | (custom) | (custom) | See Supplemental Files for 3D print file |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | a9414 | |
| Aquapel (hydrophobic glass treatment) | Pittsburgh Glass Works | 47100 | |
| Drop-Seq Beads | ChemGenes | MACOSKO-2011-10 | |
| Glass microscope slides (75 mm x 50 mm) | Corning | 294775X50 | |
| Ionic Krytox Surfactant | Synthesis instructions in ref 14. Can substitute with PEG-PFPE surfactant. | ||
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Novec 7500 | 3M | 98-0212-2928-5 | Commonly knowns as HFE 7500 |
| PBS | Fisher Scientific | BP243820 | |
| PE-2 polyethylene tubing | Scientific Commodities | B31695-PE/2 | |
| PEG-PFPE surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant | |
| PGMEA developer | Sigma-Aldrich | 484431 | |
| Photomasks | CadArt Servcies | (custom) | See Supplemental Files for mask designs |
| Spin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| SSC Buffer | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| SU-8 2100 | MicroChem | Y111075 | |
| SU-8 2150 | MicroChem | Y111077 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Krayden | 4019862 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Used to make TE-TW buffer |
| YR Digestion buffer | Zymo Research | R1001-1 | Spheroplasting buffer |
| YR Lysis Buffer | Zymo Research | R1001-2 | |
| Zymolyase | Zymo Research | E1005 | Spheroplasting enzyme mixture |
References
- Peralta-Yahya, P. P., Zhang, F., Del Cardayre, S. B., Keasling, J. D. Microbial engineering for the production of advanced biofuels. Nature. 488 (7411), 320-328 (2012).
- Curran, K. A., Alper, H. S. Expanding the chemical palate of cells by combining systems biology and metabolic engineering. Metabolic Engineering. 14 (4), 289-297 (2012).
- Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
- Mager, W. H., Winderickx, J. Yeast as a model for medical and medicinal research. Trends in Pharmacological Sciences. 26 (5), 265-273 (2005).
- Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. Opportunities for yeast metabolic engineering: Lessons from synthetic biology. Biotechnology Journal. 6 (3), 262-276 (2011).
- Vanella, R., et al. Yeast-based assays for screening 11β-HSD1 inhibitors. Microbial Cell Factories. 15 (1), (2016).
- Zhuang, X., Chappell, J. Building terpene production platforms in yeast. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1854-1864 (2015).
- Agresti, J. J., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4004-4009 (2010).
- Wang, G., et al. RNAi expression tuning, microfluidic screening, and genome recombineering for improved protein production in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9324-9332 (2019).
- Beneyton, T., et al. Droplet-based microfluidic high-throughput screening of heterologous enzymes secreted by the yeast Yarrowia lipolytica. Microbial Cell Factories. 16 (1), 18 (2017).
- Sjostrom, S. L., et al. High-throughput screening for industrial enzyme production hosts by droplet microfluidics. Lab on a Chip. 14 (4), 806-813 (2014).
- Nadal-Ribelles, M., et al. Sensitive high-throughput single-cell RNA-seq reveals within-clonal transcript correlations in yeast populations. Nature Microbiology. 4 (4), 683-692 (2019).
- Gasch, A. P., et al. Single-cell RNA sequencing reveals intrinsic and extrinsic regulatory heterogeneity in yeast responding to stress. PLoS Biology. 15 (12), 2004050 (2017).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- von der Haar, T. A quantitative estimation of the global translational activity in logarithmically growing yeast cells. BMC Systems Biology. 2, 87 (2008).
- Liu, L., Dalal, C. K., Heineike, B. M., Abate, A. R. High throughput gene expression profiling of yeast colonies with microgel-culture Drop-seq. Lab on a Chip. 19 (10), 1838-1849 (2019).
- Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab on a Chip. 12 (5), 882-891 (2012).
- Berman, J., Sudbery, P. E. Candida albicans: A molecular revolution built on lessons from budding yeast. Nature Reviews Genetics. 3 (12), 918-930 (2002).
- Srikantha, T., Soll, D. R. A white-specific gene in the white-opaque switching system of Candida albicans. Gene. 131 (1), 53-60 (1993).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).
- Sun, Y., et al. Deletion of a yci1 domain protein of Candida albicans allows homothallic mating in MTL heterozygous cells. mBio. 7 (2), 00465-00516 (2016).
- McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet Detection in Single-Cell RNA Sequencing Data Using Artificial Nearest Neighbors. Cell Systems. 8 (4), 329-337 (2019).
- Baran-Gale, J., Chandra, T., Kirschner, K. Experimental design for single-cell RNA sequencing. Briefings in Functional Genomics. 17 (4), 233-239 (2018).
- Silander, O. K., et al. A Genome-Wide Analysis of Promoter-Mediated Phenotypic Noise in Escherichia coli. PLoS Genetics. 8 (1), 1002443 (2012).
- Newman, J. R. S., et al. Single-cell proteomic analysis of S. cerevisiae reveals the architecture of biological noise. Nature. 441 (7095), 840-846 (2006).
- Tuch, B. B., et al. The Transcriptomes of Two Heritable Cell Types Illuminate the Circuit Governing Their Differentiation. PLoS Genetics. 6 (8), 1001070 (2010).
- Romo, J. A., et al. Global Transcriptomic Analysis of the Candida albicans Response to Treatment with a Novel Inhibitor of Filamentation. mSphere. 4 (5), 00620 (2019).
- Huang, H., et al. Generation and manipulation of hydrogel microcapsules by droplet-based microfluidics for mammalian cell culture. Lab on a Chip. 17 (11), 1913-1932 (2017).
- Lin, X., Nishio, K., Konno, T., Ishihara, K. The effect of the encapsulation of bacteria in redox phospholipid polymer hydrogels on electron transfer efficiency in living cell-based devices. Biomaterials. 33 (33), 8221-8227 (2012).
