Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

कोलोरेक्टल HT29 में ड्राइवर जीन की खोज-व्युत्पन्न कैंसर स्टेम की तरह ट्यूमरमंडल

Published: July 22, 2020 doi: 10.3791/61077
Automatic Translation
1, 4, 1, 1,2,3
1Radiation Biology Research Center, Institute for Radiological Research, Chang Gung University, Chang Gung Memorial Hospital at Linkou, 2Department of Medical Imaging and Radiological Sciences, Chang Gung University, 3Department of Radiation Oncology, Chang Gung Memorial Hospital, 4Department of Laboratory Medicine, Mackay Memorial Hospital

Summary

यहां प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल के लिए स्थापित कैंसर स्टेम की तरह कोलोरेक्टल HT29 कोशिकाओं से प्राप्त कोशिकाओं को बनाए रखने के अतिउप्रेरित चालक जीन की खोज है । उपलब्ध बायोइन्फॉर्मेटिक्स के साथ आरएनसीक्यू को लक्षित ट्यूमर कोशिकाओं के अस्तित्व में शामिल संभावित तंत्र को स्पष्ट करने के लिए जीन अभिव्यक्ति नेटवर्क की जांच और स्क्रीन करने के लिए किया गया था।

Abstract

कैंसर स्टेम सेल नैदानिक चिकित्सा के खिलाफ एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, ट्यूमर पतन के लिए योगदान । ट्यूमरजीनेसिस और कैंसर स्टेमनेस गुणों की शुरुआत में कई ऑन्कोजीन शामिल हैं। चूंकि कोलोरेक्टल कैंसर से व्युत्पन्न ट्यूमरमंडल के गठन में जीन अभिव्यक्ति अस्पष्ट है, इसलिए एक समय में एक जीन पर काम करने वाले तंत्रों की खोज करने में समय लगता है। यह अध्ययन कोलोरेक्टल कैंसर स्टेम की तरह विट्रो के अस्तित्व में शामिल चालक जीन को जल्दी से खोजने के लिए एक विधि को दर्शाता है । कोलोरेक्टल HT29 कैंसर कोशिकाओं है कि LGR5 व्यक्त जब spheroids के रूप में सुसंस्कृत और एक वृद्धि CD133 स्टेमनेस मार्कर के साथ चयनित और इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया । प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग कोलोरेक्टल एचटी29-व्युत्पन्न स्टेम-जैसे ट्यूमरस्फीयर के गठन में ओवरएक्सप्रेस्ड ड्राइवर जीन को जल्दी से उजागर करने के लिए उपलब्ध बायोइन्फॉर्मेटिक्स के साथ आरएनएएसेक प्रदर्शन करने के लिए किया जाता है। कार्यप्रणाली जल्दी से स्क्रीन और अन्य रोग मॉडल में संभावित चालक जीन की खोज कर सकते हैं।

Introduction

कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) दुनिया भर में उच्च व्यापकता और मृत्यु दर के साथ मौत का एक प्रमुख कारण है1,,2। जीन उत्परिवर्तन और प्रवर्धन के कारण, कैंसर कोशिकाएं प्रसार नियंत्रण के बिना बढ़ती हैं, जो सेल अस्तित्व3,एंटी-एपोप्टोसिस4और कैंसर स्टेमनेस5,,6, 7,7में योगदान देती हैं। ट्यूमर ऊतक के भीतर, ट्यूमर विषमता ट्यूमर कोशिकाओं को चिकित्सीय उपचार 8 केदौरानअनुकूलित और जीवित रहने की अनुमति देती है। कैंसर स्टेम सेल (सीएससी), अंतर कैंसर प्रकार की तुलना में आत्म नवीकरण और pluripotency की एक उच्च दर के साथ, ट्यूमर पुनरावृत्ति9,,10 और मेटास्टैटिक सीआरसी11के लिए मुख्य रूप से जिम्मेदार हैं । सीएससी अधिक दवा,प्रतिरोध12, 13,,14और एंटी-एपोप्टोसिस गुण14 15,,16,इस प्रकार ट्यूमर कीमोथैरेपी जीवित है।

यहां, चयनित सीआरसी स्टेम कोशिकाओं में स्टेमनेस के लिए संभावित तंत्र की जांच करने के लिए, आरएनसीक्यू को ट्यूमर स्फेरॉइड में अलग-अलग व्यक्त जीन को स्क्रीन करने के लिए किया गया था। कैंसर कोशिकाएं कम पालन की स्थिति में उगाई जाने पर गोलाकार (जिसे ट्यूमरस्फीयर भी कहा जाता है) बना सकती हैं और ईजीएफ, टीएफजीएफ, एचजीएफ और आईएल6 सहित सुसंस्कृत माध्यम में जोड़े गए विकास कारकों से प्रेरित होती हैं। इसलिए, हमने सीआरसी एचटी29 ट्यूमर कोशिकाओं का चयन किया जो ऑक्सलिप्लैटिन और इरिनोटकॉन17के साथ इलाज करते समय फॉस्फोरिलेटेड स्टेट3 में वृद्धि के साथ कीमोथेरपी का विरोध करते हैं। इसके अलावा, HT29 उच्च स्टेमनेस मार्कर व्यक्त किया जब वर्णित संस्कृति की स्थिति में सुसंस्कृत । एचटी29-व्युत्पन्न सीएससी मॉडल ने लेउसिन-रिच रिपीट-युक्त जी-प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर 5 (एलजीआर 5)18,सीआरसी स्टेम सेल19,,20का एक विशिष्ट मार्कर व्यक्त किया । इसके अलावा, कैंसर स्टेम सेल के लिए एक सामान्य बायोमार्कर माना जाता है, CD133भी HT29 सेल लाइन21में अत्यधिक व्यक्त किया जाता है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य22के व्यक्तिगत ऑन्कोजीन की जांच करने के विपरीत बायोइन्फॉर्मेटिक्स डेटासेट के आधार पर स्थापित कैंसर स्टेम जैसे ट्यूमरस्फीयर में ड्राइवर जीन के समूहों की खोज करना है। यह आरएनसीक्यू विश्लेषण के माध्यम से संभावित आणविक तंत्रों की जांच करता है जिसके बाद उपलब्ध बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषण होते हैं ।

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण एक उच्च थ्रूपुट, आसानी से उपलब्ध है, और विश्वसनीय डीएनए अनुक्रमण विधि कंप्यूटेशनल मदद के आधार पर, ट्यूमर चिकित्सा23मार्गदर्शन के लिए व्यापक रूप से चालक जीन स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया । इस तकनीक का उपयोग एक पृथक आरएनए नमूने24के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन से जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए भी किया जाता है । हालांकि, जब RNAseq के साथ स्क्रीनिंग, चिकित्सा के साथ लक्षित करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण जीन प्रयोगात्मक और नियंत्रण के नमूनों के बीच उच्चतम अभिव्यक्ति अंतर नहीं हो सकता है । इसलिए, केजीजी 25 , जीओ,26 , 27या पैंथर2628 जैसे वर्तमान डेटासेट28के आधार पर जीन को वर्गीकृत करने और पहचानने के लिए कुछ जैव सूचनाएं विकसित की गईं, जिनमें सरलता पाथवे विश्लेषण (आईपीए)29 और नेटवर्कएनालिस्ट30शामिल हैं ।27 यह प्रोटोकॉल माता-पिता HT29 कोशिकाओं की तुलना में चयनित HT29-व्युत्पन्न स्फेरॉइड में जीन के एक समूह को जल्दी से खोजने के लिए आरएनएसेक और नेटवर्कएनालिस्ट के एकीकरण को दर्शाता है। महत्वपूर्ण जीन में अंतर की खोज के लिए अन्य रोग मॉडलों के लिए इस विधि का आवेदन करने का भी सुझाव दिया गया है।

व्यक्तिगत जीन अभिव्यक्ति की जांच की तुलना में, एक उच्च थ्रूपुट तकनीक ट्यूमर सटीक दवा के लिए आसानी से संभावित चालक जीन खोजने के लिए लाभ प्रदान करती है। केजीजी, गो या पैंथर जैसे उपयोगी डेटासेट के साथ, विशिष्ट जीन को रोग मॉडल, सिग्नलिंग रास्ते, या विशिष्ट कार्यों के आधार पर पहचाना जा सकता है, और यह जल्दी से विशिष्ट, महत्वपूर्ण जीन पर ध्यान केंद्रित करने, समय और अनुसंधान लागत की बचत करने की अनुमति देता है। इसी तरह के आवेदन का प्रयोग पिछले अध्ययनों में किया जाता है, 14,18,31. विशेष रूप से, एक ट्यूमर अधिक जटिल है क्योंकि ट्यूमर के विभिन्न प्रकार के अस्तित्व और प्रसार के लिए जीन और रास्ते भेद व्यक्त करते हैं। इसलिए, यह प्रोटोकॉल विभिन्न परिस्थितियों में विभिन्न ट्यूमर प्रकारों को अलग करने वाले जीन उठा सकता है। विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति के तंत्र को समझकर कैंसर के खिलाफ प्रभावी रणनीतियां खोजने की क्षमता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. सेल संस्कृति और ट्यूमरमंडल गठन

  1. 10 सेमी डिश में कल्चर HT29 कोशिकाओं में दुल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन एंटीबायोटिक (पी/एस) के साथ ।
  2. 5% सीओ2 और 95% आर्द्रता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को बढ़ाएं, जब तक कि वे 80% तक न पहुंच जाएं।
  3. ट्रिपसिनाइज 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 0.25% ट्राइपसिन के 1 मिलीएल के साथ HT29 कोशिकाओं को और फलस्वरूप 10% एफबीएस और 1% पी/एस के साथ डीएमईएम के 2 मिलील जोड़कर ट्राइप्सिन को बेअसर कर देते हैं।
  4. हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके एचटी29 कोशिकाओं की गणना करें।
  5. 1% पी/एस के साथ सीरम-मुक्त डीएमईएम के 2 मिलील के साथ कम संलग्न 6 अच्छी प्लेटों में 2,000 कोशिकाओं/अच्छी तरह से जोड़ें और 0.2% B27 के साथ पूरक हैं, एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) के 20 एनजी/एमएल, फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (5एफजीएफ) के 20 एनजी/एमएल, हेपेटोसिटे ग्रोथ फैक्टर (एचजीएफ) के 20 एनजी/एमएल और इंटरल्यूकिन 6 (आईएल6) के 20 एनजी/एमएल ।
  6. 5% सीओ2 और 95% आर्द्रता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को विकसित करें।
  7. हर 2 दिन में 0.5 एमएल कैंसर स्टेम सेल मीडियम डालें, जब तक कि ट्यूमर को कम से कम 7 दिनों तक व्यास में मापने और जीटी;100 माइक्रोन को न करें।
  8. डिजिटल सेल इमेजिंग सिस्टम के साथ एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके ट्यूमरस्फीयर व्यास का निरीक्षण और मापें।
  9. जब ट्यूमर के प्रकोप और व्यास में 100 माइक्रोन तक पहुंचते हैं, तो ट्यूमर केमंडल को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 0.25% ट्राइपसिन के साथ ट्रिप्सिनाइज करें और 2x विकास माध्यम की मात्रा जोड़कर ट्राइप्सिन को बेअसर करें। हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
  10. 10 मिनट के लिए 1,200 आरपीएम पर सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को हटा दें।
  11. एंटी-एलजीआर 5-पीई के 2 माइक्रोन के साथ 5 x 104 कोशिकाओं और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए व्यक्तिगत रूप से डीएमईएम के 100 माइक्रोन में एंटी-सीडी 133-पीई के 2 माइक्रोन के साथ, 200 आरपीएम पर मिलाते हुए।
    नोट: CD133 एक सामान्य कैंसर स्टेम सेल बायोमार्कर है जो एचटी29 कोशिकाओं में अत्यधिक व्यक्त किया जाता है।
  12. पीबीएस के 900 माइक्रोन जोड़ें और प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके एलजीआर 5 और सीडी 133 अभिव्यक्ति का विश्लेषण करें। FL2-H चैनल में फ्लोरेसेंस में बदलाव जीन अभिव्यक्ति को इंगित करता है ।

2. आरएनए अलगाव

नोट: निर्माता के निर्देशों का पालन करने वाले आरएनए अलगाव के लिए एक तेजी से कॉलम के साथ एक वाणिज्यिक किट (सामग्रीकी तालिका देखें) का उपयोग करें।

  1. काटा कोशिकाओं (2 x 10 5 कोशिकाओं) में पीबीएस के50 μL जोड़ें और उन्हें पाइपिंग के साथ फिर से खर्च करें।
  2. बीटा-मर्केप्टोएथेनॉल (एमई) के 2 माइक्रोन युक्त लाइसिस बफर के 200 माइक्रोल जोड़ें। भंवर जल्दी से और 5 मिनट के लिए खड़े हो जाओ।
  3. 10 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम पर समाधान को सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट को इकट्ठा करें और 70% इथेनॉल के 200 माइक्रोन के साथ मिलाएं।
  4. 1 मिनट के लिए 14,000 x g पर अपकेंद्रित्र द्वारा सॉल्वेंट को हटाने के लिए संलग्न कॉलम का उपयोग करें।
  5. वॉश सॉल्यूशन 1 और 2 का उपयोग करके धोएं 1 मिनट के लिए 14,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा गैर-आरएनए को पूरी तरह से हटाने के लिए।
  6. अवशिष्ट इथेनॉल को हटाने के लिए 2 मिनट के लिए 14,000 x ग्राम पर फिर से सेंट्रलाइज करें।
  7. 1 मिनट के लिए 14,000 x ग्राम पर आसुत पानी, अपकेंद्रित्र के 50 माइक्रोन जोड़ें, और समाधान इकट्ठा करें।
  8. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ OD260 का उपयोग कर आरएनए एकाग्रता को मापें।
    आरएनए एकाग्रता (μg/mL) = (OD२६०)x (४० μg आरएनए/एमएल) और ओडी२६०/OD२८० >2 । आरएनए नमूनों में आरएनए इंटीग्रिटी नंबर (आरआईआर) और जीटी; 7 होना चाहिए ।

3. आरएनसीक्यू प्रोफाइलिंग और बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषण

नोट: RNAseq विश्लेषण व्यावसायिक रूप से किया गया था (सामग्री की तालिकादेखें) माता पिता HT29 कोशिकाओं की तुलना में HT29-व्युत्पन्न ट्यूमरमंडल में अंतर जीन की जांच करने के लिए ।

  1. पुस्तकालय निर्माण, पुस्तकालय गुणवत्ता नियंत्रण, और डीएनए अनुक्रमण सहित RNAseq चरणों के लिए वाणिज्यिक सेवाओं का उपयोग करें।
  2. डेटा रिपोर्ट में महत्वपूर्ण जानकारी होनी चाहिए, जिसमें पढ़े गए मायने, लॉग2 गुना परिवर्तन और पी वैल्यू शामिल हैं । निम्नलिखित मापदंडों के अनुसार अंतर जीन का चयन करें: एचटी29 ट्यूमरस्फीयर समूह में पढ़े गए काउंट और जीटी 100 के साथ एक और 1 लॉग2 गुना परिवर्तन के साथ जीन, और एचटी 29 पैरेंटल ग्रुप में रीड काउंट और जीटी 100 के साथ जीन और 1 लॉग2 गुना परिवर्तन। इस मामले में, एक पी वैल्यू एंड एलटी; 0.05 को स्वीकार्य माना गया था और डेटा का उपयोग(तालिका 1)किया गया था।
    नोट: यहां, एक जीन गिनती और gt;100 एक विशेष जीन के अध्ययन को जारी रखने और उसकी अभिव्यक्ति को मान्य करने के लिए दहलीज के रूप में इस्तेमाल किया गया था ।
  3. सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें, एक हीटमैप दिखाने के लिए और लॉग 2 गुना परिवर्तन में अतिउपर्णित जीन और जीटी;1 और डाउनरेनियमित जीन और लेफ्टिनेंट; 1 की पहचान करने के लिए।
  4. एक्स के साथ ज्वालामुखी प्लॉट आकर्षित करने के लिए आर सॉफ्टवेयर का उपयोग करें: log2 गुना परिवर्तन; y: -log10 (पी मूल्य) अंतर जीन दिखाने के लिए।
    1. आर लाइब्रेरी स्थापित करें
      इंस्टॉल.पैकेज (लाइब्रेरी (कैलिब्रेट))
    2. निम्नलिखित कार्यक्रम के साथ RStudio में डेटा पढ़ें:
      res &-read.csv ("/Users/xxx.csv", हेडर =T)
      सिर
      (res, प्लॉट (log2FoldChange), -log10 (pvalue), pch=19, मुख्य = "HT29CSC बनाम HT29", xlim =c (-6,6), कर्नल = "#C0C0C0"))
      (सबसेट (आरई, प्ल्यूज़ एंड एलटी;05 और लॉग2फोल्डचेंज एंड जीटी;1), अंक (लॉग2फोल्डचेंज, -लॉग10 (प्लावै), pch=19, col="red"))
      (सबसेट (आरई, प्ल्यूज़ एंड एलटी;05 और लॉग2फोल्डचेंज एंड एलटी;(-1)), अंक (लॉग2फोल्डचेंज, -लॉग10 (प्लावै), pch=19, col="blue"))
      (सबसेट (आरई, प्लास, प्ल्यूव्यू और जीटी;.05), अंक (log2FoldChange, -log10 (pvalue), pch=19, col="#444444"))
      abline (h=1.3, lty =2)
      एलाइन (v=1, lty =2)
      abline (v=(-1), lty =2)
    3. ज्वालामुखी साजिश प्राप्त करने के लिए रन निष्पादित करें।

4. ड्राइवर जीन चयन

  1. नेटवर्कएनालिस्ट में सिंगल जीन इनपुट चुनें।
  2. जीव और आईडी प्रकार आधिकारिक जीन प्रतीक के रूप में निर्दिष्ट "मानव" के साथ तालिका 1 से चयनित अतिउपर्णित जीन की प्रतिलिपि और पेस्ट करें। Official Gene Symbol
    नोट: वैकल्पिक रूप से, कॉपी और पेस्ट के लिए एनसेम्बल जीन आईडी का उपयोग करें।
  3. जेनेटिक पीपीआई के बाद प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) का उपयोग करके इसका विश्लेषण करने के लिए अपलोड और आगे बढ़ें पर क्लिक करके डेटा डालें।
  4. अपलोड किए गए जीन को क्रॉस-लिंक करने वाले सीड जीन को दिखाने के लिए 900 के कॉन्फिडेंस स्कोर कटऑफ के साथ स्ट्रिंग इंटरेक्टोम डेटाबेस का इस्तेमाल करें। अधिक व्यक्तिगत जीन के साथ संबद्ध बीज जीन ड्राइवर जीन है कि HT29-व्युत्पन्न ट्यूमरमंडल के गठन को बनाए रखने में शामिल किया जा सकता है के रूप में चुना गया ।
    नोट: उपयोग के लिए तीन इंटरैक्टोम डेटासेट हैं: आईएमएक्स, स्ट्रिंग और रोलां। स्ट्रिंग उच्च विश्वास प्रयोगात्मक सबूत होते हैं। कम अपलोड किए गए जीन नंबरों के साथ, IMEx को इंटरैक्टोम नेटवर्क में ड्राइवर जीन की भविष्यवाणी करने और लेने के लिए चुना जा सकता है।
  5. मैपिंग अवलोकन में आगे बढ़ें।
  6. लेआउट नॉब में बैकग्राउंड और फोर्स एटलस में व्हाइट चुनें।
  7. अपरेगुलेशन जीन समूह का विश्लेषण करने के लिए पैंथर बीपी का चयन करें।
    नोट: इससे पता चलता है कि HSPA5 इस अध्ययन में HT29-व्युत्पन्न ट्यूमरमंडल में एंटी-एपोप्टोसिस के लिए जिम्मेदार था(चित्रा 3A)। विशिष्ट कार्यात्मक क्षेत्र को संकीर्ण करने के लिए, केजीजी, गो या पैंथर वर्गीकरण का उपयोग वैकल्पिक रूप से विशिष्ट चालक जीन का चयन करने के लिए किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

कैंसर स्टेम सेल में तंत्र की जांच के लिए मॉडल स्थापित करने के लिए, कोलोरेक्टल HT29 कोशिकाओं को एक कम लगाव B27, EGF, bFGF, HGF, और IL6 युक्त प्लेट में विट्रो में कैंसर स्टेम की तरह ट्यूमरस्फीयर संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया गया । ट्यूमर के 100 माइक्रोन व्यास 7 दिनों में बनते थे(चित्रा 1A)। ट्यूमरमंडल को एकल कोशिकाओं के लिए ट्राइपसाइन किया गया था और एलजीआर 5 और सीडी 133 अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। एलजीआर 5 HT29-ड्राइव ट्यूमरमंडल में 1.1% से बढ़कर 11.4% हो गया और कोशिकाओं को प्रवाह साइटोमेट्री(चित्रा 1B)का उपयोग करके पता लगाया गया। एक अन्य स्टेमनेस मार्कर, सीडी 133, माता-पिता HT29 कोशिकाओं (चित्रा 1C) की तुलना में सुसंस्कृत HT29-व्युत्पन्न ट्यूमरमंडल में 61.8% से बढ़कर81.1%हो गया। इसके बाद ट्यूमर के आरोपी आरएनसीक्यू जांच के लिए तैयार हुए।

आरएनसीक्यू का उपयोग माता-पिता की HT29 कोशिकाओं की तुलना में HT29-व्युत्पन्न ट्यूमरस्फीयर में जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल की जांच करने के लिए किया गया था । दोनों नमूनों के लिए न्यूक्लियोटाइड रीडिंग में त्रुटि दर 0.03% थी। कुल जीन मैपिंग दर एचटी29 के लिए 87.87% और एचटी29-व्युत्पन्न ट्यूमरस्फीयर के लिए 87.25% थी। प्रति मिलियन ट्रांसक्रिप्ट (एफपीकेएम) के प्रति किलोबेस के टुकड़े, ट्रांसक्रिप्ट (एमआरएनए) अभिव्यक्ति का संकेत देने के लिए जासूसी गिनती को सामान्य करते हैं, 0 और 1 के बीच अंतराल HT29 कोशिकाओं के लिए 75.87% था, और एचटी29-व्युत्पन्न ट्यूमरस्फीयर के लिए 77.16% था। परिणामस्वरूप अनुक्रमण के लिए उपयुक्त थे । अनुक्रमण के बाद, लॉग2 गुना परिवर्तन के साथ जीन और अपररेगुलेशन में जीटी;1 और <-1 डाउनरेगुलेशन में पी वैल्यू और लेफ्टिनेंट के साथ 0.05हीटमैप (चित्रा 2 ए,तालिका 1, तालिका2)द्वारा दिखाया गया था। ७९ अपनयनित जीन और ३३ डाउनरेगुयन्ड जीन चुने गए । इसके अलावा, लॉग2 गुना परिवर्तन और पी मूल्य (-log10 पी मूल्य) का उपयोग कर ज्वालामुखी साजिश HT29-व्युत्पन्न ट्यूमरमंडल और माता पिता HT29 कोशिकाओं(चित्रा 2B)के बीच महत्वपूर्ण जीन भेद करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । प्रारंभिक चयन के आधार पर, तीन संभावित उपनियमित जीन की पहचान की गई, जिसमें HT29-व्युत्पन्न ट्यूमरमंडल(चित्रा 2 ए)में ACSS2, HMGCS1और PCSK9शामिल हैं । इसके अलावा, ड्राइवर जीन की पहचान करने के लिए केवल log2 गुना परिवर्तन के अनुसार नहीं, NetworkAnalyst का उपयोग किया गया था। पी वैल्यू के साथ लॉग2 गुना चेंज और जीटी;1 के साथ अपैरल जीन्स का विश्लेषण किया गया और इसके परिणामस्वरूप एचएसपीए5, एचएसपी 90ए1, बीआरसीए1, एसएफएन, ई2एफ1, CYCS, सीडीसी6, ALYREF, SQSTM1और TOMM40 (चित्रा 3A)सहित जीन नेटवर्क को क्रॉस-लिंक किया गया । बीज जीन के कार्य और महत्व की पहचान करने के लिए, वर्गीकरण इंटरफेस का उपयोग एचटी29-व्युत्पन्न ट्यूमरस्फीयर में एंटी-एपोप्टोसिस में शामिल जीन को निर्धारित करने के लिए पैंथर बीपी प्रदर्शन करने के लिए किया जा सकता है। परिणामों से संकेत मिलता है कि HSPA5 और SQSTM1 एपोप्टोसिस(चित्रा 3A)के नकारात्मक विनियमन के साथ जुड़े थे । इसके अलावा, चयनित 10 जीन फलस्वरूप मान्य थे; क्यूपीसीआर(चित्रा 3बी)का उपयोग करके पुष्टि किए गए HT29-व्युत्पन्न ट्यूमरमंडल में अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई।

Figure 1
चित्रा 1: विट्रो में कैंसर स्टेम की तरह ट्यूमरस्फीयर की स्थापना। (A)HT29 का इस्तेमाल ट्यूमर के बनने के लिए किया गया था और HT29-व्युत्पन्न ट्यूमरमंडल (स्केल बार = 100 माइक्रोन) में(बी)एलजीआर5 का पता चला था। (ग)CD133 स्थापित ट्यूमरमंडल में स्टेमनेस पात्रों की पहचान करने के लिए एक और मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: हीटमैप और ज्वालामुखी साजिश HT29-व्युत्पन्न ट्यूमरमंडल में अंतर जीन का चयन करने के लिए इस्तेमाल किया गया । लॉग2 गुना परिवर्तन और जीटी 1 और <-1 के साथ पढ़ा गिनती और जीटी;100, पी वैल्यू < 0.05 का इस्तेमाल गैर-महत्वहीन जीन को बाहर करने और यह सुनिश्चित करने के लिए किया गया था कि डेटा सटीक थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: HT29-व्युत्पन्न ट्यूमरमंडल में ड्राइवर जीन की पहचान करने के लिए NetworkAnalyst का उपयोग किया गया था। (क)उपनियमित जीन का चयन और विश्लेषण किया गया, और एक वर्गीकरण इंटरफेस, पैंथर बीपी, अंतर चालक जीन के लिए संभावित कार्य प्रदान की है । (ख)तब, माता-पिता HT29 कोशिकाओं की तुलना में HT29-व्युत्पन्न ट्यूमरमंडल में उपविधि प्राप्त 10 जीन को मान्य करने के लिए क्यूपीसीआर का उपयोग किया जाता था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 1: आरएनसीक्यू द्वारा विश्लेषण किए गए माता-पिता HT29 कोशिकाओं की तुलना में HT29-serived ट्यूमरमंडल में अपविनियमित जीन। कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 2: आरएनसीक्यू द्वारा विश्लेषण किए गए माता-पिता HT29 कोशिकाओं की तुलना में HT29-serived ट्यूमरमंडल में डाउनरेगुइट जीन। कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस अध्ययन में, सुसंस्कृत कैंसर स्टेम जैसे ट्यूमरमंडलों को उपलब्ध बायोइन्फॉर्मेटिक्स के साथ आरएनसीक्यू डेटा का विश्लेषण करने में एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया था। एक रोग मॉडल के लिए, HT29-व्युत्पन्न ट्यूमरमंडल का उपयोग किया गया था। क्योंकि ट्यूमर के नेतृत्व में ट्यूमर चिकित्सा के खिलाफ दवा प्रतिरोध है, स्थापित मॉडल जीन अभिव्यक्ति में मतभेदों की जांच करके प्रतिरोध के विस्तृत तंत्र की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, उपलब्ध बायोइन्फॉर्मेटिक्स के साथ आरएनसीक्यू का उपयोग करके जीनोमिक तकनीक अध्ययन मॉडल की तेजी से समझ प्रदान करती है ताकि संभावित रूप से शामिल जीन को उच्च आत्मविश्वास के साथ मान्य किया जा सके। साथ ही ट्यूमर के बनने में किस तरह के जीन की पहचान की जा सकती है।

आरएनएईक्यू विश्लेषण32के लिए आरएनए की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है। सुनिश्चित करें कि नमूना RIN और gt;7 है, क्योंकि यह मानचित्रण पढ़ता है, जीन मानचित्रण, और FPKM के बीच निश्चितता बढ़ जाती है । आरएनसीक्यू डेटा का विश्लेषण करते समय, आईपीए29 और नेटवर्कएनालिस्ट30 संभावित जीन और सिग्नलिंग रास्तों की पहचान करने के लिए उपलब्ध थे । हालांकि, निम्नलिखित मापदंडों के अनुसार अनावश्यक जीन से इंकार करना आवश्यक है: प्रायोगिक समूह में पढ़े गए काउंट और जीटी 100 के साथ एक और gt;1 लॉग2 गुना परिवर्तन दिखा रहे जीन, और नियंत्रण समूह में पढ़े गए गिनती और जीटी 100 के साथ जीन और एलटी;1 लॉग2 गुना परिवर्तन। क्यूपीसीआर या पश्चिमी ब्लॉट्स का उपयोग करके परिणामी सत्यापन के लिए उच्च पठन गणनाएं आसान हैं।

जैविक कार्यों और प्रक्रियाओं की समझ के आधार पर, कई बायोइन्फॉर्मेटिक्स उपकरण हैं जो ब्याज की बीमारियों के संभावित तंत्रों की तेजी से जांच की अनुमति देते हैं। आरएनसीक्यू जैसे जीन अभिव्यक्ति के लिए स्क्रीन करने के लिए एक उच्च थ्रूपुट उपकरण के साथ संयुक्त, अध्ययन रोगों के विकास को विनियमित करने वाले संभावित तंत्र का प्रस्ताव और जांच की जा सकती है। यहां, HT29 से प्राप्त सीआरसी स्टेम जैसे ट्यूमरमंडल के गठन की जांच करने की विधि से पता चला है कि SQSTM1 और HSPA5 लक्ष्य जीन उपनियमित थे और ट्यूमरमंडल में एंटी-एपोप्टोसिस में शामिल थे । इसलिए, इन जीनों के विस्तृत तंत्र की जांच करने के लिए और अधिक प्रयोग तैयार किए जा सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप अनुसंधान अध्ययन करते समय अधिक आत्मविश्वास और प्रभावकारिता होती है।

यहां, ट्यूमरस्फीयर में केवल उपनियमित जीन का विश्लेषण किया गया क्योंकि विकास कारकों के अलावा अप्रेगुलेशन को प्रेरित माना जाता था। अन्यथा, यदि प्रयोग ट्यूमर कोशिकाओं में जीन नॉकडाउन का इस्तेमाल किया, डाउनरेडाइनल जीन लक्ष्य है कि जैव सूचना का उपयोग कर जांच के लिए चुना जा सकता है के रूप में माना जाएगा । हालांकि कार्यप्रणाली तेजी से और भरोसेमंद है, बाद में सत्यापन अभी भी qPCR और पश्चिमी दाग के माध्यम से की जरूरत है । यह भी सुझाव दिया जाता है कि जीन अभिव्यक्ति सत्यापन के लिए अधिक सेल लाइनों का उपयोग किया जाए, विशेष रूप से नैदानिक नमूनों के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रासंगिक वित्तीय खुलासे नहीं हैं ।

Acknowledgments

लेखक तकनीकी सहायता के लिए इंस्टीट्यूट फॉर रेडियोलॉजिकल रिसर्च, चांग गुंग मेमोरियल अस्पताल के विकिरण जीव विज्ञान कोर प्रयोगशाला का शुक्रिया अदा करते हैं । इस अध्ययन को चांग गुंग मेमोरियल अस्पताल (CMRPD1J0321), चेंग हसीन जनरल अस्पताल (CHGH 106-06), और मैके मेमोरियल अस्पताल (एमएमएच-सीटी-१०६०५ और एमएमएच-106-61) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । फंडिंग निकायों का अध्ययन और डेटा संग्रह, विश्लेषण और डेटा की व्याख्या या पांडुलिपि लिखने के डिजाइन में कोई प्रभाव नहीं था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
iRiS Digital Cell Imaging System Logos Biosystems, Inc I10999 for observing the formation of tumorspheres
Flow cytometry BD biosciences FACSCalibur for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres
anti-LGR5-PE Biolegend 373803 LGR5 detection reagent
anti-CD133-PE Biolegend 372803 CD133 detection reagent
EGF GenScript Z00333 for culture of tumorspheres
bFGF GenScript Z03116 for culture of tumorspheres
HGF GenScript Z03229 for culture of tumorspheres
IL6 GenScript Z03034 for culture of tumorspheres
PureLink RNA extraction kit Invitrogen 12183025 isolate total RNA for RNAseq analysis
RNAseq performance Biotools, Taiwan RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan
NetworkAnalyst Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada http://www.networkanalyst.ca/
Prism GraphPad Software a statistical analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors. Przegląd Gastroenterologiczny. 14 (2), 89-103 (2019).
  2. Wong, M. C., Ding, H., Wang, J., Chan, P. S., Huang, J. Prevalence and risk factors of colorectal cancer in Asia. Intestinal Research. 17 (3), 317-329 (2019).
  3. Liu, Q., et al. Positive expression of basic transcription factor 3 predicts poor survival of colorectal cancer patients: possible mechanisms involved. Cell Death & Disease. 10 (7), 509 (2019).
  4. Slattery, M. L., et al. Dysregulated genes and miRNAs in the apoptosis pathway in colorectal cancer patients. Apoptosis. 23 (3-4), 237-250 (2018).
  5. Arteaga, C. L., Engelman, J. A. ERBB receptors: from oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics. Cancer Cell. 25 (3), 282-303 (2014).
  6. Yarden, Y., Pines, G. The ERBB network: at last, cancer therapy meets systems biology. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 553-563 (2012).
  7. Cheng, C. C., et al. YM155 as an inhibitor of cancer stemness simultaneously inhibits autophosphorylation of epidermal growth factor receptor and G9a-mediated stemness in lung cancer cells. PLoS One. 12 (8), 0182149 (2017).
  8. Prasetyanti, P. R., Medema, J. P. Intra-tumor heterogeneity from a cancer stem cell perspective. Molecular Cancer. 16 (1), 41 (2017).
  9. Zhao, Y., et al. CD133 expression may be useful as a prognostic indicator in colorectal cancer, a tool for optimizing therapy and supportive evidence for the cancer stem cell hypothesis: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (9), 10023-10036 (2016).
  10. Choi, J. E., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell markers in colorectal adenocarcinoma: Clinicopathological significance. Oncology Reports. 38 (3), 1695-1705 (2017).
  11. Massard, C., Deutsch, E., Soria, J. C. Tumour stem cell-targeted treatment: elimination or differentiation. Annals of Oncology. 17 (11), 1620-1624 (2006).
  12. Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66 (10), 1802-1810 (2017).
  13. Dallas, N. A., et al. Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition. Cancer Research. 69 (5), 1951-1957 (2009).
  14. Chang, Y. F., et al. STAT3 induces G9a to exacerbate HER3 expression for the survival of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors in lung cancers. BMC Cancer. 19 (1), 959 (2019).
  15. Catalano, V., et al. Colorectal cancer stem cells and cell death. Cancers (Basel). 3 (2), 1929-1946 (2011).
  16. Piggott, L., et al. Suppression of apoptosis inhibitor c-FLIP selectively eliminates breast cancer stem cell activity in response to the anti-cancer agent, TRAIL. Breast Cancer Research. 13 (5), 88 (2011).
  17. Chung, S. Y., et al. Two novel SHP-1 agonists, SC-43 and SC-78, are more potent than regorafenib in suppressing the in vitro stemness of human colorectal cancer cells. Cell Death Discovery. 4, 25 (2018).
  18. Cheng, C. C., et al. STAT3 exacerbates survival of cancer stem-like tumorspheres in EGFR-positive colorectal cancers: RNAseq analysis and therapeutic screening. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 60 (2018).
  19. Kleist, B., Xu, L., Li, G., Kersten, C. Expression of the adult intestinal stem cell marker Lgr5 in the metastatic cascade of colorectal cancer. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 4 (4), 327-335 (2011).
  20. Medema, J. P. Targeting the Colorectal Cancer Stem Cell. New England Journal of Medicine. 377 (9), 888-890 (2017).
  21. Sahlberg, S. H., Spiegelberg, D., Glimelius, B., Stenerlow, B., Nestor, M. Evaluation of cancer stem cell markers CD133, CD44, CD24: association with AKT isoforms and radiation resistance in colon cancer cells. PLoS One. 9 (4), 94621 (2014).
  22. Xia, J., Gill, E. E., Hancock, R. E. NetworkAnalyst for statistical, visual and network-based meta-analysis of gene expression data. Nature Protocols. 10 (6), 823-844 (2015).
  23. Gagan, J., Van Allen, E. M. Next-generation sequencing to guide cancer therapy. Genome Medicine. 7 (1), 80 (2015).
  24. Panichnantakul, P., Bourgey, M., Montpetit, A., Bourque, G., Riazalhosseini, Y. RNA-Seq as a Tool to Study the Tumor Microenvironment. Methods in Molecular Biology. 1458, 311-337 (2016).
  25. Kanehisa, M., Sato, Y. KEGG Mapper for inferring cellular functions from protein sequences. Protein Science. 29 (1), 28-35 (2020).
  26. Ashburner, M., et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature Genetics. 25 (1), (2000).
  27. The Gene Ontology Collective. The Gene Ontology Resource: 20 years and still GOing strong. Nucleic Acids Research. 47, 330-338 (2019).
  28. Mi, H., Muruganujan, A., Thomas, P. D. PANTHER in 2013: modeling the evolution of gene function, and other gene attributes, in the context of phylogenetic trees. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 377-386 (2013).
  29. Yu, F., Shen, X. Y., Fan, L., Yu, Z. C. Genome-wide analysis of genetic variations assisted by Ingenuity Pathway Analysis to comprehensively investigate potential genetic targets associated with the progression of hepatocellular carcinoma. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 18 (15), 2102-2108 (2014).
  30. Zhou, G., et al. NetworkAnalyst 3.0: a visual analytics platform for comprehensive gene expression profiling and meta-analysis. Nucleic Acids Research. 47 (1), 234-241 (2019).
  31. Cheng, C. C., et al. Epidermal growth factor induces STAT1 expression to exacerbate the IFNr-mediated PD-L1 axis in epidermal growth factor receptor-positive cancers. Molecular Carcinogenesis. 57 (11), 1588-1598 (2018).
  32. Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).

Tags

रिऐक्शन इश्यू 161 कोलोरेक्टल कैंसर कैंसर स्टेम सेल सीडी 133 एचटी29 एलजीआर 5 आरएनसीक्यू नेटवर्कएनालिस्ट
कोलोरेक्टल HT29 में ड्राइवर जीन की खोज-व्युत्पन्न कैंसर स्टेम की तरह ट्यूमरमंडल
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, C. C., Hsu, P. J., Sie, Z.… More

Cheng, C. C., Hsu, P. J., Sie, Z. L., Chen, F. H. Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres. J. Vis. Exp. (161), e61077, doi:10.3791/61077 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter