Fluorescerande immunlokalisering av arabinogalaktanproteiner och pectiner i växtvävnadernas cellvägg

Summary

Detta protokoll beskriver i detalj hur växtmaterialet för immunlokalisering av arabinogalaktanproteiner och pectiner är fixerat, inbäddat i ett hydrofilt akrylharts, sektionerat och monterat på glasrutschbanor. Vi visar cellvägg relaterade epitopes kommer att upptäckas med specifika antikroppar.

Abstract

Växtutveckling innebär ständiga justeringar av cellväggens sammansättning och struktur som svar på både inre och yttre stimuli. Cellväggarna består av cellulosa och icke-cellulosapolysackarider tillsammans med proteiner, fenolföreningar och vatten. 90% av cellväggen består av polysackarider (t.ex. pectins) och arabinogalactanproteiner (AGPs). Fluorescerande immunolokalisering av specifika glykan epitoper i växt histologiska sektioner är fortfarande ett viktigt verktyg för att avslöja ombyggnad av vägg polysackarid nätverk, struktur och komponenter.

Här rapporterar vi en optimerad fluorescerande immunolocalization förfarande för att upptäcka glycan epitopes från AGPs och pectins i växtvävnader. Paraformaldehyd/glutaraldehyd fixering användes tillsammans med LR-Vit inbäddning av växtproverna, vilket möjliggör ett bättre bevarande av vävnadsstrukturen och kompositionen. Tunna delar av de inbäddade prover som erhållits med en ultra-microtome användes för immunolocalization med specifika antikroppar. Denna teknik erbjuder bra upplösning, hög specificitet och chansen att upptäcka flera glykanepotoper i samma prov. Denna teknik möjliggör subcellulär lokalisering av glykaner och detekterar deras ackumuleringsnivå i cellväggen. Det tillåter också bestämning av spatio-temporala mönster av AGP och pektin distribution under utvecklingsprocesser. Användningen av detta verktyg kan i slutändan vägleda forskningsriktningar och länka glykaner till specifika funktioner i växter. Dessutom kan den erhållna informationen komplettera biokemiska studier och genuttrycksstudier.

Introduction

Växtcellväggar är komplexa strukturer bestående av polysackarider och glykoproteiner. Cellväggar är extremt dynamiska strukturer vars arkitektur, organisation och sammansättning varierar beroende på celltyp, lokalisering, utvecklingsstadium, yttre och inre stimuli¹. Arabinogalactan proteiner (AGPs) och pectins är viktiga komponenter i växtcellväggen. AGPs är mycket glykosylerade proteiner och pectins är homogalacturonan polysackarider vars sammansättning, mängd och struktur varierar kraftigt under olika växtutvecklingsstadier^2,3,4. AGPs och pektin studier har visat deras engagemang i flera växtprocesser såsom programmerad celldöd, svar på abiotiska påfrestningar, sexuell växtreproduktion, bland många andra⁵. De flesta av dessa studier började med information från immunolokaliseringsstudier.

Med tanke på dess komplexitet kräver studien av cellväggar många olika verktyg. Detektion av glykanepotoper med monoklonala antikroppar (mAbs) är ett värdefullt tillvägagångssätt för att lösa polysackarid och glykoproteinfördelning längs denna struktur. Det finns en stor samling mAbs tillgängliga för att upptäcka glykan epitoper och specificiteten för varje mAb förbättras kontinuerligt samt⁶. Tekniken här beskrivs är tillämplig på alla växtarter och är ett perfekt verktyg för att vägleda framtida forskningsriktningar som kan innebära dyrare och mer komplexa tekniker.

I denna teknik är specifika antikroppar kemiskt konjugerade till fluorescerande färgämnen som FITC (fluorescein isothiocyanate), TRITC (tetramethylrhodamine-5-(och 6)-isothiocyanate) eller flera Alexa Fluor färgämnen. Immunofluorescens erbjuder flera fördelar, vilket möjliggör en tydlig och snabb subcellulär lokalisering av glykaner som kan observeras direkt under ett fluorescensmikroskop. Det är mycket specifikt och känsligt, eftersom beredningen av provet effektivt kan skydda antigenens naturliga struktur, även om det förekommer i lägre mängder. Det gör det möjligt att upptäcka flera antigener i samma prov och viktigast av allt, erbjuder högkvalitativa och visuellt vackra resultat. Trots den stora kraften som erbjuds av fluorescens immunolocalization studier, betraktas de ofta som svåra att utföra och genomföra troligen på grund av bristen på detaljerade protokoll som tillåter visualisering av de olika stegen i förfarandet. Här ger vi några enkla riktlinjer för hur man utför denna teknik och hur man får högkvalitativa bilder.

För protokollet som presenteras här måste proverna först åtgärdas och bäddas in med det lämpligaste fixeringen. Även om betraktas som en tidskrävande och relativt tråkig teknik, korrekt fixering och inbäddning av växtprovet är nyckeln till att säkerställa en framgångsrik immunolocalization analys. För detta ändamål är den vanligaste kemisk fixering med hjälp av korslänkande fixativ, som aldehyder. Korslänkande fixativ upprättar kemiska bindningar mellan vävnadens molekyler, stabiliserar och härdar provet. Formaldehyd och glutaraldehyd är korslänkande fixativ, och ibland används en blandning av båda^{fixativen 7}. Formaldehyd erbjuder stor strukturell bevarande av vävnader och under längre tidsperioder, producerar små vävnadsupprullningar och är kompatibel med immunostaining. Glutaraldehyd är ett starkare och stabilt fixativ som vanligtvis används i kombination med formaldehyd. Användningen av glutaraldehyd har vissa nackdelar som måste beaktas eftersom det introducerar vissa fria aldehydgrupper i den fasta vävnaden, vilket kan generera viss ospecificerad märkning. Även korskopplingen mellan proteiner och andra molekyler kan ibland göra vissa målepotoper otillgängliga för antikropparna. För att undvika detta måste fixeringens kvantitet och varaktighet noggrant definieras.

Efter fixering är proverna inbäddade i rätt harts för att härda innan sektionerna erhålls. London Harts (LR-White) akrylharts är det harts som val för immunolokaliseringsstudier. Till skillnad från andra hartser är LR-White hydrofil, vilket gör att antikropparna kan nå sina antigener, utan att behöva någon behandling för att underlätta det. LR-White har också fördelen att erbjuda låg auto-fluorescens, vilket möjliggör en minskning av bakgrundsljud under immunofluorescensavbildning.

Det finns många färgningstekniker tillgängliga för att upptäcka olika komponenter i cellväggen, såsom alciansk blå färgning, toluidinblå färgning eller periodisk syra-Schiff (PAS) färgning. Ingen av dessa erbjuder kraften i immunolocalization analyser⁸. Detta tillvägagångssätt ger större specificitet vid detektion av glykaner och erbjuder större information om cellväggens sammansättning och struktur.

Protocol

1. Provberedning: fixering, uttorkning och LR-vit inbäddning

1. Fixering och uttorkning
   FIXERINGSPROCESSEN är avgörande för att bevara provet. genom att korsa samman molekyler stoppas cellulär metabolism, vilket säkerställer cellulär integritet och förhindrar molekylär diffusion. Fixeringsmedel och den koncentration som används måste anpassas till detta ändamål, så att antigenerna är tillräckligt exponerade för att interagera med antikropparna. Följande protokoll kombinerar den milda fixativa förmågan hos paraformaldehyd, med den starkare effekten av glutaraldehyd. Deras proportioner optimerades för AGPs och cellväggskomponenter, men det är lämpligt för andra proteiner och cellstrukturer. Den efterföljande uttorkningsprocessen förbereder proverna för LR-vit inbäddning. Växtvävnader från flera växtarter användes i detta experiment. Quercus suber prover samlades in från träd som odlats på fältet. Trithuria submersa prover delades vänligt med oss av Paula Rudall (Kew Gardens, London, Storbritannien).
   1. Så alla Arabidopsis växter direkt på jorden och växa i en inomhus tillväxtanläggning med 60% relativ fuktighet och en dag / natt cykel av 16 h ljus vid 21 °C och 8 h mörker vid 18 °C. Välj de växtvävnader som ska analyseras och trimma proverna så att de inte är större än 16 mm^2.
   2. Överför omedelbart provet till en glasflaska som tidigare fyllts med tillräckligt med kall fixativ lösning (2% formaldehyd (w/v), 2,5% glutaraldehyd (w/v), 25 mM PIPES pH 7 och 0,001% Tween-20 (v/v)) för att helt minska proverna (Figur 1A).
      VARNING: Formaldehyd och glutaraldehyd är båda fixativa medel som kan vara skadliga vid inandning och kontakt. Utför fixeringssteget på en rökhuv och använd lämpliga skyddskläder och nitrilhandskar. Alla lösningar från detta steg och framåt, inklusive alkoholserier fram till 70%, bör lagras för senare sanering av specialiserad personal.
   3. När du har samlat alla prover uppdaterar du fixeringen.
   4. Överför injektionsflaskan till en vakuumkammare och applicera långsamt vakuum. När det når -60 kPa börjar det flytande materialet sjunka till botten av injektionsflaskan (figur 1B).
   5. Förvaras under ett vakuum på högst -80 kPa i 2 timmar vid rumstemperatur.
   6. Släpp långsamt vakuumet, försegla glasflaskan och placera över natten vid 4 °C.
   7. Kassera alla prover som inte sjönk under fixeringen över natten. Tvätta de återstående proverna med 25 mM PBS pH 7 i 10 min, följt av en 20 minuters tvätt i 25 mM RÖRbuffert pH 7.2.
   8. Dehydrera proverna i en etanolserie (25%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90% och 3x 100% etanol) i 20 min vardera. Överför omedelbart de uttorkade proverna till märkta glasflaskor för inbäddning (figur 1C).
      OBS: Uttorkningsprocessen kan pausas vid 70% etanolsteg.
2. Inbäddning av LR-vitt harts
   OBS: LR-vit är ett icke-hydrofobt akrylharts med låg viskositet, vilket gör det idealiskt för genomträngande vävnader med många tjocka cellväggar. LR-White finns också i flera hårdhetsgrader som är kompatibla för att skära de flesta växtprover. Se till att det använda hartset redan är blandat med rätt katalysator eller följ leverantörens instruktioner för att förbereda hartset. Följande inbäddningsprocess är långsam men resultaten motiverar i hög grad medlen.
   1. Granska proverna genom att inkubera med LR-vitt harts i en serie halvmånekoncentration av harts (1:3, 2:3, 1:1, 3:2, 3:1, 1:0) i etanol och inkubera i 24 timmar vid 4 °C i varje steg.
      VARNING: LR-Vitt harts är ett akrylharts med låg toxicitet; Det kan dock vara irriterande för huden genom kontakt och inandning. Att arbeta i ett välventilerat område eller under en rökhuv med lämpligt skyddsslitage och nitrilhandskar rekommenderas starkt.
   2. Uppdatera det LR-vita hartset och inkubera i ytterligare 12 timmar vid 4 °C.
   3. Förbered lämpliga inbäddningsgelatiner (storlek 1 (0,5 ml) för prover upp till 3 mm, 2 x 0,37 ml för prover upp till 5 mm eller 3 x 0,3 ml för prover upp till 8 mm och papperstaggar (figur 1D).
      OBS: Välj kapselns storlek för att vara något större än provet, så att provet kan vara helt inneslutet i hartset. Kom också ihåg att märka taggarna med en penna, eftersom penna eller tryckta bläck kommer att förorena hartset och förstöra provet.
   4. Applicera en droppe färskt LR-vitt harts på botten av varje kapsel.
   5. Placera ett prov i varje gelatinkapsel och fyll till maximal kapacitet med färskt harts. Placera kapsellocket och tryck försiktigt för att bilda en hermetisk tätning (Figur 1E).
   6. Polymerisera hartset i 24 till 48 timmar vid 58 °C, eller tills det är helt härdat.
   7. Förvara prover i rumstemperatur.
      OBS: Postpolymerisering LR-vitt harts är inert.

2. Skjut förberedelsen

OBS: Glasrutschbanorna måste vara rena, fria från damm, fett eller andra föroreningar. Även nya diabilder måste rengöras eftersom vissa leverantörer använder oljor och tvättmedel för att förhindra att rutschkanorna fastnar ihop. Eventuellt fett eller rengöringsmedel kommer att störa sektionens vidhäftning till glidningen, även om det behandlas med poly-L-lysin. Ludd och damm kommer att påverka provets observationer och eventuellt förstöra experimentet. Teflonbelagda diabilder med reaktionsbrunnar är perfekta för denna uppgift. De är prisvärda, återanvändbara och minskar drastiskt mängden antikroppslösning som behövs. Med korrekt rengöring kan utmärkt kvalitet fluorescerande immunlokalisering utföras till en mycket överkomlig kostnad.

1. Rutschkana tvätt
   1. Placera bilderna i ett färgställ och täck med rengöringslösning (0,1% SDS (w/v), 1% ättiksyra (v/v), 10% etanol (v/v)).
   2. Håll en mild agitation i 20 min.
   3. Överför färgställningarna till ett ddH₂O-bad med mild agitation i 10 min. Upprepa 4 gånger.
   4. Töm försiktigt racken innan du doppar kort i 100% etanol och låt rutschkanorna torka i en dammfri miljö.
   5. Förvara tills den används.
2. Poly-L-lysinbeläggning (tillval)
   OBS: Små sektioner håller vanligtvis mycket bra för att rengöra glasrutschbanor. Det här steget rekommenderas endast för större sektioner (>2 mm²). Större sektioner tenderar att vika och rynka, och är inte tillrådliga. Använd dock vid behov reaktionsbilder med större hål. Rengör dem enligt ovan och fortsätt enligt följande.
   1. Placera rena diabilder i en fyrkantig Petri-skål. Pipett 0,001% poly-L-lysinlösning (w/v) för att täcka hålen i diabilderna, utan att överflöda.
   2. Låt rutschkanorna torka över natten vid 40 °C i slutna petriskålar.
      OBS: De belagda rutschkanorna är klara för omedelbar användning och kan förvaras i en dammfri miljö vid rumstemperatur i flera månader.

3. Provklippning och sektionering

1. Provklippning
   1. Med ett vasst rakblad, trimma de LR-vita blocken under ett stereomikroskop för att bilda en pyramidformad struktur där toppen är vinkelrät mot provets intresseområde (Kompletterande figur 1A).
      OBS: Ultramikrotomprovhållaren är ett utmärkt verktyg för att säkra blocket. Om enheten inte har en universell provhållare, använd den som passar bäst för runda block.
   2. Trimma pyramidstrukturen genom att ta bort fina skivor av överskottshartset vinkelrätt mot pyramidens huvudaxel.
   3. Fortsätt tills provet har uppnåtts som bildar skärytan. Inom skärytan bör målprovet helst omges i trapetsform.
      OBS: Hartsblocket kan trimmas ytterligare i slitsvinkel för att minska sektionens yta med ett vasst blad (Figur 1F).
2. Halvtunn sektionering
   OBS: En mikrotom med glasknivar kommer att användas. Antikroppens förmåga att binda till epitopen kommer att villkora immunolabelingreaktionens framgång. Den hydrofila karaktären hos LR-white hartset möjliggör god kontakt mellan antikropparna och provsektionerna. Tunnare sektioner kommer att presentera svagare Calcofluor-färgning som kommer att användas för att hitta sektionerna och hjälpa till med avbildningsprocessen. Detsamma gäller för andra fläckar som senare kan appliceras. Även överdriven tjocklek kommer att påverka bildförvärvskvaliteten. En bra kompromiss för sektionstjocklek kan hittas mellan 200 och 700 nm, beroende på vävnadsegenskaperna. Montera blocken tätt på provhållaren på ultramikrotomen.
   1. Med en ultramikrotom, gör sektioner med en tjocklek mellan 200 och 700 nm (Figur 1G).
   2. Kontrollera sektionsområdet genom att överföra några sektioner till en ddH₂O-droppe på en glasrutschbana. Placera rutschkanan på en 50 °C varmplatta tills vatten avdunstar. Fläck som placerar en droppe på 1% ToluidinBlå O (w/v) i 1% borsyralösning (w/v) över sektionerna i 30 s. Skölj och observera under mikroskopet.
   3. När du hittar önskad struktur, överför en eller två sektioner till varje droppe ddH₂O som tidigare placerats på varje brunn i en ren reaktionsbild.
   4. Placera varje bild i en sluten ren 10 cm fyrkantig petriskål och låt den torka vid 50 °C.
   5. Lagra bilder i en ren arkivlåda tills de används.

4. Immunlokalisering

OBS: Fluorescerande immunolocalization förfarandet är beroende av sekventiell användning av två antikroppar. Den primära antikroppen höjs mot ett specifikt målantigen. Den sekundära antikroppen höjs specifikt mot den primära antikroppen och för fluorescerande tekniker konjugeras till en fluorofor (FITC i detta specifika protokoll). Den primära antikroppen kommer att användas för att upptäcka målantigenet i provet, och den sekundära antikroppen kommer att användas för att markera den plats där den primära antikroppen som är ansluten till provet efter att ha tvättat bort överskottet av primär antikropp. Kontroller är en viktig del av denna analys och måste alltid utföras för att säkerställa observationerna. En brunn på bilden bör reserveras för användning som en negativ kontroll, där den primära antikroppsbehandlingen kommer att hoppas över, och därför bör ingen signal observeras i slutet av experimentet. En positiv kontroll måste ingå i försöket genom att man behandlar en brunn med en antikropp som märkningen redan är känd och säker på. Den positiva kontrollen används för att bekräfta den sekundära antikroppsmärkningens effektivitet och reaktionsförhållanden medan den negativa kontrollen testar den sekundära antikroppsspecifikiteten.

1. Förbered en inkubationskammare genom att placera några dämpade pappershanddukar längst ner i en pipettspetslåda och slå in den med tennfolie(kompletterande figur 1B-1E). Placera diabilderna i inkubationskammaren.
2. Pipett en 50 μL droppe per 8 mm blockeringslösning (5% fettfri torrmjölk (w/v) i 1 M PBS) och inkubera i 10 min. Ta bort blockeringslösningen och tvätta alla brunnar två gånger med PBS i 10 min.
3. Förbered de primära antikroppslösningarna (se kompletterande tabell 1),1:5 (v/v) antikropp vid blockering av lösningen; göra en uppskattning på ca 40 μL per 8 mm brunn.
   OBS: Antikroppens koncentration måste justeras enligt tillverkningsprotokollet.
4. Utför en sluttvätt med ddH₂O i 5 min, låt aldrig brunnarna torka helt.
5. Pipett den primära antikroppslösningen på reaktionsbrunnarna. Pipettblockeringslösning till styrbrunnarna.
6. Stäng inkubationskammaren och låt stå i 2 timmar vid rumstemperatur följt av över natten vid 4 °C. Förbered den sekundära antikroppslösningen, 1% i blockeringslösning (v/v) ca 40 μL per brunn. Håll den täckt med tennfolie.
7. Tvätta alla brunnar två gånger med PBS i 10 min, följt av 10 extra minuter med ddH₂O. Se till att inga spår av blockeringslösningen eller avlagringarna syns på brunnarna.
8. Pipett den sekundära antikroppslösningen till alla brunnar. Från och med nu skyddar du bilderna från ljus.
9. Inkubera i 3-4 timmar i mörker vid rumstemperatur.
10. Tvätta alla brunnar två gånger i 10 min med PBS följt av en annan tvätt på 10 min med ddH₂O.
11. Applicera en droppe calcofluor (1:10,000 (w/v) fluorescerande ljusare 28 i PBS) på varje brunn. Utan tvättning, applicera en droppe monteringsmedium (se Materialförteckningen)på varje brunn och placera ett täckskydd (Figur 1H).
12. Observera med ett fluorescensmikroskop, utrustat med linsen 10x/0,45, 20x/0,75, 40x/0,95 respektive 100x/1,40, använd UV (för kalkofluorfläck) och FITC-filter för att upptäcka cellvägg respektive immunlokalisering (figur 1I). Använd följande våglängder: excitation/emission (nm) 358/461 för UV och 485/530 för FITC.
13. För en bättre visualisering av resultaten överlappar båda bilderna med ImageJ eller liknande.

Representative Results

I ett framgångsrikt experiment kommer den sekundära antikroppen specifikt att fastställa platsen för den specifika epitopen i ljusgrönt, på ett konsekvent sätt, vilket möjliggör karakterisering av cellväggens sammansättning på ett visst utvecklingsstadium av cellen, vävnaden eller organet. Till exempel har LM6-antikroppen en hög affinitet för 1,5-arabinan, en förening med typ-I rhamnogalacturonan som finns rikligt med en märkning av cellväggen i den utvecklande Quercus-underkäke längre (Figur 2A), vilket gör det möjligt att dra slutsatsen att denna typ av pektin är riklig och en del av den primära cellväggens sammansättning. JIM5 har affinitet för homogalacturonans knappt förestrifierade som vanligtvis finns vid rotspetsen av Quercus suber embryo, med angivande av organets mekaniska egenskaper (Figur 2B). Xylogalacturonan är en typ av pektin rik på xylos i samband med cellvägg lossning, de finns i degenererande celler. Antikroppen LM8 känner särskilt igen xylogalacturonans, i mogna organ kan den användas för att upptäcka degenererande celler eller vävnader, som frödospermcellerna under de sista stadierna av Quercus suber ekollon mognad (Figur 2C).

JIM13 har affinitet för AGPs som finns på strukturer relaterade till reproduktion, cellinjer relaterade till mikrogametogenesis i Arabidopsis thaliana (Figur 2D). JIM8 känner också igen epitoper av AGPs som finns i celler och organ relaterade till reproduktion som stigmatisk papillae och mikropyle av Basal Angiosperm Trithuria submersa (Figur 2E-2F). Båda antikropparna har föreslagits vara molekylära markörer för gametophytic cellinjer i växter⁹.

Vanliga misstag i detta protokoll är normalt lätta att upptäcka och identifiera. När tvättarna hoppas över eller reaktionsbrunnarna låt torka, visas den sekundära antikroppen vanligtvis som ett ospecificerat utstryk som täcker urskillningslöst över celler, vävnader, harts och glid (Figur 3A). Aggregat av grön fluorokrom bildas om den obundna primära antikroppen inte har tvättats bort ordentligt (figur 3B). En annan vanlig orsak till att denna teknik misslyckas är relaterad till vikningen och/eller lösgöringen av avsnitten (figur 3C), vilket gör experimentet värdelöst. Detta problem är vanligtvis relaterat till antingen dålig vidhäftning av avsnitten till bilderna, förmodligen på grund av användning av orena bilder och / eller aggressiv tvättning.

Provberedningen är också ett kritiskt steg i denna procedur. Lyckligtvis är de vanligaste fixerings- och inbäddningsproblemen lätta att upptäcka (figur 3D). Om allt går bra kommer hartsblocket att vara fritt från sprickor och provet kommer att vara tydligt synligt med en blekgul till ljusbrun färg (Figur 3D-1). Prover som är ineffektivt inbäddade visar pudriska vita fläckar eller områden (figur 3D-2). Att hålla provstorleken under 8 mm är viktigt för att garantera att den fixativa lösningen penetrerades. När proverna är dåligt fixerade kommer de att verka mörkbruna nästan svarta (Bild 3D-3). Även polymerisationstemperaturen är viktig för både bevarandet av epitoperna och korrekt härdning av hartset. En överdriven temperatur kan leda till att hartset spricker, vilket gör det omöjligt att dela upp provet (figur 3D-4).

Figur 1. Översikt över hela protokollet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 2: Typiska resultat av AGPs och Pectin immunolocalization i växtprover. A)LM6 märkning av arabinan moiety av pectins i en Quercus suber anther i meios I. (B) Specifik märkning av låg metylesterifierade pectins i en Quercus suber embryorotspets av JIM5. Xylogalacturonan märkt av LM8 i den avstående frövitan av en Quercus-suber som mognar ekollon. D)JIM13-märkning av AGP i tapetum och tetrads av en Arabidopsis thaliana anther. e)AGPs märkta av JIM8 i den stigmatiska papillaen av Trithuria submersa. (F) JIM8 märkning AGPs vid mikropyle (vit pil) av en Trithuria submersa ägglossning. Meiotisk mikrospor (Mc), Tapetum (Tp), Root (R), Root tip (Rt), Testa (Ts), Endosperm (Ed), Embryo (Em), Epidermis (Ep), Stigmatic papillae (SP), Ovule (OV). Skalstänger: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Vanliga misstag och problem under protokollet. a)Fel på tvättstegen identifieras genom förekomst av ospecificerat utstryk av sekundär antikropp (₊) över provharts. B)Det dåliga specificitets- eller tvättfelet hos den primära antikroppen resulterar i bildandet av FITC-aggregat (+) som inte är bundna till en viss plats. (C) Veck och sektionsavlossning är ofta resultatet av aggressiv tvätt och orena diabilder. (D) Exempel på provfixering och inbäddning. (1) perfekt provstorlek och inbäddning, (2) inbäddningsfel, (3) fel på provfixering, (4) hartshärdningsfel. FITC-märkt antikropp (grön) och Calcofluor-vit fläck (blå). Skalstänger: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande figur 1. A)Schematisk representation av blockklippningssekvensen för beredning av provet (gult block) för sektionering med ultramicrotome. För det första avlägsnas gelatinkapseln (1). Därefter trimmas de först i en 40° till 45° vinkel mot sidorna av kapseln tangentiellt till provet (2), ett andra snitt görs vid 90° av den första (3) följt av en tredje (4) och fjärde enligt samma regel (5). Från denna första fas av trimning resulterar en pyramidformad struktur som toppen ligger ovanför provet. Slutligen rakas toppen med ett vasst blad av vinkelrätt mot hartsblockens huvudaxel för att nå det inbäddade provet. En kvadratisk eller trapetsformad yta bör erhållas i slutet av proceduren (6). B)Nödvändiga förnödenheter för att göra en inkubationskammare. tennfolie (1), dubbelsidig silvertejp (2), pappershanddukar (3) och en pipettspetslåda. (C) Första steget, tennfolien är fastsatt på lådan med den dubbelsidiga silvertejpen. (D) Andra steget tas pipettspetshållaren bort för att placera pappershanddukar längst ner i lådan. (E) Tredje steget, pappershanddukarna fuktas med vatten och pipettspetshållaren placeras tillbaka för att fungera har en bricka för bilderna. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell 1: Förteckning över användbara monoklonala antikroppar. Tabellen ovan är ett exempel på tillgängliga antikroppar, med information om deras mål och var de kan köpas. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Den fluorescerande immunolocalization metoden i växter här beskrivs, medan sömlöst okomplicerad, förlitar sig på framgången för flera små steg. Den första är provberedning och fixering. Under detta första steg används en blandning av formaldehyd och glutaraldehyd för att korsa huvuddelen av cellkomponenterna. Formaldehyden i lösningen ger en mild och reversibel fixering medan glutaraldehyden ger en stark mer permanent länkning; Balansen mellan de två fixativen ger lämplig mängd korslänkning, vilket gör det möjligt för epitoperna att reagera med den primära antikroppen¹⁰. För att fixeringslösningen ska fungera korrekt måste provet vara litet. Stora strukturer mer än 7 mm i diameter är mycket svåra att fixa och bör klippas för att säkerställa fixativ penetration.

Efter sår eller stress utsöndrar vissa växter stora mängder tanniner som bildar mörka fällningar som kan reagera med formaldehyden som stör fixeringsprocessen. Att hålla proverna på is och byta ut fixeringslösningen när det blir grumligt bidrar till att minska denna effekt. Luft kan också störa fixeringsprocessen och senare i inbäddning och härdning av hartset. Den föreslagna vakuumbehandlingen bör ta bort det mesta av luften. För särskilt luftiga vävnader kan vakuumsteget förlängas längre än 2 timmar tills ingen mer luft kommer ut ur proverna och de sjunker till botten. Alla prover som hittas flytande efter det fixativa steget över natten bör kasseras. Hartsinbäddning ger stöd för att skära det konserverade provet, och dess hårdhet bör vara ungefärlig till de inbäddade^{vävnaderna 10}. LR-White finns i tre hårdhetsgrader: svårt för träiga kraftigt sklerosifierade vävnader, medelkvalitet för de allra flesta vävnader från löv till pollenkorn och mjuk kvalitet för mer känsliga vävnader. För en perfekt inbäddning måste hartset helt tränga in i provet; Detta erhålls bättre med en långsam och gradvis infiltration. Vid tidigare tester kan kortare inkubationstider användas. Gelatinkapslarna är både små och hermetiskt förseglingsbara, vilket gör dem perfekta för LR-vit hartshärdning. För storlek 2 (0,37 ml) ska härdningen vara klar efter 24 timmar vid 58 °C. För andra kapselstorlekar bör härdningstiden justeras. LR-White härdat harts bör gå från nästan färglöst till en ljus gyllene / bärnstensfärgad färg och kännas svårt för naglarna. Provklippning och användning av ultramikrotomen kräver övning men kommer att ge tydliga siffror. Tjockleken och storleken på sektionen är viktig för avbildnings- och immunlokaliseringsanalysen. Sektionstjockleken ska hållas runt 500 nm. Sektioner som är för tunna kommer att resultera i dålig färgning och sektionstjocklekar över 700 nm kommer att störa bildförvärvet och upplösningen. Den hydrofila karaktären hos LR-vitt harts möjliggör direkt användning av sektionerna vid färgning och immunlokalisering utan att ta bort hartset.

Blockeringslösningen (5% fettfri torrmjölk i 1 M PBS) minskar ospecificerad bindning av antikroppar. Nonfat torr mjölk har varit ett pålitligt alternativ till BSA eller andra mer traditionella blockeringsmedel, och är betydligt billigare. Blockeringslösningen måste filtreras genom ett pappersfilter före användning, för att undvika fällningar som bildar svårtvättade aggregat, behåller antikroppar och äventyrar experimentet. De föreslagna antikroppskvoterna och inkubationstiderna har optimerats och framgångsrikt tillämpats på olika arter i flera^{studier 9,11,12,13,14,15,16}.

Avdunstning och utläggning till ljus är två frågor som måste undvikas under immunolocalization förfarandet. En fuktig och mörk inkubationskammare löser båda dessa problem. En handledning om hur man gör en mörk kammare finns i kompletterande figur 1B-1E. Detta immunolocalization protokoll kräver användning av en primär antikropp riktad till mål epitopen utan egen etikett, och en sekundär antikropp konjugeras till en fluorokrom (FITC) som höjs mot den primära antikroppen IgG. Denna metod erbjuder flera fördelar jämfört med användningen av ett enda antikroppsdetekteringssystem på grund av en ökad stringens av detektionen, eftersom den sekundära antikroppen inte har någon affinitet till målprovsarten. Detta system erbjuder ökad signal eftersom de primära antikroppsmolekylerna kan vara riktade mot flera molekyler av den sekundära antikroppen, var och en med en fluorokrom¹⁷.

Förfallet av fluorokromer genom intensivt ljus, eller fotoblekning, är en viktig fråga i denna teknik. Speciellt när man utforskar för svaga lokaliserade signaler kan signalen bli oåterkalleligt förlorad före avbildning. Monteringsmediet ökar kraftigt stabiliteten och livslängden hos fluorokromerna¹⁸; Det är dock mycket tillrådligt att testa monteringsmediet, eftersom vissa kan reagera med fläcken och/ eller fluorokromen, bilda fällningar och sudda ut bilden. Konfigurationen av det optiska systemet som används för att observera och registrera immunlokaliseringen är en av de viktigaste aspekterna för att detta experiment ska lyckas. På grund av sektionens reducerade tjocklek är fördelarna med att använda det konfokala mikroskopet begränsade. Den mest framgångsrika installationen kräver ett konventionellt upprätt epifluorescensmikroskop utrustat med en fluorescerande ljuskälla, LED eller kvicksilverlampa¹⁹, med tillräckliga mål av fluorescenskvalitet. Även ljusfilter av god kvalitet inställda för excitation/emission (nm) 358/461 för UV och 485/530 för FITC krävs. För fluorescensbildförvärvet rekommenderas kylda monokromatiska digitalkameror på grund av deras höga hastighet och känslighet, men offrar sann färginformation²⁰. Polykromatiska kameror ger möjlighet att enkelt sortera ut signal från bakgrundsfluorescens men är långsammare och mycket mindre känsliga än sina monokromatiska motsvarigheter.

Metoden begränsas av tillgången på specifika antikroppar. Trots tillgången till en stor och expanderande samling antikroppar riktade mot växter epitoper, förståeligt nog inte alla växtföreningar är ännu täckta. Även lipider tenderar att extraheras med den beskrivna inbäddningsmetoden och rekommenderas därför inte för vävnader med hög oljehalt. Cryostat-avsnittet kan vara ett alternativ, trots att bildupplösning offrats. Temperaturen på LR-Vit hartspolymerisering kan i vissa fall förändra känsligare epitoper. Om målepotopen är temperaturkänslig, byt LR-White mot LR-Guldharts. Polymerisation vid -25 °C under vitt ljus erbjuder LR-Gold ett utmärkt bevarande av de termokänsliga epitoperna, men kommer att kräva förvärv av en specialiserad polymerisationsapparat och är något giftigare än LR-White.

Denna metod har använts i ett brett spektrum av arter och vävnader. Det ger snabb tillgång till tillförlitlig information om specifik epitopfördelning. Erbjuda stödjande data för evolutionära modeller och identifiera markörer och specifika anpassningar i celler och vävnader samtidigt som de ger visuellt lockande resultat. Användningen av antikroppar konjugerade med fluorokromer över peroxidas eller alkalisk fosfatas konjugation^{alternativ 10}, är mindre tidskrävande, betydligt mindre benägna att överreaktion artefakter och ger en tydlig subcellulär upplösning svårt att matcha med någon annan teknik. Användningen av antikroppar som är specifika för cellväggsrelaterade polymerer ger en inblick i arrangemanget av föreningar till mycket begränsade domäner. En sådan resolution skulle vara utmanande att få från traditionella biokemiska verktyg. Den ständigt växande uppsättningen primära antikroppar som finns tillgängliga erbjuder ständiga nya upptäcktsmöjligheter i växtcellens inre arbete.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25% (w/v) Gluteraldehyde	Agar Scientific	AGR1010	aq. Solution, methanol free
8 wells Glass reaction slides	Marinfeld	MARI1216750	other brands may be used
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produced in GOAT	Sigma-Aldrich	F6258
cover slips, 24 mm x 50 mm	Marinfeld	MARI0100222	The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used
ddH2O	na	na
Absolute ethanol	na	na
Fluorescent brightner 28	Sigma-Aldrich	F-6259
Gelatin capsules	Agar scientific	AGG29211	The capsule size should fit the size of the sample.
Glass vials	na	na	Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be cleaned with 96% ethanol after use to remove LR-White residue and reused.
LR-white medium grade, embdeding resin	Agar Scientific	AGR1281	LR-White comes in several forms; the medium grade provides an adequate cutting support for most tissues, while for harder tissues a harder grade of LR-white may be recommendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please follow the instructions of the supplier to prepare the resin.
Non fat dry milk	Nestlé	na	any non fat dry milk is adequate
Oven	na	na	generic laboratory oven
Petri dish, 10 cm x 10 cm square	na	na
PIPES	Sigma Aldrich	P1851
Rat generated Monoclonal Anti-Body	Plant probes	na	Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1
Razor blades	na	na	regular razor blades
SDS	Sigma-Aldrich	L6026
Toluidine Blue-O	Agar Scientific	AGR1727
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC7
Upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters	Leica Mycrosistems	DMLb
Vacuum chamber	na	na
Vacuum pump	na	na
Vectashield	vecta Labs	T-1000	Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An anti-fade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.)