Med optogenetisk manipulering av spesifikke nevronale populasjoner eller hjerneregioner, kan atferd endres med høy temporal og romlig oppløsning hos fritt bevegelige dyr. Ved å bruke forskjellige optogenetiske verktøy i kombinasjon med kronisk implanterte optiske fibre, kan en rekke nevronale modulasjoner og atferdstesting utføres.
Optogenetisk modulering av nevronale kretser i fritt bevegelige mus påvirker akutt og langsiktig oppførsel. Denne metoden er i stand til å utføre manipulasjoner av enkeltnevroner og regionspesifikt senderutløsning, opptil hele nevronale kretser i sentralnervesystemet, og tillater direkte måling av atferdsutfall. Nevroner uttrykker optogenetiske verktøy via en injeksjon av virale vektorer som bærer DNA av valget, for eksempel Channelrhodopsin2 (ChR2). Lys bringes inn i spesifikke hjerneregioner via kroniske optiske implantater som avsluttes rett over målområdet. Etter to uker med utvinning og riktig verktøyuttrykk, kan mus gjentatte ganger brukes til atferdstester med optogenetisk stimulering av nevronene av interesse.
Optogenetisk modulering har en høy temporal og romlig oppløsning som kan oppnås med høy cellespesifisitet, sammenlignet med de vanlige metodene som kjemisk eller elektrisk stimulering. Lyset skader ikke nevronalt vev og kan derfor brukes til langsiktige eksperimenter, samt for flere atferdseksperimenter i en mus. Mulighetene for optogenetiske verktøy er nesten ubegrenset og muliggjør aktivering eller deaktivering av hele nevroner, eller til og med manipulering av en bestemt reseptortype for lys.
Resultatene av slike atferdseksperimenter med integrert optogenetisk stimulering visualiserer direkte endringer i atferd forårsaket av manipulasjonen. Oppførselen til samme dyr uten lysstimulering som baseline er en god kontroll for induserte endringer. Dette gir en detaljert oversikt over nevronale typer eller nevrotransmittersystemer som er involvert i spesifikk atferd, for eksempel angst. Plastisiteten til nevronale nettverk kan også undersøkes i detalj gjennom langsiktig stimulering eller atferdsobservasjoner etter optisk stimulering. Optogenetikk vil bidra til å opplyse nevronal signalering i flere typer nevrologiske sykdommer.
Moduleringen av nevronale kretser i sentralnervesystemet og deres atferdsmessige resultater er viktig for å forstå hvordan hjernen fungerer, spesielt i psykiatriske sykdommer og kognitive oppgaver som læring og hukommelse. Med optogenetikk kan enkeltceller eller cellepopulasjoner opptil hele kretser moduleres av lys. Vanlige optogenetiske verktøy som Channelrhodopsin2 (ChR2) eller Archaerhodopsin (Arch) er i stand til å aktivere eller dempe nevroner, eller øke eller hemme senderutgivelse ved axonterminaler som projiserer til distinkte hjerneregioner1,,2,,3,,4. Arch må imidlertid brukes nøye da det ble vist at aktiveringen ved presynaptiske terminaler øker spontan senderutgivelse5. Arch er en ytre utbedring protonpumpe som endrer pH-verdien inne i cellen. Dette alkaliske miljøet induserer kalsiumtilstrømning og forbedrer senderutgivelsen5. For å spesifikt modulere intracellulære signalveier, kan reseptor chimeras består av et lettaktiverbart optogenetisk verktøy, for eksempel rhodopsin eller kjegle opsin, sammen med en tilstrekkelig G-protein komponertreseptor, opprettes 6,7,8. Mengden og variasjonen av optogenetiske verktøy tilgjengelig har økt betydelig i løpet av det siste tiåret9.
Formålet med optogenetikk er å manipulere nevronale kretser under oppførsel. Optogenetikk muliggjør for eksempel måling av akutte atferdsendringer som endringer i angstatferd. Optogenetiske verktøy leveres inn i målområder av hjernen via virale vektorer. Ved hjelp av spesielle arrangører og enhancers, eller Cre-loxP-systemet, kan celletype spesifisitet sikres for uttrykk for optogenetiske verktøy (Figur 1A). Det er flere genmodifiserte muselinjer som uttrykker enzymet Cre-Recombinase i bestemte celletyper bare. For eksempel uttrykker Nex-Cre-mus Cre-Recombinase i pyramidale nevroner i cortex og hippocampus under kontroll av Nex-promotor10. Dette enzymet er i stand til å invertere DNA-sekvenser, som er flankert av loxP-sidene11. Følgelig kan DNA-sekvensen av et dobbelt-floxed optogenetisk verktøy, som er invertert og flankert av loxP-sider, bare transkriberes av nevroner som har Cre-Recombinase, men ikke av andre nevronaletyper 12,13. Når det gjelder Nex-Cre-mus, vil det optogenetiske verktøyet utelukkende uttrykkes i pyramidale nevroner. Lysstimulering av visse hjerneregioner oppnås deretter via kronisk implantasjon av optiske fibre rett over interesseområdet. Dyr kan deretter bli kombinert med en passende lyskilde og fritt oppføre seg i nesten alle slags atferdstester.
Figur 1: Injeksjon og implantasjon. A) Cre-loxP system for ChR2-YFP. Dobbel floxed optogenetic verktøyet er pakket i en adeno assosiert virus (AAV) for injeksjon i hjernevevet. B) Skytten visning av virusinjeksjon og implantasjon av et optisk nevronalt grensesnitt inn i / over IL-regionen av mPFC. Injeksjon og implantasjon ble gjort ovenfra. Alle områder av interesse, IL, BLA og DRN, vises. C) Detaljert visning av den implanterte optiske fiberen, hylsen og lyskilden. D) Spredning av blå og rød laserlysstimulering i grå materie hjernevev fra en 200 μm lysfiber (Yizhar et al. 2011). Blått lys sprer seg, maksimalt 0, 5 mm inn i vevet, rødt lys ca 1 mm. Fargekoding: rød 50%, gul 10%, grønn 5%, blå 1% hvis lyset når dette området. E) Koronar visning av ensidig implantasjon rett over venstre IL med en 200 μm optisk fiber. IL-regionen har en bredde på 0,25 mm på hver halvkule og en dybde på 0, 2 mm. Blå og røde lyspærer er boarder av 5% lys spredning og overføres fra Yizhar et al til riktig størrelse. LoxP: locus av X-over P1; ChR2: Channelrhodopsin; YFP: gul fluorescerende protein; dflox: dobbel floxed; IL: infralimbic cortex; BLA: basolateral amygdala; DRN: dorsal raphe kjerner; PrL: prelimbic region. Dette tallet er endret fra Berg 201948. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Optogenetic tilnærminger benyttes som det muliggjør både høy temporal og romlig oppløsning14 og celletype spesifikk modulasjon. I tillegg er det mulig å gjentatte ganger bruke implantert enhet uten videre behandling. Etter en stereotaktisk kirurgi, hvor injeksjonen av et adeno-assosiert virus som bærer det optogenetiske verktøyet og implantasjonen av den optiske fiberen utføres, kan musene komme seg i to uker. Vi har valgt en gjenopprettingstid på bare 2 uker, fordi dette er nok tid til å komme seg fra operasjonen og for viruset å uttrykke. Etter hvert som atferdseksperimentene etterfølges av immunohistokjemi, må vi sørge for at mus ikke blir for gamle under forsøket; ellers reduseres vevskvaliteten. De viser ingen åpenbare atferdsmessige funksjonsnedsettelse fra implantatet og engasjerer seg i typisk buratferd. Selvfølgelig er implantasjonen ledsaget av en betydelig kirurgisk lesjon; Derfor overvåkes musene intensivt. Etter operasjonen må mus være enkelt plassert, da gruppehusmus har en tendens til å skade hverandres friske sår og implantater. Imidlertid har boligforhold en stor innvirkning på angstnivået til hannmus, da enkelthusmus viser lavere angstnivåer15 og generelt mindre depressive symptomer16.
Kjemisk eller elektrisk manipulering av hjernekretser mangler den høye celletypen spesifisitet av optogenetikk og har en lavere temporal og romlig oppløsning14,,17,,18. Avhengig av det eksperimentelle spørsmålet kan elektrisk eller kjemisk stimulering ha forskjellige fordeler. Når du passerer fiberterminaler i en bestemt region må også stimuleres, elektrisk stimulering er den beste metoden. Kjemisk stimulering er et godt valg for når senderspesifikke reseptorer i en hel region skal aktiveres av agonister. En annen stor fordel med optogenetikk sammenlignet med kjemisk eller elektrisk stimulering er at endogene, nevroner ikke er følsomme for lys, noe som unngår forekomsten av bivirkninger19. Faktisk kan høye lysintensiteter indusere varmeeffekter8,20, men på grunn av riktige kontrollgrupper kan atferdseffektene på grunn av optogenetisk manipulasjon elimineres.
Undersøke gnageratferd, spesielt med hensyn til psykiatriske sykdommer, har sterkt forbedret seg med optogenetikk hos fritt bevegelige dyr, da det muliggjør direkte modulering av enkeltreseptorer opp til bestemtecellepopulasjoner 21 ogkretser 22. Muligheten til å måle de akutte effektene av slike modulasjoner, samt de langsiktige atferdseffektene etter en definert tid23 eller etter kronisk stimulering24,gir en bred fleksibilitet av eksperimentelle design og gir svært detaljert innsikt i hjernekretser. Lysstimulering kan brukes til å modulere nevroner som ligger på injeksjonsstedet til det optogenetiske verktøyet. Når både injeksjon og implantasjon adresserer samme hjerneregion, kan cellelegemer og ryggprojisering av aksler av prinsippnevroner og interneuroner i denne regionen målrettes3,,6,,8. Imidlertid kan lysfiberen også implanteres i et område forskjellig fra den injiserte. I dette tilfellet kan lysstimulering modulere senderutløsning ved axonterminaler i projeksjonsområder i den injiserte regionen25,,26,,27.
I studien her brukes optogenetikk i kombinasjon med eksperimenter for å analysere angstrelatert oppførsel. Angstrelaterte psykiatriske sykdommer påvirker mer enn en tredjedel av verdensbefolkning 28,29,30 og forårsaker en høy økonomiskbyrde 31. De berørte lider av en følelse av opphisselse, spenning og bekymring etterfulgt av unngåelsesatferd32,33. Disse kronisk forekommende negative følelser, som hovedsakelig fokuserer på fremtidigehendelser 34, forstyrrer sterkt pasientens daglige liv. Vanlige behandlinger som benzodiazepiner eller selektive serotoninreopptakshemmere (SSRI) er bare vellykkede hos noen av pasientene. En stor mengde mennesker reagerer ikke på behandlingen i det hele tatt35, som viser at mekanismen som ligger til grunn for slike sykdommer ennå ikke er fullt ut forstått. Den mediale prefrontal cortex (mPFC) er kjent for å spille en viktig rolle i utviklingen og manifestasjonen av angst21,25,27,36,37,38. Spesielt kan overaktivering av den infralimbic cortex (IL) regionen i mPFC være en del av angstrelatertelidelser 39,40. Eksempeleksperimentet som er beskrevet her, kan bidra til å forstå hvordan modulasjoner i IL-regionen i mPFC påvirker angstatferd. I tillegg kan utviklingen av nye terapeutiske strategier for angstrelaterte psykiatriske sykdommer også potensielt støttes.
2-6 måneder gamle mannlige Nex-Cre mus brukes til å uttrykke ChR2 spesielt i pyramidale nevroner innenfor IL-regionen av mPFC41. Nex-Cre mus har en C57Bl/6 bakgrunn og uttrykke enzymet Cre-recombinase spesielt i pyramidale nevroner. Under en stereotaktisk kirurgi injiseres dobbelt floxed ChR2-DNA inn i IL-regionen via adeno-tilknyttede virale vektorer. Det optiske implantatet er plassert rett over interesseområdet (figur 1B) og implantatet er festet med tannsement. Kontrolldyr får en injeksjon av dobbel floxed tdTomato-DNA i samme region for å etterligne cellespesifikt uttrykk.
Dyr er gruppe-plassert til operasjonsdagen og etterpå er enkelt plassert for å unngå skader fra andre mus. Mus er plassert i individuelle ventilerte bur (IVC) stativer i TypI-L bur for enkelthus mus. Den lyse mørke syklusen følger en 12:12 h rytme, lysfasen starter kl 10. Alle atferdseksperimenter utføres i den mørke fasen, som ligner den aktive fasen av gnagere. Vann og standard matpellets er tilgjengelig ad libitum. Etter to uker med utvinning, som sikrer et tilstrekkelig uttrykk for ChR2 i pyramidale nevroner, brukes mus til atferdseksperimenter.
Open Field (OF) er en 50 cm x 50 cm kvadrert labyrint med sandblåste 40 cm høye vegger. Bakken er delt i 16 firkanter hvor de indre 4 representerer sentrum. Den målte virkemåten er: 1) tid brukt i midten, 2) antall midtoppføringer og 3) total avstand flyttet. I løpet av dette eksperimentet er det 4 studier på totalt 20 minutter. I forsøk 1 og 3 oppstår ingen lysstimulering, og i forsøk 2 og 4 utføres en stimulering på 20 Hz med 5 ms lyspuls og 1 mW lysintensitet på 473 nm (figur 2A). I de senere studiene ble det tatt hensyn til boligen til testområdet, men bruk av sham-injiserte kontrolldyr indikerer hvordan habituation uttrykkes.
Barnes Maze er et eksperiment for læring og hukommelse. Det er en sirkulær plattform som er 92 cm i diameter og inneholder 20 likeverdige hull rundt omkretsen. 19 av hullene er lukket og under ett hull presenteres en escape box. I 4 påfølgende dager har mus 4 treningsforsøk for å lære plasseringen av escape-boksen. På den femtedagen fjernes rømningsboksen, og mus testes på hvor mye tid de trenger for å finne riktig hull. Den målte virkemåten er: 1) Tid til escape box / riktig hull er funnet, 2) Antall målbesøk og feil, og 3) Avstand flyttet til i escape-boksen. Lysstimuleringen i ulike grupper gjøres enten under oppkjøp eller konsolidering, som finner sted på treningsdagene 1-4, eller under henting på testdagen, som er dag 5 (figur 2D).
Figur 2: Atferdseksperimenter med optogenetiske protokoller. A) Skjematisk tegning av Open Field-eksperimentet med den tilsvarende lysstimuleringsprotokollen. C) Skjematisk tegning av Elevated-Plus Maze-eksperimentet med den tilsvarende lysstimuleringsprotokollen. D) Skjematisk tegning av Barnes Maze-eksperimentet med den tilsvarende lysstimuleringsprotokollen. EPM: Forhøyet pluss labyrint; AV: Åpent felt; BM: Barnes Labyrint Test. Dette tallet er endret fra Berg 201948. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
For optogenetisk stimulering må lysintensiteten og frekvensen tilpasses det optogenetiske verktøyet og nevronale typen som er under etterforskning. Lavest mulig lysintensitet bør brukes for å unngå skade på vevet, da flere studier har vist at det er mulige varmeeffekter på grunn av sterk lysintensitet8,20. For ChR2 brukes ofte en 20 Hz stimulering med 5 ms lyspuls2. Siden ChR2 er ganske lysfølsom, er 1 mW lysintensitet tilstrekkelig. Lysstimuleringsprotokollen veksler mellom lys av og på forsøk for å måle atferdsendringer direkte. De eksterne romforholdene for atferdseksperimenter bør forbli stabile for hele gruppen av dyr. Viktige forhold å vurdere er støyen (husk at enhetene selv kan lage støy), lukten (rengjør alltid atferdsoppsettene med etanol), lysintensiteten og eksperimentereren. Eksperimentereren bør alltid være den samme personen. I tillegg bør tiden på dagen for eksperimentene være den samme for alle dyr i en gruppe, noen timer etter starten av den mørke fasen i anlegget foretrekkes.
Målet med dette eksperimentet er å øke eksitasjon / hemming (E / I) forholdet i IL-regionen gjennom sterk aktivering av eksitatoriske pyramidale nevroner. Et forbedret E/I-forhold i denne spesielle cortex-regionen er kjent for å øke angstnivået hosmus 40,,42,,43,,44.
Å bruke lys til å manipulere nevronal signalisering har vært den metoden for valg i nesten ett tiår nå. Siden 2005, antall publiserte artikler om utvikling av nye optogenetic verktøy4,6,8,14,49,50,51 og studier der slike verktøy benyttes til å undersøke hjernen kretser21,23,40,43,52, høyt økt. På den ene siden, med det enorme mangfoldet av injiserbare optogenetiske verktøy, implantasjonsvarianter, transgene muselinjer og atferdseksperimenter, er muligheten for eksperimenter mangfoldig og ubegrenset. På den annen side er muligheten til å gjøre feil ved valg av eksperimentelle forhold svært høy og eksperimentene er så spesifikke, at ofte er sammenlignbarheten med andre studier vanskelig.
Kritiske trinn
Et viktig kritisk trinn i denne protokollen er riktig planlegging. Valget av optogenetic verktøyet bør matche det vitenskapelige spørsmålet. Er det bare nødvendig å manipulere den generelle aktiviteten til en nevron eller synapse? Deretter kommersielt gitt verktøy som ChR221,,25,,27 og Arch37 er et godt valg. Men bortsett fra det, hvis en spesiell nevrotransmitter system eller en enkelt reseptor bør manipuleres, en individuell reseptor chimera er ofte bedre valg3,6. Flere reseptor chimeras med GPCRs, den såkalte Opto-XRs, og retningslinjer for å produsere dem er allerede tilgjengelig4,50. Annet enn valg av optogenetiske verktøy, er muselinjen i kombinasjon med atferdseksperimentet også kritisk. Ulike bakgrunnsstammer, som for eksempel C57Bl/6 og BALB/cByJ, viser forskjellige atferdsfenotyper i noen henseender53,,54. C57Bl/6-mus har lav baseline angst og kan brukes til anxiogen manipulasjon, mens BALB/cByJ viser høyere angstnivåer og er derfor mer følsomme for anxiolytiske legemidler. I tillegg kan de transgene variantene av disse bakgrunnsstammene også variere i fenotypen48. Med en riktig kombinasjon av spesifikke arrangører i forbindelse med et optogenetisk verktøy og transgen muselinje, kan nesten alle ønskede cellepopulasjoner målrettes.
Et kritisk skritt under operasjonen er rettet mot riktig plassering. Ved hjelp av musen hjerneatlas, riktige koordinater for fremre-bakre aksen, og mediale-lateral akse, og dybden av strukturen kan etableres45. I virkeligheten har hver hodeskalle en litt annen form og størrelse. Dermed er F-faktor46 for å justere stereotaktiske koordinater ganske viktig, som er riktig nese- og ørefiksering under stereotaktisk kirurgi. Hvis musens hode er vippet, vil injeksjons canulaen ikke klare å målrette mot ønsket interesseområde.
I tillegg er diameteren på injeksjons canula også kritisk. Hvis det er for lite, kan ingen virus slippes ut i vevet, hvis det er for bredt, vil kanulaen lekke virusløsning på vei til interesseområdet. Hvis den implanterte optiske fiberen avsluttes rett over målområdet, spiller virusuttrykket i cortex-områdene ovenfor ingen rolle. Men hvis implantatet er plassert over andre regioner for å stimulere axon terminaler, aksonene i øvre cortex regioner vil også bli aktivert av lys og forfalske innhentet data. Som et eksempel: IL-regionen og den prelimbic (PrL) regionen begge projisere til basal amygdala55,56 menhar helt forskjellige funksjoner og roller i modulering av angst26,57. Hvis implantatet er plassert over amygdala for å aktivere axon terminaler fra IL-regionen, og under injeksjon virusoppløsningen ble også plassert i PrL på grunn av feil injeksjon kanula, risikoen for også å aktivere axon terminaler fra PrL er svært høy.
Under utarbeidelsen av skallen for fiksering av implantatet, er den sparsomme bruken av primer og binding avgjørende for en pålitelig og holdbar fiksering. Hvis 2-komponent vedheftssystemet ikke påføres tynt, kan tannsementen løsne fra skallen etter et par dager eller uker. I tillegg må skallen også tørkes helt før du fikser implantatet, da ellers vil sementen ikke festes riktig til skallen.
Kritiske trinn finnes også i atferdsdelen av denne protokollen. For det første er byggingen av labyrinten svært viktig. I hvert atferdsoppsett finnes det flere varianter i litteraturen om størrelse og form, samt for selve prosedyren58,,59,,60. Det er viktig å velge en variant som gjør dataene sammenlignbare og reproduserbare. Også spesielle krav til brukte muselinjer bør tas i betraktning43,48. I de representative dataene for EPM kan det ses at flere Nex-Cre-mus falt fra labyrinten eller gled av flere ganger (Figur 2b). For disse musene ville en labyrint med en liten vegg rundt de åpne armene ha vært et bedre alternativ.
For det andre er det viktig å holde alle eksterne romforholdkonstante 61, ellers ville forskjellige grupper av mus ikke være sammenlignbare i det hele tatt. I denne forbindelse er det svært viktig å velge tidspunktet for eksperimentet som en hvor det eksperimentelle oppsettet er ledig og eksperimentereren alltid er tilstede. Videre bør hendelser i bygningen, for eksempel byggearbeid, testing av systemer (brannalarm) eller rengjøringsdagen til museanlegget, vurderes for å unngå interferens med de oppnådde dataene.
Til slutt er håndtering og boforhold avgjørende for atferdseksperimenter. Når en implantasjon utføres, må mus være enkelt plassert på grunn av risikoen for skade fra andre mus. For å sikre god sammenligning mellom grupper og en lav feil i én gruppe, må hver mus ha samme burstørrelse og berikelse. For angstrelaterte eksperimenter har enkeltboliger noen fordeler som singe housed mannlige mus viser en lavere baseline angst nivå, mindre variasjon i deres angstnivå, og mindre depressive-lignende symptomer15,16. Gruppehus hannmus kan sterkt variere i angstnivået på grunn av hierarki blant musene. Foruten huset er en konstant og lik håndtering av alle mus og grupper også viktig. Å gripe musen for å koble den lette fiberen på implantatet er veldig stressende. Derfor må denne prosedyren være den samme for hver mus, noe som betyr samme teknikk og samme eksperimenterer. Videre må habituation tid i venteburet, som er ment å roe musen ned fra stressende tilkoblingsprosedyre, også ha like forhold i varighet, søppel og posisjon til labyrinten. Håndteringen i museanlegget er også avgjørende for senere atferdsytelse. Eksperimentelle og kontrollerende dyr bør ikke rengjøres på forskjellige dager eller av forskjellige mennesker, da dette også er stressende for mus. I tillegg bør rengjøringsdagen ikke være den eksperimentelle dagen for å unngå forskjeller i atferd.
Feilsøking
Det er flere problemer som kan oppstå under protokollen. For eksempel kan boring av en helhet i skallen under stereotaktisk kirurgi skade blodårene. Vanligvis oppstår sterk blødning, spesielt over bregma og lambda. Hvis dette skjer, ikke prøv å stoppe blødningen med bomullpinner som de har en tendens til å utvide enda mer blødning ut av fartøyet på grunn av deres absorbens, i stedet, skyll direkte med NaCl.
Det kan også hende at trykkinjeksjonen av virusoppløsningen ikke virker. I dette tilfellet kan det være at parafilm, en scab fra burr hullet eller hjernevev, tetter spissen av kanula. I dette tilfellet fjerner du kanulaen sakte ut av hjernen uten å endre x- eller y-aksen og bruker en pinsett for å fjerne 1-2 mm av den fremre delen av kanulaspissen. Før du senker kanula igjen, test for funksjonalitet ved å bruke liten mengde trykk for å se om viruset kommer ut av kanulaspissen. For å unngå forstoppelse, senk kanulaen med konstant hastighet og ikke stopp bevegelsen før den dypeste dybden på injeksjonssiden er nådd. Hvis for mye av kanulaspissen fjernes og diameteren er for stor, vil kanulaen skade vevet og risikoen for å bruke viruset samtidig vil bli økt. Sørg derfor for at bare den tette delen av spissen fjernes nøye.
Under atferdseksperimentet kan oppsettet av eksperimentet i videosporingsprogramvaren (f.eks. Ethovision XT) forårsake problemer. Hvis for eksempel lyseffekten ikke fungerer som den skal, kan dette skyldes flere grunner. Pulser må åpnes, programmeres og startes før Ethovision XT åpnes. Maskinvaren må velges riktig i “Eksperimentell oppsett” (trinn 3.2.2.4). Hvis feil IO-Box, eller noe annet enn “Kostymemaskinvare” er valgt, kan ikke Pulser-enheten styres av Ethovision. Hvis testen av lyseffekten er vellykket, men den programmerte lysprotokollen i “Innstillinger for prøvekontroll” ikke fungerer under anskaffelsen, kan underregelen eller underregelreferansen være plassert feil eller betingelsene og handlingene er uklare. For eksempel: tilhører referansen den riktige underregelen? Er referansen programmert riktig (f.eks. hvor ofte utføres underregelen)?
I tillegg kan det hende at under “deteksjonsinnstillinger” dyret er tilstrekkelig sporet, men under oppkjøpet er det prøver der motivet ikke er funnet. I dette tilfellet, sjekk om belysningen i eksperimentelle rommet ble endret, eller om noe produsert uønskede skygger i labyrinten. Hele bunnen av labyrinten må ha samme farge, da innstillingen bare vil fungere for en bestemt kombinasjon. Hvis forskjellige bunnfarger eller skygger av en eller annen grunn ikke kan unngås, definerer du deteksjonsinnstillingen i den mørkeste delen av labyrinten.
Hvis du vil endre eventuelle innstillinger etter anskaffelsen av de første dyrene, må du ikke bruke disse endringene i de allerede brukte innstillingene. Dupliser dem for å justere dem. Dette betyr også at den allerede registrerte prøveversjonen ikke er gyldig lenger for dataanalyse. I et slikt tilfelle registrerer du alle dyr for denne eksperimentelle gruppen med de opprinnelige innstillingene, og opprett et nytt eksperiment etterpå hvor de innspilte videoene analyseres i stedet for live sporing. I dette “fra video” eksperimentet kan flere innstillinger brukes til analyse uten å miste sammenlignbarhet mellom dyr eller til og med data.
Begrensninger og fremtidige applikasjoner
Denne metoden for å manipulere atferd med optogenetikk i fritt bevegelige dyr inkluderer også begrensninger. Under operasjonen er nærheten til de to implantatene begrenset. For dobbel implantasjon må avstanden mellom de to implantatene minimalt være bredden på apparatet for å holde implantatet. Apparatet må senke det andre implantatet ned i burrhullet, mens de første implantatene allerede er festet. En løsning for dette kan være en vinklet implantasjon, hvor tuppene av glassfiberen kan være svært nær mens de keramiske ferlene over skallen har størreavstand 23,,55,,56,,57,,62,,63. En ulempe med en vinklet implantasjon er lyset som sprer seg. Når fiberspissen skrås i stedet for rett over, er det stimulerte området forskjellig. Ved to målregioner i umiddelbar nærhet må den endrede posisjonen til lysstimuleringen vurderes.
Under atferdseksperimentet kan byggingen av labyrinten forstyrre den optiske kabelen som er koblet til dyret. Noen atferdstester, for eksempel den lyse mørke boksen, inneholder et innendørs område64,,65og andre labyrinter inneholder rom som musen må gå inn i. Slike eksperimenter kan ikke utføres med dette oppsettet. Et trådløst system kan også være et alternativ22,26,66. Men heldigvis kan noen labyrinter, som Barnes Maze, ordnes på en slik måte, at musene er i stand til å gå inn i de relevanterommene 67.
Foruten de med lukkede soner, kan labyrinter som er for brede forårsake også problemer. Jo større området av labyrinten, jo lenger kabelen må være for å tillate dyret å gå til alle posisjoner i labyrinten. Det må tas hensyn til at dyret ikke er i stand til å tråkke på kabelen eller ta det og bite det. En løsning for det kan være en konstruksjon som ruller opp overflødig kabel. En ulempe er at dra for å rulle ut kabelen er vanskelig for mus. Denne løsningen passer bedre for rotter. Et annet mulig alternativ kan være å gjøre lysstimuleringen på forhånd, i stedet for under forsøket, er dette selvfølgelig bare mulig hvis en langsiktig effekt på grunn av lysstimuleringen oppstår23.
Sammenligning med eksisterende/alternative metoder
Alternative metoder ville være kjemisk eller elektrisk stimulering underatferd 8,18. Kjemiske agonister eller antagonister er i stand til å aktivere eller dempe nevroner via spesifikke reseptorer og kan også manipulere enkelt nevrotransmittersystemer38,68. På den ene siden er reseptorspesifisiteten ganske høy for kjemikalier, fordi spesifikk agonist eller antagonist bare aktiverer visse reseptorer39. På den annen side er spesifisiteten for reseptorundertyper av samme nevrotransmittergruppe ofte utilstrekkelig. De fleste kjemikalier binder seg til minst to undertyper med ulike sannsynligheter69. I tillegg kan kjemikalier ikke skille mellom nevronale celletyper så lenge de har de samme reseptortypene. Utover dette er timelig og romlig oppløsning dårlig for kjemiske manipulasjoner i forhold til optogenetikk. Agonister eller antagonister administreres ofte oralt35 eller via systemiske injeksjoner57,,70. Hvis infusjonen av kjemikaliet gjøres direkte i hjernevevet, vises effektene raskere enn med orale applikasjoner, men fortsatt på en langsommere tidsskala enn med lysstimulering. Som administrerte kjemikalier diffuse i hjernen og er ikke spesifikke for nevronale typer eller hjerneregioner, manipulering av spesifikke hjernekretser det ikke mulig.
Elektrisk stimulering har en høyere temporal oppløsning enn kjemiskstimulering 9,,14. Spredningen i nevronalt vev er mindre enn med kjemisk stimulering, og romlig oppløsning er bedre enn med kjemisk stimulering. Elektrisk stimulering mangler imidlertid muligheten til å spesifikt adressere forskjellige nevronale celletyper eller reseptortyper, da hver nevron i nærheten av elektroden vil reagere på den elektriske stimuleringen.
Alternative metoder for atferden i fritt bevegelige mus er for eksempel elektrofysiologiske opptak i hjerneskiver, hvor enkeltnevroner eller aksoner kan moduleres med optogenetikk og fremkalte effekter kan måles via opptak avelektroder 6,,71. In vitro eksperimenter tilbyr muligheten til å undersøke molekylær og cellulær basis av optogenetiske stimuleringer, men har begrensningen at iboende tilkobling og innspill fra andre hjerneregioner mangler. Et annet alternativ er å bruke optogenetic i forbindelse med multiphoton imaging1,72. I dette tilfellet har mus hodet fast og kan bedøves eller være våken for å løse enkle oppgaver.
For å utføre et vellykket optogenetisk eksperiment, er et bredt spekter av verktøy og applikasjoner tilgjengelige i dag. Valg av optogenetiske verktøy og atferdsmessig oppsett er avgjørende for å svare på spesifikke forskningsspørsmål. Hvis den rette kombinasjonen av verktøy og eksperimenter er valgt, tillater optogenetikk en enestående, grundig undersøkelse av nevronale kretser med høy temporal og romlig oppløsning. Dette vil bidra til å forstå og utvikle nye terapeutiske strategier for psykiatriske sykdommer og kognisjon.
The authors have nothing to disclose.
Stor takk til Prof Klaus-Armin Narve og Dr. Sandra Goebbels (Max-Plank-Institute of Experimental Medicine, Goettingen, Tyskland) for vennlig å gi Nex-Cre mus. Vi takker også vårt videoteam Yunus Dikici og Ruben Wiesner for opptak og behandling av JoVE-videoen for denne artikkelen. I tillegg, stor takk til Kristin Claussen for hennes voice-over og Kimberly Anne Go for korrekturlesing av manuskriptet.
De presenterte resultatene ble oppnådd ved Ruhr-universitetet i Bochum og videoen ble spilt inn ved Universitetet i Bremen.
Dette arbeidet ble finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) – Projektnummer 122679504 – SFB 874 og DFG MA 4692/3-2.
Ketamin | Sigma-Aldrich | K2753-64 | Anestasia |
20 % Glucose | AlleMan Pharma | Injection s.c. for fast recovery | |
Behavioral mazes | Costum made | Measure anxiety | |
Bepanthen | Bayer | Ophthalmic oinment | |
Betaisodona | Monodipharma | Sterilant containing iodine | |
Betaisodona | Monodipharma | Iodine oinment | |
Binocular | Olympus | SZ52, 110AL0.62x WD160 | Surgery |
Ceramic ferrules | Thorlabs | CFLC230-10 | Implant |
Ceramic Fiber Scribe | Thorlabs | CSW12.5 | Cutting of the glass fiber |
Channelrhodopsin2-YFP virus | Penn Vector Core | Addgene 20298 | Optogenetic tool |
Compressed air | Kontakt Chemie | Druckluft 67 | Drying of the skull |
Coordinate system | Stoelting | Stereotactic coordinates for the surgery | |
Correl Draw | Graphical software version 13 | ||
Cryoslicer | MICROM | HM500OM | Production of brain slices for staining |
Ethovision XT 14 | Noldus | Software for behavioral tracking | |
Exel | Statistical Software | ||
Ferrule Polishing Puck | Thorlabs | D50-F | Polishing implants round side |
Fiber Patch Cord dual | Prizmatix | Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm | Cables, which are connected with the two implants of a bilateral implantation |
Fiber Patch Cord single | Prizmatix | Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm | Cable, which is connected with the implant via a sleeve |
Fiber Stripping Tool | Thorlabs | T06S13 | Stripping glass fiber for implant |
Filter paper | VWR European | 516-0300 | Cut into pieces for the Novelty-Suppressed Feeding test |
Food pellets | Mühle Levers | Höveler Nagerfutter | Nutrition for the mice |
Glass pipettes | Harvard Apparatus | GC150-10 | Injection pipettes |
Gradia direct-Flo | Henry Schein | 103322 | Fluid dental cementum |
Heating lamp | efbe-Schott/Phillips | R95E | Prevent the mice from cooling after the surgery |
Heating plate | Stoelting | Integrated into coordinate system | |
Injection canula | Braun | 100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20 | All injections and to bore hole into the skull |
Litter | T 1350 | Grounding for the Novelty-Supressed Feeding test | |
Mouse cages | Zoonlab | 405 cm^2 | Single housing for experiments |
Optibond FL | Kerr | 26684E | Preparation of the skull for implantation |
Optical glass fiber | Thorlabs | FT200EMT | Light fiber for implant |
Optogenetics-LED.STSI | Prizmatix | Optogenetic toolbox for light stimulation during behavioral experiments | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005-1KG-R | Perfusion of mice to remove the brains |
Polishing sheet 0.02 µm grit | Thorlabs | LFCF | Polishing implants round side |
Polishing sheet 1 µm grit | Thorlabs | LF1D | Polishing implants round side |
Polishing sheet 30 µm grit | Thorlabs | LF30D | Polishing implants round side |
Polishing sheet 6 µm grit | Thorlabs | LF6D | Polishing implants round side |
Pulser Software | Prizmatix | Software for light device control | |
Rimadyl-Carprofen | Zoetis | Analgesia | |
Sigma Plot | Software for statistics | ||
Sleeve | Thorlabs | FT200EMT | Connection of implant and light cable |
SodiumCloride (NaCl) | Braun | 3570410 | Rinsing of the skull |
Superglue | Pattex Henkel | To Fix the glass fiber in the ferrule | |
td-Tomato virus | Penn Vector Core | Addgene 51503 | Optogenetic tool |
UV light | KoQGHJ | wireless, 1200 mW/cm^2 | Polymeration lamp for dental cementum |
Xylavet-Xylazin | cp pharma | Anesthesia |