Summary
Hier gepresenteerd is een protocol om de overuitexpressieve driver genen behoud van de gevestigde kanker stam-achtige cellen afgeleid van colorectale HT29 cellen te ontdekken. RNAseq met beschikbare bioinformatica werd uitgevoerd om genexpressienetwerken te onderzoeken en te screenen voor het ophelderen van een potentieel mechanisme dat betrokken is bij de overleving van gerichte tumorcellen.
Abstract
Kanker stamcellen spelen een vitale rol tegen klinische therapieën, bij te dragen aan tumor terugval. Er zijn veel oncogenes betrokken bij tumorigenese en de initiatie van kanker stamheid eigenschappen. Aangezien genexpressie in de vorming van colorectale kanker-afgeleide tumorsferen onduidelijk is, kost het tijd om de mechanismen te ontdekken die aan één gen tegelijk werken. Deze studie toont een methode om snel te ontdekken van de bestuurder genen die betrokken zijn bij de overleving van de colorectale kanker stam-achtige cellen in vitro. Colorectale HT29 kankercellen die de LGR5 uitdrukken wanneer gekweekt als sferoïden en begeleiden een toename CD133 stemness markers werden geselecteerd en gebruikt in deze studie. Het gepresenteerde protocol wordt gebruikt om RNAseq uit te voeren met beschikbare bioinformatica om snel de overuitexpressiebestuurdersgenen te ontdekken in de vorming van colorectale HT29-afgeleide stamachtige tumorsferen. De methodologie kan snel potentiële bestuurdersgenen in andere ziektemodellen screenen en ontdekken.
Introduction
Colorectale kanker (CRC) is een belangrijke doodsoorzaak met een hoge prevalentie en sterfte wereldwijd1,2. Als gevolg van genmutaties en versterkingen groeien kankercellen zonder proliferative controle, wat bijdraagt aan celoverleving3, anti-apoptose4en kankerstamness5,6,7. Binnen een tumorweefsel, tumor heterogeniteit kan tumorcellen aan te passen en te overleven tijdens therapeutische behandelingen8. Kankerstamcellen (CSC's), met een hoger percentage zelfvernieuwing en pluripotentie dan differentiële kankertypes, zijn voornamelijk verantwoordelijk voor tumorrecidief9,10 en gemetastasatied CRC11. CSC's presenteren meer resistentie tegen geneesmiddelen12,13,14 en anti-apoptose eigenschappen15,16, dus overleven tumor chemotherapieën.
Hier, om het potentiële mechanisme voor stamheid in de geselecteerde CRC stamcellen te onderzoeken, werd RNAseq uitgevoerd om differentieel uitgedrukte genen in tumorsferoïden te screenen. De kankercellen kunnen sferoïden (ook wel tumorsferen) vormen wanneer ze worden gekweekt in lage therapietrouw en gestimuleerd door groeifactoren die zijn toegevoegd aan het gekweekte medium, waaronder EGF, bFGF, HGF en IL6. Daarom hebben we crc HT29-tumorcellen geselecteerd die bestand zijn tegen chemotherapieën met een toename van fosforyleerde STAT3 wanneer ze worden behandeld met oxaliplatine en irinotecon17. Bovendien, HT29 uitgedrukt hogere stemness markers wanneer gekweekt in de beschreven cultuur voorwaarden. Het HT29-afgeleide CSC-model gaf hogere hoeveelheden leucine-rijke repeat-containing G-eiwit gekoppelde receptor 5 (LGR5)18, een specifieke marker van CRC stamcellen19,20. Bovendien wordt CD133, beschouwd als een algemene biomarker voor kankerstamcellen , ook zeer uitgedrukt in de HT29-cellijn21. Dit protocol doel is om groepen van de bestuurder genen te ontdekken in de gevestigde kanker stam-achtige tumorsferen op basis van bio-informatica datasets in tegenstelling tot het onderzoeken van individuele oncogenen22. Het onderzoekt potentiële moleculaire mechanismen door middel van RNAseq-analyse, gevolgd door beschikbare bioinformatica-analyses.
De volgende generatie sequencing is een high-throughput, gemakkelijk beschikbaar, en betrouwbare DNA-sequencing methode op basis van computationele hulp, gebruikt om volledig te screenen driver genen voor het begeleiden van tumor therapieën23. De technologie wordt ook gebruikt voor het detecteren van genexpressie van omgekeerde transcriptie van een geïsoleerd RNA-monster24. Echter, bij het screenen met RNAseq, de belangrijkste genen te richten met therapie kan niet de hoogste expressie differentieel tussen experimentele en controle monsters. Daarom zijn sommige bioinformatica ontwikkeld voor het classificeren en identificeren van genen op basis van actuele datasets zoals KEGG25, GO26,27of PANTHER28, waaronder Ingenuity Pathway Analysis (IPA)29 en NetworkAnalyst30. Dit protocol toont de integratie van RNAseq en NetworkAnalyst om snel een groep genen te ontdekken in de geselecteerde HT29-afgeleide sferoïden in vergelijking met ouderlijke HT29-cellen. Toepassing van deze methode op andere ziektemodellen wordt ook voorgesteld voor het ontdekken van verschillen in belangrijke genen.
Vergeleken met onderzoek van individuele genexpressie biedt een hoge doorvoertechniek voordelen om gemakkelijk potentiële bestuurdersgenen te vinden voor tumorprecisiegeneeskunde. Met nuttige datasets zoals KEGG, GO of PANTHER kunnen specifieke genen worden geïdentificeerd op basis van de ziektemodellen, signaleringstrajecten of specifieke functies, en dit maakt het mogelijk om snel te focussen op specifieke, belangrijke genen, wat tijd en onderzoekskosten bespaart. Een soortgelijke toepassing wordt gebruikt in eerdere studies14,18,31. In het bijzonder, een tumor is ingewikkelder omdat verschillende soorten tumoren uitdrukken onderscheidende genen en paden voor overleving en proliferatie. Daarom kan dit protocol genen oppikken die verschillende tumortypen onder verschillende omstandigheden onderscheiden. Er is het potentieel om effectieve strategieën tegen kanker te vinden door het mechanisme van specifieke genexpressie te begrijpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celkweek en tumorsfeervorming
- Kweek HT29-cellen in een schaal van 10 cm met het gemodificeerde adelaarsmedium (DMEM) van Dulbecco met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine antibioticum (P/S).
- Kweek de cellen in een couveuse bij 37 °C met 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid onder aseptische omstandigheden, tot ze 80% samenvloeiing bereiken.
- Trypsinize HT29 cellen met 1 mL van 0,25% trypsine gedurende 5 min bij 37 °C en neutraliseren bijgevolg de trypsine door 2 mL DMEM toe te voegen met 10% FBS en 1% P/S.
- Tel de HT29 cellen met behulp van een hemocytometer.
- Voeg 2.000 cellen/put toe aan een laag aangesloten 6 putplaten met 2 mL serumvrije DMEM met 1% P/S en aangevuld met 0,2% B27, 20 ng/mL van epidermale groeifactor (EFG), 20 ng/mL van fibroblast growth factor (bFGF), 20 ng/mL hepatocyte growth factor (HGF) en 20 ng/mL interleukine 6 (IL6).
- Kweek de cellen bij 37 °C met 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid onder aseptische omstandigheden.
- Voeg elke 2 dagen 0,5 mL stamcelmedium toe tot de tumorsferen minstens 7 dagen meten >100 μm in diameter.
- Observeer en meet de tumorsfeerdiameter met behulp van een omgekeerde microscoop met een digitaal celbeeldvormingssysteem.
- Wanneer de tumorsferen >100 μm in diameter bereiken, trypsinize de tumorsferen met 0.25% trypsine gedurende 5 min bij 37 °C en neutraliseer de trypsine door 2x het volume van het groeimedium toe te voegen. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
- Centrifuge bij 1.200 tpm gedurende 10 minuten en verwijder de supernatant.
- Incubeer 5 x 104 cellen met 2 μL anti-LGR5-PE en 2 μL anti-CD133-PE in 100 μL DMEM individueel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, schudden bij 200 rpm.
OPMERKING: CD133 is een algemene kanker stamcel biomarker die sterk wordt uitgedrukt in HT29 cellen. - Voeg 900 μL PBS toe en analyseer de LGR5- en CD133-expressie met behulp van stroomcytometrie. Een verandering in fluorescentie in het FL2-H kanaal duidt op genexpressie.
2. RNA-isolatie
OPMERKING: Gebruik een commerciële kit (zie Tabel van materialen)met een snelle kolom voor RNA-isolatie volgens de instructies van de fabrikant.
- Voeg 50 μL PBS toe aan de geoogste cellen (2 x 105 cellen) en verbouw ze opnieuw met pipet.
- Voeg 200 μL lysebuffer toe met 2 μL bèta-mercaptoethanol (β-ME). Vortex snel en laat staan voor 5 min.
- Centrifuge de oplossing op 16.000 x g gedurende 10 min. Verzamel de supernatant en meng met 200 μL ethanol.
- Gebruik de bijgevoegde kolom om het oplosmiddel te verwijderen door middel van centrifugatie op 14.000 x g gedurende 1 min.
- Was met wasoplossing 1 en 2 om niet-RNAs volledig te verwijderen door centrifugatie op 14.000 x g gedurende 1 min.
- Centrifuge opnieuw op 14.000 x g gedurende 2 min om rest ethanol te verwijderen.
- Voeg 50 μL gedestilleerd water toe, centrifuge bij 14.000 x g gedurende 1 min en verzamel de oplossing.
- Meet de RNA-concentratie met OD260 met een spectrofotometer.
RNA-concentratie (μg/mL) = (OD260) x (40 μg RNA/mL) en OD260/OD280 > 2. RNA-monsters moeten een RNA-integriteitsnummer (RIN) > 7 hebben.
3. RNAseq profilering en bioinformatica analyse
OPMERKING: RNAseq-analyse werd commercieel uitgevoerd (zie Tabel van Materialen)om de differentiële genen in de HT29-afgeleide tumorsferen te onderzoeken in vergelijking met ouderlijke HT29-cellen.
- Gebruik commerciële services voor RNAseq-stappen, waaronder bibliotheekbouw, bibliotheekkwaliteitscontrole en DNA-sequencing.
- Het gegevensrapport moet belangrijke informatie bevatten, waaronder de leestellingen, log2-vouwwijziging en p-waarde. Selecteer de differentiële genen op basis van de volgende parameters: genen met een > 1 log2-vouwen veranderen met leestellingen >100 in de HT29-tumorsfeergroep en genen <-1 log2 fold change with read count >100 in the HT29 parental group. In dit geval werd een p-waarde < 0,05 aanvaardbaar geacht en werden de gegevens gebruikt (tabel 1).
OPMERKING: Hier werd een gentelling >100 gebruikt als drempel om de studie van een bepaald gen voort te zetten en de expressie ervan te valideren. - Gebruik statistische analysesoftware (zie Tabel van Materialen),om een heatmap weer te geven en overexpressed genen te identificeren >1 en gedownreguleerde genen < 1 in log2 fold change.
- Gebruik R-software om de Volcano Plot te tekenen met x: log2 fold change; y: -log10 (p waarde) om de differentiële genen te tonen.
- R-bibliotheek installeren
install.packages(bibliotheek(kalibreren)) - Lees de gegevens in RStudio met het volgende programma:
res <-read.csv("/Users/xxx.csv", header=T)
hoofd(res)
met(res, plot(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, main="HT29CSC vs HT29", xlim=c(-6,6), col="#C0C0C0"))
met(subset(res, pvalue<.05 & log2FoldChange>1), punten(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="red"))
met(subset(res, pvalue<.05 & log2FoldChange<(-1)), punten(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="blue"))
met(subset(res, pvalue>.05), punten(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="#444444"))
abline(h=1.3, lty=2)
abline(v=1, lty=2)
abline(v=(-1), lty=2) - Voer de run uit om de Vulkaan Plot te verkrijgen.
- R-bibliotheek installeren
4. Driver gen selectie
- Selecteer Single geninput in NetworkAnalyst.
- Kopieer en plak de geselecteerde overexpressed genen uit tabel 1 met "mens" opgegeven als het organisme en id-type Officieel gensymbool.
OPMERKING: Gebruik ook Ensembl Gene ID voor kopiëren en plakken. - Voeg de gegevens in door op Upload te klikken en ga verder om deze te analyseren met behulp van eiwit-eiwit interactie (PPI) na genetische PPI.
- Gebruik de STRING interactome database met een vertrouwensscore cutoff van 900 om de zaadgenen te laten zien die de geüploade genen kruisen. De zaadgenen die associëren met meer individuele genen werden geselecteerd als driver genen die betrokken kunnen zijn bij het handhaven van de vorming van HT29-afgeleide tumorsferen.
OPMERKING: Er zijn drie interactome datasets voor gebruik: IMEx, STRING en Rolland. STRING bevat hoger vertrouwen experimenteel bewijs. Met lagere geüploade gennummers kan IMEx worden geselecteerd om de bestuurdersgenen in de interactome-netwerken te voorspellen en op te pikken. - Selecteer Doorgaan in het toewijzingsoverzicht.
- Selecteer Wit op de achtergrond en Atlas forceren in de knop Indeling.
- Selecteer PANTHER BP om de upregulatiegengroep te analyseren.
OPMERKING: Dit toont aan dat HSPA5 verantwoordelijk was voor anti-apoptose in de HT29-afgeleide tumorsferen in deze studie(figuur 3A). Om het specifieke functionele veld te beperken, kunnen KEGG, GO of PANTHER classificatie als alternatief worden gebruikt om de specifieke bestuurdersgenen te selecteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om het model voor het onderzoeken van het mechanisme in kankerstamcellen vast te stellen, werden colorectale HT29 cellen gebruikt om de kankerstam-achtige tumorsferen in vitro te kweken in een laag-gehechtheidsplaat die B27, EGF, bFGF, HGF, en IL6 bevat. De tumorsferen >100 μm in diameter werden gevormd in 7 dagen(figuur 1A). De tumorsferen werden trypsinized aan enige cellen en geanalyseerd gebruikend stroomcytometrie om LGR5 en CD133 uitdrukking te ontdekken. LGR5 steeg in de HT29-drived tumorsferen van 1,1% tot 11,4% en de cellen werden gedetecteerd met behulp van flow cytometrie (Figuur 1B). Een andere stemness marker, CD133, steeg ook van 61,8% tot 81,1% in de gekweekte HT29-afgeleide tumorsferen in vergelijking met ouderlijke HT29 cellen (Figuur 1C). Toen waren de tumorsferen klaar voor RNAseq onderzoek.
RNAseq werd gebruikt om het genexpressieprofiel in de HT29-afgeleide tumorsferen te onderzoeken in vergelijking met de ouderlijke HT29-cellen. Het foutenpercentage bij nucleotidemeting was 0,03% voor beide monsters. Het totale genmappingpercentage was 87,87% voor HT29 en 87,25% voor tumorsferen uit HT29 afgeleide tumorsferen. De fragmenten per kilobase van transcriptie per miljoen (FPKM), het normaliseren van de detective telt voor het aangeven van de transcriptie (mRNA) expressie, interval tussen 0 en 1 was 75,87% voor HT29 cellen, en 77,16% voor HT29-afgeleide tumorsferen. De resultaten waren geschikt voor de daaruit voortvloeiende volgorde. Na het opeenvolgen van de teksten zijn de genen met log2 fold change >1 in upregulation en <-1 in downregulation met p-waarde < 0,05 weergegeven door de heatmap (Figuur 2A,Tabel 1,Tabel 2) geselecteerd. Er waren 79 upregulated genen en 33 downregulated genen geselecteerd. Bovendien werd de vulkaan plot met behulp van log2 vouw verandering en p waarde (-log10 p waarde) werd gebruikt om de belangrijke genen te onderscheiden tussen HT29-afgeleide tumorsferen en ouderlijke HT29 cellen (Figuur 2B). Op basis van de voorlopige selectie werden drie mogelijk upregulated genen geïdentificeerd, waaronder ACSS2, HMGCS1en PCSK9, in de HT29-afgeleide tumorsferen(figuur 2A). Bovendien, om de bestuurder genen niet alleen volgens de log2 vouw verandering te identificeren, NetworkAnalyst werd gebruikt. De upregulated genen met log2 fold change >1 met p waarde <0.05 werden geanalyseerd en resulteerden in 10 zaadgenen die de gennetwerken kruisen, waaronder HSPA5, HSP90AA1, BRCA1, SFN, E2F1, CYCS, CDC6, ALYREF, SQSTM1en TOMM40 (Figuur 3A). Om de functie en betekenis van de zaadgenen te identificeren, kan de classificatie-interface worden gebruikt om PANTHER BP uit te voeren om de genen te bepalen die betrokken zijn bij anti-apoptose in HT29-afgeleide tumorsferen. De resultaten gaven aan dat HSPA5 en SQSTM1 geassocieerd waren met negatieve regulatie van apoptose (figuur 3A). Bovendien werden de geselecteerde 10 genen gevalideerd; expressie toegenomen in de HT29-afgeleide tumorsferen zoals bevestigd met behulp van qPCR (Figuur 3B).
Figuur 1: Oprichting van kanker stam-achtige tumorsfeer in vitro. (A) HT29 werd gebruikt om tumorsferen te vormen, en (B) LGR5 werd gedetecteerd in de HT29-afgeleide tumorsferen (Schaal bar = 100 μm). (C) CD133 werd gebruikt als een andere marker om de stamheidskarakters in de gevestigde tumorsferen te identificeren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Heatmap en vulkaan plot werden gebruikt om de differentiële genen in de HT29-afgeleide tumorsferen te selecteren. Log2 fold change >1 en <-1 met leestelling >100, p waarde < 0,05 werden gebruikt om niet-belangrijke genen uit te sluiten en ervoor te zorgen dat de gegevens juist waren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: NetworkAnalyst werd gebruikt om de bestuurdersgenen in de HT29-afgeleide tumorsferen te identificeren. (A) De upregulated genen werden geselecteerd en geanalyseerd bijgevolg, en een classificatie-interface, PANTHER BP, mits de potentiële functies voor de differentiële bestuurder genen. (B)Vervolgens werd qPCR gebruikt om de 10 genen te valideren die in HT29-afgeleide tumorsferen zijn geupreguleerd in vergelijking met ouderlijke HT29-cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Tabel 1: De upregulated genen in HT29-serived tumorsferen in vergelijking met ouderlijke HT29 cellen geanalyseerd door RNAseq. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: De gesegreguleerde genen in HT29-serived tumorsferen in vergelijking met ouderlijke HT29 cellen geanalyseerd door RNAseq. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie werden gekweekte kankerstamachtige tumorsferen gebruikt als model bij het analyseren van RNAseq-gegevens met beschikbare bioinformatica. Voor een ziektemodel werden HT29-afgeleide tumorsferen gebruikt. Omdat de tumorsferen resistentie tegen tumortherapieën hebben, kan het gevestigde model worden gebruikt om de gedetailleerde mechanismen van resistentie te onderzoeken door verschillen in genexpressie te onderzoeken. Bovendien biedt genomische technologie met RNAseq met beschikbare bioinformatica een snel inzicht in het studiemodel, zodat de genen die mogelijk betrokken zijn, met een hoger vertrouwen kunnen worden gevalideerd. Ook kan het soort genen worden geïdentificeerd dat betrokken is bij de vorming van tumorsferen.
RNA-kwaliteit is van cruciaal belang voor de RNAseq-analyse32. Zorg ervoor dat het monster RIN >7 heeft, omdat het de zekerheid tussen het in kaart brengen van reads, mapping genen en FPKM verhoogt. Bij het analyseren van RNAseq-gegevens waren IPA29 en NetworkAnalyst30 beschikbaar om potentiële genen en signaleringstrajecten te identificeren. Het is echter essentieel om de onnodige genen uit te sluiten volgens de volgende parameters: genen die een >1 log2-vouwverandering laten zien met leestellingen >100 in de experimentele groep en genen <-1 log2 fold change met leestelling > 100 in de controlegroep. Hogere leeswaarden zijn gemakkelijker voor de daaruit voortvloeiende validatie met behulp van qPCR of Western blots.
Gebaseerd op het begrip van biologische functies en processen, zijn er veel bioinformatica tools die een snel onderzoek van de potentiële mechanismen van ziekten van belang. In combinatie met een instrument met hoge doorvoer om te screenen op genexpressie zoals RNAseq, kunnen potentiële mechanismen worden voorgesteld die de ontwikkeling van de bestudeerde ziekten reguleren. Hier bleek uit de methode voor het onderzoeken van de vorming van CRC-stamachtige tumorsferen afgeleid van HT29 dat SQSTM1 en HSPA5 de doelgenen waren die zijn gereglementeerd en betrokken waren bij anti-apoptose in tumorsferen. Daarom kunnen meer experimenten worden ontworpen om het gedetailleerde mechanisme van deze genen te onderzoeken, wat resulteert in meer vertrouwen en werkzaamheid bij het uitvoeren van onderzoeken.
Hier werden alleen de upregulated genen in de tumorsferen geanalyseerd omdat upregulation werd beschouwd als veroorzaakt door de toevoeging van de groeifactoren. Anders, als het experiment gebruikte gen knockdown in de tumorcellen, de downregulated genen zou worden beschouwd als doelen die kunnen worden geselecteerd voor onderzoek met behulp van de bio-informatica. Hoewel de methodologie snel en betrouwbaar is, is latere validatie nog steeds nodig via qPCR en Western blots. Er wordt ook gesuggereerd dat meer cellijnen worden gebruikt voor de validatie van genexpressie, vooral voor klinische monsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen relevante financiële informatie.
Acknowledgments
De auteurs bedanken het Radiation Biology Core Laboratory of Institute for Radiological Research, Chang Gung Memorial Hospital, voor technische ondersteuning. Deze studie werd ondersteund door subsidies van Chang Gung Memorial ziekenhuis (CMRPD1J0321), Cheng Hsin General Hospital (CHGH 106-06), en Mackay Memorial Hospital (MMH-CT-10605 en MMH-106-61). Financieringsorganen hadden geen invloed op het ontwerp van de studie en het verzamelen van gegevens, analyse en interpretatie van gegevens of bij het schrijven van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| iRiS Digital Cell Imaging System | Logos Biosystems, Inc | I10999 | for observing the formation of tumorspheres |
| Flow cytometry | BD biosciences | FACSCalibur | for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres |
| anti-LGR5-PE | Biolegend | 373803 | LGR5 detection reagent |
| anti-CD133-PE | Biolegend | 372803 | CD133 detection reagent |
| EGF | GenScript | Z00333 | for culture of tumorspheres |
| bFGF | GenScript | Z03116 | for culture of tumorspheres |
| HGF | GenScript | Z03229 | for culture of tumorspheres |
| IL6 | GenScript | Z03034 | for culture of tumorspheres |
| PureLink RNA extraction kit | Invitrogen | 12183025 | isolate total RNA for RNAseq analysis |
| RNAseq performance | Biotools, Taiwan | RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan | |
| NetworkAnalyst | Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada | http://www.networkanalyst.ca/ | |
| Prism | GraphPad Software | a statistical analysis software |
References
- Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors. Przegląd Gastroenterologiczny. 14 (2), 89-103 (2019).
- Wong, M. C., Ding, H., Wang, J., Chan, P. S., Huang, J. Prevalence and risk factors of colorectal cancer in Asia. Intestinal Research. 17 (3), 317-329 (2019).
- Liu, Q., et al. Positive expression of basic transcription factor 3 predicts poor survival of colorectal cancer patients: possible mechanisms involved. Cell Death & Disease. 10 (7), 509 (2019).
- Slattery, M. L., et al. Dysregulated genes and miRNAs in the apoptosis pathway in colorectal cancer patients. Apoptosis. 23 (3-4), 237-250 (2018).
- Arteaga, C. L., Engelman, J. A. ERBB receptors: from oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics. Cancer Cell. 25 (3), 282-303 (2014).
- Yarden, Y., Pines, G. The ERBB network: at last, cancer therapy meets systems biology. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 553-563 (2012).
- Cheng, C. C., et al. YM155 as an inhibitor of cancer stemness simultaneously inhibits autophosphorylation of epidermal growth factor receptor and G9a-mediated stemness in lung cancer cells. PLoS One. 12 (8), 0182149 (2017).
- Prasetyanti, P. R., Medema, J. P. Intra-tumor heterogeneity from a cancer stem cell perspective. Molecular Cancer. 16 (1), 41 (2017).
- Zhao, Y., et al. CD133 expression may be useful as a prognostic indicator in colorectal cancer, a tool for optimizing therapy and supportive evidence for the cancer stem cell hypothesis: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (9), 10023-10036 (2016).
- Choi, J. E., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell markers in colorectal adenocarcinoma: Clinicopathological significance. Oncology Reports. 38 (3), 1695-1705 (2017).
- Massard, C., Deutsch, E., Soria, J. C. Tumour stem cell-targeted treatment: elimination or differentiation. Annals of Oncology. 17 (11), 1620-1624 (2006).
- Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66 (10), 1802-1810 (2017).
- Dallas, N. A., et al. Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition. Cancer Research. 69 (5), 1951-1957 (2009).
- Chang, Y. F., et al. STAT3 induces G9a to exacerbate HER3 expression for the survival of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors in lung cancers. BMC Cancer. 19 (1), 959 (2019).
- Catalano, V., et al. Colorectal cancer stem cells and cell death. Cancers (Basel). 3 (2), 1929-1946 (2011).
- Piggott, L., et al. Suppression of apoptosis inhibitor c-FLIP selectively eliminates breast cancer stem cell activity in response to the anti-cancer agent, TRAIL. Breast Cancer Research. 13 (5), 88 (2011).
- Chung, S. Y., et al. Two novel SHP-1 agonists, SC-43 and SC-78, are more potent than regorafenib in suppressing the in vitro stemness of human colorectal cancer cells. Cell Death Discovery. 4, 25 (2018).
- Cheng, C. C., et al. STAT3 exacerbates survival of cancer stem-like tumorspheres in EGFR-positive colorectal cancers: RNAseq analysis and therapeutic screening. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 60 (2018).
- Kleist, B., Xu, L., Li, G., Kersten, C. Expression of the adult intestinal stem cell marker Lgr5 in the metastatic cascade of colorectal cancer. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 4 (4), 327-335 (2011).
- Medema, J. P. Targeting the Colorectal Cancer Stem Cell. New England Journal of Medicine. 377 (9), 888-890 (2017).
- Sahlberg, S. H., Spiegelberg, D., Glimelius, B., Stenerlow, B., Nestor, M. Evaluation of cancer stem cell markers CD133, CD44, CD24: association with AKT isoforms and radiation resistance in colon cancer cells. PLoS One. 9 (4), 94621 (2014).
- Xia, J., Gill, E. E., Hancock, R. E. NetworkAnalyst for statistical, visual and network-based meta-analysis of gene expression data. Nature Protocols. 10 (6), 823-844 (2015).
- Gagan, J., Van Allen, E. M. Next-generation sequencing to guide cancer therapy. Genome Medicine. 7 (1), 80 (2015).
- Panichnantakul, P., Bourgey, M., Montpetit, A., Bourque, G., Riazalhosseini, Y. RNA-Seq as a Tool to Study the Tumor Microenvironment. Methods in Molecular Biology. 1458, 311-337 (2016).
- Kanehisa, M., Sato, Y. KEGG Mapper for inferring cellular functions from protein sequences. Protein Science. 29 (1), 28-35 (2020).
- Ashburner, M., et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature Genetics. 25 (1), (2000).
- The Gene Ontology Collective. The Gene Ontology Resource: 20 years and still GOing strong. Nucleic Acids Research. 47, 330-338 (2019).
- Mi, H., Muruganujan, A., Thomas, P. D. PANTHER in 2013: modeling the evolution of gene function, and other gene attributes, in the context of phylogenetic trees. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 377-386 (2013).
- Yu, F., Shen, X. Y., Fan, L., Yu, Z. C. Genome-wide analysis of genetic variations assisted by Ingenuity Pathway Analysis to comprehensively investigate potential genetic targets associated with the progression of hepatocellular carcinoma. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 18 (15), 2102-2108 (2014).
- Zhou, G., et al. NetworkAnalyst 3.0: a visual analytics platform for comprehensive gene expression profiling and meta-analysis. Nucleic Acids Research. 47 (1), 234-241 (2019).
- Cheng, C. C., et al. Epidermal growth factor induces STAT1 expression to exacerbate the IFNr-mediated PD-L1 axis in epidermal growth factor receptor-positive cancers. Molecular Carcinogenesis. 57 (11), 1588-1598 (2018).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
