Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Opdagelsen af Driver Gener i Kolorektal HT29-afledt Cancer Stem-Lignende Tumorsfærer

Published: July 22, 2020 doi: 10.3791/61077
Automatic Translation
1, 4, 1, 1,2,3
1Radiation Biology Research Center, Institute for Radiological Research, Chang Gung University, Chang Gung Memorial Hospital at Linkou, 2Department of Medical Imaging and Radiological Sciences, Chang Gung University, 3Department of Radiation Oncology, Chang Gung Memorial Hospital, 4Department of Laboratory Medicine, Mackay Memorial Hospital

Summary

Præsenteret her er en protokol til at opdage de overudtrykte driver gener opretholde de etablerede kræft stamceller-lignende celler stammer fra kolorektal HT29 celler. RNAseq med tilgængelig bioinformatik blev udført for at undersøge og screene genekspressionnetværk for at belyse en potentiel mekanisme, der er involveret i overlevelsen af målrettede tumorceller.

Abstract

Kræft stamceller spiller en afgørende rolle mod kliniske behandlinger, bidrager til tumor tilbagefald. Der er mange onkogener involveret i tumorigenesis og indledningen af kræft stængelegenskaber. Da genekspression i dannelsen af kolorektal cancer-afledte tumorsfærer er uklart, det tager tid at opdage de mekanismer, der arbejder på et gen ad gangen. Denne undersøgelse viser en metode til hurtigt at opdage føreren gener involveret i overlevelsen af kolorektal cancer stamceller-lignende celler in vitro. Kolorektal HT29 kræftceller, der udtrykker LGR5 når dyrket som sfæroider og ledsage en stigning CD133 stængel markører blev udvalgt og brugt i denne undersøgelse. Den præsenterede protokol bruges til at udføre RNAseq med tilgængelige bioinformatik til hurtigt at afdække de overudtrykte driver gener i dannelsen af kolorektal HT29-afledte stængel-lignende tumorsfærer. Metoden kan hurtigt screene og opdage potentielle drivergener i andre sygdomsmodeller.

Introduction

Kolorektal cancer (CRC) er en førende dødsårsag med høj prævalens og dødelighed påverdensplan 1,2. På grund af genmutationer og forstærkninger vokser kræftcellerne uden proliferativ kontrol, hvilket bidrager til celleoverlevelse3,anti-apoptose4og kræftstændthed5,,6,7. Inden for en tumor væv, tumor heterogenitet tillader tumorceller til at tilpasse sig og overleve under terapeutiske behandlinger8. Kræft stamceller (CSCs), med en højere grad af selvfornyelse og pluripotency end differentialkræft typer, er hovedansvarlige for tumor tilbagefald9,,10 og metastatisk CRC11. CsCs nuværende mere resistens12,,13,,14 og anti-apoptose egenskaber15,,16, dermed overlevende tumor kemoterapi.

Her, for at undersøge den potentielle mekanisme for stamtændighed i de udvalgte CRC stamceller, RNAseq blev udført for at screene differentieret udtrykte gener i tumor sfæroider. Kræftcellerne kan danne sfæroider (også kaldet tumorsfærer), når de dyrkes i lav overholdelse betingelser og stimuleres af vækstfaktorer føjet til dyrket medium, herunder EGF, bFGF, HGF, og IL6. Derfor valgte vi CRC HT29 tumorceller, der modstår kemoterapi med en stigning i fosforyleret STAT3, når de behandles med oxaliplatin og irinotecon17. Desuden udtrykte HT29 højere stængelmarkører, når de dyrkes under de beskrevne kulturforhold. Den HT29-afledte CSC-model udtrykte større mængder leucinrige gentagende G-protein-koblede receptor 5 (LGR5)18, en specifik markør for CRC-stamceller19,20. Desuden, CD133, betragtes som en generel biomarkør for kræft stamceller, er også meget udtrykt i HT29 cellelinje21. Denne protokol formål er at opdage grupper af driver gener i de etablerede kræft stilk-lignende tumorsfærer baseret på bioinformatik datasæt i modsætning til at undersøge individuelle onkogener22. Det undersøger potentielle molekylære mekanismer gennem RNAseq analyse efterfulgt af tilgængelige bioinformatik analyser.

Næste generation sekventering er en høj-throughput, let tilgængelige, og pålidelig DNA sekventering metode baseret på beregningsmæssige hjælp, der anvendes til omfattende skærm driver gener til at vejlede tumor behandlinger23. Teknologien bruges også til at detektere genekspression fra omvendt transskription af en isoleret RNA-prøve24. Men når screening med RNAseq, de vigtigste gener til at målrette med terapi kan ikke have den højeste udtryksforskel mellem eksperimentelle og kontrol prøver. Derfor er der udviklet bioinformatik til klassificering og identifikation af gener baseret på aktuelle datasæt som KEGG25,GO26,27eller PANTHER28, herunder Ingenuity Pathway Analysis (IPA)29 og NetworkAnalyst30. Denne protokol viser integrationen af RNAseq og NetworkAnalyst for hurtigt at opdage en gruppe af gener i de valgte HT29-afledte sfæroider sammenlignet med forældre HT29-celler. Anvendelse af denne metode til andre sygdomsmodeller er også foreslået for at opdage forskelle i vigtige gener.

Sammenlignet med undersøgelse af individuelle genekspression, en høj-throughput teknik giver fordele at finde potentielle driver gener nemt for tumor præcision medicin. Med nyttige datasæt som KEGG, GO eller PANTHER kan specifikke gener identificeres baseret på sygdomsmodeller, signalveje eller specifikke funktioner, og det giver mulighed for hurtigt at fokusere på specifikke, vigtige gener, hvilket sparer tid og forskningsomkostninger. En lignende ansøgning anvendes i tidligere undersøgelser14,18,31. Især, en tumor er mere kompliceret, fordi forskellige typer af tumorer udtrykke skelne gener og veje for overlevelse og spredning. Derfor kan denne protokol afhente gener, der adskiller forskellige tumortyper under forskellige omstændigheder. Der er potentiale til at finde effektive strategier mod kræft ved at forstå mekanismen for specifikke genekspression.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellekultur og tumorsfæredannelse

  1. Kultur HT29 celler i en 10 cm skål, der indeholder Dulbecco's modificerede ørn medium (DMEM) med 10% føtal kvæg serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin antibiotikum (P / S).
  2. Cellerne vokser i en inkubator ved 37 °C med 5% CO2 og 95% luftfugtighed under aseptiske forhold, indtil de når 80% sammenflydende.
  3. Trypsinize HT29 celler med 1 ml af 0,25% trypsin i 5 min ved 37 °C og dermed neutralisere trypsin ved at tilføje 2 ml DMEM med 10% FBS og 1% P / S.
  4. Tæl HT29-cellerne ved hjælp af et hæmocyometer.
  5. Der tilsættes 2.000 celler/brønd til en lav vedhæftet 6 brøndplader med 2 ml serumfri DMEM med 1% P/S og suppleret med 0,2% B27, 20 ng/ml epidermal vækstfaktor (EGF), 20 ng/ml fibroblast vækstfaktor (bFGF), 20 ng/ml hepatocyt vækstfaktor (HGF), og 20 ng/ml af interleukin 6 (IL6).
  6. Cellerne vokser ved 37 °C med 5 % CO2 og 95 % luftfugtighed under aseptiske forhold.
  7. Tilsæt 0,5 ml kræft stamcellemedium hver 2 dage, indtil tumorsfærer foranstaltning > 100 μm i diameter i mindst 7 dage.
  8. Overhold og mål tumorsphere diameter ved hjælp af en omvendt mikroskop med en digital celle billeddannelse system.
  9. Når tumorsfærer nå > 100 μm i diameter, trypsinize tumorsfærer med 0,25% trypsin i 5 min ved 37 °C og neutralisere trypsin ved at tilføje 2x mængden af vækst medium. Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer.
  10. Centrifuge ved 1.200 rpm i 10 min og fjern supernatanten.
  11. 5 x 104 celler med 2 μL anti-LGR5-PE og 2 μL anti-CD133-PE i 100 μL DMEM individuelt i 30 min. ved stuetemperatur, der rystes ved 200 omdrejninger i minuttet.
    BEMÆRK: CD133 er en generel kræft stamcellebiomarkør, der er stærkt udtrykt i HT29 celler.
  12. Der tilsættes 900 μL PBS, og LGR5- og CD133-udtrykket analyseres ved hjælp af flowcytometri. En ændring i fluorescens i FL2-H-kanalen indikerer genekspression.

2. RNA-isolation

BEMÆRK: Brug et kommercielt sæt (se materialetabel)med en hurtig kolonne til RNA-isolering i overensstemmelse med producentens anvisninger.

  1. Der tilsættes 50 μL PBS til de høstede celler (2 x10 5 celler) og resuspenderes dem med pipettering.
  2. Der tilsættes 200 μL lysisbuffer indeholdende 2 μL beta-mercaptoethanol (β-ME). Vortex hurtigt og lad stå i 5 min.
  3. Opløsningen centrifugeres ved 16.000 x g i 10 min. Supernatanten opsames og blandes med 200 μL 70% ethanol.
  4. Brug den vedlagte kolonne til at fjerne opløsningsmidlet ved centrifugering ved 14.000 x g i 1 min.
  5. Vask med vaskeopløsning 1 og 2 for helt at fjerne ikke-RNAs ved centrifugering ved 14.000 x g i 1 min.
  6. Centrifuge igen ved 14.000 x g i 2 min for at fjerne resterende ethanol.
  7. Der tilsættes 50 μL destilleret vand, centrifugeres ved 14.000 x g i 1 min.
  8. RNA-koncentrationen måles ved hjælp af OD260 med et spektrofotometer.
    RNA-koncentration (μg/ml) = (OD260) x (40 μg RNA/ml) og OD260/OD280 > 2. RNA-prøver skal have et RNA-integritetsnummer (RIN) > 7.

3. RNAseq profilering og bioinformatik analyse

BEMÆRK: RNAseq-analysen blev udført Table of Materialskommercielt (se materialetabel) for at undersøge differentialgenerne i de HT29-afledte tumorsfærer sammenlignet med forældrenes HT29-celler.

  1. Brug kommercielle tjenester til RNAseq-trin, herunder bibliotekskonstruktion, kvalitetskontrol af biblioteket og DNA-sekvensering.
  2. Datarapporten skal indeholde vigtige oplysninger, herunder antallet af læsninger, ændring af log2-foldning og p-værdi. Vælg differentialgenerne i henhold til følgende parametre: gener med en > 1 log2-foldændring med læsetællinger >100 i HT29-tumorsfæregruppen og gener <-1 log2-foldændring med læseantal >100 i HT29-forældregruppen. I dette tilfælde blev en p-værdi < 0,05 anset for acceptabel, og dataene blev anvendt (tabel 1).
    BEMÆRK: Her blev et genantal >100 brugt som tærskel til at fortsætte studiet af et bestemt gen og validere dets udtryk.
  3. Brug statistisk analysesoftware (se Materialetabel), til at vise et heatmap og identificere overudtrykte gener >1 og nedregulerede gener < 1 i log2-foldændring.
  4. Brug R software til at tegne Volcano Plot med x: log2 fold forandring; y: -log10 (p værdi) for at vise differentialgenerne.
    1. Installer R-bibliotek
      install.packages(library(calibrate))
    2. Læs dataene i RStudio med følgende program:
      res <-read.csv("/Brugere/xxx.csv", header=T)
      hoved(res)
      med(res, plot(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, main="HT29CSC vs HT29", xlim=c(-6,6), col="#C0C0C0"))
      med(undersæt(res,pvalue<.05 & log2FoldChange>1), punkter(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="rød"))
      med(undersæt(res,pvalue<.05 & log2FoldChange<(-1)), punkter(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="blå"))
      med(delsæt(res,pvalue>.05), punkter(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="#444444"))
      abline(h=1,3, lty=2)
      abline(v=1, lty=2)
      abline(v=-1), lty=2)
    3. Udfør køre for at opnå Volcano Plot.

4. Valg af drivergen

  1. Vælg Enkelt geninput i NetworkAnalyst.
  2. Kopier og indsæt de udvalgte overudtrykte gener fra tabel 1 med "human" angivet som organisme og ID type officielle gensymbol.
    BEMÆRK: Alternativt kan du bruge Ensembl Gene ID til kopiering og ind at indsætte.
  3. Indsæt dataene ved at klikke på Upload og Fortsæt for at analysere det ved hjælp af protein-protein interaktion (PPI) efter genetisk PPI.
  4. Brug STRING interactome databasen med en tillidsscore cutoff på 900 for at vise frøgener, der kryds forbinder de uploadede gener. Frøgener forbinder med mere individuelle gener blev valgt som driver gener, der kan være involveret i at opretholde dannelsen af HT29-afledte tumorsfærer.
    BEMÆRK: Der er tre interactome datasæt til brug: IMEx, STRING og Rolland. STRING indeholder eksperimentelle beviser for højere tillid. Med lavere uploadede gennumre kan IMEx vælges til at forudsige og afhente drivergene i de interagerende netværk.
  5. Vælg Fortsæt i tilknytningsoversigten.
  6. Vælg Hvid i baggrunds- og kraftatlassen i layoutknappen.
  7. Vælg PANTHER BP for at analysere upregulationsgengruppen.
    BEMÆRK: Dette viser, at HSPA5 var ansvarlig for anti-apoptose i HT29-afledte tumorsfærer i denne undersøgelse (Figur 3A). For at indsnævre det specifikke funktionelle felt kan KEGG,GO eller PANTHER klassificering bruges alternativt til at vælge de specifikke drivergener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at etablere modellen til undersøgelse af mekanismen i kræft stamceller, kolorektal HT29 celler blev brugt til at dyrke kræft stamceller in vitro i en lav-vedhæftede fil plade indeholdende B27, EGF, bFGF, HGF, og IL6. Tumorsfærerne >100 μm i diameter blev dannet i 7 dage (Figur 1A). Tumorsfærerne blev trypsiniseret til enkelte celler og analyseret ved hjælp af flowcytometri til at opdage LGR5 og CD133 udtryk. LGR5 steg i HT29-fordring tumorsfærer fra 1,1% til 11,4%, og cellerne blev opdaget ved hjælp af flow cytometri (Figur 1B). En anden stamtændighed markør, CD133, også steget fra 61,8% til 81,1% i de dyrkede HT29-afledte tumorsfærer i forhold til forældrenes HT29 celler (Figur 1C). Derefter, tumorsfærerne var klar til RNAseq undersøgelse.

RNAseq blev brugt til at undersøge genekspressionprofilen i HT29-afledte tumorsfærer sammenlignet med de forældre ht29-celler. Fejlprocenten ved nukleotidaflæsning var 0,03% for begge prøver. Den samlede genkortlægningsrate var 87,87% for HT29 og 87,25% for HT29-afledte tumorsfærer. Fragmenterne pr kilobase af udskrift per million (FPKM), normalisere detektiv tæller for at angive udskrift (mRNA) udtryk, interval mellem 0 og 1 var 75,87% for HT29 celler, og 77,16% for HT29-afledte tumorsfærer. Resultaterne var egnede til efterfølgende sekvensering. Efter sekvensering aflæsninger blev generne med log2 fold-change >1 i upregulation og <-1 i nedregulering med p-værdi < 0,05 vist ved heatmap (Figur 2A,Tabel 1,Tabel 2) valgt. Der blev udvalgt 79 opregulerede gener og udvalgt 33 nedregulerede gener. Desuden blev Volcano plot ved hjælp af log2 fold forandring og p værdi (-log10 p værdi) bruges til at skelne de betydelige gener mellem HT29-afledte tumorsfærer og forældrenes HT29 celler (Figur 2B). Baseret på den foreløbige udvælgelse, tre potentielt upregulated gener blev identificeret, herunder ACSS2, HMGCS1, og PCSK9, i HT29-afledte tumorer (Figur 2A). For at identificere driverens gener ikke udelukkende i henhold til ændringen af log2-folden blev NetworkAnalyst desuden anvendt. De upregulated gener med log2 fold forandring > 1 med p værdi <0,05 blev analyseret og resulterede i 10 frø gener krydskobling af gennetværk, herunder HSPA5, HSP90AA1, BRCA1, SFN, E2F1, CYCS, CDC6, ALYREF, SQSTM1, og TO4MM0 (Figur 3A). For at identificere frøgenerenes funktion og betydning kan klassificeringsgrænsefladen bruges til at udføre PANTHER BP til at bestemme de gener, der er involveret i anti-apoptose i HT29-afledte tumorsfærer. Resultaterne viste, at HSPA5 og SQSTM1 var forbundet med negativ regulering af apoptose (figur 3A). Desuden blev de udvalgte 10 gener derfor valideret; ekspression øget i HT29-afledte tumorsfærer som bekræftet ved hjælp af qPCR (Figur 3B).

Figure 1
Figur 1: Etablering af kræft stilk-lignende tumorsfære in vitro. (A) HT29 blev brugt til at danne tumorer, og (B) LGR5 blev påvist i HT29-afledte tumorsfærer (Scale bar = 100 μm). (C) CD133 blev brugt som en anden markør til at identificere stængelceller i de etablerede tumorsfærer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Heatmap og Volcano plot blev brugt til at vælge differentiale gener i HT29-afledte tumorsfærer. Log2-foldningsændring >1 og <-1 med læseantal >100, p-værdi < 0,05 blev brugt til at udelukke ikke-ubetydelige gener og sikre, at dataene var nøjagtige. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: NetworkAnalyst blev brugt til at identificere førerens gener i HT29-afledte tumorsfærer. (A)De upregulerede gener blev udvalgt og analyseret derfor, og en klassificeringsgrænseflade, PANTHER BP, gav de potentielle funktioner for de differentierede drivergener. (B)Derefter, qPCR blev brugt til at validere de 10 gener upregulated i HT29-afledte tumorsfærer i forhold til forældrenes HT29 celler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1: De upregulated gener i HT29-serived tumorsfærer i forhold til forældrenes HT29 celler analyseret af RNAseq. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: De nedregulerede gener i HT29-serived tumorsfærer i forhold til forældrenes HT29 celler analyseret af RNAseq. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne undersøgelse, dyrket kræft stilk-lignende tumorsfærer blev brugt som en model i at analysere RNAseq data med tilgængelige bioinformatik. For en sygdom model, HT29-afledte tumorsfærer blev brugt. Fordi tumorsfærer har resistens over for tumorbehandlinger, den etablerede model kan bruges til at undersøge de detaljerede mekanismer for resistens ved at undersøge forskelle i genekspression. Desuden giver genomisk teknologi, der anvender RNAseq med tilgængelig bioinformatik, en hurtig forståelse af studiemodellen, så de potentielt involverede gener kan valideres med større sikkerhed. Også, den slags gener, der er involveret i dannelsen af tumorsfærer kan identificeres.

RNA-kvalitet er afgørende for RNAseq-analysen32. Sørg for, at prøven har RIN >7, da det øger sikkerheden mellem kortlægningslæsninger, kortlægning af gener og FPKM. Ved analyse af RNAseq-data var IPA29 og NetworkAnalyst30 tilgængelige til at identificere potentielle gener og signalveje. Det er dog vigtigt at udelukke de unødvendige gener i henhold til følgende parametre: gener, der viser en >1 log2-foldændring med læsetællinger >100 i forsøgsgruppen, og gener <-1 log2-foldændring med læseantal > 100 i kontrolgruppen. Højere læsetal er nemmere for efterfølgende validering ved hjælp af qPCR eller western blots.

Baseret på forståelsen af biologiske funktioner og processer, der er mange bioinformatik værktøjer giver mulighed for hurtig undersøgelse af de potentielle mekanismer af sygdomme af interesse. Kombineret med et værktøj med høj kapacitet til at screene for genekspression såsom RNAseq kan potentielle mekanismer, der regulerer udviklingen af de undersøgte sygdomme, foreslås og undersøges. Her viste metoden til undersøgelse af dannelsen af CRC-stængellignende tumorsfærer afledt af HT29, at SQSTM1 og HSPA5 var målgener upregulated og involveret i anti-apoptose i tumorsfærer. Derfor kan flere eksperimenter designes til at undersøge den detaljerede mekanisme af disse gener, hvilket resulterer i mere tillid og effektivitet, når de udfører forskningsundersøgelser.

Her blev kun de upregulated gener i tumorsfærerne analyseret, fordi upregulering blev anset for at være induceret ved tilsætning af vækstfaktorerne. Ellers, hvis forsøget anvendes gen knockdown i tumorceller, de nedregulerede gener vil blive betragtet som mål, der kan vælges til undersøgelse ved hjælp af bioinformatik. Selv om metoden er hurtig og pålidelig, er der stadig behov for efterfølgende validering via qPCR og western blots. Det foreslås også, at der anvendes flere cellelinjer til validering af genekspression, især til kliniske prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen relevante finansielle oplysninger.

Acknowledgments

Forfatterne takker Radiation Biology Core Laboratory of Institute for Radiological Research, Chang Gung Memorial Hospital, for teknisk support. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Chang Gung Memorial hospital (CMRPD1J0321), Cheng Hsin General Hospital (CHGH 106-06), og Mackay Memorial Hospital (MMH-CT-10605 og MMH-106-61). Finansieringsorganerne havde ingen indflydelse på udformningen af undersøgelsen og dataindsamlingen, analysen og fortolkningen af data eller skriftligt manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
iRiS Digital Cell Imaging System Logos Biosystems, Inc I10999 for observing the formation of tumorspheres
Flow cytometry BD biosciences FACSCalibur for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres
anti-LGR5-PE Biolegend 373803 LGR5 detection reagent
anti-CD133-PE Biolegend 372803 CD133 detection reagent
EGF GenScript Z00333 for culture of tumorspheres
bFGF GenScript Z03116 for culture of tumorspheres
HGF GenScript Z03229 for culture of tumorspheres
IL6 GenScript Z03034 for culture of tumorspheres
PureLink RNA extraction kit Invitrogen 12183025 isolate total RNA for RNAseq analysis
RNAseq performance Biotools, Taiwan RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan
NetworkAnalyst Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada http://www.networkanalyst.ca/
Prism GraphPad Software a statistical analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors. Przegląd Gastroenterologiczny. 14 (2), 89-103 (2019).
  2. Wong, M. C., Ding, H., Wang, J., Chan, P. S., Huang, J. Prevalence and risk factors of colorectal cancer in Asia. Intestinal Research. 17 (3), 317-329 (2019).
  3. Liu, Q., et al. Positive expression of basic transcription factor 3 predicts poor survival of colorectal cancer patients: possible mechanisms involved. Cell Death & Disease. 10 (7), 509 (2019).
  4. Slattery, M. L., et al. Dysregulated genes and miRNAs in the apoptosis pathway in colorectal cancer patients. Apoptosis. 23 (3-4), 237-250 (2018).
  5. Arteaga, C. L., Engelman, J. A. ERBB receptors: from oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics. Cancer Cell. 25 (3), 282-303 (2014).
  6. Yarden, Y., Pines, G. The ERBB network: at last, cancer therapy meets systems biology. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 553-563 (2012).
  7. Cheng, C. C., et al. YM155 as an inhibitor of cancer stemness simultaneously inhibits autophosphorylation of epidermal growth factor receptor and G9a-mediated stemness in lung cancer cells. PLoS One. 12 (8), 0182149 (2017).
  8. Prasetyanti, P. R., Medema, J. P. Intra-tumor heterogeneity from a cancer stem cell perspective. Molecular Cancer. 16 (1), 41 (2017).
  9. Zhao, Y., et al. CD133 expression may be useful as a prognostic indicator in colorectal cancer, a tool for optimizing therapy and supportive evidence for the cancer stem cell hypothesis: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (9), 10023-10036 (2016).
  10. Choi, J. E., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell markers in colorectal adenocarcinoma: Clinicopathological significance. Oncology Reports. 38 (3), 1695-1705 (2017).
  11. Massard, C., Deutsch, E., Soria, J. C. Tumour stem cell-targeted treatment: elimination or differentiation. Annals of Oncology. 17 (11), 1620-1624 (2006).
  12. Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66 (10), 1802-1810 (2017).
  13. Dallas, N. A., et al. Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition. Cancer Research. 69 (5), 1951-1957 (2009).
  14. Chang, Y. F., et al. STAT3 induces G9a to exacerbate HER3 expression for the survival of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors in lung cancers. BMC Cancer. 19 (1), 959 (2019).
  15. Catalano, V., et al. Colorectal cancer stem cells and cell death. Cancers (Basel). 3 (2), 1929-1946 (2011).
  16. Piggott, L., et al. Suppression of apoptosis inhibitor c-FLIP selectively eliminates breast cancer stem cell activity in response to the anti-cancer agent, TRAIL. Breast Cancer Research. 13 (5), 88 (2011).
  17. Chung, S. Y., et al. Two novel SHP-1 agonists, SC-43 and SC-78, are more potent than regorafenib in suppressing the in vitro stemness of human colorectal cancer cells. Cell Death Discovery. 4, 25 (2018).
  18. Cheng, C. C., et al. STAT3 exacerbates survival of cancer stem-like tumorspheres in EGFR-positive colorectal cancers: RNAseq analysis and therapeutic screening. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 60 (2018).
  19. Kleist, B., Xu, L., Li, G., Kersten, C. Expression of the adult intestinal stem cell marker Lgr5 in the metastatic cascade of colorectal cancer. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 4 (4), 327-335 (2011).
  20. Medema, J. P. Targeting the Colorectal Cancer Stem Cell. New England Journal of Medicine. 377 (9), 888-890 (2017).
  21. Sahlberg, S. H., Spiegelberg, D., Glimelius, B., Stenerlow, B., Nestor, M. Evaluation of cancer stem cell markers CD133, CD44, CD24: association with AKT isoforms and radiation resistance in colon cancer cells. PLoS One. 9 (4), 94621 (2014).
  22. Xia, J., Gill, E. E., Hancock, R. E. NetworkAnalyst for statistical, visual and network-based meta-analysis of gene expression data. Nature Protocols. 10 (6), 823-844 (2015).
  23. Gagan, J., Van Allen, E. M. Next-generation sequencing to guide cancer therapy. Genome Medicine. 7 (1), 80 (2015).
  24. Panichnantakul, P., Bourgey, M., Montpetit, A., Bourque, G., Riazalhosseini, Y. RNA-Seq as a Tool to Study the Tumor Microenvironment. Methods in Molecular Biology. 1458, 311-337 (2016).
  25. Kanehisa, M., Sato, Y. KEGG Mapper for inferring cellular functions from protein sequences. Protein Science. 29 (1), 28-35 (2020).
  26. Ashburner, M., et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature Genetics. 25 (1), (2000).
  27. The Gene Ontology Collective. The Gene Ontology Resource: 20 years and still GOing strong. Nucleic Acids Research. 47, 330-338 (2019).
  28. Mi, H., Muruganujan, A., Thomas, P. D. PANTHER in 2013: modeling the evolution of gene function, and other gene attributes, in the context of phylogenetic trees. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 377-386 (2013).
  29. Yu, F., Shen, X. Y., Fan, L., Yu, Z. C. Genome-wide analysis of genetic variations assisted by Ingenuity Pathway Analysis to comprehensively investigate potential genetic targets associated with the progression of hepatocellular carcinoma. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 18 (15), 2102-2108 (2014).
  30. Zhou, G., et al. NetworkAnalyst 3.0: a visual analytics platform for comprehensive gene expression profiling and meta-analysis. Nucleic Acids Research. 47 (1), 234-241 (2019).
  31. Cheng, C. C., et al. Epidermal growth factor induces STAT1 expression to exacerbate the IFNr-mediated PD-L1 axis in epidermal growth factor receptor-positive cancers. Molecular Carcinogenesis. 57 (11), 1588-1598 (2018).
  32. Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).

Tags

Tilbagetrækning kolorektal cancer kræft stamceller CD133 HT29 LGR5 RNAseq NetworkAnalyst
Opdagelsen af Driver Gener i Kolorektal HT29-afledt Cancer Stem-Lignende Tumorsfærer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, C. C., Hsu, P. J., Sie, Z.… More

Cheng, C. C., Hsu, P. J., Sie, Z. L., Chen, F. H. Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres. J. Vis. Exp. (161), e61077, doi:10.3791/61077 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter