Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

גילוי של גנים הנהג ב המעי הגס HT29-נגזר סרטן גזע כמו Tumorspheres

Published: July 22, 2020 doi: 10.3791/61077
Automatic Translation
1, 4, 1, 1,2,3
1Radiation Biology Research Center, Institute for Radiological Research, Chang Gung University, Chang Gung Memorial Hospital at Linkou, 2Department of Medical Imaging and Radiological Sciences, Chang Gung University, 3Department of Radiation Oncology, Chang Gung Memorial Hospital, 4Department of Laboratory Medicine, Mackay Memorial Hospital

Summary

הציג כאן הוא פרוטוקול כדי לגלות את הגנים המובעות יתר שמירה על התאים הקבועים גזע הסרטן נגזר מתאי HT29 המעי הגס. RNAseq עם ביואינפורמטיקה זמין בוצע כדי לחקור והמסך רשתות ביטוי גנים להבהיר מנגנון פוטנציאלי מעורב בהישרדות של תאים סרטניים ממוקד.

Abstract

תאים גזע סרטן לשחק תפקיד חיוני נגד טיפולים קליניים, לתרום התדרדרות הגידול. ישנם אונגנים רבים המעורבים בטווריגנזה ובייזום של סגולות סרטן. מאז ביטוי הגנים היווצרות של סרטן המעי הגס, כדורים הנגזרים אינו ברור, זה לוקח זמן כדי לגלות את המנגנון עובד על גן אחד בכל פעם. מחקר זה מדגים שיטה כדי לגלות במהירות את הגנים הנהג מעורב הישרדות של סרטן המעי הגס תאים גזע כמו מבחנה. המעי הגס HT29 תאים סרטניים כי לבטא את LGR5 כאשר מתורבת כמו spheroids וללוות להגדיל CD133 מסמנים שבטנס נבחרו ובשימוש במחקר זה. הפרוטוקול המוצג משמש לביצוע RNAseq עם ביואינפורמטיקה זמין כדי לחשוף במהירות את הגנים מנהל ההתקן בהתהוות של המעי הגס HT29 כדורים נגזר כמו גזע. המתודולוגיה יכולה להקרין במהירות ולגלות גנים פוטנציאליים של מנהלי התקנים במודלים של מחלות אחרות.

Introduction

סרטן המעי הגס (CRC) הוא הגורם המוביל למוות עם שכיחות ותמותה גבוהה ברחבי העולם1,2. בשל מוטציות גנים והגברה, תאים סרטניים לצמוח ללא שליטה מתרבים, אשר תורמת הישרדות התא3, anti-אפופטוזיס4, סרטן שמנת5,6,7. בתוך רקמת הגידול, הגידול טרוגניות מאפשר תאים סרטניים כדי להסתגל ולשרוד במהלך טיפולים טיפוליים8. תאי גזע הסרטן (CSCs), עם שיעור גבוה יותר של חידוש עצמי ו-pluripotency מאשר סוגי סרטן הדיפרנציאלי, הם בעיקר אחראי על הישנות הגידול9,10 ו-CRC גרורות11. CSCs להציג יותר התנגדות סמים12,13,14 ו אנטי אפופטוזיס נכסים15,16, ובכך ששרדו סרטן כימותרפיות.

כאן, על מנת לחקור את המנגנון הפוטנציאלי לסטדיות בתאי הגזע הנבחרים של CRC, RNAseq בוצע למסך באופן מהותי הביע גנים של הגידול בגידולים. התאים הסרטניים יכולים ליצור spheroids (המכונה גם tumorspheres) כאשר גדל בתנאים הקפדה נמוכה מגורה על ידי גורמי גדילה הוסיף למדיום תרבותי, כולל EGF, bFGF, HGF, ו IL6. לכן, בחרנו CRC HT29 תאים סרטניים המתנגדים כימותרפיות עם עלייה ב-STAT3 זרחתי כאשר מטופלים עם oxaliplatin ו irinotecon17. בנוסף, HT29 הביעו סמנים גבוהים יותר כאשר הם מתורבתים בתנאי התרבות המתוארים. HT29-נגזר מודל csc הביע כמויות גבוהות יותר של החזרה leucine-עשיר המכיל G-חלבון מצמידים הקולטן 5 (LGR5)18, סמן מסוים של תאים הגזע CRC19,20. יתר על כן, CD133, נחשב סמנים כלליים לתאי גזע הסרטן, הוא גם מתבטא במידה רבה ב-HT29 cell קו21. המטרה של פרוטוקול זה היא לגלות קבוצות של גנים של מנהלי התקן בסרטן הוקמה כמו גזע tumorspheres מבוסס על הנתונים בביואינפורמטיקה מגדיר לעומת חקירת אונגנים הפרט22. הוא חוקר מנגנונים מולקולריים פוטנציאליים באמצעות ניתוח RNAseq ולאחריו ניתוחים זמינים בביואינפורמטיקה.

רצף הדור הבא הוא התפוקה גבוהה, זמין בקלות, ואמין רצפי DNA שיטה מבוססת על העזרה החישובית, המשמש באופן מקיף גנים מנהלי התקנים עבור הנחיית טיפולים סרטניים23. הטכנולוגיה משמשת גם לגילוי ביטוי גנטי מתוך שעתוק הפוכה של מבודד RNA לדוגמה24. עם זאת, כאשר ההקרנה עם RNAseq, הגנים החשובים ביותר למקד עם טיפול לא יכול להיות הפרש הביטוי הגבוה ביותר בין דגימות ניסוי ובקרה. לכן, כמה ביואינפורמטיקה פותחו לסיווג וזיהוי גנים המבוססים על מערכות נתונים נוכחיות כגון kegg25, GO26,27, או פנתר28, כולל ניתוח מסלול תחכום (IPA)29 ו אנליסט הרשת30. פרוטוקול זה מציג את השילוב של RNAseq ואנליסט הרשת כדי לגלות במהירות קבוצה של גנים בHT29 שנבחרו הנגזרים בהשוואה לתאי HT29 הורים. יישום שיטה זו לדגמי מחלות אחרות מוצע גם לגילוי הבדלים בגנים חשובים.

בהשוואה לחקירה של ביטוי גנים בודדים, טכניקה תפוקה גבוהה מספק יתרונות למצוא גנים פוטנציאליים מנהל התקן בקלות עבור תרופה דיוק הגידול. עם ערכות נתונים שימושיות כגון KEGG, GO, או פנתר, גנים ספציפיים ניתן לזהות מבוסס על דגמי המחלה, מסלולים איתות, או פונקציות ספציפיות, וזה מאפשר במהירות התמקדות בגנים ספציפיים, חשוב, חיסכון בזמן ומחקר עלויות. יישום דומה משמש במחקרים קודמים14,18,31. במיוחד, גידול הוא מסובך יותר, כי סוגים שונים של גידולים לבטא גנים מסלולים להישרדות והתפשטות. לכן, פרוטוקול זה יכול להרים גנים להבחין סוגי גידולים שונים בנסיבות שונות. יש פוטנציאל למצוא אסטרטגיות אפקטיביות נגד סרטן על ידי הבנת המנגנון של ביטוי גנטי ספציפי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. היווצרות התרבות התאית והמבנה הטמורספירה

  1. התרבות HT29 תאים בצלחת 10 ס מ המכיל מדיום הנשר שונה ביותר של דולקקו (DMEM) עם 10% סרום של שור עוברי (FBS) ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין אנטיביוטי (P/S).
  2. לגדל את התאים בחממה ב 37 ° c עם 5% CO2 ו 95% לחות תחת תנאים אספטי, עד שהם מגיעים 80% השטף.
  3. טריסילזציה HT29 תאים עם 1 מ ל של 0.25% טריפסין עבור 5 דקות ב 37 ° c וכתוצאה מכך לנטרל את טריפסין על ידי הוספת 2 מ ל DMEM זיכרון עם 10% FBS ו 1% P/S.
  4. ספור את התאים הHT29 באמצעות הטציטוטומטר.
  5. הוסף 2,000 תאים/גם כדי מצורף נמוכה 6 צלחות היטב עם 2 מ ל של הסרום ללא dmem עם 1% P/S ו שיושלם עם 0.2% B27, 20 ng/ml של גורם גדילה באפידרמיס (egf), 20 ng/ml של גורם הצמיחה פיברוהפיצוץ (bfgf), 20 ng/ml של גורם הצמיחה hepatocyte (hgf), ו -20 ng/ml של אינטרלויקין 6 (IL6).
  6. לגדול את התאים ב 37 ° צ' עם 5% CO2 ו 95% לחות תחת תנאים אספטי.
  7. הוסף 0.5 mL של תא גזע סרטן בינונית כל 2 ימים עד למדוד את הספירות > 100 יקרומטר בקוטר לפחות 7 ימים.
  8. להתבונן ולמדוד את קוטר tumorsphere באמצעות מיקרוסקופ הפוך עם מערכת הדמיה תא דיגיטלי.
  9. כאשר הכדוריות מ> גיעות לקוטר של כ-100 יקרומטר, טריזיציזציה של כדורי הטומורזה עם 0.25% טריפסין במשך 5 דקות ב-37 ° c ומנטרלים את טריפסין על-ידי הוספת 2x לנפח הגדילה הבינוני. לספור את התאים באמצעות הומוציטומטר.
  10. צנטריפוגה ב 1,200 rpm עבור 10 דקות ולהסיר את supernatant.
  11. דגירה 5 x 104 תאים עם 2 μl של ANTI-LGR5-pe ו-2 μl של ANTI-CD133-pe ב 100 ΜL של dmem באופן אינדיבידואלי עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר, רועד ב 200 rpm.
    הערה: CD133 הוא ביוארקר כללי של תא גזע סרטן כי הוא ביטוי מאוד בתאי HT29.
  12. הוסף 900 μL של PBS ולנתח את הביטוי LGR5 ו-CD133 באמצעות הזרמת cy try. שינוי בקרינה הפלואורסצנטית בערוץ FL2-H מצביע על ביטוי גנטי.

2. בידוד רנ א

הערה: השתמש בערכה מסחרית (ראה טבלת חומרים) עם טור מהיר לבידוד RNA בעקבות הוראות היצרן.

  1. הוסף 50 μL של PBS לתאים שנקטפו (2 x 105 תאים) ולהשעות אותם מחדש עם ליטוף.
  2. להוסיף 200 μL של מאגר ליזה המכיל 2 μL של בטא-mercaptoethanol (β-ME). מערבולת במהירות ולתת לעמוד 5 דקות.
  3. צנטריפוגה את הפתרון ב 16,000 x g עבור 10 דקות. לאסוף את supernatant ולערבב עם 200 μl של 70% אתנול.
  4. השתמש בעמודה המצורפת כדי להסיר את הממס על ידי צנטריפוגה ב 14,000 x g עבור 1 דקות.
  5. לשטוף באמצעות כביסה פתרון 1 ו-2 כדי להסיר לחלוטין non-RNAs ידי צנטריפוגה ב 14,000 x g עבור 1 דקות.
  6. צנטריפוגה שוב ב 14,000 x g עבור 2 דקות כדי להסיר אתנול שיורית.
  7. הוסף 50 μL של מים מזוקקים, צנטריפוגה ב 14,000 x g עבור 1 דקות, ולאסוף את הפתרון.
  8. למדוד את הריכוז RNA באמצעות OD260 עם ספקטרוסקופיה.
    הריכוז RNA (μg/mL) = (OD260) x (40 ΜG RNA/mL) ו-OD260/od280 > 2. בדגימות RNA צריך להיות מספר שלמות RNA (RIN) > 7.

3. ניתוח הפרופיל של RNAseq וביואינפורמטיקה

הערה: ניתוח RNAseq התבצע באופן מסחרי (ראה טבלת חומרים) כדי לחקור את הגנים הדיפרנציאלים בHT29 הנגזרות בהשוואה לתאי ההורים HT29.

  1. השתמש בשירותים מסחריים עבור שלבי RNAseq, כולל בניית ספריות, בקרת איכות ספריה ורצפי DNA.
  2. על דוח הנתונים להכיל מידע חשוב, כולל ספירות קריאה, שינוי log2 קיפול וערך p. בחר את הגנים הדיפרנציאלי בהתאם לפרמטרים הבאים: גנים עם > שינוי log2 1 קיפול עם ספירות קריאה > 100 בקבוצה HT29 tumorsphere, וגנים <-1 log2 שינוי לקפל עם ספירה לקריאה > 100 בקבוצה HT29 הורים. במקרה זה, ערך p < 0.05 נחשב למקובל והנתונים שימשו (טבלה 1).
    הערה: כאן, ספירת גנים > 100 שימש את הסף כדי להמשיך את המחקר של גן מסוים ולאמת את ההבעה שלו.
  3. השתמש בתוכנה לניתוח סטטיסטי (ראה טבלת חומרים), כדי להציג מפת חום ולזהות גנים המבוסרים > 1 וגנים מוסדרות < 1 בשינוי קיפול log2.
  4. השתמש בתוכנה R כדי לצייר את העלילה הר געש עם x: log2 לשנות את הקיפול; y:-log10 (ערך p) כדי להציג את הגנים הדיפרנציאלי.
    1. התקנת ספריית R
      התקנת חבילות (ספריה (כיול))
    2. קרא את הנתונים ב-RStudio עם התוכנית הבאה:
      res < t-read. csv ("/Users/xxx.csv", כותרת = T)
      ראש (במיל)
      עם (res, מגרש (log2FoldChange,-log10 (pvalue), pch = 19, ראשי = "HT29CSC vs HT29", xlim = c (6, 6), col = "#C0C0C0"))
      עם (מערכת משנה (res, pvalue < .05 & log2FoldChange > 1), נקודות (log2FoldChange,-log10 (pvalue), pch = 19, קולונל = "אדום")
      עם (מערכת משנה (res, pvalue < .05 & log2FoldChange < ( -1)), נקודות (log2FoldChange,-log10 (pvalue), pch = 19, קולונל = "כחול")
      עם (קבוצת משנה (res, pvalue > .05), נקודות (log2FoldChange,-log10 (pvalue), pch = 19, col = "#444444"))
      אבליין (h = 1.3, lty = 2)
      אבליין (v = 1, lty = 2)
      abline (v = ( -1), lty = 2)
    3. לבצע את הריצה כדי להשיג את העלילה הר געש.

4. בחירת גנים מנהלי התקנים

  1. בחרו קלט גן יחיד באנליסט הרשת.
  2. העתק והדבק את הגנים המובטאים הנבחרים מטבלה 1 עם "אדם" שצוין בתור האורגניזם וסוג המזהה הגן הרשמי.
    הערה: לחלופין, השתמש במזהה הגן Ensembl עבור העתקה והדבקה.
  3. הכנס את הנתונים על-ידי לחיצה על העלאה והמשך כדי לנתח אותה באמצעות האינטראקציה של חלבון חלבונים (ppi) בעקבות הגנטי PPI.
  4. השתמש במסד הנתונים של STRING interactome עם חיתוך ביטחון של 900 כדי להראות את הגנים הזרעים המקשרים בין הגנים שהועלו. הגנים הזרע שיוך עם גנים בודדים יותר נבחרו כגנים מנהלי התקנים שעשויים להיות מעורבים בשמירה על היווצרות של HT29-הנגזרים.
    הערה: קיימות שלוש ערכות נתונים בין-משתמשים: IMEx, STRING ו-Rolland. מחרוזת מכילה ראיות ביטחון גבוה יותר ניסיוני. עם מספרי גנים נמוכים שהועלו, IMEx ניתן לבחור כדי לנבא ולאסוף את הגנים של מנהלי ההתקנים ברשתות interactome.
  5. בחר באפשרות ' המשך ' במבט כולל על המיפוי.
  6. בחר לבן ברקע ואלץ את אטלס בתוך כפתור הפריסה .
  7. בחר פנתר BP לנתח את קבוצת הגנים upregulation.
    הערה: זה מראה כי HSPA5 היה אחראי נגד אפופטוזיס בתוך HT29-הספירות הנגזרות במחקר זה (איור 3A). כדי לצמצם את השדה הפונקציונלי הספציפי, הסיווג KEGG, GO או פנתר יכול לשמש לחילופין כדי לבחור את הגנים הספציפיים של מנהלי ההתקנים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להקים את המודל לחקירת המנגנון בתאי גזע הסרטן, תאים HT29 המעי הגס שימשו לתרבות הגזע הסרטן כמו tumorspheres בתחום מחוץ ללוח מצורף נמוך המכיל B27, EGF, bFGF, HGF, ו IL6. הספירות הטומוראות > 100 יקרומטר בקוטר נוצרו ב -7 ימים (איור 1a). כדורי הטומורזציה היו טריציגניים לתאים בודדים ונותחו באמצעות הזרימה cy, try כדי לזהות ביטוי LGR5 ו-CD133. LGR5 גדל ב-HT29-drived הספירות מ 1.1% כדי 11.4% ואת התאים זוהו באמצעות הזרמת cy try (איור 1B). טוש נוסף, CD133, גדל גם מ 61.8% ל 81.1% בתחום התרבותי HT29-נגזר הנגזרות לעומת תאים HT29 הורים (איור 1C). ואז, כדורי הטומורו היו מוכנים. לחקירה של אר.

RNAseq שימש כדי לחקור את הפרופיל ביטוי הגנים בHT29 הנגזרות בהשוואה לתאי HT29 ההורים. שיעור השגיאה בקריאה בנוקלאוטיד היה 0.03% עבור שני הדגימות. שיעור המיפוי הגנטי הכולל היה 87.87% עבור HT29 ו 87.25% עבור כדורי HT29 נגזרות. השברים לקילו-בסיס של תעתיק למיליון (FPKM), מנרמל את ספירות הבלשים לציון הביטוי התמליל (mRNA), מרווח בין 0 ל-1 היה 75.87% עבור תאים HT29 ו-77.16% עבור כדוריות HT29 נגזרות. התוצאות היו מתאימות לרצף הסוגר. לאחר העריכה ברצף, הגנים עם log2 לשנות את הקיפול > 1 ב upregulation ו <-1 ב-downregulation עם ערך p < 0.05 מוצג על ידי מפת החום (איור 2A,טבלה 1,טבלה 2) נבחרו. היו 79 הגנים upregulated ו 33 גנים מוסדרים שנבחרו. בנוסף, את העלילה הר געש באמצעות log2 שינוי קיפול ו-p ערך (-log10 p ערך) שימש כדי להבדיל בין הגנים המשמעותיים בין HT29-נגזרות הורים תאים HT29 ההורים (איור 2B). בהתבסס על הבחירה המוקדמת, זוהו שלושה גנים בעלי פוטנציאל פוטנציאלי, כולל ACSS2, HMGCS1 וPCSK9, בספירות הHT29 הנגזרות (איור 2a). יתר על כן, על מנת לזהות את הגנים של מנהלי ההתקנים לא רק על פי שינוי log2 קיפול, השתמשו באנליסט הרשת. הגנים upregulated עם שינוי log2 קיפול > 1 עם ערך p < 0.05 נותחו והביא 10 גנים זרע לחצות את רשתות גנים, כולל HSPA5, HSP90AA1, BRCA1, sfn, E2F1, cycs, CDC6, alyref, SQSTM1, ו TOMM40 (איור 3a). כדי לזהות את הפונקציה ואת המשמעות של הגנים הזרע, ממשק סיווג יכול לשמש כדי לבצע פנתר BP כדי לקבוע את הגנים המעורבים אנטי אפופטוזיס ב-HT29 הנגזרות. התוצאות הראו כי HSPA5 ו SQSTM1 היו קשורים בוויסות שלילי של אפופטוזיס (איור 3a). יתר על כן, 10 הגנים שנבחרו אושרו כתוצאה מכך; ביטוי גדל בספירות הHT29-נגזרות כמאושר באמצעות qPCR (איור 3B).

Figure 1
איור 1: הקמת כדור מדומה לסרטן בצורת מבחנה. (א) HT29 שימש ליצירת כדורים מבוססי, ו-(ב) LGR5 זוהה בספירות HT29-נגזרות (סרגל קנה מידה = 100 μm). (ג) CD133 שימש כסמן נוסף כדי לזהות את הדמויות הסטדיות בתחומים הקבועים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מפת החום ומגרש הר הגעש שימשו כדי לבחור את הגנים הדיפרנציאלי בHT29 הנגזרות. Log2 לשנות קיפול > 1 ו < -1 עם ספירה לקריאה > 100, ערך p < 0.05 שימשו כדי להוציא גנים שאינם משמעותיים ולוודא הנתונים היו מדויקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: אנליסט הרשת שימש לזיהוי הגנים של מנהלי ההתקנים בHT29 הנגזרים. (א) הגנים upregulated נבחרו ונותחו כתוצאה מכך, וממשק סיווג, הפנתר BP, סיפק את הפונקציות הפוטנציאליות של הגנים מנהל ההתקן הדיפרנציאלי. (ב) אז, qpcr שימש כדי לאמת את 10 הגנים upregulated ב HT29-נגזרות הנגזרים לעומת תאים HT29 הורים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: הגנים upregulated ב-HT29-בעלי כדורים מוקדמים בהשוואה לתאי הורים HT29 שנותחו על ידי RNAseq. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה.

שולחן 2: הגנים המווסתים בHT29-כדורים מבוססי-הורים בהשוואה לתאי ההורים HT29 שנותחו על ידי RNAseq. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במחקר זה, הסרטן התרבותי כמו גזע מדומה שימשו כמודל בניתוח נתונים RNAseq עם ביואינפורמטיקה זמין. למודל מחלה, נעשה שימוש ב-HT29 הספירות הנגזרות. מכיוון שבספירות הטומוריות יש עמידות בסמים נגד טיפולים סרטניים, המודל הוקם יכול לשמש לחקירת מנגנונים מפורטים של התנגדות על ידי חקירת הבדלים בביטוי הגנים. יתר על כן, טכנולוגיה גנומית באמצעות RNAseq עם ביואינפורמטיקה זמין מספק הבנה מהירה של מודל המחקר כך גנים העלולים להיות מעורבים יכול להיות מאומת עם ביטחון גבוה יותר. כמו כן, ניתן לזהות את סוג הגנים המעורבים בהיווצרות היווצרות כדורים.

איכות RNA היא קריטית עבור ניתוח RNAseq32. ודא שלמדגם יש RIN > 7, מכיוון שהוא מגדיל את הוודאות בין מיפוי, מיפוי גנים ו-FPKM. בעת ניתוח נתוני RNAseq, IPA29 ו אנליסט הרשת30 היו זמינים כדי לזהות גנים פוטנציאליים מסלולים איתות. עם זאת, חיוני לשלול את הגנים המיותרים בהתאם לפרמטרים הבאים: גנים המציגים שינוי log2 1 > מתקפל עם ספירות קריאה > 100 בקבוצה הניסיונית, וגנים <-1 log2 לשנות את הקיפול עם ספירה לקריאה > 100 בקבוצת הביקורת. ספירות קריאה גבוהות יותר קלות לאימות סוגר באמצעות הגושים qPCR או מערביים.

בהתבסס על הבנה של פונקציות ותהליכים ביולוגיים, ישנם כלים ביואינפורמטיקה רבים המאפשרים חקירה מהירה של מנגנונים פוטנציאליים של מחלות עניין. בשילוב עם כלי תפוקה גבוהה למסך עבור ביטוי גנטי כגון RNAseq, מנגנונים פוטנציאליים המסדיר את התפתחות המחלות לחקור ניתן להציע ונחקר. כאן, השיטה לחקירת היווצרות של שיטות הגזע האנטי-כדורי הנגזרות מHT29 חשף כי SQSTM1 ו HSPA5 היו הגנים היעד upregulated ו מעורב anti-אפופטוזיס ב tumorspheres. לכן, ניסויים נוספים יכולים להיות מיועדים לחקור את המנגנון המפורט של גנים אלה, אשר מביא ביטחון ויעילות יותר בעת ניהול לימודי מחקר.

כאן, רק את הגנים upregulated בתוך הספירות הטומוריות נותחו בגלל upregulation נחשב להיגרם על ידי תוספת של גורמי הצמיחה. אחרת, אם הניסוי נעשה שימוש מנוק גן בתאי הגידול, הגנים מוסדרים ייחשב כמטרות שניתן לבחור לחקירה באמצעות ביואינפורמטיקה. למרות המתודולוגיה היא מהירה ומהימנה, האימות הבאים עדיין נדרש דרך qPCR ו blots המערבי. כמו כן, הוצע שימוש בקווי תאים נוספים עבור אימות ביטוי גנים, במיוחד עבור דגימות קליניות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין גילויים פיננסיים רלוונטיים.

Acknowledgments

המחברים מודים לליבה של הביולוגיה הרדיואקטיבית המעבדה למחקר רדיולוגי, בית החולים צ'אנג קונג הזיכרון, לתמיכה טכנית. מחקר זה היה נתמך על ידי מענקים צ ' אנג קונג החולים הזיכרון (CMRPD1J0321), צ'נג Hsin החולים הכללי (CHGH 106-06), ו מקיי החולים הזיכרון (MMH-CT-10605 ו-MMH-106-61). לגופי המימון לא היתה כל השפעה בתכנון המחקר ואיסוף הנתונים, הניתוח והפרשנות של הנתונים או בכתיבת כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
iRiS Digital Cell Imaging System Logos Biosystems, Inc I10999 for observing the formation of tumorspheres
Flow cytometry BD biosciences FACSCalibur for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres
anti-LGR5-PE Biolegend 373803 LGR5 detection reagent
anti-CD133-PE Biolegend 372803 CD133 detection reagent
EGF GenScript Z00333 for culture of tumorspheres
bFGF GenScript Z03116 for culture of tumorspheres
HGF GenScript Z03229 for culture of tumorspheres
IL6 GenScript Z03034 for culture of tumorspheres
PureLink RNA extraction kit Invitrogen 12183025 isolate total RNA for RNAseq analysis
RNAseq performance Biotools, Taiwan RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan
NetworkAnalyst Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada http://www.networkanalyst.ca/
Prism GraphPad Software a statistical analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors. Przegląd Gastroenterologiczny. 14 (2), 89-103 (2019).
  2. Wong, M. C., Ding, H., Wang, J., Chan, P. S., Huang, J. Prevalence and risk factors of colorectal cancer in Asia. Intestinal Research. 17 (3), 317-329 (2019).
  3. Liu, Q., et al. Positive expression of basic transcription factor 3 predicts poor survival of colorectal cancer patients: possible mechanisms involved. Cell Death & Disease. 10 (7), 509 (2019).
  4. Slattery, M. L., et al. Dysregulated genes and miRNAs in the apoptosis pathway in colorectal cancer patients. Apoptosis. 23 (3-4), 237-250 (2018).
  5. Arteaga, C. L., Engelman, J. A. ERBB receptors: from oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics. Cancer Cell. 25 (3), 282-303 (2014).
  6. Yarden, Y., Pines, G. The ERBB network: at last, cancer therapy meets systems biology. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 553-563 (2012).
  7. Cheng, C. C., et al. YM155 as an inhibitor of cancer stemness simultaneously inhibits autophosphorylation of epidermal growth factor receptor and G9a-mediated stemness in lung cancer cells. PLoS One. 12 (8), 0182149 (2017).
  8. Prasetyanti, P. R., Medema, J. P. Intra-tumor heterogeneity from a cancer stem cell perspective. Molecular Cancer. 16 (1), 41 (2017).
  9. Zhao, Y., et al. CD133 expression may be useful as a prognostic indicator in colorectal cancer, a tool for optimizing therapy and supportive evidence for the cancer stem cell hypothesis: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (9), 10023-10036 (2016).
  10. Choi, J. E., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell markers in colorectal adenocarcinoma: Clinicopathological significance. Oncology Reports. 38 (3), 1695-1705 (2017).
  11. Massard, C., Deutsch, E., Soria, J. C. Tumour stem cell-targeted treatment: elimination or differentiation. Annals of Oncology. 17 (11), 1620-1624 (2006).
  12. Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66 (10), 1802-1810 (2017).
  13. Dallas, N. A., et al. Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition. Cancer Research. 69 (5), 1951-1957 (2009).
  14. Chang, Y. F., et al. STAT3 induces G9a to exacerbate HER3 expression for the survival of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors in lung cancers. BMC Cancer. 19 (1), 959 (2019).
  15. Catalano, V., et al. Colorectal cancer stem cells and cell death. Cancers (Basel). 3 (2), 1929-1946 (2011).
  16. Piggott, L., et al. Suppression of apoptosis inhibitor c-FLIP selectively eliminates breast cancer stem cell activity in response to the anti-cancer agent, TRAIL. Breast Cancer Research. 13 (5), 88 (2011).
  17. Chung, S. Y., et al. Two novel SHP-1 agonists, SC-43 and SC-78, are more potent than regorafenib in suppressing the in vitro stemness of human colorectal cancer cells. Cell Death Discovery. 4, 25 (2018).
  18. Cheng, C. C., et al. STAT3 exacerbates survival of cancer stem-like tumorspheres in EGFR-positive colorectal cancers: RNAseq analysis and therapeutic screening. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 60 (2018).
  19. Kleist, B., Xu, L., Li, G., Kersten, C. Expression of the adult intestinal stem cell marker Lgr5 in the metastatic cascade of colorectal cancer. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 4 (4), 327-335 (2011).
  20. Medema, J. P. Targeting the Colorectal Cancer Stem Cell. New England Journal of Medicine. 377 (9), 888-890 (2017).
  21. Sahlberg, S. H., Spiegelberg, D., Glimelius, B., Stenerlow, B., Nestor, M. Evaluation of cancer stem cell markers CD133, CD44, CD24: association with AKT isoforms and radiation resistance in colon cancer cells. PLoS One. 9 (4), 94621 (2014).
  22. Xia, J., Gill, E. E., Hancock, R. E. NetworkAnalyst for statistical, visual and network-based meta-analysis of gene expression data. Nature Protocols. 10 (6), 823-844 (2015).
  23. Gagan, J., Van Allen, E. M. Next-generation sequencing to guide cancer therapy. Genome Medicine. 7 (1), 80 (2015).
  24. Panichnantakul, P., Bourgey, M., Montpetit, A., Bourque, G., Riazalhosseini, Y. RNA-Seq as a Tool to Study the Tumor Microenvironment. Methods in Molecular Biology. 1458, 311-337 (2016).
  25. Kanehisa, M., Sato, Y. KEGG Mapper for inferring cellular functions from protein sequences. Protein Science. 29 (1), 28-35 (2020).
  26. Ashburner, M., et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature Genetics. 25 (1), (2000).
  27. The Gene Ontology Collective. The Gene Ontology Resource: 20 years and still GOing strong. Nucleic Acids Research. 47, 330-338 (2019).
  28. Mi, H., Muruganujan, A., Thomas, P. D. PANTHER in 2013: modeling the evolution of gene function, and other gene attributes, in the context of phylogenetic trees. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 377-386 (2013).
  29. Yu, F., Shen, X. Y., Fan, L., Yu, Z. C. Genome-wide analysis of genetic variations assisted by Ingenuity Pathway Analysis to comprehensively investigate potential genetic targets associated with the progression of hepatocellular carcinoma. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 18 (15), 2102-2108 (2014).
  30. Zhou, G., et al. NetworkAnalyst 3.0: a visual analytics platform for comprehensive gene expression profiling and meta-analysis. Nucleic Acids Research. 47 (1), 234-241 (2019).
  31. Cheng, C. C., et al. Epidermal growth factor induces STAT1 expression to exacerbate the IFNr-mediated PD-L1 axis in epidermal growth factor receptor-positive cancers. Molecular Carcinogenesis. 57 (11), 1588-1598 (2018).
  32. Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).

Tags

נסיגה סוגיה 161 סרטן המעי הגס תא גזע של סרטן CD133 HT29 LGR5 RNAseq אנליסט הרשת
גילוי של גנים הנהג ב המעי הגס HT29-נגזר סרטן גזע כמו Tumorspheres
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, C. C., Hsu, P. J., Sie, Z.… More

Cheng, C. C., Hsu, P. J., Sie, Z. L., Chen, F. H. Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres. J. Vis. Exp. (161), e61077, doi:10.3791/61077 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter