Detta protokoll beskriver i detalj hur växtmaterialet för immunlokalisering av arabinogalaktanproteiner och pectiner är fixerat, inbäddat i ett hydrofilt akrylharts, sektionerat och monterat på glasrutschbanor. Vi visar cellvägg relaterade epitopes kommer att upptäckas med specifika antikroppar.
Växtutveckling innebär ständiga justeringar av cellväggens sammansättning och struktur som svar på både inre och yttre stimuli. Cellväggarna består av cellulosa och icke-cellulosapolysackarider tillsammans med proteiner, fenolföreningar och vatten. 90% av cellväggen består av polysackarider (t.ex. pectins) och arabinogalactanproteiner (AGPs). Fluorescerande immunolokalisering av specifika glykan epitoper i växt histologiska sektioner är fortfarande ett viktigt verktyg för att avslöja ombyggnad av vägg polysackarid nätverk, struktur och komponenter.
Här rapporterar vi en optimerad fluorescerande immunolocalization förfarande för att upptäcka glycan epitopes från AGPs och pectins i växtvävnader. Paraformaldehyd/glutaraldehyd fixering användes tillsammans med LR-Vit inbäddning av växtproverna, vilket möjliggör ett bättre bevarande av vävnadsstrukturen och kompositionen. Tunna delar av de inbäddade prover som erhållits med en ultra-microtome användes för immunolocalization med specifika antikroppar. Denna teknik erbjuder bra upplösning, hög specificitet och chansen att upptäcka flera glykanepotoper i samma prov. Denna teknik möjliggör subcellulär lokalisering av glykaner och detekterar deras ackumuleringsnivå i cellväggen. Det tillåter också bestämning av spatio-temporala mönster av AGP och pektin distribution under utvecklingsprocesser. Användningen av detta verktyg kan i slutändan vägleda forskningsriktningar och länka glykaner till specifika funktioner i växter. Dessutom kan den erhållna informationen komplettera biokemiska studier och genuttrycksstudier.
Växtcellväggar är komplexa strukturer bestående av polysackarider och glykoproteiner. Cellväggar är extremt dynamiska strukturer vars arkitektur, organisation och sammansättning varierar beroende på celltyp, lokalisering, utvecklingsstadium, yttre och inre stimuli1. Arabinogalactan proteiner (AGPs) och pectins är viktiga komponenter i växtcellväggen. AGPs är mycket glykosylerade proteiner och pectins är homogalacturonan polysackarider vars sammansättning, mängd och struktur varierar kraftigt under olika växtutvecklingsstadier2,3,4. AGPs och pektin studier har visat deras engagemang i flera växtprocesser såsom programmerad celldöd, svar på abiotiska påfrestningar, sexuell växtreproduktion, bland många andra5. De flesta av dessa studier började med information från immunolokaliseringsstudier.
Med tanke på dess komplexitet kräver studien av cellväggar många olika verktyg. Detektion av glykanepotoper med monoklonala antikroppar (mAbs) är ett värdefullt tillvägagångssätt för att lösa polysackarid och glykoproteinfördelning längs denna struktur. Det finns en stor samling mAbs tillgängliga för att upptäcka glykan epitoper och specificiteten för varje mAb förbättras kontinuerligt samt6. Tekniken här beskrivs är tillämplig på alla växtarter och är ett perfekt verktyg för att vägleda framtida forskningsriktningar som kan innebära dyrare och mer komplexa tekniker.
I denna teknik är specifika antikroppar kemiskt konjugerade till fluorescerande färgämnen som FITC (fluorescein isothiocyanate), TRITC (tetramethylrhodamine-5-(och 6)-isothiocyanate) eller flera Alexa Fluor färgämnen. Immunofluorescens erbjuder flera fördelar, vilket möjliggör en tydlig och snabb subcellulär lokalisering av glykaner som kan observeras direkt under ett fluorescensmikroskop. Det är mycket specifikt och känsligt, eftersom beredningen av provet effektivt kan skydda antigenens naturliga struktur, även om det förekommer i lägre mängder. Det gör det möjligt att upptäcka flera antigener i samma prov och viktigast av allt, erbjuder högkvalitativa och visuellt vackra resultat. Trots den stora kraften som erbjuds av fluorescens immunolocalization studier, betraktas de ofta som svåra att utföra och genomföra troligen på grund av bristen på detaljerade protokoll som tillåter visualisering av de olika stegen i förfarandet. Här ger vi några enkla riktlinjer för hur man utför denna teknik och hur man får högkvalitativa bilder.
För protokollet som presenteras här måste proverna först åtgärdas och bäddas in med det lämpligaste fixeringen. Även om betraktas som en tidskrävande och relativt tråkig teknik, korrekt fixering och inbäddning av växtprovet är nyckeln till att säkerställa en framgångsrik immunolocalization analys. För detta ändamål är den vanligaste kemisk fixering med hjälp av korslänkande fixativ, som aldehyder. Korslänkande fixativ upprättar kemiska bindningar mellan vävnadens molekyler, stabiliserar och härdar provet. Formaldehyd och glutaraldehyd är korslänkande fixativ, och ibland används en blandning av bådafixativen 7. Formaldehyd erbjuder stor strukturell bevarande av vävnader och under längre tidsperioder, producerar små vävnadsupprullningar och är kompatibel med immunostaining. Glutaraldehyd är ett starkare och stabilt fixativ som vanligtvis används i kombination med formaldehyd. Användningen av glutaraldehyd har vissa nackdelar som måste beaktas eftersom det introducerar vissa fria aldehydgrupper i den fasta vävnaden, vilket kan generera viss ospecificerad märkning. Även korskopplingen mellan proteiner och andra molekyler kan ibland göra vissa målepotoper otillgängliga för antikropparna. För att undvika detta måste fixeringens kvantitet och varaktighet noggrant definieras.
Efter fixering är proverna inbäddade i rätt harts för att härda innan sektionerna erhålls. London Harts (LR-White) akrylharts är det harts som val för immunolokaliseringsstudier. Till skillnad från andra hartser är LR-White hydrofil, vilket gör att antikropparna kan nå sina antigener, utan att behöva någon behandling för att underlätta det. LR-White har också fördelen att erbjuda låg auto-fluorescens, vilket möjliggör en minskning av bakgrundsljud under immunofluorescensavbildning.
Det finns många färgningstekniker tillgängliga för att upptäcka olika komponenter i cellväggen, såsom alciansk blå färgning, toluidinblå färgning eller periodisk syra-Schiff (PAS) färgning. Ingen av dessa erbjuder kraften i immunolocalization analyser8. Detta tillvägagångssätt ger större specificitet vid detektion av glykaner och erbjuder större information om cellväggens sammansättning och struktur.
Den fluorescerande immunolocalization metoden i växter här beskrivs, medan sömlöst okomplicerad, förlitar sig på framgången för flera små steg. Den första är provberedning och fixering. Under detta första steg används en blandning av formaldehyd och glutaraldehyd för att korsa huvuddelen av cellkomponenterna. Formaldehyden i lösningen ger en mild och reversibel fixering medan glutaraldehyden ger en stark mer permanent länkning; Balansen mellan de två fixativen ger lämplig mängd korslänkning, vilket g?…
The authors have nothing to disclose.
Författarna fick stöd från EU-projektet 690946 “SexSeed” (Sexual Plant Reproduction – Seed Formation) finansierat av H2020-MSCA-RISE-2015 och SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017. AMP fick ett bidrag från EU:s MSCA-IF-2016-projekt (nr 753328). MC fick ett bidrag från FCT PhD grant SFRH/BD/111781/2015.
25% (w/v) Gluteraldehyde | Agar Scientific | AGR1010 | aq. Solution, methanol free |
8 wells Glass reaction slides | Marinfeld | MARI1216750 | other brands may be used |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT | Sigma-Aldrich | F6258 | |
cover slips, 24 mm x 50 mm | Marinfeld | MARI0100222 | The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used |
ddH2O | na | na | |
Ethanol absolute | na | na | |
Fluorescent brightner 28 | Sigma-Aldrich | F-6259 | |
Gelatin capsules | Agar scientific | AGG29211 | The capsule size sould feat the size of the sample. |
Glass vials | na | na | Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused. |
LR-white medium grade, embdeding resin | Agar Scientific | AGR1281 | LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin. |
Non fat dry milk | Nestlé | na | any non fat dry milk is adequate |
Oven | na | na | generic laboratory oven |
Petri dish, 10 cm x 10 cm square | na | na | |
PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
Rat generated Monoclonal Anti-Body | Plant probes | na | Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1 |
Razor blades | na | na | regular razor blades |
SDS | Sigma-Aldrich | L6026 | |
Toluidine Blue-O | Agar Scientific | AGR1727 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC7 | |
upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters | Leica Mycrosistems | DMLb | |
vaccum chamber | na | na | |
vaccum pump | na | na | |
Vectashield | vecta Labs | T-1000 | Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.) |