Summary
Questo protocollo descrive in dettaglio come viene fissato il materiale vegetale per l'immunolocalizzazione delle proteine arabinogalactane e delle pectine, incorporato in una resina acrilica idrofila, sezionale e montato su vetrini. Mostriamo che gli epitopi correlati alla parete cellulare verranno rilevati con anticorpi specifici.
Abstract
Lo sviluppo dell'impianto comporta regolazioni costanti della composizione e della struttura della parete cellulare in risposta a stimoli sia interni che esterni. Le pareti cellulari sono composte da cellulosa e polisaccaridi non cellulosici insieme a proteine, composti fenolici e acqua. Il 90% della parete cellulare è composto da polisaccaridi (ad esempio, pectine) e proteine arabinogalactane (ARP). L'immunolocalizzazione fluorescente di specifici epitopi glicani nelle sezioni istologiche vegetali rimane uno strumento chiave per scoprire il rimodellamento delle reti, della struttura e dei componenti del polisaccaride delle pareti.
Qui, segnalamo una procedura di immunolocalizzazione fluorescente ottimizzata per rilevare epitopi glicani da ARP e pectine nei tessuti vegetali. La fissazione della paraformaldeide/glutaraldeide è stata utilizzata insieme all'incorporamento LR-White dei campioni vegetali, consentendo una migliore conservazione della struttura e della composizione dei tessuti. Sezioni sottili dei campioni incorporati ottenuti con un ultra-microtomo sono state utilizzate per l'immunolocalizzazione con anticorpi specifici. Questa tecnica offre grande risoluzione, alta specificità e la possibilità di rilevare più epitopi glicani nello stesso campione. Questa tecnica consente la localizzazione subcellulare dei glicani e rileva il loro livello di accumulo nella parete cellulare. Consente inoltre la determinazione dei modelli spazio-temporali di distribuzione dell'AGP e della pectina durante i processi di sviluppo. L'uso di questo strumento può in ultima analisi guidare le direzioni di ricerca e collegare i glicani a funzioni specifiche nelle piante. Inoltre, le informazioni ottenute possono integrare gli studi biochimici e di espressione genica.
Introduction
Le pareti delle cellule vegetali sono strutture complesse composte da polisaccaridi e glicoproteine. Le pareti cellulari sono strutture estremamente dinamiche la cui architettura, organizzazione e composizione variano a seconda del tipo di cella, della localizzazione, dello stadio di sviluppo, degli stimoli esterni e interni1. Le proteine arabinogalactane (ARP) e le pectine sono componenti importanti della parete cellulare della pianta. Gli ARP sono proteine altamente glicosilate e le pectine sono polisaccaridi omogalattivonan la cui composizione, quantità e struttura variano notevolmente durante le diverse fasi di sviluppo dellepiante 2,3,4. ARP e studi sulla pectina hanno rivelato il loro coinvolgimento in diversi processi vegetali come la morte cellulare programmata, la risposta a stress abiotici, la riproduzione delle piante sessuali, tra moltialtri 5. La maggior parte di questi studi è iniziata con informazioni ottenute da studi di immunolocalizzazione.
Data la sua complessità, lo studio delle pareti cellulari richiede molti strumenti diversi. Il rilevamento di epitopi glicani utilizzando anticorpi monoclonali (mAbs) è un approccio prezioso per risolvere la distribuzione di polisaccaride e glicoproteina lungo questa struttura. C'è una vasta collezione di mAb disponibili per rilevare epitopi glicani e la specificità di ogni mAb viene continuamente migliorataanche 6. La tecnica qui descritta è applicabile a tutte le specie vegetali ed è uno strumento perfetto per guidare le direzioni di ricerca future che potrebbero comportare tecniche più costose e complesse.
In questa tecnica, anticorpi specifici sono coniugati chimicamente a coloranti fluorescenti come FITC (isotiocianato di fluoresceina), TRITC (tetrametillrhodamina-5-(e 6)-isotiocianato) o diversi coloranti Alexa Fluor. L'immunofluorescenza offre diversi vantaggi, consentendo una localizzazione subcellulare chiara e rapida dei glicani che possono essere osservati direttamente al microscopio a fluorescenza. È altamente specifico e sensibile, poiché la preparazione del campione può proteggere efficacemente la struttura naturale dell'antigene, anche se presente in quantità inferiori. Consente il rilevamento di più antigeni nello stesso campione e, cosa più importante, offre risultati di alta qualità e visivamente belli. Nonostante la grande potenza offerta dagli studi di immunolocalizzazione a fluorescenza, sono spesso considerati difficili da eseguire e implementare molto probabilmente a causa della mancanza di protocolli dettagliati che consentono la visualizzazione delle diverse fasi della procedura. Qui, forniamo alcune semplici linee guida su come eseguire questa tecnica e su come ottenere immagini di alta qualità.
Per il protocollo qui presentato, i campioni devono prima essere corretti e incorporati utilizzando il fissatore più appropriato. Sebbene considerata una tecnica dispendiosa in termini di tempo e relativamente noiosa, una corretta fissazione e incorporamento del campione vegetale è la chiave per garantire un test di immunolocalizzazione di successo. A questo scopo, il più comune è la fissazione chimica usando fissanti reticali, come le aldeidi. I fissatori incrociati stabiliscono legami chimici tra molecole del tessuto, stabilizzando e indurendo il campione. La formaldeide e la glutaraldeide sono fissivi di collegamento incrociato e talvolta viene utilizzata una combinazione di entrambi i fissivi7. La formaldeide offre una grande conservazione strutturale dei tessuti e per lunghi periodi di tempo, producendo piccole retrazioni tissutali ed essendo compatibile con l'immunostaining. La glutaraldeide è un fissatore più forte e stabile solitamente usato in combinazione con la formaldeide. L'uso della glutaraldeide ha alcuni svantaggi che devono essere presi in considerazione in quanto introduce alcuni gruppi di aldeide liberi nel tessuto fisso, che possono generare qualche etichettatura aspecifica. Anche il collegamento incrociato tra proteine e altre molecole occasionalmente può rendere alcuni epitopi bersaglio inaccessibili per gli anticorpi. Per evitare ciò, la quantità e la durata della fissazione devono essere accuratamente definite.
Dopo la fissazione, i campioni vengono incorporati nella resina corretta per indurirsi prima di ottenere le sezioni. La resina acrilica London Resin (LR-White) è la resina preferita per gli studi di immunolocalizzazione. A differenza di altre resine, LR-White è idrofilo, permettendo agli anticorpi di raggiungere i loro antigeni, senza bisogno di alcun trattamento per facilitarlo. LR-White ha anche il vantaggio di offrire una bassa autofluorescenza, consentendo una riduzione del rumore di fondo durante l'imaging ad immunofluorescenza.
Ci sono molte tecniche di colorazione disponibili per rilevare diversi componenti della parete cellulare, come la colorazione blu alciana, la colorazione blu toluidina o la colorazione periodica acido-schiff (PAS). Nessuno di questi offre il potere delle analisi di immunolocalizzazione8. Questo approccio fornisce una maggiore specificità nel rilevamento dei glicani, offrendo informazioni più vaste sulla composizione e la struttura della parete cellulare.
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Protocol
1. Preparazione del campione: fissazione, disidratazione e incorporamento LR-White
- Fissazione e disidratazione
NOTA: il processo di fissazione è fondamentale per preservare il campione; incrociando le molecole il metabolismo cellulare viene interrotto, garantendo l'integrità cellulare e prevenendo la diffusione molecolare. Gli agenti fissivi e la concentrazione utilizzata devono essere adeguati a tale scopo, lasciando gli antigeni sufficientemente esposti per interagire con gli anticorpi. Il seguente protocollo combina la lieve capacità fissativa della paraformaldeide, con l'effetto più forte della glutaraldeide. Le loro proporzioni sono state ottimizzate per ARP e componenti delle pareti cellulari, ma è adatto ad altre proteine e strutture cellulari. Il successivo processo di disidratazione preparerà i campioni per l'incorporamento LR-White. Tessuti vegetali di diverse specie vegetali sono stati utilizzati in questo esperimento. Campioni di Quercus suber sono stati raccolti da alberi coltivati nel campo. I campioni di submersa trithuria sono stati gentilmente condivisi con noi da Paula Rudall (Kew Gardens, Londra, Regno Unito).- Seminare tutte le piante arabidopsis direttamente sul terreno e crescere in un impianto di crescita interna con 60% di umidità relativa e un ciclo giorno/notte di 16 ore di luce a 21 °C e 8 ore di buio a 18 °C. Selezionare i tessuti vegetali da analizzare e tagliare i campioni in modo che non siano di dimensioni superiori a 16 mm2.
- Trasferire immediatamente il campione su una fiala di vetro precedentemente riempita con una soluzione fissante a freddo sufficiente (2% di formaldeide (w/v), 2,5% di glutaraldeide (w/v), 25 mM PIPES pH 7 e 0,001% Tween-20 (v/v)) per immergere completamente i campioni(figura 1A).
ATTENZIONE: Formaldeide e glutaraldeide sono entrambi agenti fissivi che possono essere dannosi per inalazione e contatto. Eseguire la fase di fissazione su un cappuccio dei fumi e indossare indumenti protettivi adeguati e guanti in nitrile. Tutte le soluzioni da questo passo in poi, comprese le serie di alcol fino al 70%, devono essere conservate per una successiva decontaminazione da parte di personale specializzato. - Dopo aver raccolto tutti i campioni, aggiornare il fissatore.
- Trasferire i flaconcini in una camera a vuoto e applicare lentamente il vuoto. Una volta raggiunto -60 kPa, il materiale galleggiante inizierà ad affondare sul fondo del flaconcino (Figura 1B).
- Conservare sotto vuoto non più di -80 kPa per 2 ore a temperatura ambiente.
- Rilasciare lentamente il vuoto, sigillare il flaconcino di vetro e posizionarlo durante la notte a 4 °C.
- Scartare tutti i campioni che non hanno affondato durante la fissazione notturna. Lavare i campioni rimanenti con 25 mM PBS pH 7 per 10 min, seguito da un lavaggio di 20 minuti in tampone pipes pH 7.2 da 25 mM PIPES.
- Disidratare i campioni in una serie di etanolo (25%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90% e 3x 100% etanolo) per 20 minuti ciascuno. Trasferire immediatamente i campioni disidratati su flaconcini di vetro etichettati per l'incorporamento (Figura 1C).
NOTA: Il processo di disidratazione può essere messo in pausa nella fase del 70% di etanolo.
- Incorporamento in resina LR-White
NOTA: LR-white è una resina acrilica non idrofobica a bassa viscosità, che la rende ideale per penetrare tessuti con molti strati di pareti cellulari spesse. LR-White è disponibile anche in diversi gradi di durezza compatibili per il taglio della maggior parte dei campioni di impianto. Assicurarsi che la resina usata sia già fornita con il corretto catalizzatore miscelato o seguire le istruzioni del fornitore per preparare la resina. Il seguente processo di incorporamento è lento, ma i risultati giustificano notevolmente i mezzi.- Perfondere i campioni incubando con la resina LR-White in una serie di concentrazione crescente di resina (1:3, 2:3, 1:1, 3:2, 3:1, 1:0) in etanolo, incubando per 24 ore a 4 °C in ogni fase.
ATTENZIONE: La resina LR-White è una resina acrilica a bassa tossicità; tuttavia, può essere irritante per la pelle per contatto e inalazione. Si consiglia vivamente di lavorare in un'area ben ventilata o sotto una cappa aspirante con un'adeguata usura protettiva e guanti in nitrile. - Rinfrescare la resina lr-bianca e incubare per ulteriori 12 ore a 4 °C.
- Preparare capsule di gelatina di incorporamento di dimensioni appropriate (dimensioni 1 (0,5 mL) per campioni fino a 3 mm, 2 x 0,37 mL per campioni fino a 5 mm o 3 x 0,3 mL per campioni fino a 8 mm e etichette di carta(figura 1D).
NOTA: Selezionare la dimensione della capsula in modo che sia leggermente più grande del campione, in modo che il campione possa essere completamente racchiuso nella resina. Inoltre, ricorda di etichettare le etichette con una matita, perché penna o inchiostri stampati contamineranno la resina, rovinando il campione. - Applicare una goccia di resina fresca LR-bianca sul fondo di ogni capsula.
- Mettere un campione in ogni capsula di gelatina e riempire alla massima capacità con resina fresca. Posizionare il cappuccio della capsula e premere delicatamente per formare una guarnizione ermetica (Figura 1E).
- Polimerizzare la resina per 24-48 ore a 58 °C o fino a completo indurimento.
- Conservare i campioni a temperatura ambiente.
NOTA: La resina LR-bianca post polimerizzazione è inerte.
- Perfondere i campioni incubando con la resina LR-White in una serie di concentrazione crescente di resina (1:3, 2:3, 1:1, 3:2, 3:1, 1:0) in etanolo, incubando per 24 ore a 4 °C in ogni fase.
2. Preparazione delle diapositive
NOTA: I vetrini devono essere puliti, senza polvere, grasso o altri contaminanti. Anche le nuove diapositive devono essere pulite poiché alcuni fornitori utilizzano oli e detergenti per evitare che le diapositive si attacchino. Qualsiasi grasso o detergente interferirà con l'adesione della sezione allo scivolo, anche se trattato con poli-L-lisina. Lanugine e la polvere influenzeranno le osservazioni del campione e molto probabilmente rovineranno l'esperimento. Gli scivoli rivestiti in teflon con pozzi di reazione sono perfetti per questo compito. Sono convenienti, riutilizzabili e riducono drasticamente la quantità di soluzione anticorpale necessaria. Con una corretta pulizia, l'immunolocalizzazione fluorescente di ottima qualità può essere eseguita a un costo molto conveniente.
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Lavaggio scivolo
- Posizionare le diapositive in un rack di colorazione e coprire con soluzione detergente (0,1% SDS (w/v), 1% acido acetico (v/v), 10% etanolo (v/v)).
- Mantenere una lieve agitazione per 20 minuti.
- Trasferire i rack di colorazione in un bagno ddH2O con lieve agitazione per 10 minuti. Ripeti 4 volte.
- Scolare accuratamente i rack prima di immergersi brevemente in etanolo al 100% e lasciare asciugare gli scivoli in un ambiente privo di polvere.
- Conservare fino all'uso.
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Rivestimento in poli-L-lisina (opzionale)
NOTA: Le piccole sezioni di solito si attaccano molto bene alle diapositive di vetro pulite. Questo passaggio è consigliato solo per sezioni più grandi (>2 mm2). Le sezioni più grandi tendono a piegarsi e rughe e non sono raccomandabili. Tuttavia, se necessario, utilizzare diapositive di reazione con fori più grandi. Puliscili come sopra e procedi come segue.- Posizionare diapositive pulite in una piastra di Petri quadrata. Pipetta soluzione di poli-L-lisina allo 0,001% (w/v) per coprire i fori delle diapositive, senza traboccare.
- Lasciare asciugare gli scivoli durante la notte a 40 °C in piastre di Petri chiuse.
NOTA: I vetrini rivestiti sono pronti per l'uso immediato e possono essere conservati in un ambiente privo di polvere a temperatura ambiente, per diversi mesi.
3. Rifilatura e sessatura del campione
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Rifilatura di esempio
- Con una lama affilata, tagliare i blocchi LR-White sotto uno stereomicroscopio per formare una struttura a forma di piramide in cui l'apice è perpendicolare all'area di interesse del campione (Figura supplementare 1A).
NOTA: Il supporto per campioni ultra-microtomi è uno strumento eccellente per fissare il blocco. Se il dispositivo non dispone di un supporto per campioni universale, utilizzare quello più adatto per i blocchi rotondi. - Tagliare la struttura piramidale rimuovendo le fette sottili della resina in eccesso perpendicolarmente all'asse principale della piramide.
- Procedere fino a raggiungere il campione formando la superficie di taglio. All'interno della superficie di taglio, il campione di destinazione dovrebbe idealmente essere racchiuso in una forma trapezoidale.
NOTA: Il blocco di resina può essere ulteriormente tagliato con un angolo di fessurazione per ridurre la superficie della sezione con una lama affilata (Figura 1F).
- Con una lama affilata, tagliare i blocchi LR-White sotto uno stereomicroscopio per formare una struttura a forma di piramide in cui l'apice è perpendicolare all'area di interesse del campione (Figura supplementare 1A).
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Sessatura semisottile
NOTA: Verrà utilizzato un microtomo con coltelli di vetro. La capacità dell'anticorpo di legarsi all'epitopo condizionerà il successo della reazione immunoetichettatura. La natura idrofila della resina LR-White consentirà un buon contatto degli anticorpi con le sezioni del campione. Sezioni più sottili presenteranno la colorazione Calcofluor più debole che verrà utilizzata per aiutare a localizzare le sezioni e assistere con il processo di imaging. Lo stesso vale per altre macchie che potrebbero essere applicate in seguito. Anche lo spessore eccessivo influenzerà la qualità dell'acquisizione dell'immagine. Un buon compromesso per lo spessore della sezione può essere trovato tra 200 e 700 nm, a seconda delle caratteristiche tissutali. Montare i blocchi saldamente sul supporto del campione dell'ultra-microtomo.- Con un ultra-microtomo, creare sezioni con uno spessore compreso tra 200 e 700 nm (Figura 1G).
- Controllare l'area della sezione trasferendo alcune sezioni in una goccia ddH2O su uno scivolo di vetro. Posizionare lo scivolo su una piastra calda a 50 °C fino a quando l'acqua evapora. Macchia che posiziona un calo dell'1% di Toluidina Blue O (w/v) in soluzione di acido borico all'1% (w/v) sulle sezioni per 30 s. Risciacquare e osservare al microscopio.
- Dopo aver trovato la struttura desiderata, trasferire una o due sezioni ad ogni goccia di ddH2O precedentemente posizionata su ogni pozzo di una diapositiva di reazione pulita.
- Posizionare ogni scivolo in una piastra di petri quadrata chiusa di 10 cm e lasciarla asciugare a 50 °C.
- Archiviare le diapositive in una casella di archiviazione pulita fino all'uso.
4. Immunolocalizzazione
NOTA: La procedura di immunolocalizzazione fluorescente si basa sull'uso sequenziale di due anticorpi. L'anticorpo primario viene sollevato contro uno specifico antigene bersaglio. L'anticorpo secondario viene sollevato specificamente contro l'anticorpo primario e per le tecniche fluorescenti è coniugato a un fluorofore (FITC in questo specifico protocollo). L'anticorpo primario sarà utilizzato per rilevare l'antigene bersaglio nel campione e l'anticorpo secondario verrà utilizzato per contrassegnare il luogo in cui l'anticorpo primario collegato al campione dopo aver lavato via l'eccesso di anticorpo primario. I controlli sono una parte importante di questo saggio e devono sempre essere eseguiti per garantire l'accuratezza delle osservazioni. Un pozzo sullo scivolo dovrebbe essere riservato all'uso come controllo negativo, dove il trattamento anticorpale primario verrà saltato, e quindi nessun segnale dovrebbe essere osservato alla fine dell'esperimento. Un controllo positivo deve essere incluso nell'esperimento trattando un bene con un anticorpo che l'etichettatura è già nota e certa. Il controllo positivo viene utilizzato per confermare l'efficacia e le condizioni di reazione dell'etichettatura degli anticorpi secondari mentre il controllo negativo verifica la specificità dell'anticorpo secondario.
- Preparare una camera di incubazione posizionando alcuni tovaglioli di carta smorzati nella parte inferiore di una scatola di punte di pipetta e avvolgendolo con un foglio di latta(Figura supplementare 1B-1E). Posizionare le diapositive nella camera di incubazione.
- Pipettare una goccia di 50 μL per 8 mm di pozzo di soluzione di blocco (5% di latte secco non grasso (w/v) in 1 M PBS) e incubare per 10 min. Rimuovere la soluzione di blocco e lavare tutti i pozzi due volte con PBS per 10 minuti.
- Preparare le soluzioni anticorpali primarie (vedi tabella supplementare 1), 1:5 (v/v) anticorpo in soluzione di blocco; fare una stima di circa 40 μL per 8 mm di pozzo.
NOTA: La concentrazione dell'anticorpo deve essere regolata secondo il protocollo della fabbricazione. - Eseguire un lavaggio finale con ddH2O per 5 minuti, non lasciare mai asciugare completamente i pozzi.
- Pipetta la soluzione anticorpale primaria ai pozzi di reazione. Soluzione di bloccaggio pipetta ai pozzi di controllo.
- Chiudere la camera di incubazione e lasciare riposare per 2 ore a temperatura ambiente seguita da pernottamento a 4 °C. Preparare la soluzione anticorpale secondaria, 1% in soluzione di blocco (v/v) circa 40 μL per pozzo. Tienilo coperto di lamina di latta.
- Lavare tutti i pozzi due volte con PBS per 10 minuti, seguito da 10 minuti aggiuntivi con ddH2O. Assicurarsi che nessuna traccia della soluzione di blocco o dei depositi sia visibile sui pozzi.
- Pipettare la soluzione anticorpale secondaria a tutti i pozzi. D'ora in ora in su, proteggi le diapositive dalla luce.
- Incubare per 3-4 ore al buio a temperatura ambiente.
- Lavare tutti i pozzi due volte per 10 minuti con PBS seguito da un altro lavaggio di 10 minuti con ddH2O.
- Applicare una goccia di calcofluor (1:10.000 (con v) fluorescente più luminosa 28 in PBS) su ciascun pozzo. Senza lavaggio, applicare una goccia di mezzo di montaggio (vedere Tabella dei materiali) su ciascun pozzo e posizionare un coverslip ( Figura1H).
- Osservare con un microscopio a fluorescenza, dotato di lente 10x/0.45, 20x/0.75, 40x/0.95 e 100x/1.40, utilizzare filtri UV (per calcofluoro) e FITC, rispettivamente per rilevare la parete cellulare e l'immunolocalizzazione(figura 1I). Utilizzare le seguenti lunghezze d'onda: eccitazione/emissione (nm) 358/461 per UV e 485/530 per FITC.
- Per una migliore visualizzazione dei risultati, sovrapporre entrambe le immagini a ImageJ o simili.
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Representative Results
In un esperimento riuscito, l'anticorpo secondario intaserà specificamente la posizione dell'epitopo specifico in verde brillante, in modo coerente, consentendo la caratterizzazione della composizione della parete cellulare in una certa fase di sviluppo della cellula, del tessuto o dell'organo. Ad esempio l'anticorpo LM6 ha un'alta affinità per 1,5-arabinan, un composto con rhamnogalacturonan di tipo I che può essere trovato abbondantemente etichettando la parete cellulare dell'anther Quercus suber in via di sviluppo (Figura 2A), permettendo così di concludere che questo tipo di pectina è abbondante e parte della composizione della parete cellulare primaria. JIM5 ha affinità per gli omogalattiuronani appena esterificati che si trovano tipicamente sulla punta della radice dell'embrione Quercus suber, specificando le proprietà meccaniche dell'organo (Figura 2B). Gli xilogalacturonan sono un tipo di pectina ricca di xilosio associata all'allentamento della parete cellulare, si trovano nelle cellule degeneranti. L'anticorpo LM8 riconosce specificamente gli xilogalatturoni, negli organi in maturazione può essere utilizzato per rilevare cellule o tessuti degenerante, come le cellule endosperma durante le fasi finali della maturazione della ghianda Quercus suber (Figura 2C).
JIM13 ha affinità per gli ARP trovati su strutture legate alla riproduzione, linee cellulari legate alla microgametogenesi in Arabidopsis thaliana (Figura 2D). JIM8 riconosce anche epitopi di ARP presenti in cellule e organi legati alla riproduzione come le papille stigmatiche e il micropilo del submersa di Trithuria dell'Angiosperma Basale (Figura 2E-2F). Entrambi gli anticorpi sono stati suggeriti come marcatori molecolari per le linee cellulari gametofite nelle piante9.
Gli errori comuni a questo protocollo sono normalmente facili da rilevare e identificare. Quando i lavaggi vengono saltati o i pozzi di reazione vengono lasciati asciugare, l'anticorpo secondario apparirà di solito come uno striscio non specifico che copre indiscriminatamente su cellule, tessuti, resina e scivolo (Figura 3A). Gli aggregati di fluorocromo verde si formeranno se l'anticorpo primario illimitato non è stato lavato via correttamente (Figura 3B). Un'altra causa comune di fallimento di questa tecnica è legata alla piegatura e/o al distacco delle sezioni (Figura 3C), rendendo l'esperimento inutile. Questo problema è solitamente correlato con una scarsa adesione delle sezioni alle diapositive, probabilmente a causa dell'uso di diapositive impure e / o lavaggio aggressivo.
Anche la preparazione del campione è un passaggio critico in questa procedura. Fortunatamente, i problemi di fissazione e incorporamento più comuni sono facili da individuare (Figura 3D). Se tutto va bene, il blocco di resina sarà privo di crepe e il campione sarà chiaramente visibile con un colore dal giallo pallido al marrone chiaro(Figura 3D-1). I campioni incorporati in modo inefficiente mostreranno macchie o aree bianche polverose (Figura 3D-2). Mantenere la dimensione del campione inferiore a 8 mm è importante per garantire la penetrazione della soluzione fissante. Quando i campioni sono scarsamente fissati, appariranno marrone scuro quasi nero (Figura 3D-3). Anche la temperatura di polimerizzazione è importante sia per la conservazione degli epitopi che per il corretto indurimento della resina. Una temperatura eccessiva può causare la rottura della resina rendendo impossibile il sessamento del campione(figura 3D-4).
Figura 1. Panoramica del protocollo completo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Risultati tipici degli ARP e dell'immunolocalizzazione della pectina nei campioni vegetali. (A) Etichettatura LM6 della moiety arabina delle pectine in un anther Quercus suber in meiosi I. (B) Etichettatura specifica delle pectine a basso metilesterificato in una punta di radice embrionale Quercus suber di JIM5. (C) Xylogalacturonan etichettato da LM8 nell'endosperma reclinabile di una ghianda in maturazione Quercus suber. (D) Etichettatura JIM13 degli ARP nel tapetum e dei tetradi di un'etere arabidopsis thaliana. (E) ARP etichettati da JIM8 nelle papille stigmatiche della Trithuria submersa. (F) ARP di etichettatura JIM8 al micropilo (freccia bianca) di un ovulo di trithuria submersa. Microspore meiotica (Mc), Tapetum (Tp), radice (R), punta della radice (Rt), testa (Ts), endosperma (Ed), embrione (Em), epidermide (Ep), papille stigmatiche (SP), ovulo (OV). Barre di scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Errori e problemi comuni durante il protocollo. (A) Il fallimento delle fasi di lavaggio è identificato dalla presenza di striscio non specifico di anticorpi secondari (+) sulla resina campione. (B) La scarsa specificità o il fallimento del lavaggio dell'anticorpo primario provoca la formazione di aggregati FITC (+) non legati ad un luogo specifico. (C) Le pieghe e il distacco della sezione sono spesso il risultato di lavaggi aggressivi e diapositive impure. (D) Esempi di fissazione e incorporamento dei campioni; (1) dimensioni e incorporamento del campione perfetti, (2) fallimento dell'incorporamento, (3) guasto di fissazione del campione, (4) indurimento della resina. Anticorpo etichettato FITC (verde) e macchia calcofluor-bianca (blu). Barre di scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1. (A) Rappresentazione schematica della sequenza di taglio dei blocchi per la preparazione del campione (blocco giallo) per la sessatura con l'ultramicrotoma. In primo luogo, la capsula di gelatina viene rimossa (1). Quindi vengono prima tagliati con un angolo da 40° a 45° ai lati della capsula tangenzialmente al campione (2), un secondo taglio viene effettuato a 90° del primo (3) seguito da un terzo (4) e quarto seguendo la stessa regola (5). Da questa prima fase di rifilatura risulta una struttura a forma piramidale che si trova sopra il campione. Infine, con una lama affilata la cima viene rasata perpendicolarmente all'asse principale del blocco di resina per raggiungere il campione incorporato. Una superficie quadrata o trapezoiata deve essere ottenuta alla fine della procedura (6). (B) Forniture necessarie per realizzare una camera di incubazione; lamina di stagno (1), nastro adesivo a doppia lato (2), tovaglioli di carta (3) e una scatola di punta della pipetta. (C) Primo passo, il foglio di stagno è fissato alla scatola con il nastro adesivo a doppia fronte. (D) Secondo gradino, il supporto delle punte della pipetta viene rimosso per posizionare gli asciugamani di carta nella parte inferiore della scatola. (E) Terzo gradino, gli asciugamani di carta sono umidi con acqua e il supporto delle punte della pipetta viene riposto per agire ha un vassoio per gli scivoli. Clicca qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare 1: Elenco degli anticorpi monoclonali utili. La tabella precedente rappresenta un esempio di anticorpi disponibili, con informazioni sui loro obiettivi e dove possono essere acquistati. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il metodo di immunolocalizzazione fluorescente nelle piante qui descritto, sebbene perfettamente semplice, si basa sul successo di diversi piccoli passaggi. Il primo dei quali è la preparazione e la fissazione del campione. Durante questo primo passaggio, una miscela di formaldeide e glutaraldeide viene utilizzata per collegare la maggior parte dei componenti cellulari. La formaldeide nella soluzione fornisce una fissazione lieve e reversibile mentre la glutaraldeide fornisce un forte collegamento più permanente; l'equilibrio tra i due fissatori fornisce l'adeguata quantità di reti incrociate, consentendo all'esposizione degli epitopi di reagire con l'anticorpo primario10. Affinché la soluzione fissante funzioni correttamente, il campione deve essere piccolo. Strutture di grandi dimensioni di diametro superiore a 7 mm sono molto difficili da fissare e devono essere ritagliate per garantire la penetrazione fissante.
Dopo il mento o lo stress, alcune piante secernono grandi quantità di tannini formando precipitati scuri che possono reagire con la formaldeide che interferisce con il processo fissivo. Mantenere i campioni sul ghiaccio e sostituire la soluzione fissante ogni volta che diventa torbida aiuta a ridurre questo effetto. L'aria può anche interferire con il processo fissivo e successivamente nell'incorporamento e nell'indurimento della resina. Il trattamento sottovuoto proposto dovrebbe rimuovere la maggior parte dell'aria. Per tessuti particolarmente ariosi, il passo del vuoto può essere esteso oltre 2 ore, fino a quando non esce più aria dai campioni e affondano sul fondo. Qualsiasi campione trovato fluttuante dopo il passaggio fissivo notturno deve essere scartato. L'incorporamento della resina fornisce supporto per il taglio del campione conservato e la sua durezza dovrebbe essere approssimativa ai tessuti incorporati10. LR-White è disponibile in tre gradi di durezza: duro per tessuti legnosi pesantemente sclerificati, grado medio per la stragrande maggioranza dei tessuti dalle foglie ai grani di polline e grado morbido per tessuti più delicati. Per un perfetto incorporamento, la resina deve penetrare completamente nel campione; questo si ottiene meglio con un'infiltrazione lenta e graduale. Con test precedenti, possono essere utilizzati periodi di incubazione più brevi. Le capsule di gelatina sono sia piccole che ermeticamente sigillabili, il che le rende perfette per la polimerizzazione della resina LR-White. Per una taglia 2 (0,37 mL), la polimerizzazione deve essere completa dopo 24 ore a 58 °C. Per altre dimensioni della capsula, il tempo di polimerizzazione deve essere regolato. La resina polimerizzata LR-White dovrebbe passare da un colore quasi incolore a un colore chiaro dorato / ambrato e sentirsi duro con le unghie. Il taglio del campione e l'uso dell'ultra microtomo richiedono pratica, ma produrranno cifre chiare. Lo spessore e le dimensioni della sezione sono importanti per il test di imaging e immunolocalizzazione. Lo spessore della sezione deve essere mantenuto intorno a 500 nm. Le sezioni troppo sottili si tradurranno in una scarsa colorazione e gli spessori delle sezioni oltre i 700 nm interferiranno con l'acquisizione e la risoluzione dell'immagine. La natura idrofila della resina LR-White consente l'uso diretto delle sezioni nella colorazione e immunolocalizzazione senza rimuovere la resina.
La soluzione di blocco (5% di latte secco non grasso in 1 M PBS) riduce il legame non specifico degli anticorpi. Il latte secco non grasso è stato un'alternativa affidabile alla BSA o ad altri agenti bloccanti più tradizionali ed è significativamente meno costoso. La soluzione di blocco deve essere filtrata attraverso un filtro di carta prima dell'uso, per evitare precipitati che formano aggregati difficili da lavare, trattenere gli anticorpi e compromettere l'esperimento. I rapporti anticorpali proposti e i tempi di incubazione sono stati ottimizzati e applicati con successo a diverse specie in diversistudi 9,11,12,13,14,15,16.
L'evaporazione e l'esposizione alla luce sono due problemi che devono essere evitati durante la procedura di immunolocalizzazione. Una camera di incubazione umida e scura risolve entrambi questi problemi. Un'esercitazione su come creare una camera scura è disponibile nella Figura supplementare 1B-1E. Questo protocollo di immunolocalizzazione richiede l'uso di un anticorpo primario diretto all'epitopo bersaglio senza alcuna etichetta propria e di un anticorpo secondario coniugato con un fluorocromo (FITC) che viene sollevato contro l'anticorpo primario IgG. Questo metodo offre diversi vantaggi rispetto all'uso di un singolo sistema di rilevamento degli anticorpi a causa di un maggiore rigore del rilevamento, poiché l'anticorpo secondario non ha affinità con le specie campione bersaglio. Questo sistema offre un segnale maggiore in quanto le molecole di anticorpo primario possono essere prese di mira da diverse molecole dell'anticorpo secondario, ognuna con un fluorocromo17.
Il decadimento dei fluorocromi per luce intensa, o sbiancamento fotografico, è un problema importante in questa tecnica. Soprattutto quando si esplorano deboli segnali localizzati, il segnale potrebbe perdersi irreversibilmente prima dell'imaging. Il mezzo di montaggio aumenta notevolmente la stabilità e la durata dei fluorocromi18; tuttavia, è altamente consigliabile testare il supporto di montaggio, poiché alcuni possono reagire con la macchia e / o il fluorocromo, formando precipitati e sfocando l'immagine. La configurazione del sistema ottico utilizzato per osservare e registrare l'immunolocalizzazione è uno degli aspetti più importanti per il successo di questo esperimento. A causa dello spessore ridotto delle sezioni, i vantaggi dell'utilizzo del microscopio confocale sono limitati. La configurazione di maggior successo richiede un microscopio a epifluorescenza verticale convenzionale dotato di una sorgente luminosa fluorescente, LED o lampadina amercurio 19,con adeguati obiettivi di grado di fluorescenza. Sono richiesti anche filtri luce di buona qualità impostati per l'eccitazione/emissione (nm) 358/461 per i raggi UV e 485/530 per FITC. Per l'acquisizione di immagini a fluorescenza, le fotocamere digitali monocromatiche refrigerate sono consigliate a causa della loro alta velocità e sensibilità, ma sacrificano le vere informazioni sulcolore 20. Le telecamere policromatiche offrono la possibilità di ordinare facilmente il segnale dalla fluorescenza di fondo, ma sono più lente e molto meno sensibili delle loro controparti monocromatiche.
Il metodo è limitato dalla disponibilità di anticorpi specifici. Nonostante la disponibilità di una vasta ed in espansione raccolta di anticorpi rivolti alle piante epitopi, comprensibilmente non tutti i composti vegetali sono ancora coperti. Anche i lipidi tendono ad essere estratti con il metodo di incorporamento descritto e quindi non sono raccomandati per tessuti ad alto contenuto di olio. La sezione Cryostat può essere un'alternativa, nonostante sacrifici la risoluzione dell'immagine. La temperatura della polimerizzazione della resina LR-White può in alcuni casi alterare epitopi più sensibili. Se l'epitopo target è sensibile alla temperatura, cambiare LR-White per resina LR-Gold. Polimerizzando a -25 °C sotto luce bianca, LR-Gold offre un'eccellente conservazione degli epitopi termosensibili, ma richiederà l'acquisizione di un apparato polimerizzatore specializzato ed è leggermente più tossico di LR-White.
Questo metodo è stato utilizzato in un'ampia gamma di specie e tessuti. Consente un rapido accesso a informazioni affidabili sulla distribuzione specifica degli epitopi. Offrire dati di supporto per modelli evolutivi e identificare marcatori e adattamenti specifici in cellule e tessuti, fornendo al contempo risultati visivamente allettanti. L'uso di anticorpi coniugati con fluorocromi su perossidasi o alternative di coniugazione della fosfatasi alcalina10, richiede meno tempo, significativamente meno soggetto a artefatti di reazione eccessiva e fornisce una chiara risoluzione subcellulare difficile da abbinare a qualsiasi altra tecnica. L'uso di anticorpi specifici per i polimeri correlati alla parete cellulare consente una visione della disposizione dei composti in domini molto restrittivi. Tale risoluzione sarebbe difficile da ottenere dagli strumenti biochimici tradizionali. Il set in continua espansione di anticorpi primari disponibili offre nuove e costanti opportunità di scoperta nel funzionamento interno delle cellule vegetali.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Gli autori hanno ricevuto il sostegno del progetto ue 690946 "SexSeed" (Sexual Plant Reproduction – Seed Formation) finanziato da H2020-MSCA-RISE-2015 e SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017. AMP ha ricevuto una sovvenzione dal progetto MSCA-IF-2016 dell'Unione Europea (n. 753328). MC ha ricevuto una sovvenzione dalla borsa di dottorato FCT SFRH/BD/111781/2015.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25% (w/v) Gluteraldehyde | Agar Scientific | AGR1010 | aq. Solution, methanol free |
| 8 wells Glass reaction slides | Marinfeld | MARI1216750 | other brands may be used |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produced in GOAT | Sigma-Aldrich | F6258 | |
| cover slips, 24 mm x 50 mm | Marinfeld | MARI0100222 | The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used |
| ddH2O | na | na | |
| Absolute ethanol | na | na | |
| Fluorescent brightner 28 | Sigma-Aldrich | F-6259 | |
| Gelatin capsules | Agar scientific | AGG29211 | The capsule size should fit the size of the sample. |
| Glass vials | na | na | Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be cleaned with 96% ethanol after use to remove LR-White residue and reused. |
| LR-white medium grade, embdeding resin | Agar Scientific | AGR1281 | LR-White comes in several forms; the medium grade provides an adequate cutting support for most tissues, while for harder tissues a harder grade of LR-white may be recommendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please follow the instructions of the supplier to prepare the resin. |
| Non fat dry milk | Nestlé | na | any non fat dry milk is adequate |
| Oven | na | na | generic laboratory oven |
| Petri dish, 10 cm x 10 cm square | na | na | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Rat generated Monoclonal Anti-Body | Plant probes | na | Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1 |
| Razor blades | na | na | regular razor blades |
| SDS | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| Toluidine Blue-O | Agar Scientific | AGR1727 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC7 | |
| Upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters | Leica Mycrosistems | DMLb | |
| Vacuum chamber | na | na | |
| Vacuum pump | na | na | |
| Vectashield | vecta Labs | T-1000 | Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An anti-fade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.) |
References
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