Summary
Этот протокол подробно описывает, как фиксируется растительный материал для иммунолокализации арабиногалактановых белков и пектинов, встроенный в гидрофильные акриловые смолы, секционированные и установленные на стеклянных слайдах. Мы показываем, что эпитопы, связанные с клеточной стеной, будут обнаружены с помощью специфических антител.
Abstract
Развитие растений включает в себя постоянную корректировку состава и структуры клеточной стенки в ответ как на внутренние, так и на внешние раздражители. Клеточные стенки состоят из целлюлозы и неклеточных полисахаридов вместе с белками, фенольными соединениями и водой. 90% клеточной стенки состоит из полисахаридов (например, пектинов) и арабиногалактановых белков (АГП). Флуоресцентная иммунолокализация специфических гликан-эпитопов в гистологических секциях растений остается ключевым инструментом для обнаружения ремоделирования стеночных полисахаридных сетей, структуры и компонентов.
Здесь мы сообщаем об оптимизированной флуоресцентной процедуре иммунолокализации для обнаружения эпитопов гликанов из АЛП и пектинов в тканях растений. Параформальдегид/глутаралдегид фиксация была использована вместе с LR-White встраивания образцов растений, что позволяет лучше сохранить структуру ткани и состава. Тонкие секции встроенных образцов, полученных с помощью ультрамистома, использовались для иммунолокализации специфическими антителами. Этот метод предлагает отличное разрешение, высокую специфичность и возможность обнаружения нескольких гликан-эпитопов в одном образце. Этот метод позволяет субклеточной локализации гликанов и обнаруживает их уровень накопления в клеточной стенке. Это также позволяет определить пространственно-временные модели AGP и распределения пектина в процессах развития. Использование этого инструмента может в конечном итоге направлять направления исследований и связывать гликаны с конкретными функциями растений. Кроме того, полученная информация может дополнять биохимические исследования и исследования экспрессии генов.
Introduction
Стенки клеток растений являются сложными структурами, состоящими из полисахаридов и гликопротеинов. Клеточные стены являются чрезвычайно динамичными структурами, архитектура, организация и состав которых варьируются в зависимости от типа клетки, локализации, стадии развития, внешних и внутреннихстимулов 1. Арабиногалактановые белки (АГП) и пектины являются важными компонентами стенки клеток растений. AGPs высоко гликозилированных белков и пектинов гомогалактуронных полисахаридов, состав, количество и структура которых сильно различаются на различныхстадиях развития растений 2,3,4. AGPs и исследования пектина показали их участие в нескольких процессах завода, таких как запрограммированная гибель клеток, ответ на абиотические стрессы, половое размножение растений, среди многихдругих 5. Большинство из этих исследований началось с информации, полученной в результате исследований иммунолокализации.
Учитывая его сложность, изучение клеточных стенок требует много различных инструментов. Обнаружение гликановых эпитопов с использованием моноклональных антител (мабов) является ценным подходом к разрешению распределения полисахаридов и гликопротеинов вдоль этой структуры. Существует большая коллекция mAbs доступны для обнаружения гликан эпитопов и специфика каждого mAb постоянно совершенствуется, атакже 6. Описанная здесь методика применима ко всем видам растений и является идеальным инструментом для руководства будущими направлениями исследований, которые могут включать более дорогостоящие и сложные методы.
В этом методе, специфические антитела химически конъюгируются к флуоресцентным красителям such as FITC (фторсейн изотиоцианат), TRITC (тетраметилдодамин-5-(и 6)-isothiocyanate) или несколько красителей Alexa Fluor. Иммунофлуоресценция предлагает ряд преимуществ, что позволяет четко и быстро субклеточной локализации гликанов, которые могут быть непосредственно замечены под флуоресцентным микроскопом. Он очень специфичен и чувствителен, так как подготовка образца может эффективно защитить естественную структуру антигена, даже если присутствует в меньшем количестве. Это позволяет обнаруживать несколько антигенов в одном образце и, самое главное, предлагает высокое качество и визуально красивые результаты. Несмотря на большую мощность, предлагаемую исследованиями иммунолокализации флуоресценции, они часто считаются трудными для выполнения и реализации, скорее всего, из-за отсутствия подробных протоколов, позволяющих визуализировать различные этапы процедуры. Здесь мы предоставляем несколько простых рекомендаций о том, как выполнить эту технику и как получить высококачественные изображения.
Для протокола, представленного здесь, образцы должны быть сначала исправлены и встроены с использованием наиболее подходящего фиксатора. Хотя считается трудоемким и относительно утомительным методом, надлежащая фиксация и встраивание образца растения является ключом к обеспечению успешного анализа иммунолокализации. Для этой цели наиболее обычной является химическая фиксация с использованием перекрестных фиксаторов, таких как альдегиды. Перекрестные фиксаторы устанавливают химические связи между молекулами ткани, стабилизируют и затвердевают образец. Формальдегид и глутаралдегид являются перекрестными фиксаторами, и иногда используется сочетание обоих фиксаторов7. Формальдегид предлагает большое структурное сохранение тканей и в течение длительных периодов времени, производя небольшие опровержения тканей и быть совместимым с иммуностимулированием. Glutaraldehyde является более сильным и стабильным фиксатор обычно используется в сочетании с формальдегидом. Использование глутаралдегид имеет некоторые недостатки, которые должны быть приняты во внимание, как он вводит некоторые свободные группы альдегида в фиксированной ткани, которые могут генерировать некоторые неспецифические маркировки. Кроме того, перекрестные связи между белками и другими молекулами иногда может сделать некоторые целевые эпитопы недоступными для антител. Чтобы избежать этого, количество и продолжительность фиксации должны быть тщательно определены.
После фиксации образцы встраиваются в правильную смолу, чтобы затвердеть перед получением секций. Лондонская смола (LR-White) акриловая смола является смолой выбора для иммунолокализации исследований. В отличие от других смол, LR-белый является гидрофильной, что позволяет антителам достичь своих антигенов, без необходимости какого-либо лечения, чтобы облегчить его. LR-White также имеет преимущество, предлагая низкую аутофлуоресценцию, что позволяет снижение фонового шума во время иммунофлуоресценции изображения.
Есть много методов окрашивания доступны для обнаружения различных компонентов клеточной стенки, таких как Alcian синий окрашивания, толуйдин синий окрашивания или периодические кислоты Шифф (PAS) окрашивания. Ни один из них не предлагает силу иммунолокализации анализы8. Такой подход дает большую специфичность в обнаружении гликанов, предлагая более обширную информацию о составе и структуре клеточной стенки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка образцов: фиксация, обезвоживание и встраивание LR-White
- Фиксация и обезвоживание
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс фиксации имеет решающее значение для сохранения образца; путем перекрестного обмена молекул клеточный метаболизм останавливается, обеспечивая клеточной целостности и предотвращения молекулярной диффузии. Фиксативные агенты и используемая концентрация должны быть скорректированы с этой целью, оставляя антигены достаточно подвержены взаимодействию с антителами. Следующий протокол сочетает в себе мягкую фиксативную способность параформальдегида, с более сильным эффектом глутаралдегида. Их пропорции были оптимизированы для AGPs и компонентов клеточной стенки, но это подходит для других белков и клеточных структур. Последующий процесс обезвоживания подготовит образцы для встраивания LR-White. В этом эксперименте использовались растительные ткани нескольких видов растений. Образцы субайдеров Кверка были взяты из деревьев, выращенных в полевых условиях. Образцы субмерсы Trithuria любезно поделились с нами Паула Рудалл (Кью Гарденс, Лондон, Великобритания).- Посеять все растения Arabidopsis непосредственно на почве и расти в помещении роста объекта с 60% относительной влажности и день / ночь цикла 16 ч света при 21 градусов по Цельсию и 8 ч темноты при 18 градусов по Цельсию. Выберите ткани растений для анализа, и отделка образцов будет не более 16 мм2 в размерах.
- Немедленно перенесите образец на стеклянный флакон, ранее наполненный достаточным холодным фиксаторным раствором (2% формальдегида (w/v), 2,5% glutaraldehyde (w/v), 25 mM PIPES pH 7 и 0.001% Tween-20 (v/v)) для полного погружения образцов(рисунок 1A).
ВНИМАНИЕ: Формальдегид и глутаралдегид являются фиксаторными агентами, которые могут быть вредны при вдыхании и контакте. Выполните фиксацию шаг на капоте дыма и носить адекватную защитную одежду и нитриловые перчатки. Все решения с этого шага, включая серию алкоголя до 70%, должны храниться для дальнейшего обеззараживания специализированным персоналом. - Собрав все образцы, обновите фиксатор.
- Перенесите флаконы в вакуумную камеру и медленно нанесите вакуум. По достижении -60 кПа, плавающий материал начнет опускаться на дно флакона(рисунок 1B).
- Хранить под вакуумом не более -80 кПа в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Медленно отпустите вакуум, загерметив стеклянный флакон и поместите на ночь при 4 градусов по Цельсию.
- Откажитесь от любых образцов, которые не утонули во время ночной фиксации. Вымойте оставшиеся образцы с 25 мММ PBS рН 7 в течение 10 минут, а затем 20 минут мыть в 25 мМ PIPES буфер рН 7,2.
- Обезвоживать образцы в серии этанола (25%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90%, и 3x 100% этанола) в течение 20 мин каждый. Немедленно перенесите обезвоженные образцы на помеченные стеклянные флаконы для встраивания(рисунок 1C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс обезвоживания может быть приостановлен на 70% этанола шаг.
- LR-Белая смола встраивания
ПРИМЕЧАНИЕ: LR-белый является негидрофобной акриловой смолы с низкой вязкостью, что делает его идеальным для проникновения тканей со многими толстыми слоями стенок клеток. LR-White также поставляется в нескольких классах твердости, совместимых для резки большинства образцов растений. Пожалуйста, убедитесь, что используемая смола уже поставляется с надлежащей катализатора смешивается, или следовать инструкциям поставщика для подготовки смолы. Следующий процесс встраивания идет медленно, но результаты в значительной степени оправдывают средства.- Перелить образцы путем инкубации с LR-белой смолы в серии полумесяца концентрации смолы (1:3, 2:3, 1:1, 3:2, 3:1, 1:0) в этаноле, инкубации в течение 24 ч при 4 градусов по Цельсию на каждом шагу.
ВНИМАНИЕ: LR-белая смола является низкой токсичности акриловой смолы; однако, это может быть раздражителем для кожи при контакте и вдыхании. Рекомендуется работать в хорошо проветриваемой области или под дымовой капотом с соответствующим защитным износом и нитрильными перчатками. - Освежите LR-белую смолу и инкубировать еще 12 ч при 4 градусах Цельсия.
- Подготовка соответствующих размеров встраивания желатиновых капсул (размер 1 (0,5 мл) для образцов до 3 мм, 2 х 0,37 мл для образцов до 5 мм или 3 х 0,3 мл для образцов до 8 мм и бумажных меток(рисунок 1D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите размер капсулы, чтобы быть немного больше, чем образец, так что образец может быть полностью заключен в смолу. Кроме того, не забудьте обозначить теги карандашом, потому что ручка или печатные чернила будут загрязнять смолу, разрушая образец. - Нанесите одну каплю свежей LR-белой смолы на дно каждой капсулы.
- Поместите образец в каждую желатиновую капсулу и заполните до максимальной емкости свежей смолой. Поместите капсулу крышку и нажмите осторожно, чтобы сформировать герметичный уплотнение( Рисунок 1E).
- Полимеризируйте смолу на 24-48 ч при 58 градусах Цельсия или до полного затвердевшего.
- Храните образцы при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пост полимеризации LR-белой смолы является инертным.
- Перелить образцы путем инкубации с LR-белой смолы в серии полумесяца концентрации смолы (1:3, 2:3, 1:1, 3:2, 3:1, 1:0) в этаноле, инкубации в течение 24 ч при 4 градусов по Цельсию на каждом шагу.
2. Подготовка слайда
ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянные слайды должны быть чистыми, без пыли, жира или любых других загрязняющих веществ. Даже новые слайды должны быть очищены, как некоторые поставщики используют масла и моющие средства, чтобы предотвратить слайды от слипания. Любая смазка или моющее средство будет мешать прилипать к слайду, даже если его обработать поли-L-лизином. Линт и пыль повлияют на наблюдения образца и, вполне возможно, разрушат эксперимент. Тефлоновые слайды с реакционными скважинами идеально подходят для этой задачи. Они доступны по цене, многоразовые и резко уменьшить количество антител решение необходимо. При надлежащей очистке, отличное качество флуоресцентной иммунолокализации может быть выполнена по очень доступной цене.
-
Стирка слайдов
- Поместите слайды в окрашивание стойки и накройте раствором для очистки (0,1% SDS (w/v), 1% уксусной кислоты (v/v), 10% этанола (v/v)).
- Поддерживайте легкое возбуждение в течение 20 минут.
- Перенесите окрашивающие стойки в ванну ddH2O с легким возбуждением в течение 10 мин. Повторите 4 раза.
- Тщательно слейте стеллажи перед погружением кратко в 100% этанола и дайте слайды высохнуть в без пыли окружающей среды.
- Хранить до использования.
-
Поли-L-лизиновое покрытие (по желанию)
ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшие секции обычно придерживаются очень хорошо для очистки стеклянных слайдов. Этот шаг рекомендуется только для больших секций (2 мм2). Большие секции, как правило, складываются и морщины, и не рекомендуется. Тем не менее, при необходимости используйте реакционые слайды с большими отверстиями. Очистите их, как указано выше, и продолжайте следующим образом.- Поместите чистые горки в квадратную чашку Петри. Pipette 0.001% поли-L-лизин раствор (w/v) для покрытия отверстий слайдов, без переполнения.
- Пусть слайды высохнут на ночь при 40 градусов по Цельсию в закрытых чашках Петри.
ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытые слайды готовы к немедленному использованию и могут храниться в свободной от пыли среде при комнатной температуре, в течение нескольких месяцев.
3. Пример обрезки и секции
-
Обрезка образцов
- С острым лезвием бритвы, обрезать LR-белые блоки под стереомикроскопом, чтобы сформировать пирамида формы структуры, где вершина перпендикулярна области интересов образца (Дополнительный рисунок 1A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Ультра-микротома образца держатель является отличным инструментом для обеспечения блока. Если устройство не имеет универсального держателя образца, используйте тот, который наиболее подходит для круглых блоков. - Обрезать пирамидарной структуры, удалив тонкие ломтики избыточной смолы перпендикулярно пирамиды основной оси.
- Продолжайте до тех пор, пока образец не будет достигнут формирования режущей поверхности. В пределах режущей поверхности образец мишени в идеале должен быть заключен в трапециевидную форму.
ПРИМЕЧАНИЕ: Блок смолы можно дополнительно обрезать под углом щели, чтобы уменьшить площадь поверхности секции острым лезвием(рисунок 1F).
- С острым лезвием бритвы, обрезать LR-белые блоки под стереомикроскопом, чтобы сформировать пирамида формы структуры, где вершина перпендикулярна области интересов образца (Дополнительный рисунок 1A).
-
Полутонкое сечение
ПРИМЕЧАНИЕ: Микротом с стеклянными ножами будет использоваться. Способность антитела связываться с эпитопом будет состояние иммунолабеля реакции успеха. Гидрофильная природа LR-белой смолы позволит хорошо контактировать антител с образцами секций. Более тонкие секции будут представлять более слабые окраски Calcofluor, которые будут использоваться, чтобы помочь найти разделы и помочь с процессом визуализации. То же самое относится и к другим пятнам, которые впоследствии могут быть применены. Также чрезмерная толщина повлияет на качество приобретения изображения. Хороший компромисс для толщины раздела можно найти между 200 и 700 nm, в зависимости от характеристик ткани. Намонтировать блоки плотно на держатель образца ультра-микротомы.- С ультра-микротом, сделать разделы с толщиной от 200 до 700 нм(рисунок 1G).
- Проверьте область раздела, передав некоторые разделы на ddH2O падение на стеклянную горку. Поместите горку на горячую тарелку на 50 градусов цельсия до тех пор, пока вода не испарится. Пятно размещения падение на 1% Толуйдин Blue O (w/v) в 1% борной кислоты раствор (ж / в) над секциями на 30 с. Промыть и наблюдать под микроскопом.
- Найдя нужную структуру, перенесите одну или две секции на каждую каплю ddH2O, ранее размещенную на каждой колодец чистого слайда реакции.
- Поместите каждую горку в закрытую чистую 10-сантиметровую тарелку Петри и дайте ей высохнуть при 50 градусах Цельсия.
- Храните слайды в чистом архивном ящике до использования.
4. Иммунолокализация
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура флуоресцентной иммунолокализации опирается на последовательное использование двух антител. Первичное антитело поднимается против конкретного целевого антигена. Вторичное антитело поднято специфически против главным образом антитела и для флуоресцентных методов conjugated к флюорофору (FITC в этом специфическом протоколе). Первичные антитела будут использоваться для обнаружения целевого антигена в образце, а вторичные антитела будут использоваться для определения места, где первичное антитело подключено к образцу после смывания избытка первичного антитела. Контроль является важной частью этого анализа и всегда должен выполняться для обеспечения точности наблюдений. Один колодец на слайде должен быть зарезервирован для использования в качестве отрицательного контроля, где первичное лечение антителом будет пропущено, и поэтому не следует наблюдать сигнал в конце эксперимента. Положительный контроль должен быть включен в эксперимент, рассматривая один хорошо с антителом, маркировка которого уже известна и уверена. Положительный контроль используется для подтверждения вторичной эффективности маркировки антител и условий реакции, в то время как отрицательный контроль проверяет вторичную специфичность антител.
- Подготовка инкубационной камеры, поместив некоторые влажные бумажные полотенца в нижней части коробки советы пипетки и упаковка его с фольгой(Дополнительный рисунок 1B-1E). Поместите горки в инкубационую камеру.
- Pipette 50 йл падение на 8 мм хорошо блокирующего раствора (5% обезжиренного сухого молока (w/v) в 1 М PBS) и инкубировать в течение 10 мин. Снимите блокирующий раствор и промойте все скважины дважды с помощью PBS в течение 10 минут.
- Подготовка первичных антител решений (см. Дополнительная таблица 1), 1:5 (V /V) антитела в блокирующий раствор; сделать оценку около 40 йл на 8 мм хорошо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация антитела должна быть скорректирована в соответствии с протоколом производства. - Выполните окончательную стирку с ddH2O в течение 5 минут, никогда не позволяйте скважины высохнуть полностью.
- Pipette основной раствор антитела к скважинам реакции. Пипетка блокирует раствор для контрольных скважин.
- Закройте инкубационую камеру и дайте постоять 2 ч при комнатной температуре, а затем на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию. Подготовь вторичный раствор антитела, 1% в блокирующий раствор (v/v) около 40 йл на колодец. Держите его покрыты фольгой.
- Вымойте все скважины дважды с PBS в течение 10 минут, а затем 10 дополнительных минут с ddH2O. Убедитесь, что никаких следов блокирующего раствора или отложений не видно на скважинах.
- Пипетт вторичный раствор антител ко всем скважинам. Отныне защитите горки от света.
- Инкубация в течение 3-4 ч в темноте при комнатной температуре.
- Вымойте все скважины дважды в течение 10 минут с PBS следуют еще один мыть 10 мин с ddH2O.
- Нанесите каплю кальцифлюора (1:10,000 (w/v) флуоресцентный ярче 28 в PBS) к каждой хорошо. Без стирки нанесите каплю монтажной среды (см. таблицу материалов)к каждому колодец и поместите крышку(рисунок 1H).
- Наблюдайте с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного объективом 10x/0.45, 20x/0.75, 40x/0.95 и 100x/1.40, используйте УФ (для кальцифторного пятна) и фильтры FITC для обнаружения клеточной стенки и иммунолокализации соответственно(рисунок 1I). Используйте следующие длины волн: возбуждение/излучение (нм) 358/461 для УФ и 485/530 для FITC.
- Для лучшей визуализации результатов перекрывают оба изображения с ImageJ или аналогичными.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В успешном эксперименте, вторичные антитела будут конкретно определить расположение конкретного эпитопа в ярко-зеленый, в последовательной манере, что позволяет для характеристики состава клеточной стенки на определенной стадии развития клетки, ткани или органа. Например, антитела LM6 имеет высокое сродство к 1,5-арабинан, соединение с типом-I rhamnogalacturonan, которые могут быть найдены обильно маркировки клеточной стенки развивающихся подурок кверкуса anther (Рисунок 2A), что позволяет сделать вывод, что этот тип пектина в изобилии и часть первичной клеточной стенки состава. JIM5 имеет сродство к homogalacturonans едва эстерифицированных, которые обычно находятся на кончике корня эмбриона субэра Кверка, указывая механические свойства органа(рисунок 2B). Xylogalacturonan являются одним из видов пектина, богатого ксилозой, связанные с ослаблением клеточной стенки, они находятся в вырождающихся клетках. Антитело LM8 специально распознает ксилогалактуроны, в органах созревания оно может быть использовано для обнаружения вырождающихся клеток или тканей, таких как эндосперм-клетки на заключительных стадиях созревания кукурузы кверкуса(рисунок 2C).
JIM13 имеет сродство к AGPs найти на структурах, связанных с размножением, клеточных линий, связанных с микрогаметогенезом в Arabidopsis талиана (Рисунок 2D). JIM8 также распознает эпитопы AGPs, присутствующих в клетках и органах, связанных с размножением, как стигматическое сосородие и микропиль Басального Angiosperm Trithuria submersa (Рисунок 2E-2F). Оба антитела были предложены, чтобы быть молекулярными маркерами для линий gametophytic клеток в растениях9.
Распространенные ошибки в этом протоколе, как правило, легко обнаружить и идентифицировать. Когда моет пропущены или реакции скважины позволяют высохнуть, вторичные антитела, как правило, появляются в качестве неспецифического мазка, охватывающих без разбора над клетками, тканями, смолы и слайда (рисунок 3A). Агрегаты зеленого фторхрома образуются, если неохвачённые первичные антитела не были должным образом смыты(рисунок 3B). Другая распространенная причина отказа этого метода связана со складыванием и/или отслоением секций(рисунок 3C),что делает эксперимент бесполезным. Эта проблема, как правило, связана либо с плохим примыкание разделов к слайдам, вероятно, из-за использования нечистых слайдов, и / или агрессивной стирки.
Подготовка образца также является важным шагом в этой процедуре. К счастью, наиболее распространенные проблемы фиксации и встраивания легко обнаружить(рисунок 3D). Если все пойдет хорошо смолы блок будет свободен от трещин и образец будет хорошо видны с бледно-желтого до светло-коричневогоцвета (рисунок 3D-1). Образцы неэффективно встроенных покажет порошкообразные белые пятна или области(рисунок 3D-2). Сохранение размера выборки ниже 8 мм важно, чтобы гарантировать проникновение фиксаторного решения. Когда образцы плохо фиксируются, они будут появляться темно-коричневый почти черный(рисунок 3D-3). Также температура полимеризации важна как для сохранения эпитопов, так и для правильного затвердевания смолы. Чрезмерная температура может привести к трещине смолы, что делает раздел образца невозможным(рисунок 3D-4).
Рисунок 1. Обзор полного протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Типичные результаты AGPs и иммунолокализации пектина в образцах растений. (A) LM6 маркировки арабинан moiety пектинов в кверк субер пыльник в мейоз I. (B) Специфическая маркировка низких метилэтерифицированных пектинов в корень эмбриона Кверк субар кончик JIM5. (C) Xylogalacturonan помечены LM8 в отступающей эндосперм кверкус suber созревания желудь. (D) JIM13 маркировки AGPs в ленточных и тетрадах арабидопсиса талиана пыль. (E) AGPs помечены JIM8 в стигматическом сосочных сосок Trithuria submersa. (F) JIM8 маркировки AGPs на микропиле (белая стрелка) из Trithuria submersa ovule. Мейотический микроспор (Mc), Tapetum (Tp), Root (R), Root tip (Rt), Testa (Ts), Endosperm (Ed), Embryo (Em), Epidermis (Ep), Stigmatic papillae (SP), Ovule (OV). Шкала баров: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Общие ошибки и проблемы во время протокола. (A) Отказ мыть шаги определены наличием неспецифического мазка вторичных антител (я)надобразцом смолы. (B)Плохая специфичность или отказ от мытья первичного антитела приводит к образованию агрегатов FITC ( ) не связаны с конкретным местом. (C)Складки и отслоение секции часто являются результатом агрессивной стирки и нечистых слайдов. (D)Примеры фиксации выборки и встраивания; (1) идеальный размер выборки и встраивание, (2) сбой встраивания, (3) отказ фиксации образца, (4) отказ затвердевания смолы. FITC помечены антитела (зеленый) и Calcofluor-белое пятно (синий). Шкала баров: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная цифра 1. (A) Схематическое представление последовательности обрезки блока для подготовки образца (желтый блок) для сечения с ультрамикротом. Во-первых, желатиновая капсула удаляется (1). Затем они сначала обрезаются под углом от 40 до 45 градусов по бокам капсулы касательно образца (2), второй разрез делается под 90 "первого (3) с последующим третьим (4) и четвертым после того же правила (5). Из этой первой фазы обрезки приводит пирамидальная структура, вершина которой расположена над образцом. Наконец, с острым лезвием вершина сбрил перпендикулярно смолы блок основной оси для достижения встроенного образца. Квадратная или трапециевидная поверхность должна быть получена в конце процедуры (6). (B)Необходимые материалы для инкубационой камеры; фольга (1), двусторонняя клейкая лента (2), бумажные полотенца (3) и коробка наконечника пипетки. (C)Первый шаг, фольга олова крепится к коробке с двусторонним клейкой лентой. (D)Второй шаг, держатель наконечников пипетки удаляется, чтобы поместить бумажные полотенца в нижней части коробки. (E) Третий шаг, бумажные полотенца смочены водой и пипетки советы держатель помещается обратно действовать имеет лоток для слайдов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица 1: Список полезных моноклональных антител. Приведенная выше таблица представляет собой пример доступных антител с информацией об их целях и о том, где их можно приобрести. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод флуоресцентной иммунолокализации растений, описанный здесь, хотя и легко прост, опирается на успех нескольких небольших шагов. Первым из них является подготовка и фиксация образца. Во время этого первого шага, смесь формальдегида и глутаралдегида используется для перекрестного большинства компонентов клеток. Формальдегид в растворе обеспечивает мягкую и обратимую фиксацию, в то время как глутаралдегид обеспечивает сильную, более постоянную связь; баланс между двумя фиксаторами обеспечивает соответствующее количество перекрестных ссылок, что позволяет воздействию эпитопов реагировать с первичным антителом10. Для правильной работы фиксаторного решения образец должен быть небольшим. Большие конструкции диаметром более 7 мм очень трудно исправить и должны быть обрезаны для обеспечения фиксаторного проникновения.
После раны или стресса, некоторые растения выделяет большое количество танинов формирования темных осадков, которые могут реагировать с формальдегидом вмешательства в процесс фиксации. Хранение образцов на льду и замена фиксаторного решения всякий раз, когда он становится облачным помогает уменьшить этот эффект. Воздух может также вмешиваться в процесс фиксации, а затем в встраивании и упрочнения смолы. Предлагаемая вакуумная обработка должна удалить большую часть воздуха. Для особенно воздушных тканей, вакуумный шаг может быть продлен дальше, чем 2 ч, пока не больше воздуха выходит из образцов, и они опускаются на дно. Любой образец, найденный плавающим после ночного фиксации шага, должен быть отброшен. Встраивание смол обеспечивает поддержку для резки сохранившегося образца, и его твердость должна быть приближена к встроеннымтканям 10. LR-White поставляется в трех классах твердости: жесткий для древесных сильно склерифицированных тканей, среднего класса для подавляющего большинства тканей от листьев до пыльцы зерна, и мягкий сорт для более деликатных тканей. Для идеального встраивания смола должна полностью проникнуть в образец; это лучше получить при медленном и постепенном проникновении. При предыдущем тестировании могут использоваться более короткие инкубационые периоды. Капсулы желатина являются небольшими и герметично герметически герметически герметически, что делает их идеальными для лечения LR-белой смолы. Для размера 2 (0,37 мл), лечение должно быть полным после 24 ч при 58 градусов по Цельсию. Для других размеров капсулы, время лечения должно быть скорректировано. LR-Белая вылеченная смола должна перейти от почти бесцветного к светло-золотистому/янтарного цвета и чувствовать себя трудно ногти. Обрезка образцов и использование ультра-микротомы требует практики, но даст четкие цифры. Толщина и размер секции имеет важное значение для анализа изображений и иммунолокализации. Толщина секции должна быть около 500 нм. Разделы, которые являются слишком тонкими приведет к плохой окрашивания и толщина секции более 700 нм будет мешать получению изображения и разрешения. Гидрофильная природа LR-белой смолы позволяет напрямую использовать секции при окрашивание и иммунолокализации без удаления смолы.
Блокирующий раствор (5% обезжиренного сухого молока в 1 МТГ) уменьшает неспецифическую привязку антител. Обезжиренное сухое молоко является надежной альтернативой BSA или другим более традиционным блокирующим агентам и значительно дешевле. Блокирующий раствор должен быть отфильтрован через бумажный фильтр перед использованием, чтобы избежать осадков, которые образуют трудно смыть агрегаты, сохранить антитела, и скомпрометировать эксперимент. Предлагаемые соотношения антител и инкубационые времена были оптимизированы и успешно применены к различным видамв нескольких исследованиях 9,11,12,13,14,15,16.
Испарение и экспозиция к свету являются двумя вопросами, которые следует избегать во время процедуры иммунолокализации. Влажная и темная инкубационая камера решает обе эти проблемы. Учебник о том, как сделать темную камеру можно найти в дополнительном рисунке 1B-1E. Этот протокол иммунолокализации требует использования первичного антитела, направленного к целевому эпитопу без собственной этикетки, и вторичного антитела, спрягаемого с фторхромом (FITC), который поднимается против первичного антитела IgG. Этот метод предлагает несколько преимуществ по сравнению с использованием одной системы обнаружения антител из-за повышенной строгости обнаружения, так как вторичное антитело не имеет сродства к целевому виду образца. Эта система предлагает повышенный сигнал, как основные молекулы антитела могут быть направлены на несколько молекул вторичного антитела, каждый из которых несет фторхром17.
Распад фторхромов интенсивным светом, или фото отбеливание, является важным вопросом в этой технике. Особенно при изучении слабых локализованных сигналов, сигнал может стать необратимо потеряны до изображения. Монтаж среды значительно повышает стабильность и продолжительность жизни фторхромов18; однако, очень целесообразно проверить монтажные средства массовой информации, так как некоторые могут реагировать с пятном и / или фторхрома, образуя осадки и размытия изображения. Конфигурация оптической системы, используемой для наблюдения и регистрации иммунолокализации, является одним из наиболее важных аспектов успеха этого эксперимента. Из-за снижения толщины секций преимущества использования конфокального микроскопа ограничены. Наиболее успешная установка требует обычного вертикально epifluorescence микроскоп оснащен флуоресцентным источником света, светодиодной или ртутнойлампочки 19 , с адекватными целямифлуоресценции класса. Также необходимы световые фильтры хорошего качества, установленные для возбуждения/выброса (нм) 358/461 для УФ-излучения и 485/530 для FITC. Для приобретения изображения флуоресценции, охлажденные монохромные цифровые камеры рекомендуются из-за их высокой скорости и чувствительности, но жертвуют истинной цветовойинформацией 20. Полихромные камеры обеспечивают возможность легко сортировать сигнал от фоновой флуоресценции, но медленнее и гораздо менее чувствительны, чем их монохромные аналоги.
Метод ограничен наличием специфических антител. Несмотря на наличие обширной и расширяющейся коллекции антител, направленных на эпитопы растений, понятно, что еще не все растительные соединения покрыты. Кроме того, липиды, как правило, извлекаются описанным методом встраивания, и поэтому не рекомендуется для тканей с высоким содержанием масла. Раздел Cryostat может быть альтернативой, несмотря на жертву разрешения изображения. Температура полимеризации LR-белой смолы может в некоторых случаях изменять более чувствительные эпитопы. Если эпитоп цели чувствителен к температуре, переключитесь на LR-White для смолы LR-Gold. Полимеризация при -25 градусов по Цельсию при белом свете, LR-Gold предлагает отличное сохранение термочувствительных эпитопов, но потребует приобретения специализированного аппарата полимеризации и немного более токсичным, чем LR-White.
Этот метод был использован в широком диапазоне видов и тканей. Это позволяет быстро получить доступ к достоверной информации о конкретном распределении эпитопа. Предлагая подтверждающие данные для эволюционных моделей и идентифицяющие маркеры и специфические адаптации в клетках и тканях, обеспечивая при этом визуально заманчивые результаты. Использование антител, конъюгированных с фторхромами над пероксидазой или щелочными альтернативами спряженияфосфатазы 10, является менее трудоемким, значительно менее склонны к чрезмерной реакции артефактов и обеспечивает четкое субклеточное разрешение трудно соответствовать любой другой технике. Использование антител, характерных для полимеров, связанных с клеточной стеной, позволяет понять расположение соединений в очень ограничивающих областях. Такое разрешение было бы сложно получить из традиционных биохимических инструментов. Постоянно расширяющийся набор основных антител, доступных предлагает постоянные новые возможности открытия в растительной клетки внутренней работы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствие конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы получили поддержку от проекта ЕС 690946 'SexSeed' (Сексуальная репродукция растений - Формирование семян), финансируемого H2020-MSCA-RISE-2015 и SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017. AMP получила грант от проекта MSCA-IF-2016 Европейского союза (No 753328). МК получил грант от FCT PhD грант SFRH/BD/111781/2015.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25% (w/v) Gluteraldehyde | Agar Scientific | AGR1010 | aq. Solution, methanol free |
| 8 wells Glass reaction slides | Marinfeld | MARI1216750 | other brands may be used |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produced in GOAT | Sigma-Aldrich | F6258 | |
| cover slips, 24 mm x 50 mm | Marinfeld | MARI0100222 | The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used |
| ddH2O | na | na | |
| Absolute ethanol | na | na | |
| Fluorescent brightner 28 | Sigma-Aldrich | F-6259 | |
| Gelatin capsules | Agar scientific | AGG29211 | The capsule size should fit the size of the sample. |
| Glass vials | na | na | Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be cleaned with 96% ethanol after use to remove LR-White residue and reused. |
| LR-white medium grade, embdeding resin | Agar Scientific | AGR1281 | LR-White comes in several forms; the medium grade provides an adequate cutting support for most tissues, while for harder tissues a harder grade of LR-white may be recommendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please follow the instructions of the supplier to prepare the resin. |
| Non fat dry milk | Nestlé | na | any non fat dry milk is adequate |
| Oven | na | na | generic laboratory oven |
| Petri dish, 10 cm x 10 cm square | na | na | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Rat generated Monoclonal Anti-Body | Plant probes | na | Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1 |
| Razor blades | na | na | regular razor blades |
| SDS | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| Toluidine Blue-O | Agar Scientific | AGR1727 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC7 | |
| Upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters | Leica Mycrosistems | DMLb | |
| Vacuum chamber | na | na | |
| Vacuum pump | na | na | |
| Vectashield | vecta Labs | T-1000 | Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An anti-fade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.) |
References
- Keegstra, K.
- Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues. Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).
- Showalter, A. Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).
- Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development. Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).
- Seifert, G., Roberts, K.
- Ruprecht, C., et al. A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies. Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).
- Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy. Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505 (2017).
- Osborn, M., Weber, K. Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures. Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).
- Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction. Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).
- Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).
- Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto. Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).
- Coimbra, S., Salema, R. Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules. Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).
- Coimbra, S., Duarte, C. Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus. Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).
- El-Tantawy, A., et al. Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus. Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).
- Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae). Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).
- Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis. Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).
- Hibbs, A. R. Fluorescence Immunolabelling. Confocal Microscopy for Biologists. , Springer. Boston, MA. (2004).
- Johnson, G. D., et al. Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy. Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).
- Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors. Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).
- Weber, G. F., Menko, A. S. Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes. BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).
