Summary
Aquí se presenta un protocolo para descubrir los genes conductores sobreexpresados que mantienen las células similares al cáncer derivadas de las células HT29 colorrectales. RNAseq con bioinformática disponible se realizó para investigar y examinar las redes de expresión génica para esclarecer un mecanismo potencial implicado en la supervivencia de las células tumorales dirigidas.
Abstract
Las células madre cancerosas desempeñan un papel vital contra las terapias clínicas, contribuyendo a la recaída tumoral. Hay muchos oncogenes involucrados en la tumorigenesis y el inicio de las propiedades del tallo del cáncer. Dado que la expresión génica en la formación de tumores tirectales derivados del cáncer no está clara, se necesita tiempo para descubrir los mecanismos que trabajan en un gen a la vez. Este estudio demuestra un método para descubrir rápidamente los genes conductores implicados en la supervivencia de las células similares al cáncer colorrectal in vitro. En este estudio se seleccionaron y utilizaron células cancerosas HT29 colorrectales que expresan el LGR5 cuando se cultivan como esferoides y acompañan a un aumento de los marcadores de vástago CD133. El protocolo presentado se utiliza para realizar RNAseq con bioinformática disponible para descubrir rápidamente los genes controladores sobreexpresados en la formación de tumores tirásticos derivados del tallo colorrectal. La metodología puede detectar y descubrir rápidamente posibles genes conductores en otros modelos de enfermedades.
Introduction
El cáncer colorrectal (CRC) es una de las principales causas de muerte con alta prevalencia y mortalidad en todo el mundo1,,2. Debido a mutaciones genéticas y amplificaciones, las células cancerosas crecen sin control proliferativo, lo que contribuye a la supervivencia celular3,la antipoptosis4y la íltividad del cáncer5,,6,,7. Dentro de un tejido tumoral, la heterogeneidad tumoral permite que las células tumorales se adapten y sobrevivan durante los tratamientos terapéuticos8. Las células madre cancerosas (CSC), con una mayor tasa de auto-renovación y pluripotencia que los tipos diferenciales de cáncer, son principalmente responsables de la recurrencia tumoral9,,10 y la CRC metastásica11. Los CCC presentan más resistencia a los medicamentos12,13,14 y propiedades anti-apoptosis15,16, sobreviviendo así a las quimioterapias tumorales.
Aquí, con el fin de investigar el mecanismo potencial para el tallo en las células madre CRC seleccionadas, RNAseq se realizó para examinar los genes expresados diferencialmente en los esferoides tumorales. Las células cancerosas pueden formar esferoides (también llamados tumoresferas) cuando se cultivan en condiciones de baja adherencia y estimuladas por factores de crecimiento añadidos al medio cultivado, incluyendo EGF, bFGF, HGF, y IL6. Por lo tanto, seleccionamos células tumorales CRC HT29 que resisten las quimioterapias con un aumento de STAT3 fosforilado cuando se tratan con oxaliplatina e irinotecon17. Además, HT29 expresó marcadores de tallo más altos cuando se cultiva en las condiciones de cultivo descritas. El modelo CSC derivado de HT29 expresaba mayores cantidades de receptor acoplado por proteína G rico en leucina 5 (LGR5)18, un marcador específico de células madre CRC19,20. Además, CD133, considerado un biomarcador general para las células madre cancerosas, también está muy expresado en la línea celular HT2921. El propósito de este protocolo es descubrir grupos de genes conductores en las tumoresferas similares al cáncer establecidas basadas en conjuntos de datos bioinformáticos en lugar de investigar oncogenesindividuales 22. Investiga posibles mecanismos moleculares a través del análisis RNAseq seguido de análisis bioinformáticos disponibles.
La secuenciación de próxima generación es un método de secuenciación de ADN de alto rendimiento, fácil de disponible y fiable basado en la ayuda computacional, utilizado para examinar exhaustivamente los genes del conductor para guiar las terapias tumorales23. La tecnología también se utiliza para detectar la expresión génica a partir de la transcripción inversa de una muestra de ARN aislada24. Sin embargo, al realizar el cribado con RNAseq, los genes más importantes a atacar con terapia pueden no tener el diferencial de expresión más alto entre las muestras experimentales y de control. Por lo tanto, se desarrollaron algunas bioinformáticas para clasificar e identificar genes basados en conjuntos de datos actuales como KEGG25,GO26,,27o PANTHER28,incluyendo Ingenuity Pathway Analysis (IPA)29 y NetworkAnalyst30. Este protocolo muestra la integración de RNAseq y NetworkAnalyst para descubrir rápidamente un grupo de genes en los esferoides derivados de HT29 seleccionados en comparación con las células HT29 parentales. También se sugiere la aplicación de este método a otros modelos de enfermedades para descubrir diferencias en genes importantes.
En comparación con la investigación de la expresión génica individual, una técnica de alto rendimiento proporciona ventajas para encontrar genes potenciales del conductor fácilmente para la medicina de precisión tumoral. Con conjuntos de datos útiles como KEGG, GO o PANTHER, se pueden identificar genes específicos basados en los modelos de la enfermedad, las vías de señalización o funciones específicas, y esto permite centrarse rápidamente en genes específicos e importantes, ahorrando tiempo y costos de investigación. Una aplicación similar se utiliza en estudios anteriores14,18,31. En particular, un tumor es más complicado porque diferentes tipos de tumores expresan genes y vías distintivas para la supervivencia y la proliferación. Por lo tanto, este protocolo puede detectar genes que distinguen diferentes tipos de tumores en diferentes circunstancias. Existe el potencial de encontrar estrategias eficaces contra el cáncer mediante la comprensión del mecanismo de expresión génica específica.
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Protocol
1. Cultivo celular y formación de la tumoral
- Cultivo de células HT29 en un plato de 10 cm que contiene el medio de águila modificada de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de antibiótico de penicilina-estreptomicina (P/S).
- Cultivar las células en una incubadora a 37oC con 5% de CO2 y 95% de humedad en condiciones asépticas, hasta que alcancen el 80% de confluencia.
- Trypsinize HT29 cells with 1 mL of 0.25% trypsin for 5 min at 37 oC and asly neutrally the trypsin by adding 2 mL of DMEM with 10% FBS and 1% P/S.
- Cuente las células HT29 usando un hemocicómetro.
- Añadir 2.000 células/pozo a una baja unión de 6 placas de pozo con 2 ml de DMEM sin suero con 1% P/S y complementado con 0.2% B27, 20 ng/ml del factor de crecimiento epidérmico (EGF), 20 ng/ml del factor de crecimiento de fibroblastos (bFGF), 20 ng/ml de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y 20 ng/ml de interleucina 6 (IL6).
- Cultivar las células a 37oC con un 5% de CO2 y un 95% de humedad en condiciones asépticas.
- Añadir 0,5 ml de medio de células madre cancerosas cada 2 días hasta que las tumoresferas miden >100 m de diámetro durante al menos 7 días.
- Observar y medir el diámetro de la tumoressfera utilizando un microscopio invertido con un sistema de imágenes celulares digitales.
- Cuando las tumoresferas alcancen >100 m de diámetro, tripsan las tumoresferas con 0,25% de trippsina durante 5 min a 37oC y neutralicen la trippsina añadiendo 2 veces el volumen del medio de crecimiento. Cuente las células usando un hemocicómetro.
- Centrifugar a 1.200 rpm durante 10 min y retire el sobrenadante.
- Incubar 5 x 104 células con 2 l de anti-LGR5-PE y 2 l de anti-CD133-PE en 100 s de DMEM individualmente durante 30 min a temperatura ambiente, agitando a 200 rpm.
NOTA: CD133 es un biomarcador general de células madre cancerosas que se expresa altamente en células HT29. - Agregue 900 l de PBS y analice la expresión LGR5 y CD133 utilizando la citometría de flujo. Un cambio en la fluorescencia en el canal FL2-H indica la expresión génica.
2. Aislamiento de ARN
NOTA: Utilice un kit comercial (consulte La Tabla de materiales)con una columna rápida para el aislamiento del ARN siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Añadir 50 l de PBS a las células cosechadas (2 x 105 células) y resuspenderlas con pipeteo.
- Añadir 200 l de tampón de liceo que contenga 2 l de beta-mercaptoetanol (-ME). Vórtice rápidamente y dejar reposar durante 5 minutos.
- Centrifugar la solución a 16.000 x g durante 10 min. Recoger el sobrenadante y mezclar con 200 l de etanol al 70%.
- Utilice la columna adjunta para retirar el disolvente mediante centrifugación a 14.000 x g durante 1 min.
- Lavar con la solución de lavado 1 y 2 para eliminar completamente los NON-RNA por centrifugación a 14.000 x g durante 1 min.
- Centrifugar de nuevo a 14.000 x g durante 2 min para eliminar el etanol residual.
- Añadir 50 l de agua destilada, centrífuga a 14.000 x g durante 1 min, y recoger la solución.
- Mida la concentración de ARN utilizando OD260 con un espectrofotómetro.
Concentración de ARN (g/ml) á (OD260) x (40 g de ARN/ml) y OD260/OD280 > 2. Las muestras de ARN deben tener un número de integridad de ARN (RIN) > 7.
3. Perfilado RNAseq y análisis bioinformático
NOTA: El análisis de RNAseq se realizó comercialmente (ver Tabla de Materiales)para investigar los genes diferenciales en las tumoresferas derivadas de HT29 en comparación con las células HT29 parentales.
- Utilice servicios comerciales para los pasos de RNAseq, incluida la construcción de bibliotecas, el control de calidad de la biblioteca y la secuenciación de ADN.
- El informe de datos debe contener información importante, incluidos los recuentos de lectura, el cambio de plegado log2 y el valor p. Seleccione los genes diferenciales de acuerdo con los siguientes parámetros: los genes con un cambio de plegado de > 1 log2 con recuentos de lectura >100 en el grupo de tumoresfera HT29, y los genes <-1 log2 cambian con el recuento de lectura >100 en el grupo parental HT29. En este caso, se consideró aceptable un valor p < 0.05 y se utilizaron los datos (Tabla 1).
NOTA: Aquí, se utilizó un recuento de genes >100 como umbral para continuar el estudio de un gen en particular y validar su expresión. - Utilice software de análisis estadístico (consulte Tabla de materiales), para mostrar un mapa de calor e identificar genes sobreexpresados >1 y genes regulados hacia abajo < 1 en el cambio de plegado de log2.
- Utilice el software R para dibujar la gráfica del volcán con x: cambio de pliegue log2; y: -log10 (valor p) para mostrar los genes diferenciales.
- Instalar la biblioteca R
install.packages(library(calibrate)) - Lea los datos en RStudio con el siguiente programa:
res <-read.csv("/Users/xxx.csv", header-T)
cabeza(s)
with(res, plot(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch-19, main-"HT29CSC vs HT29", xlim-c(-6,6), col-"#C0C0C0"))
with(subset(res, pvalue<.05 & log2FoldChange>1), points(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch-19, col-"red"))
with(subset(res, pvalue<.05 & log2FoldChange<(-1)), points(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch-19, col-"blue"))
with(subset(res, pvalue>.05), points(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch-19, col-"#444444"))
ablina (h-1,3, lty-2)
abline(v-1, lty-2)
abline(v-(-1), lty-2) - Ejecute la carrera para obtener la gráfica del volcán.
- Instalar la biblioteca R
4. Selección del gen del conductor
- Seleccione Entrada de un solo gen en NetworkAnalyst.
- Copie y pegue los genes sobreexpresados seleccionados de la Tabla 1 con "humano" especificado como el organismo y el tipo de identificación Símbolo genético oficial.
NOTA: Alternativamente, utilice Ensembl Gene ID para copiar y pegar. - Inserte los datos haciendo clic en Cargar y Proceder para analizarlos mediante la interacción proteína-proteína (IPP) después del IBP genético.
- Utilice la base de datos de interacto STRING con un límite de puntuación de confianza de 900 para mostrar los genes de semillas que cruzan los genes cargados. Los genes de semillas que se asocian con más genes individuales fueron seleccionados como genes conductores que pueden estar involucrados en el mantenimiento de la formación de tumores de origen derivado de HT29.
NOTA: Hay tres conjuntos de datos interactome para su uso: IMEx, STRING y Rolland. STRING contiene evidencia experimental de mayor confianza. Con números de genes cargados más bajos, IMEx se puede seleccionar para predecir y recoger los genes del controlador en las redes interactome. - Seleccione Continuar en la vista general de asignación.
- Seleccione Blanco en el Fondo y Forzar Atlas en el botón Diseño.
- Seleccione PANTHER BP para analizar el grupo genético de regulación ascendente.
NOTA: Esto muestra que HSPA5 fue responsable de la antipoptosis en las tumoresferas derivadas de HT29 en este estudio (Figura 3A). Para reducir el campo funcional específico, la clasificación KEGG, GO o PANTHER se puede utilizar alternativamente para seleccionar los genes de controlador específicos.
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Representative Results
Para establecer el modelo para investigar el mecanismo en las células madre cancerosas, se utilizaron células TI29 colorrectales para cultivar las tumoresferas similares al cáncer in vitro en una placa de baja unión que contiene B27, EGF, bFGF, HGF e IL6. Las tumoresferas >100 m de diámetro se formaron en 7 días(Figura 1A). Las tumoresferas se tripsinaronizaron a células individuales y se analizaron utilizando citometría de flujo para detectar la expresión LGR5 y CD133. LGR5 aumentó en las tumoresferas con accionamiento HT29 del 1,1% al 11,4% y las células se detectaron utilizando citometría de flujo(Figura 1B). Otro marcador de stemness, CD133, también aumentó del 61,8% al 81,1% en las tumoresferas derivadas de HT29 cultivadas en comparación con las células parentales HT29(Figura 1C). Entonces, las tumoresferas estaban listas para la investigación de RNAseq.
RNAseq se utilizó para investigar el perfil de expresión génica en las tumoresferas derivadas de HT29 en comparación con las células HT29 parentales. La tasa de error en la lectura de nucleótidos fue del 0,03% para ambas muestras. La tasa total de mapeo genético fue del 87,87% para HT29 y del 87,25% para las tumoresferas derivadas de HT29. Los fragmentos por kilobase de transcripción por millón (FPKM), la normalización de los recuentos de detectives para indicar la expresión de transcripción (ARNm), el intervalo entre 0 y 1 fue del 75,87% para las células HT29 y del 77,16% para las tumoresferas derivadas de HT29. Los resultados fueron adecuados para la consiguiente secuenciación. Después de las lecturas de secuenciación, los genes con cambio de plegado log2 >1 en la regulación ascendente y <-1 en la regulación descendente con el valor p < 0.05 mostrados por el mapa de calor(Figura 2A,Tabla 1,Tabla 2). Se seleccionaron 79 genes regulados arriba y 33 genes regulados. Además, la gráfica Volcano utilizando el cambio de plegado log2 y el valor p (valor -log10 p) se utilizó para distinguir los genes significativos entre las tumoresferas derivadas de HT29 y las células HT29 parentales(Figura 2B). Sobre la base de la selección preliminar, se identificaron tres genes potencialmente regulados, incluidos ACSS2, HMGCS1y PCSK9,en las tumoresferas derivadas de HT29 (Figura 2A). Además, con el fin de identificar los genes del conductor no sólo de acuerdo con el cambio de plegado log2, se utilizó NetworkAnalyst. Los genes regulados con cambio de plegado log2 >1 con valor p <0.05 se analizaron y dieron como resultado 10 genes de semillas que se cruzaban las redes génicas, entre ellos HSPA5, HSP90AA1, BRCA1, SFN, E2F1, CYCS, CDC6, ALYREF, SQSTM1y TOMM40 (Figura 3A). Para identificar la función y la importancia de los genes de semillas, la interfaz de clasificación podría utilizarse para realizar PANTHER BP para determinar los genes implicados en la antipoptosis en las tumoresferas derivadas de HT29. Los resultados indicaron que HSPA5 y SQSTM1 estaban asociados con la regulación negativa de la apoptosis(Figura 3A). Además, los 10 genes seleccionados fueron validados; expresión aumentó en las tumoresferas derivadas de HT29 como se confirmó utilizando qPCR (Figura 3B).
Figura 1: Establecimiento de tumoresfera similares al cáncer in vitro. (A) HT29 se utilizó para formar tumoresferas, y (B) LGR5 se detectó en las tumoresferas derivadas de HT29 (barra de escala de 100 m). (C) CD133 se utilizó como otro marcador para identificar los caracteres de tallo en las tumoresferas establecidas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Mapa de calor y trazado de volcanes se utilizaron para seleccionar los genes diferenciales en las tumoresferas derivadas de HT29. El cambio de plegado log2 >1 y <-1 con recuento de lectura >100, el valor p < 0.05 se utilizaron para excluir genes no insignificantes y asegurarse de que los datos fueran precisos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: NetworkAnalyst se utilizó para identificar los genes conductores en las tumoresferas derivadas de HT29. (A) Los genes regulados se seleccionaron y analizaron en consecuencia, y una interfaz de clasificación, PANTHER BP, proporcionó las funciones potenciales para los genes diferenciales del conductor. (B) Entonces, qPCR se utilizó para validar los 10 genes regulados en tumoresferas derivadas de HT29 en comparación con las células HT29 parentales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Los genes regulados en tumores de derivados de HT29 en comparación con las células HT29 parentales analizadas por RNAseq. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Los genes regulados hacia abajo en las tumoresferas derivadas de HT29 en comparación con las células HT29 parentales analizadas por RNAseq. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
En este estudio, se utilizaron tumores de tipo tallo cultivado como modelo en el análisis de datos RNAseq con bioinformática disponible. Para un modelo de enfermedad, se utilizaron tumores timóferas derivadas de HT29. Debido a que las tumoresferas tienen resistencia a los medicamentos contra las terapias tumorales, el modelo establecido se puede utilizar para investigar los mecanismos detallados de resistencia mediante la investigación de las diferencias en la expresión génica. Además, la tecnología genómica que utiliza RNAseq con bioinformática disponible proporciona una rápida comprensión del modelo de estudio para que los genes potencialmente implicados puedan ser validados con mayor confianza. Además, se puede identificar el tipo de genes involucrados en la formación de tumoresferas.
La calidad del ARN es fundamental para el análisis RNAseq32. Asegúrese de que la muestra tenga RIN >7, porque aumenta la certeza entre las lecturas de asignación, los genes de mapeo y FPKM. Al analizar los datos de RNAseq, IPA29 y NetworkAnalyst30 estaban disponibles para identificar genes potenciales y vías de señalización. Sin embargo, es esencial descartar los genes innecesarios de acuerdo con los siguientes parámetros: los genes que muestran un cambio de plegado >1 log2 con recuentos de lectura >100 en el grupo experimental, y los genes <-1 log2 cambian con el recuento de lectura > 100 en el grupo de control. Los recuentos de lectura más altos son más fáciles para la validación consecuente mediante qPCR o manchas occidentales.
Sobre la base de la comprensión de las funciones y procesos biológicos, existen muchas herramientas bioinformáticas que permiten una rápida investigación de los posibles mecanismos de enfermedades de interés. En combinación con una herramienta de alto rendimiento para detectar la expresión génica como RNAseq, se pueden proponer e investigar mecanismos potenciales que regulan el desarrollo de las enfermedades estudiadas. Aquí, el método para investigar la formación de tumoresferas similares a tallos de la CRC derivados de HT29 reveló que SQSTM1 y HSPA5 eran los genes diana regulados y involucrados en la anti-apoptosis en tumores. Por lo tanto, se pueden diseñar más experimentos para investigar el mecanismo detallado de estos genes, lo que resulta en más confianza y eficacia al realizar estudios de investigación.
Aquí, sólo se analizaron los genes regulados en las tumoresferas porque se consideró que la regulación ascendente era inducida por la adición de los factores de crecimiento. De lo contrario, si el experimento utilizara la reducción genética en las células tumorales, los genes regulados hacia abajo se considerarían como dianas que se pueden seleccionar para la investigación utilizando la bioinformática. Aunque la metodología es rápida y fiable, todavía se necesita una validación posterior a través de qPCR y manchas occidentales. También se sugiere que se utilicen más líneas celulares para la validación de la expresión génica, especialmente para las muestras clínicas.
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Disclosures
Los autores no tienen divulgaciones financieras relevantes.
Acknowledgments
Los autores agradecen el Laboratorio Básico de Biología radiológica del Instituto de Investigación Radiológica, Chang Gung Memorial Hospital, por su apoyo técnico. Este estudio fue apoyado por subvenciones del hospital Chang Gung Memorial (CMRPD1J0321), Cheng Hsin General Hospital (CHGH 106-06), y Mackay Memorial Hospital (MMH-CT-10605 y MMH-106-61). Los organismos de financiación no tuvieron ninguna influencia en el diseño del estudio y la recopilación, análisis e interpretación de datos o en la escritura del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| iRiS Digital Cell Imaging System | Logos Biosystems, Inc | I10999 | for observing the formation of tumorspheres |
| Flow cytometry | BD biosciences | FACSCalibur | for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres |
| anti-LGR5-PE | Biolegend | 373803 | LGR5 detection reagent |
| anti-CD133-PE | Biolegend | 372803 | CD133 detection reagent |
| EGF | GenScript | Z00333 | for culture of tumorspheres |
| bFGF | GenScript | Z03116 | for culture of tumorspheres |
| HGF | GenScript | Z03229 | for culture of tumorspheres |
| IL6 | GenScript | Z03034 | for culture of tumorspheres |
| PureLink RNA extraction kit | Invitrogen | 12183025 | isolate total RNA for RNAseq analysis |
| RNAseq performance | Biotools, Taiwan | RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan | |
| NetworkAnalyst | Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada | http://www.networkanalyst.ca/ | |
| Prism | GraphPad Software | a statistical analysis software |
References
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