विशिष्ट न्यूरोनल आबादी या मस्तिष्क क्षेत्रों के ऑप्टोजेनेटिक हेरफेर के साथ, व्यवहार को स्वतंत्र रूप से चलने वाले जानवरों में उच्च लौकिक और स्थानिक संकल्प के साथ संशोधित किया जा सकता है। लंबे समय से प्रत्यारोपित ऑप्टिकल फाइबर के साथ संयोजन में विभिन्न ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों का उपयोग करके, विभिन्न प्रकार के न्यूरोनल मॉड्यूलेशन और व्यवहार परीक्षण किए जा सकते हैं।
स्वतंत्र रूप से चलती चूहों में न्यूरोनल सर्किट का ऑप्टोजेनेटिक मॉड्यूलेशन तीव्र और दीर्घकालिक व्यवहार को प्रभावित करता है। यह विधि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में पूरे न्यूरोनल सर्किटरी तक एकल न्यूरॉन्स और क्षेत्र-विशिष्ट ट्रांसमीटर रिलीज के जोड़तोड़ करने में सक्षम है, और व्यवहार परिणामों के प्रत्यक्ष माप की अनुमति देती है। न्यूरॉन्स वायरल वैक्टर के एक इंजेक्शन के माध्यम से ऑप्टोजेनेटिक उपकरण व्यक्त करते हैं, जैसे कि चैनलरोडोप्सिन 2 (ChR2)। प्रकाश को पुरानी ऑप्टिकल प्रत्यारोपण के माध्यम से विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में लाया जाता है जो सीधे लक्ष्य क्षेत्र से ऊपर समाप्त होता है। वसूली और उचित उपकरण-अभिव्यक्ति के दो सप्ताह के बाद, चूहों को बार-बार ब्याज के न्यूरॉन्स के ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना के साथ व्यवहार परीक्षणों के लिए उपयोग किया जा सकता है।
ऑप्टोजेनेटिक मॉड्यूलेशन में एक उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प होता है जिसे आमतौर पर रासायनिक या विद्युत उत्तेजना जैसे तरीकों की तुलना में उच्च कोशिका विशिष्टता के साथ पूरा किया जा सकता है। प्रकाश न्यूरोनल ऊतक को नुकसान नहीं पहुंचाता है और इसलिए इसका उपयोग दीर्घकालिक प्रयोगों के साथ-साथ एक माउस में कई व्यवहार प्रयोगों के लिए किया जा सकता है। ऑप्टोजेटिक उपकरणों की संभावनाएं लगभग असीमित हैं और पूरे न्यूरॉन्स की सक्रियता या मुंह बंद करने, या यहां तक कि प्रकाश द्वारा एक विशिष्ट रिसेप्टर प्रकार के हेरफेर को सक्षम करती हैं।
एकीकृत ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना के साथ इस तरह के व्यवहार प्रयोगों के परिणाम सीधे हेरफेर के कारण व्यवहार में परिवर्तन की कल्पना करते हैं। एक आधार रेखा के रूप में प्रकाश उत्तेजना के बिना एक ही जानवर का व्यवहार प्रेरित परिवर्तनों के लिए एक अच्छा नियंत्रण है। यह चिंता जैसे विशिष्ट व्यवहारों में शामिल न्यूरोनल प्रकार या न्यूरोट्रांसमीटर सिस्टम का विस्तृत अवलोकन करने की अनुमति देता है। ऑप्टिकल उत्तेजना के बाद दीर्घकालिक उत्तेजना या व्यवहार टिप्पणियों के माध्यम से न्यूरोनल नेटवर्क की प्लास्टिसिटी की भी बहुत विस्तार से जांच की जा सकती है। ऑप्टोजेनेटिक्स कई प्रकार के न्यूरोलॉजिकल रोगों में न्यूरोनल सिग्नलिंग को प्रबुद्ध करने में मदद करेगा।
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में न्यूरोनल सर्किट का मॉड्यूलेशन और उनके व्यवहार परिणाम यह समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं कि मस्तिष्क कैसे काम करता है, विशेष रूप से मनोरोग रोगों और सीखने और स्मृति जैसे संज्ञानात्मक कार्यों में। ऑप्टोजेनेटिक्स के साथ, पूरे सर्किटरी तक एकल कोशिकाओं या कोशिका आबादी को प्रकाश द्वारा संग्राहक किया जा सकता है। चैनलरोडोप्सिन 2 (ChR2) या आर्काएरहोडोप्सिन (आर्क) जैसे सामान्य ऑप्टोजेनेटिक उपकरण न्यूरॉन्स को सक्रिय या शांत करने में सक्षम हैं, या अलग मस्तिष्क क्षेत्रों में पेश होने वाले एक्सॉन टर्मिनलों पर ट्रांसमीटर रिलीज को बढ़ाने या बाधित करने में सक्षम हैं1,,2,,3,,4। हालांकि, आर्क को ध्यान से इस्तेमाल करने की जरूरत है क्योंकि यह दिखाया गया था कि प्रेसिनैप्टिक टर्मिनलों पर इसकी सक्रियता सहज ट्रांसमीटर रिलीज5बढ़ जाती है। आर्क एक जावक सुधार प्रोटोन पंप है जो सेल के अंदर पीएच मूल्य को बदलता है। यह क्षारीय परिवेश कैल्शियम की आमद को प्रेरित करता है और ट्रांसमीटर रिलीज5को बढ़ाता है । विशेष रूप से इंट्रासेलुलर सिग्नलिंग रास्तों को संशोधित करने के लिए, रिसेप्टर कल्पना एक हल्के सक्रिय ऑप्टोजेनेटिक उपकरण से बना है, जैसे कि रोडोप्सिन या शंकु ऑप्सिन, पर्याप्त जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर के साथ मिलकर,6,,7,,8बनाया जा सकता है। पिछलेनौदशक के दौरान उपलब्ध ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों की मात्रा और भिन्नता में काफी वृद्धि हुई है .
ऑप्टोजेनेटिक्स का उद्देश्य व्यवहार के दौरान न्यूरोनल सर्किटरी में हेरफेर करना है। ऑप्टोजेनेटिक्स सक्षम बनाता है, उदाहरण के लिए, तीव्र व्यवहार परिवर्तनों का माप जैसे चिंता व्यवहार में परिवर्तन। ऑप्टोजेनेटिक उपकरण वायरल वैक्टर के माध्यम से मस्तिष्क के लक्षित क्षेत्रों में वितरित किए जाते हैं। विशेष प्रमोटरों और एन् बढ़ाने वालों या क्रे-लोक्सपी सिस्टम की मदद से ऑप्टोजेनेटिक टूल्स(चित्रा 1 ए)की अभिव्यक्ति के लिए सेल टाइप स्पेसिटी सुनिश्चित की जा सकती है। केवल विशिष्ट कोशिका प्रकारों में एंजाइम क्रे-रिकॉम्बिनेंटस को व्यक्त करने वाली कई आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस लाइनें हैं। उदाहरण के लिए, नेक्स-क्रे चूहे कॉर्टेक्स में पिरामिड न्यूरॉन्स में क्रे-रिकॉम्बिनेंटस और नेक्स-प्रमोटर10के नियंत्रण में हिप्पोकैम्पस व्यक्त करते हैं। यह एंजाइम डीएनए-दृश्यों को उलटने में सक्षम है, जो11लोक्सपी पक्षों द्वारा घिरा हुआ है। नतीजतन, डबल-फ्लॉक्स्ड ऑप्टोजेनेटिक टूल का डीएनए-अनुक्रम, जो लोक्सपी पक्षों द्वारा उलटा और घिरा हुआ है, केवल उन न्यूरॉन्स द्वारा लिखा जा सकता है जिनके पास क्रे-रिकॉम्बेनेस होताहै, लेकिन अन्य न्यूरोनल प्रकार12,,13द्वारा नहीं। नेक्स-क्रे चूहों के मामले में, ऑप्टोजेनेटिक उपकरण पूरी तरह से पिरामिड न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाएगा। कुछ मस्तिष्क क्षेत्रों की हल्की उत्तेजना तब ब्याज के क्षेत्र से सीधे ऊपर ऑप्टिकल फाइबर के पुराने प्रत्यारोपण के माध्यम से प्राप्त की जाती है। जानवरों को तब एक उपयुक्त प्रकाश स्रोत के साथ मिलकर किया जा सकता है और लगभग सभी प्रकार के व्यवहार परीक्षणों में स्वतंत्र रूप से व्यवहार कर सकते हैं।
चित्रा 1: इंजेक्शन और प्रत्यारोपण। ए) ChR2-YFP के लिए क्रे-लोक्सपी सिस्टम । डबल फ़्लोक्स्ड ऑप्टोजेनेटिक टूल को मस्तिष्क के ऊतकों में इंजेक्शन के लिए एडेनो संबद्ध वायरस (एएवी) में पैक किया जाता है। B)एमएफसी के आईएल क्षेत्र में/ऊपर एक ऑप्टिकल न्यूरोनल इंटरफेस के वायरस इंजेक्शन और प्रत्यारोपण का Sagittal दृश्य । ऊपर से इंजेक्शन और इंप्लांटेशन किया गया। ब्याज, आईएल, बीएलए और डीआरएन के सभी क्षेत्रों को दिखाया गया है । C)प्रत्यारोपित ऑप्टिकल फाइबर, आस्तीन और प्रकाश स्रोत का विस्तृत दृश्य। D)ग्रे मैटर ब्रेन टिश्यू में 200 माइक्रोम लाइट फाइबर (येज़हार एट अल 2011) से नीले और लाल लेजर लाइट उत्तेजना का प्रसार। नीली रोशनी फैलती है, अधिकतम, ऊतक में 0.5 मिमी, लाल बत्ती लगभग 1 मिमी। रंग कोडिंग: लाल 50%, पीला 10%, हरा 5%, नीला 1% अगर प्रकाश इस क्षेत्र तक पहुंचता है। ई)एकतरफा प्रत्यारोपण के कोरोनल दृश्य सीधे एक 200 μm ऑप्टिकल फाइबर के साथ बाएं आईएल के ऊपर. आईएल क्षेत्र में प्रत्येक गोलार्द्ध में 0.25 मिमी की चौड़ाई और 0.2 मिमी की गहराई है। नीले और लाल बत्ती बल्ब 5% प्रकाश फैलने के बोर्डर हैं और येज़हर एट अल से सही आकार में स्थानांतरित किए जाते हैं। LoxP: एक्स-ओवर पी 1 का लोकस; ChR2: Channelrhodopsin; YFP: पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन; dflox: डबल floxed; आईएल: इन्फ्रालिम्बिक कॉर्टेक्स; बीएलए: बसोलेटरल एमिग्डाला; डीआरएन: पृष्ठीय राफे नाभिक; पीआरएल: प्रीलिम्बिक क्षेत्र। इस आंकड़े को बर्ग 201948से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण का उपयोग किया जाता है क्योंकि यह उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प14 और सेल प्रकार विशिष्ट मॉड्यूलेशन दोनों को सक्षम बनाता है। इसके अतिरिक्त, आगे के उपचार के बिना प्रत्यारोपित डिवाइस का दोहराव करना संभव है। एक स्टीरियोटाटिक सर्जरी के बाद, जहां ऑप्टोजेनेटिक उपकरण ले जाने वाले एडेनो से जुड़े वायरस का इंजेक्शन और ऑप्टिकल फाइबर का प्रत्यारोपण किया जाता है, चूहे दो सप्ताह तक ठीक हो सकते हैं। हम केवल 2 सप्ताह की एक वसूली समय चुना है, क्योंकि यह पर्याप्त समय के लिए सर्जरी से उबरने और वायरस के लिए व्यक्त करने के लिए है । चूंकि व्यवहार प्रयोगों को इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा फॉलो किया जाता है, इसलिए हमें यह सुनिश्चित करना होगा कि प्रयोग के दौरान चूहे बहुत पुराने न हों; अन्यथा ऊतक की गुणवत्ता में कमी आई है। वे प्रत्यारोपण से कोई स्पष्ट व्यवहार हानि दिखाने के लिए और ठेठ पिंजरे व्यवहार में संलग्न हैं । बेशक, प्रत्यारोपण एक महत्वपूर्ण शल्य घाव के साथ है; इसलिए, चूहों की गहनता से निगरानी की जाती है। सर्जरी के बाद, चूहों को एकल रखे जाने की आवश्यकता होती है, क्योंकि समूह में रखे गए चूहे एक-दूसरे के ताजा घावों और प्रत्यारोपण को घायल करते हैं। हालांकि, आवास की स्थिति पुरुष चूहों की चिंता के स्तर पर एक बड़ा प्रभाव पड़ता है, के रूप में एक घर चूहों कम चिंता का स्तर15 और सामांय में कम अवसादग्रस्तता की तरह लक्षण16दिखा ।
मस्तिष्क सर्किटरियों के रासायनिक या विद्युत हेरफेर में ऑप्टोजेनेटिक्स की उच्च कोशिका प्रकार की विशिष्टता की कमी होती है और इसमें अस्थायी और स्थानिक संकल्प14,17,18होता है ।18 प्रायोगिक प्रश्न के आधार पर, विद्युत या रासायनिक उत्तेजना के अलग-अलग फायदे हो सकते हैं। जब एक विशिष्ट क्षेत्र में फाइबर टर्मिनलों गुजर भी उत्तेजित होने की जरूरत है, विद्युत उत्तेजना सबसे अच्छा तरीका है । रासायनिक उत्तेजना एक अच्छा विकल्प है जब एक पूरे क्षेत्र में ट्रांसमीटर विशिष्ट रिसेप्टर्स को एगोनिस्ट द्वारा सक्रिय किया जाना चाहिए। रासायनिक या विद्युत उत्तेजना की तुलना में ऑप्टोजेनेटिक्स का एक और बड़ा लाभ यह है कि अंतर्जात रूप से, न्यूरॉन्स प्रकाश के प्रति संवेदनशील नहीं होते हैं, जोदुष्प्रभाव 19की घटना से बचते हैं। दरअसल, उच्च प्रकाश तीव्रता हीटिंग प्रभाव,8,20को प्रेरित कर सकती है, लेकिन उचित नियंत्रण समूहों के कारण, ऑप्टोजेनेटिक हेरफेर के कारण व्यवहार प्रभाव को समाप्त किया जा सकता है।
कृंतक व्यवहार की जांच, विशेष रूप से मनोरोग रोगों के संबंध में, स्वतंत्र रूप से चलती जानवरों में ऑप्टोजेनेटिक्स के साथ काफी सुधार हुआ है, क्योंकि यह विशिष्ट सेलआबादी 21 और सर्किटरी22तक एकल रिसेप्टर्स के प्रत्यक्ष मॉड्यूलेशन को सक्षम बनाता है। इस तरह के मॉड्यूलेशन के तीव्र प्रभावों को मापने की संभावना, साथ ही एक परिभाषित समय23 के बाद या पुरानी उत्तेजना24के बाद दीर्घकालिक व्यवहार प्रभाव, प्रयोगात्मक डिजाइनों के व्यापक लचीलेपन को सक्षम बनाता है और मस्तिष्क सर्किटरी में बहुत विस्तृत अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। ऑप्टोजेनेटिक उपकरण के इंजेक्शन साइट पर स्थित न्यूरॉन्स को मिलाने के लिए हल्के उत्तेजना का उपयोग किया जा सकता है। जब इंजेक्शन और प्रत्यारोपण दोनों एक ही मस्तिष्क क्षेत्र को संबोधित करते हैं, तो इस क्षेत्र में सिद्धांत न्यूरॉन्स और इंटरन्यूरॉन के सिद्धांत न्यूरॉन्स के बैक प्रोजेक्टिंग एक्सॉन को3,,6,,8लक्षित किया जा सकता है। हालांकि, हल्के फाइबर को इंजेक्शन से अलग क्षेत्र में भी प्रत्यारोपित किया जा सकता है। इस मामले में, प्रकाश उत्तेजना इंजेक्शन क्षेत्र25, 26, 27,26,27के प्रक्षेपण क्षेत्रों में अक्षतंपर टर्मिनलों पर ट्रांसमीटर रिलीज को मिला सकती है।
यहां अध्ययन में, ऑप्टोजेनेटिक्स का उपयोग चिंता से संबंधित व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए प्रयोगों के संयोजन में किया जाता है। चिंता से संबंधित मनोरोग रोग दुनिया की एक तिहाई से अधिकआबादी 28,29,,30 को प्रभावित करते हैं और31 उच्च आर्थिक बोझ पैदाकरतेहैं । प्रभावित लोग उत्तेजना, तनाव और चिंता की भावना से पीड़ित हैं और इसके बाद परिहार व्यवहार32,,33 ये लंबे समय से होने वाली नकारात्मक भावनाओं, जो मुख्य रूप से भविष्य की घटनाओं३४पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, दृढ़ता से रोगियों के दैनिक जीवन के साथ हस्तक्षेप । बेंजोडाइज़ेपिन्स या चयनात्मक सेरोटोनिन रीटेक अवरोधक (एसएसआरआई) जैसे सामान्य उपचार केवल कुछ रोगियों में सफल होते हैं। बड़ी मात्रा में लोग सभी35पर उपचार का जवाब नहीं देते हैं, यह दिखाते हुए कि ऐसी बीमारियों में अंतर्निहित तंत्र अभी तक पूरी तरह से समझ में नहीं आया है। मध्यपूर्व प्रांतस्था (एमपीएफसी) चिंता 21 , 25,,27, 36 ,,37,,,2538के विकास और अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जानाजाताहै।27 विशेष रूप से, एमपीएफसी में इन्फ्रालिम्बिक कॉर्टेक्स (आईएल) क्षेत्र का अतिसक्रियण चिंता से संबंधित विकारों का हिस्सा हो सकता है39,,40। यहां वर्णित उदाहरण प्रयोग यह समझने में मदद कर सकता है कि एमपीएफसी के आईएल क्षेत्र में मॉड्यूलेशन चिंता व्यवहार को कैसे प्रभावित करते हैं। इसके अतिरिक्त, चिंता से संबंधित मनोरोग रोगों के लिए नई चिकित्सीय रणनीतियों के विकास को भी संभावित रूप से समर्थित किया जा सकता है।
2-6 महीने पुराने पुरुष नेक्स-क्रे चूहों का उपयोग विशेष रूप से एमपीएफसी41के आईएल क्षेत्र के भीतर पिरामिड न्यूरॉन्स में ChR2 व्यक्त करने के लिए किया जाता है। नेक्स-क्रे चूहों की C57Bl/6 पृष्ठभूमि होती है और विशेष रूप से पिरामिड न्यूरॉन्स में एंजाइम क्रे-रिकॉम्बेन्नेस व्यक्त करते हैं। एक स्टीरियोटैक्टिक सर्जरी के दौरान, डबल floxed ChR2-डीएनए adeno संबद्ध वायरल वैक्टर के माध्यम से आईएल क्षेत्र में इंजेक्शन है । ऑप्टिकल इंप्लांट को सीधे ब्याज(चित्रा 1बी)के क्षेत्र से ऊपर रखा जाता है और इंप्लांट डेंटल सीमेंट के साथ तय किया जाता है । नियंत्रण जानवरों को सेल विशिष्ट अभिव्यक्ति की नकल करने के लिए एक ही क्षेत्र में डबल floxed tdTomato-डीएनए का एक इंजेक्शन प्राप्त होता है ।
जानवरों को सर्जरी के दिन तक समूह-रखे जाते हैं और बाद में अन्य चूहों से चोटों से बचने के लिए एकल रखे जाते हैं। चूहों को एक रखे चूहों के लिए टाइपी-एल पिंजरों में व्यक्तिगत हवादार पिंजरे (आईवीसी) रैक में रखे जाते हैं। प्रकाश-अंधेरे चक्र 12:12 घंटे की लय का अनुसरण करता है, प्रकाश चरण सुबह 10 बजे से शुरू होता है। सभी व्यवहार प्रयोग अंधेरे चरण में किए जाते हैं, जो कृंतक के सक्रिय चरण जैसा दिखता है। पानी और मानक खाद्य छर्रों विज्ञापन libitum उपलब्ध हैं। वसूली के दो सप्ताह के बाद, जो पिरामिड न्यूरॉन्स में ChR2 की पर्याप्त अभिव्यक्ति सुनिश्चित करता है, चूहों का उपयोग व्यवहार प्रयोगों के लिए किया जाता है।
ओपन फील्ड (ओएफ) 50 सेमी x 50 सेमी चुकता भूलभुलैया है जिसमें सैंडब्लास्टेड 40 सेमी ऊंची दीवारें हैं। जमीन को 16 वर्गों में विभाजित किया गया है जहां आंतरिक 4 केंद्र का प्रतिनिधित्व करते हैं। मापा व्यवहार है: 1) केंद्र में बिताया समय, 2) केंद्र प्रविष्टियों की संख्या, और 3) कुल दूरी चले गए । इस प्रयोग के दौरान कुल 20 मिनट के 4 परीक्षण होते हैं। परीक्षण 1 और 3 में, कोई प्रकाश उत्तेजना नहीं होती है, और परीक्षण 2 और 4 परीक्षणों में, 5 एमएस लाइट पल्स और 1 मेगावाट की हल्की तीव्रता के साथ 20 हर्ट्ज उत्तेजना 473 एनएम(चित्रा 2 ए)किया जाता है। बाद के परीक्षणों में, परीक्षण क्षेत्र में आदत को ध्यान में रखा गया था, लेकिन नकली-इंजेक्शन नियंत्रण जानवरों के उपयोग से पता चलता है कि आदत कैसे व्यक्त की जाती है।
बार्न्स भूलभुलैया सीखने और स्मृति के लिए एक प्रयोग है। यह एक गोलाकार मंच है जो व्यास में 92 सेमी है और परिधि के चारों ओर 20 समान दूरी के छेद होते हैं। छेद के 19 बंद कर रहे हैं और एक छेद के नीचे एक बच बॉक्स प्रस्तुत किया जाता है। लगातार 4 दिनों तक चूहों के पास एस्केप बॉक्स की लोकेशन जानने के लिए 4 ट्रेनिंग ट्रायल होते हैं। 5 वें दिन, एस्केप बॉक्स को हटा दिया जाता है, और चूहों का परीक्षण कियाजाता है कि उन्हें सही छेद खोजने के लिए कितना समय चाहिए। मापा व्यवहार है: 1) समय जब तक एस्केप बॉक्स/सही छेद पाया जाता है, 2) लक्ष्य यात्राओं और त्रुटियों की संख्या, और 3) दूरी भागने बॉक्स में जब तक चले गए । विभिन्न समूहों में प्रकाश उत्तेजना या तो अधिग्रहण या समेकन के दौरान की जाती है, जो प्रशिक्षण के दिनों में 1-4, या परीक्षण के दिन पुनर्प्राप्ति के दौरान होती है, जो दिन 5(चित्रा 2डी)है।
चित्र 2: ऑप्टोजेटिक प्रोटोकॉल के साथ व्यवहार प्रयोग। A)इसी प्रकाश उत्तेजना प्रोटोकॉल के साथ ओपन फील्ड प्रयोग की योजनाबद्ध ड्राइंग। C)इसी प्रकाश उत्तेजना प्रोटोकॉल के साथ ऊंचा-प्लस भूलभुलैया प्रयोग की योजनाबद्ध ड्राइंग। D)इसी प्रकाश उत्तेजना प्रोटोकॉल के साथ बार्न्स भूलभुलैया प्रयोग की योजनाबद्ध ड्राइंग। EPM: एलिवेटेड प्लस भूलभुलैया; के: ओपन फील्ड; बीएम: बार्ंस भूलभुलैया परीक्षण । इस आंकड़े को बर्ग 201948से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना के लिए, प्रकाश तीव्रता और आवृत्ति को ऑप्टोजेटिक उपकरण और न्यूरोनल प्रकार के अनुकूल होना चाहिए जो जांच के अधीन है। ऊतक को नुकसान से बचने के लिए सबसे कम संभव प्रकाश तीव्रता का उपयोग किया जाना चाहिए, क्योंकि कई अध्ययनों से पता चला है कि मजबूत प्रकाश तीव्रता8,,20के कारण संभावित हीटिंग प्रभाव हैं। ChR2 के लिए, एक 5 एमएस प्रकाश नाड़ी के साथ एक 20 हर्ट्ज उत्तेजना आमतौर पर 2 प्रयोग कियाजाताहै । चूंकि ChR2 काफी हल्का संवेदनशील है, इसलिए 1 एमडब्ल्यू प्रकाश तीव्रता पर्याप्त है। प्रकाश उत्तेजना प्रोटोकॉल सीधे व्यवहार परिवर्तन को मापने के लिए प्रकाश बंद और परीक्षणों के बीच विकल्प। व्यवहार प्रयोगों के लिए बाहरी कमरे की स्थिति जानवरों के पूरे समूह के लिए स्थिर रहना चाहिए। विचार करने के लिए महत्वपूर्ण शर्तें शोर हैं (ध्यान रखें कि डिवाइस खुद शोर कर सकते हैं), गंध (हमेशा इथेनॉल के साथ व्यवहार सेटअप को साफ करें), प्रकाश तीव्रता और प्रयोगकर्ता। प्रयोगकर्ता हमेशा एक ही व्यक्ति होना चाहिए। इसके अतिरिक्त, प्रयोगों के दिन का समय एक समूह में सभी जानवरों के लिए समान होना चाहिए, सुविधा में अंधेरे चरण की शुरुआत के कुछ घंटे बाद पसंद किया जाता है।
इस प्रयोग का लक्ष्य उत्तेजक पिरामिड न्यूरॉन्स की मजबूत सक्रियता के माध्यम से आईएल क्षेत्र में उत्तेजना/अवरोध (ई/आई) अनुपात को बढ़ाना है । इस विशेष प्रांतस्था क्षेत्र में एक बढ़ाया गया ई / आई अनुपात चूहों में चिंता के स्तर को बढ़ाने के लिए जाना जाता है40,42,43,44.
न्यूरोनल सिग्नलिंग में हेरफेर करने के लिए प्रकाश का उपयोग करना लगभग एक दशक से पसंद की विधि रही है। 2005 के बाद से, नए ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों के विकास के बारे में प्रकाशित लेखों की संख्या,4,,,,6,8,,14,,49,50, 51,51 और अध्ययन जहां मस्तिष्क सर्किट,21, 23,40,,43,52,अत्यधिक वृद्धि की जांच करने के लिए ऐसे उपकरणों का उपयोग किया,जाताहै। एक तरफ, इंजेक्शन ऑप्टोजेनेटिक टूल, इम्प्लांटेशन वेरिएंट, ट्रांसजेनिक माउस लाइनों और व्यवहार प्रयोगों की भारी विविधता के साथ, प्रयोगों के लिए संभावना कई गुना और असीमित है। दूसरी ओर, प्रयोगात्मक स्थितियों को चुनने में दोष करने की संभावना बहुत अधिक है और प्रयोग इतने विशिष्ट हैं, कि अक्सर अन्य अध्ययनों की तुलनीयता मुश्किल होती है।
महत्वपूर्ण कदम
इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण महत्वपूर्ण कदम उचित योजना है । ऑप्टोजेनेटिक उपकरण का चुनाव वैज्ञानिक प्रश्न से मेल र होना चाहिए। क्या केवल न्यूरॉन या सिनेप्स की समग्र गतिविधि में हेरफेर करना आवश्यक है? फिर व्यावसायिक रूप से प्रदान किए गए उपकरण जैसे ChR221,,25,,27 और आर्क37 एक अच्छा विकल्प हैं। लेकिन इसके अलावा, यदि एक विशेष न्यूरोट्रांसमीटर प्रणाली या यहां तक कि एक रिसेप्टर में हेरफेर किया जाना चाहिए, तो एक व्यक्तिगत रिसेप्टर कल्पना अक्सर बेहतर विकल्प3,,6है। जीपीसीआर के साथ कई रिसेप्टर कल्पना, तथाकथित ऑप्टो-एक्सआरएस, और उन्हें उत्पादित करने के दिशा-निर्देश पहले से ही4,,50उपलब्ध हैं। ऑप्टोजेटिक उपकरणों की पसंद के अलावा, व्यवहार प्रयोग के साथ संयोजन में माउस लाइन भी महत्वपूर्ण है। विभिन्न पृष्ठभूमि उपभेदों, उदाहरण के लिए C57Bl/6 और BALB/cByJ, कुछ मामलों में विभिन्न व्यवहार फेनोटाइप प्रदर्शित53,,54. C57Bl/6 चूहों एक कम आधारभूत चिंता है और anxiogenic हेरफेर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि BALB/cByJ उच्च चिंता का स्तर दिखाने के लिए और इसलिए अधिक anxiolytic दवाओं के प्रति संवेदनशील हैं । इसके अतिरिक्त, इन पृष्ठभूमि उपभेदों के ट्रांसजेनिक वेरिएंट भी उनके फेनोटाइप48में भिन्न हो सकते हैं। ऑप्टोजेनेटिक टूल और ट्रांसजेनिक माउस लाइन के साथ विशिष्ट प्रमोटरों के उचित संयोजन के साथ, लगभग हर वांछित सेल आबादी को लक्षित किया जा सकता है।
सर्जरी के दौरान एक महत्वपूर्ण कदम सही स्थान को लक्षित कर रहा है । माउस मस्तिष्क एटलस की मदद से, पूर्वकाल-पीछे की धुरी, और मध्य-पार्श्व धुरी के लिए उचित निर्देशांक, और संरचना की गहराई45 स्थापितकी जा सकती है। असलियत में हर खोपड़ी का थोड़ा अलग रूप और आकार होता है। इस प्रकार, स्टीरियोटाटिक निर्देशांक को समायोजित करने के लिए एफ-फैक्टर46 काफी महत्वपूर्ण है, जैसा कि स्टीरियोटाटिक सर्जरी के दौरान सही नाक और कान निर्धारण है। यदि माउस का सिर झुका हुआ है, तो इंजेक्शन कैनुला ब्याज के वांछित क्षेत्र को लक्षित करने में विफल हो जाएगा।
इसके अतिरिक्त, इंजेक्शन कैनुला का व्यास भी महत्वपूर्ण है। यदि यह बहुत छोटा है, तो ऊतक में कोई वायरस जारी नहीं किया जा सकता है, यदि यह बहुत व्यापक है, तो कैनुला ब्याज के क्षेत्र में अपने रास्ते पर वायरस समाधान लीक करेगा। यदि प्रत्यारोपित ऑप्टिकल फाइबर सीधे लक्ष्य क्षेत्र से ऊपर समाप्त होता है, तो ऊपर के प्रांतस्था क्षेत्रों में वायरस अभिव्यक्ति कोई फर्क नहीं पड़ता। लेकिन अगर प्रत्यारोपण को अक्षों टर्मिनलों को प्रोत्साहित करने के लिए अन्य क्षेत्रों के ऊपर रखा जाता है, तो ऊपरी प्रांतस्था क्षेत्रों के अक्षतंप भी प्रकाश द्वारा सक्रिय किए जाएंगे और प्राप्त डेटा को हेराफेरी करेंगे। एक उदाहरण के रूप में: आईएल क्षेत्र और प्रीलिम्बिक (पीआरएल) क्षेत्र दोनों बेसल एमिग्डाला55, 56के लिए परियोजना करते हैं, लेकिन चिंता26,,,57 के मॉड्यूलेशन में पूरी तरह से अलग कार्य और भूमिकाएं हैं।57 यदि इंप्लांट को आईएल क्षेत्र से अक्षतिंक टर्मिनलों को सक्रिय करने के लिए एमिग्डाला के ऊपर रखा जाता है, और इंजेक्शन के दौरान वायरस समाधान भी गलत इंजेक्शन कैनुला के कारण पीआरएल में रखा गया था, तो पीआरएल से अक्षत टर्मिनलों को भी सक्रिय करने का खतरा बहुत अधिक होता है।
प्रत्यारोपण के निर्धारण के लिए खोपड़ी की तैयारी के दौरान, प्राइमर और बांड का विरल उपयोग एक विश्वसनीय और टिकाऊ निर्धारण के लिए महत्वपूर्ण है। यदि 2-घटक आसंजन प्रणाली को बारीकी से लागू नहीं किया जाता है, तो दंत सीमेंट कुछ दिनों या हफ्तों के बाद खोपड़ी से अलग हो सकता है। इसके अलावा इंप्लांट ठीक करने से पहले खोपड़ी को भी पूरी तरह से सुखा लेना पड़ता है, अन्यथा सीमेंट ठीक से खोपड़ी से अटैच नहीं होगा।
इस प्रोटोकॉल के व्यवहार भाग में महत्वपूर्ण कदम भी मौजूद हैं। सबसे पहले, भूलभुलैया का निर्माण बहुत महत्वपूर्ण है। हर व्यवहार सेटअप में, आकार और रूप के बारे में साहित्य में कई वेरिएंट मौजूद हैं, साथ ही प्रक्रिया के लिए ही58,,59,,60। एक वैरिएंट चुनना महत्वपूर्ण है जो डेटा को तुलनीय और प्रजनन योग्य बनाता है। साथ ही, उपयोग की गई माउस लाइनों के लिए विशेष आवश्यकताओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए43,48. ईपीएम के प्रतिनिधि डेटा में यह देखा जा सकता है कि कई नेक्स-क्रे चूहे भूलभुलैया से गिर गए या कई बार(चित्रा 2b)से फिसल गए। इन चूहों के लिए, खुली बाहों के चारों ओर एक छोटी दीवार के साथ एक भूलभुलैया एक बेहतर विकल्प होता ।
दूसरा, सभी बाहरी कमरे की स्थिति को स्थिररखनामहत्वपूर्ण है, अन्यथा चूहों के विभिन्न समूह बिल्कुल तुलनीय नहीं होंगे। इस संबंध में प्रयोग के समय को एक के रूप में चुनना बहुत महत्वपूर्ण है जहां प्रायोगिक सेटअप खाली है और प्रयोगकर्ता हमेशा मौजूद रहता है। इसके अलावा, निर्माण कार्य, किसी भी सिस्टम (फायर अलार्म) का परीक्षण या माउस सुविधा के सफाई दिवस जैसे भवन में होने वाली घटनाओं पर विचार किया जाना चाहिए ताकि प्राप्त डेटा के साथ हस्तक्षेप से बचा जा सके।
अंत में, व्यवहार प्रयोगों के लिए हैंडलिंग और आवास की स्थिति महत्वपूर्ण है। जब एक प्रत्यारोपण किया जाता है, तो चूहों को अन्य चूहों से चोट के जोखिम के कारण एकल घर की आवश्यकता होती है। समूहों और एक समूह के भीतर एक कम त्रुटि के बीच अच्छी तुलनीयता सुनिश्चित करने के लिए, हर माउस के लिए एक ही पिंजरे का आकार और संवर्धन की जरूरत है । चिंता से संबंधित प्रयोगों के लिए, एकल आवास के कुछ फायदे हैं क्योंकि सिंगल हाउस्ड पुरुष चूहे कम बेसलाइन चिंता का स्तर, उनकी चिंता के स्तर में कम भिन्नता, और कम अवसादग्रस्तता जैसे लक्षण15,,16दिखाते हैं। समूह रखे पुरुष चूहों दृढ़ता से चूहों के बीच पदानुक्रम की वजह से उनकी चिंता के स्तर में अलग हो सकता है । आवास के अलावा, सभी चूहों और समूहों की एक निरंतर और समान हैंडलिंग भी महत्वपूर्ण है। प्रत्यारोपण पर प्रकाश फाइबर को जोड़ने के लिए माउस हथियाने बहुत तनावपूर्ण है। इसलिए, इस प्रक्रिया को हर माउस के लिए एक ही होना चाहिए, जिसका अर्थ है एक ही तकनीक और एक ही प्रयोगकर्ता। इसके अलावा, प्रतीक्षा पिंजरे में आदत का समय, जो तनावपूर्ण कनेक्टिंग प्रक्रिया से माउस को शांत करने के लिए है, को भी भूलभुलैया में अवधि, कूड़े और स्थिति में समान शर्तों की आवश्यकता होती है। माउस सुविधा के भीतर हैंडलिंग भी बाद में व्यवहार प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण है । प्रायोगिक और नियंत्रण जानवरों को विभिन्न दिनों या विभिन्न लोगों द्वारा साफ नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि यह चूहों के लिए भी तनावपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, सफाई दिवस व्यवहार में मतभेदों से बचने के लिए प्रयोगात्मक दिन नहीं होना चाहिए।
समस्या निवारण
प्रोटोकॉल के दौरान कई समस्याएं हो सकती हैं। उदाहरण के लिए, स्टीरियोटाैक्टिक सर्जरी के दौरान खोपड़ी में एक पूरी ड्रिलिंग रक्त वाहिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है । आमतौर पर, मजबूत रक्तस्राव होता है, विशेष रूप से ब्रेग्मा और लैम्ब्डा के ऊपर। यदि ऐसा होता है, तो कपास की छड़ियों के साथ रक्तस्राव को रोकने की कोशिश न करें क्योंकि वे अपनी अवशोषण के कारण पोत से बाहर और भी अधिक रक्तस्राव का विस्तार करते हैं, इसके बजाय, सीधे एनएसीएल के साथ कुल्ला करें।
यह भी हो सकता है कि वायरस के घोल का प्रेशर इंजेक्शन काम नहीं कर रहा है। इस मामले में, यह हो सकता है कि पैराफिल्म, बर्र होल या मस्तिष्क ऊतक से एक पपड़ी, कैनुला की नोक को रोक रही है। इस मामले में, एक्स-या वाई-एक्सिस को बदले बिना मस्तिष्क से धीरे-धीरे कैनुला को हटा दें और कैनुला टिप के सामने के हिस्से के 1-2 मिमी को हटाने के लिए चिमटी का उपयोग करें। कैनुला को फिर से कम करने से पहले, यह देखने के लिए दबाव की थोड़ी मात्रा लागू करके कार्यक्षमता के लिए परीक्षण करें कि क्या वायरस कैनुला टिप से बाहर आता है। कब्ज से बचने के लिए, कैनुला को निरंतर गति से कम करें और इंजेक्शन पक्ष की गहरी गहराई तक पहुंचने तक आंदोलन को न रोकें। यदि कैनुला टिप का बहुत अधिक हटा दिया जाता है और व्यास बहुत बड़ा है, तो कैनुला ऊतक को नुकसान पहुंचाएगा और वायरस को एक बार में लागू करने का जोखिम बढ़ जाएगा। इस प्रकार, सुनिश्चित करें कि टिप का केवल भरा हुआ हिस्सा ध्यान से हटा दिया गया है।
व्यवहार प्रयोग के दौरान, वीडियो ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर (जैसे, Ethovision XT) में प्रयोग के सेटअप से समस्याएं हो सकती हैं। उदाहरण के लिए, यदि प्रकाश उत्पादन ठीक से काम नहीं कर रहा है, तो यह कई कारणों से हो सकता है। एथोविजन एक्सटी खुलने से पहले पल्सर को खोला, प्रोग्राम करना और शुरू करना होगा। हार्डवेयर को “प्रायोगिक सेटअप” (चरण 3.2.2.4) में सही ढंग से चुना जाना चाहिए। यदि गलत आईओ-बॉक्स, या “कॉस्ट्यूम हार्डवेयर” के अलावा कुछ भी चुना जाता है, तो पल्सर डिवाइस को एथोविजन द्वारा नियंत्रित नहीं किया जा सकता है। यदि प्रकाश उत्पादन का परीक्षण सफल होता है, लेकिन “परीक्षण नियंत्रण सेटिंग्स” में प्रोग्राम किया गया प्रकाश प्रोटोकॉल अधिग्रहण के दौरान काम नहीं करता है, तो उप-नियम या उप-नियम संदर्भ गलत तरीके से स्थित हो सकता है या शर्तें और कार्य अस्पष्ट हैं। उदाहरण के लिए: क्या संदर्भ सही उप-नियम से संबंधित है? क्या संदर्भ को सही ढंग से प्रोग्राम किया गया है (उदाहरण के लिए, उप-नियम कितनी बार निष्पादित किया जाता है)?
इसके अतिरिक्त, ऐसा हो सकता है कि “डिटेक्शन सेटिंग्स” के दौरान जानवर को पर्याप्त रूप से ट्रैक किया जाता है, लेकिन अधिग्रहण के दौरान ऐसे नमूने होते हैं जहां विषय नहीं मिलता है। इस मामले में, जांच करें कि क्या प्रायोगिक कमरे में रोशनी बदल दी गई थी, या यदि भूलभुलैया के भीतर कुछ भी अवांछित छाया का उत्पादन किया जाता है। भूलभुलैया के पूरे नीचे एक ही रंग है, के रूप में सेटिंग केवल एक विशिष्ट संयोजन के लिए काम करेंगे । यदि जो भी कारणों से अलग नीचे रंग या छाया से बचा नहीं जा सकता है, भूलभुलैया के अंधेरे भाग में पता लगाने की सेटिंग को परिभाषित करें ।
पहले जानवरों के अधिग्रहण के बाद किसी भी सेटिंग को बदलने के लिए, पहले से उपयोग की गई सेटिंग्स में इन परिवर्तनों को लागू न करें। उन्हें समायोजित करने के लिए उन्हें डुप्लिकेट करें। इसका यह भी मतलब है कि पहले से दर्ज परीक्षण डेटा विश्लेषण के लिए अब मान्य नहीं है। ऐसे मामले में, मूल सेटिंग्स के साथ इस प्रयोगात्मक समूह के लिए सभी जानवरों को रिकॉर्ड करें, और बाद में एक नया प्रयोग बनाएं जहां लाइव ट्रैकिंग के बजाय रिकॉर्ड किए गए वीडियो का विश्लेषण किया जाता है। इस “वीडियो से” प्रयोग में, जानवरों या यहां तक कि डेटा के बीच तुलनीयता खोने के बिना विश्लेषण के लिए कई सेटिंग्स का उपयोग किया जा सकता है।
सीमाएं और भविष्य के अनुप्रयोग
स्वतंत्र रूप से चलती जानवरों में ऑप्टोजेनेटिक्स के साथ व्यवहार में हेरफेर करने की इस विधि में भी सीमाएं शामिल हैं। सर्जरी के दौरान, दो प्रत्यारोपण की निकटता प्रतिबंधित है। डबल प्रत्यारोपण के लिए, दो प्रत्यारोपण के बीच की दूरी कम से कम प्रत्यारोपण पकड़ उपकरण की चौड़ाई होना चाहिए। उपकरण को बर्र होल में दूसरे प्रत्यारोपण को कम करने की जरूरत है, जबकि पहले प्रत्यारोपण पहले से ही तय है। इसके लिए एक समाधान एक कोणित प्रत्यारोपण हो सकता है, जहां ग्लास फाइबर की युक्तियां बहुत करीब हो सकती हैं जबकि खोपड़ी के ऊपर सिरेमिक फेर्यूल्स की बड़ी दूरी23,,55,,56,57,62, 63,63है।,, कोण प्रत्यारोपण का नुकसान प्रकाश फैल रहा है। जब फाइबर टिप के बजाय सीधे ऊपर से तिरछा है, उत्तेजित क्षेत्र अलग है । निकटता में दो लक्षित क्षेत्रों के मामले में, प्रकाश उत्तेजना की बदली हुई स्थिति पर विचार करने की आवश्यकता है।
व्यवहार प्रयोग के दौरान, भूलभुलैया का निर्माण जानवर से जुड़े ऑप्टिकल केबल के साथ हस्तक्षेप कर सकता है। कुछ व्यवहार परीक्षण, जैसे कि प्रकाश-डार्क बॉक्स, एक इनडोर क्षेत्र64,65,और अन्य भूलभुलैया में ऐसे डिब्बे होते हैं जिन्हें माउस में प्रवेश करने की आवश्यकता होती है।, इस सेटअप के साथ इस तरह के प्रयोग नहीं किए जा सकते। वैकल्पिक रूप से, एक वायरलेस सिस्टम एक विकल्प22,26,,66हो सकता है।, लेकिन सौभाग्य से कुछ भूलभुलैया, जैसे बार्न्स भूलभुलैया, इस तरह से व्यवस्थित किया जा सकता है, कि चूहों को प्रासंगिक डिब्बों में प्रवेश करने में सक्षम हैं67।
बंद क्षेत्रों के साथ उन लोगों के अलावा, भूलभुलैया है कि बहुत व्यापक है भी समस्याओं का कारण बन सकता है । भूलभुलैया का क्षेत्रफल जितना बड़ा होगा, केबल को जानवर को भूलभुलैया में हर स्थिति में जाने की अनुमति नुसार होना चाहिए। देखभाल करनी होगी कि जानवर केबल पर कदम न रख सके और न ही उसे पकड़ कर काट सके। इसके लिए एक समाधान एक निर्माण हो सकता है जो अनावश्यक केबल को रोल करता है। एक नुकसान यह है कि केबल को अनरोल करने के लिए ड्रैग चूहों के लिए कठिन है। यह समाधान चूहों के लिए बेहतर अनुकूल होगा। प्रयोग के दौरान प्रकाश उत्तेजना के बजाय, एक अन्य संभव विकल्प पहले से प्रकाश उत्तेजना करना हो सकता है, निश्चित रूप से यह केवल संभव है यदि प्रकाश उत्तेजना के कारण दीर्घकालिक प्रभाव23होता है।
मौजूदा/वैकल्पिक तरीकों की तुलना
वैकल्पिक तरीके 8,18व्यवहार केदौरानरासायनिक या विद्युत उत्तेजना होंगे । रासायनिक एगोनिस्ट या विरोधी विशिष्ट रिसेप्टर्स के माध्यम से न्यूरॉन्स को सक्रिय या शांत करने में सक्षम होते हैं और एकल न्यूरोट्रांसमीटर सिस्टम38,68में भी हेरफेर कर सकते हैं । एक तरफ, रिसेप्टर-विशिष्टता रसायनों के लिए काफी अधिक है, क्योंकि विशिष्ट एगोनिस्ट या विरोधी केवल कुछ रिसेप्टर्स39को सक्रिय करते हैं। दूसरी ओर, एक ही न्यूरोट्रांसमीटर समूह के रिसेप्टर उपप्रकारों के लिए विशिष्टता अक्सर अपर्याप्त होती है। अधिकांश रसायन विभिन्न संभावनाओं69के साथ कम से कम दो उप-प्रकारों से बांधते हैं। इसके अतिरिक्त, रसायन न्यूरोनल सेल प्रकारों के बीच अंतर नहीं कर सकते हैं जब तक कि उनके पास एक ही रिसेप्टर प्रकार होते हैं। इसके अलावा, ऑप्टोजेनेटिक्स की तुलना में रासायनिक जोड़तोड़ के लिए लौकिक और स्थानिक संकल्प खराब है। अगोनिस्ट या विरोधी अक्सर मौखिक रूप से35 या प्रणालीगत इंजेक्शन57,70के माध्यम से प्रशासित होते हैं। यदि रसायन का अर्क सीधे मस्तिष्क के ऊतकों में किया जाता है, तो प्रभाव मौखिक अनुप्रयोगों की तुलना में तेजी से दिखाई देता है, लेकिन फिर भी प्रकाश उत्तेजना की तुलना में धीमी टाइमस्केल पर। प्रशासित रसायनों के रूप में मस्तिष्क में फैलाना और न्यूरोनल प्रकार या मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए विशिष्ट नहीं हैं, विशिष्ट मस्तिष्क circuitries के हेरफेर यह संभव नहीं है।
विद्युत उत्तेजना में रासायनिक उत्तेजना9,14की तुलना में अधिक लौकिक संकल्प होता है . न्यूरोनल ऊतक में भीतर का प्रसार रासायनिक उत्तेजना की तुलना में कम होता है और स्थानिक संकल्प रासायनिक उत्तेजना की तुलना में बेहतर होता है। हालांकि, विद्युत उत्तेजना में विशेष रूप से विभिन्न न्यूरोनल सेल प्रकार या रिसेप्टर प्रकारों को संबोधित करने की संभावना का अभाव है, क्योंकि इलेक्ट्रोड के निकट हर न्यूरॉन विद्युत उत्तेजना का जवाब देगा।
स्वतंत्र रूप से चलती चूहों में व्यवहार के लिए वैकल्पिक तरीके उदाहरण के लिए मस्तिष्क स्लाइस में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग हैं, जहां एकल न्यूरॉन्स या एक्सोन को ऑप्टोजेनेटिक्स के साथ संग्राहक किया जा सकता है और इलेक्ट्रोड6,,71रिकॉर्डिंग के माध्यम से अमृत प्रभाव मापा जा सकता है। इन विट्रो प्रयोग ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजनाओं के आणविक और सेलुलर आधार की जांच करने की संभावना प्रदान करते हैं लेकिन यह सीमा है कि आंतरिक कनेक्टिविटी और अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों से इनपुट गायब है। एक अन्य विकल्प यह है कि वे मल्टीफोटोजन इमेजिंग1,72के साथ ऑप्टोजेनेटिक का उपयोग करें . इस मामले में, चूहों ने अपना सिर ठीक किया है और सरल कार्यों को हल करने के लिए एनेस्थेटाइज्ड किया जा सकता है या जाग सकता है।
एक सफल ऑप्टोजेनेटिक प्रयोग करने के लिए, आजकल उपकरणों और अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला उपलब्ध है। विशिष्ट शोध प्रश्नों के उत्तर देने के लिए ऑप्टोजेनेटिक टूल्स और व्यवहार सेट-अप का चयन महत्वपूर्ण है। यदि उपकरणों और प्रयोगों का सही संयोजन चुना जाता है, तो ऑप्टोजेनेटिक्स उच्च लौकिक और स्थानिक संकल्प के साथ न्यूरोनल सर्किटरी की अभूतपूर्व, गहराई से जांच की अनुमति देता है। यह मनोरोग रोगों और अनुभूति के लिए नई चिकित्सीय रणनीतियों को समझने और विकसित करने में मदद करेगा।
The authors have nothing to disclose.
कृपया नेक्स-क्रे चूहों को उपलब्ध कराने के लिए प्रो क्लाऊस-आर्मिन नार्वे और डॉ सैंड्रा गोएबल्स (मैक्स-प्लैंक-इंस्टीट्यूट ऑफ एक्सपेरिमेंटल मेडिसिन, गोएटिंगेन, जर्मनी) को बहुत धन्यवाद। इसके अलावा, हम इस लेख के लिए जोवे वीडियो की रिकॉर्डिंग और प्रसंस्करण के लिए हमारी वीडियो-टीम यूनुस डिकी और रूबेन विस्नर का शुक्रिया अदा करते हैं। इसके अलावा, क्रिस्टिन क्लासेन को उसकी आवाज-ओवर और किम्बर्ली ऐनी गो के लिए पांडुलिपि के प्रूफरीडिंग के लिए बहुत धन्यवाद।
प्रस्तुत परिणाम बोचम में रूर-विश्वविद्यालय में प्राप्त किए गए थे और वीडियो ब्रेमेन विश्वविद्यालय में दर्ज किया गया था ।
इस काम को ड्यूश फोर्स्चुंग्सगेमेन्चाफ्ट (डीएफजी, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन) द्वारा वित्त पोषित किया गया था – प्रोजेक्टनम 122679504 – एसएफबी 874 और डीएफजी एमए 4692/3-2।
Ketamin | Sigma-Aldrich | K2753-64 | Anestasia |
20 % Glucose | AlleMan Pharma | Injection s.c. for fast recovery | |
Behavioral mazes | Costum made | Measure anxiety | |
Bepanthen | Bayer | Ophthalmic oinment | |
Betaisodona | Monodipharma | Sterilant containing iodine | |
Betaisodona | Monodipharma | Iodine oinment | |
Binocular | Olympus | SZ52, 110AL0.62x WD160 | Surgery |
Ceramic ferrules | Thorlabs | CFLC230-10 | Implant |
Ceramic Fiber Scribe | Thorlabs | CSW12.5 | Cutting of the glass fiber |
Channelrhodopsin2-YFP virus | Penn Vector Core | Addgene 20298 | Optogenetic tool |
Compressed air | Kontakt Chemie | Druckluft 67 | Drying of the skull |
Coordinate system | Stoelting | Stereotactic coordinates for the surgery | |
Correl Draw | Graphical software version 13 | ||
Cryoslicer | MICROM | HM500OM | Production of brain slices for staining |
Ethovision XT 14 | Noldus | Software for behavioral tracking | |
Exel | Statistical Software | ||
Ferrule Polishing Puck | Thorlabs | D50-F | Polishing implants round side |
Fiber Patch Cord dual | Prizmatix | Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm | Cables, which are connected with the two implants of a bilateral implantation |
Fiber Patch Cord single | Prizmatix | Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm | Cable, which is connected with the implant via a sleeve |
Fiber Stripping Tool | Thorlabs | T06S13 | Stripping glass fiber for implant |
Filter paper | VWR European | 516-0300 | Cut into pieces for the Novelty-Suppressed Feeding test |
Food pellets | Mühle Levers | Höveler Nagerfutter | Nutrition for the mice |
Glass pipettes | Harvard Apparatus | GC150-10 | Injection pipettes |
Gradia direct-Flo | Henry Schein | 103322 | Fluid dental cementum |
Heating lamp | efbe-Schott/Phillips | R95E | Prevent the mice from cooling after the surgery |
Heating plate | Stoelting | Integrated into coordinate system | |
Injection canula | Braun | 100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20 | All injections and to bore hole into the skull |
Litter | T 1350 | Grounding for the Novelty-Supressed Feeding test | |
Mouse cages | Zoonlab | 405 cm^2 | Single housing for experiments |
Optibond FL | Kerr | 26684E | Preparation of the skull for implantation |
Optical glass fiber | Thorlabs | FT200EMT | Light fiber for implant |
Optogenetics-LED.STSI | Prizmatix | Optogenetic toolbox for light stimulation during behavioral experiments | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005-1KG-R | Perfusion of mice to remove the brains |
Polishing sheet 0.02 µm grit | Thorlabs | LFCF | Polishing implants round side |
Polishing sheet 1 µm grit | Thorlabs | LF1D | Polishing implants round side |
Polishing sheet 30 µm grit | Thorlabs | LF30D | Polishing implants round side |
Polishing sheet 6 µm grit | Thorlabs | LF6D | Polishing implants round side |
Pulser Software | Prizmatix | Software for light device control | |
Rimadyl-Carprofen | Zoetis | Analgesia | |
Sigma Plot | Software for statistics | ||
Sleeve | Thorlabs | FT200EMT | Connection of implant and light cable |
SodiumCloride (NaCl) | Braun | 3570410 | Rinsing of the skull |
Superglue | Pattex Henkel | To Fix the glass fiber in the ferrule | |
td-Tomato virus | Penn Vector Core | Addgene 51503 | Optogenetic tool |
UV light | KoQGHJ | wireless, 1200 mW/cm^2 | Polymeration lamp for dental cementum |
Xylavet-Xylazin | cp pharma | Anesthesia |