Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Руководство по секционной обработке, корингу и обработке изображений для закупок и анализа образцов высокой пропускной способности кортикальной кости для синхротронной микро-CT

Published: June 12, 2020 doi: 10.3791/61081
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Biology, The University of Akron, 2Department of Geosciences, The University of Akron

Summary

Мы использовали геологический (коринг) протокол отбора проб для закупки образцов корковых костей одинакового размера для экспериментов SR-CT с переднего аспекта бедренной кости человека. Этот метод является минимально разрушительным, эффективным, приводит к цилиндрическим образцам, которые минимизируют артефакты изображений из нерегулярных форм образца и улучшают микроархитектурную визуализацию и анализ.

Abstract

Кость является динамичной и механически активной тканью, которая изменяется в структуре в течение всего срока службы человека. Продукты процесса ремоделирования костей были изучены с использованием традиционных двумерных методов. Недавние достижения в области технологии рентгеновской визуализации с помощью настольной микро-компьютерной томографии (КТ) и синхротронной радиационной микро-компьютерной томографии (СРЗКТ) позволили получить трехмерное (3D) сканирование трехмерного (3D) высокого разрешения более широкого поля зрения (FOV), чем другие методы 3D-изображения (например, SEM), обеспечивающие более полную картину микроскопических структур в человеческой кости. Образец должен быть точно по центру в FOV, однако, чтобы ограничить появление полос артефактов, как известно, влияние анализа данных. Предыдущие исследования сообщили о закупке неправильной формы ректилинейных блоков костей, которые приводят к визуализации артефактов из-за неравномерных краев или утончения изображения. Мы применили протокол геологической выборки (коринг) для закупки последовательно размера образцов коркового костного ядра для экспериментов SR-CT из переднего аспекта бедренной кости человека. Этот метод coring эффективен и минимально разрушительн к ткани. Он создает однородные цилиндрические образцы, которые уменьшают артефакты изображений по своей природе быть изометрическим во время вращения и обеспечивают единую длину пути для рентгеновских лучей во время сканирования. Обработка рентгеновских томографических данных образцов кора и неправильной формы подтверждает потенциал методики улучшения визуализации и анализа микроархитектуры корковой кости. Цель этого протокола заключается в предоставлении надежного и повторяемого метода для извлечения корковых костных ядер, который адаптируется для различных типов экспериментов по визуализации костей высокого разрешения. Главной целью работы является создание стандартизированной закупки корковых костей для SR-CT, которая является доступной, последовательной и простой. Эта процедура может быть дополнительно адаптирована исследователями в смежных областях, которые обычно оценивают твердые композитные материалы, такие как биологическая антропология, геонауки или материаловедения.

Introduction

С последними достижениями в области технологии визуализации, в настоящее время возможно получить рентгеновские данные изображения с очень высоким разрешением. Настольные микро-CT (КТ) системы являются текущим стандартом для изображения канцелятной кости из-за их неразрушающая природа1. Однако при визуализации микроструктурных особенностей корковой кости использование КТ было более ограниченным. Из-за ограничений разрешения настольные системы не могут достичь разрешения, необходимого для изображения микроструктурных объектов меньше корковых пор, таких как остеоциты лакуны. Для этого приложения, SR-CT идеально подходит из-за большего разрешения этих систем1. Например, эксперименты в Канадском источнике света (CLS) на бимеймической визуализации и терапии (BMIT)2 дали изображения с воксельами всего 0,9 мкм. Предыдущиеисследования 1,3,4,5 использовали это разрешение для приобретения проекций и последующих трехмерных (3D) оказывает из корковых образцов кости из человеческих длинных костей (Рисунок 1) для количественной оценки плотности остоцитов лакунар4,6,7,8,9 и изменения в форме лакунара и размер3 на протяжении всей жизни человека и между полами. Дальнейшие исследования показали наличие остеона бандинга улюдей 10, явление, ранее признанное связанным только с нечеловеческими млекопитающими в судебной антропологической литературе.

Для достижения исключительного разрешения рентгеновский луч должен быть тонко сфокусирован в поле зрения (FOV), что часто ограничивает максимальный размер образца несколькими миллиметрами в диаметре. В настоящее время в литературе не было описано всеобъемлющих, стандартизированных процедур, описывающих закупки образцов костей, которые соответствовали бы этим ограничениям. Центрирование образцов в FOV имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы 1) образец остается по центру, как он вращается на 180 "во время изображения, и 2) сканирование артефактов ограничены, так как нет укоренения изображения. Другими словами, никакие части образца за пределами FOV не мешают пучку войти в его координационный центр внутри FOV. Если это происходит, алгоритм реконструкции лишается некоторых данных об затухания, необходимых для полностью правильной реконструкции. Кроме того, стоит отметить, что сканирование на 360 градусов (полное вращение) сводит к минимуму последствия затвердевания пучка, но увеличивает артефакты, вызванные нестолкнения и движения образца во время визуализации. Таким образом, в то время как сканирование на 360 градусов, как правило, генерирует более чистые данные, время обработки изображений удваивается, и поэтому необходимо решить вопрос о компромиссе между экспериментальными затратами и качеством данных.

Важным и часто упускается из виду аспект экспериментов костной визуализации является точная и реплицируемая техника подготовки образцов, выполненная до сканирования. В исследованиях, которые включают методы СРЗКТ в свои эксперименты, кратко упоминается их протокол отбора проб, однако авторы практически не сообщают подробностей о конкретной методологии, используемой для сбора их образцов. Во многих таких исследованиях упоминается резка ректилинейных костных блоков произвольных размеров, но в целом не дают никакой дополнительной информации обинструментах или встраивающихматериалах,используемых 3, 4,10,11,12,13,14. Некоторые исследователи обычно используют портативные роторные инструменты (например, Dremel) для удаления ректилинейных блоков кости из области интересов (ROI)3,4,10,11,12,13,14. Этот метод приводит к неуниформенные выборки, которые могут быть больше, чем FOV, увеличивая вероятность сканирования артефактов и умножения изображения. Такие образцы часто требуют дальнейшей переработки с использованием точной алмазно-вафельной пилы (например, Бюлера Изомета). Закупка образцов с согласованными размерами (до двухсот/мм) имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы приобретенные наборы данных были самого высокого качества и последующие результаты были реплицируемы.

Ограниченная отчетность методологии выборочных закупок добавляет дополнительный уровень сложности при попытке использовать и/или проверять методы, выполненные в предыдущем исследовании. В настоящее время исследователи должны связаться с авторами непосредственно для получения дополнительной информации об их процедурах отбора проб. Протокол, подробно описанный здесь, предоставляет биомедицинским исследователям тщательно документированный, реплицируемый и экономичный метод отбора проб. Основная цель этой статьи заключается в предоставлении всеобъемлющего учебника о том, как закупать последовательно размера корковых образцов костного ядра с использованием мельничного пресса и алмазного коринга бит для точной визуализации и извлечения микроархитектуральных данных. Этот метод модифицирован из процедур, используемых для регулярного сбора однородных цилиндров малого диаметра (1-5 мм) из блоков твердых материаловв механике пород высокого давления 15,16,17,18,19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все образцы были собраны у забальзамированного трупного донора в Университете Толедо, Колледже медицины и наук о жизни и Северо-Восточном Медицинском университете Огайо (NEOMED), с информированного согласия самого донора или ближайших родственников донора. Совет по институциональному обзору Университета Акрона по защите человеческих субъектов (IRB) счел, что эти образцы освобождены от полного обзора IRB, поскольку они не были приобретены у живых людей. Для всех доноров имеется демографическая информация, включая возраст, пол и причину смерти. Выбранные лица не имеют документально кости затрагивающих условиях, ни воздействие схем лечения, которые могут повлиять на кости ремоделирования на момент смерти. Образцы кортикальной кости были получены из бедренной кости трупных современных самцов и самок в возрасте от 19 до 101 года (средний - 73,9 года). Бедренная середина была изученашироко,включая исследования вариации в корковой пористости20,21,22,23,24 и плотность материалакостной ткани 25,26,27, и, таким образом, стал широко используемым местом для микроструктурного анализа.

1. Закупки тканей и maceration

  1. Используйте колеблющиеся пилы оснащены окунуться резки карбида лезвие (для композитных материалов), чтобы закупить 7,5 см костных блоков от середины диафиза левой бедренной кости.
  2. Замочите бедренные блоки в духовке-безопасной стеклянной тарелке, наполненной порошкообразным ферментом протеазы и раствором водопроводной воды в течение 1 ч в инкубаторе, установленном при температуре 45 градусов по Цельсию.
  3. После инкубации тщательно удалите оставшиеся мягкие ткани и периостеум с помощью тупого вскрытия или стоматологических инструментов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования острых инструментов (например, скальпеля) для удаления мягких тканей. Такие приборы могут привести к повреждению кости, которая обнаруживается при сканировании, влияя на сохранение образцов и качество данных сканирования.
  4. Удалите мусор или окклюзии в медуллярной полости, поместив костные блоки в ультразвуковой очиститель в течение 5-10 минут с 20:1 частей водопроводной воды для очистки раствора (см. Таблицу материалов) или с помощью портативного флоксера воды (например, Waterpik).
  5. Погрузите костной блок в чашку образца и заполните 70% этанола. Разрешить кости, чтобы замочить, по крайней мере 24 часов, чтобы удалить липиды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ксилены также могут быть использованы для удаления липидов. Расширенное замачивание в ксиленах, однако, может сделать кости хрупкими или меловыми, поскольку это эмульгатор.
  6. Через 24 часа удалите костные блоки из этанола и дайте высохнуть при температуре окружающей среды в течение 24-48 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь.

2. Раздел тканей

  1. Поместите 75 х 25 мм стеклянный микроскоп слайд на горячей пластине установлен на 140 градусов по Цельсию. Растопить щедрое количество тепловой эпоксидной смолы (см.Таблицу материалов) в центре слайда.
    1. При подготовке дополнительных тонких секций для микроскопии (Lt;50 мкм), костной блок, возможно, должны быть встроены в две части эпоксидной смолы для сохранения trabeculae. Кроме того, при внедрении этого протокола для хрупких образцов (например, диагенетической кости или высоко трабекуляризованных образцов) необходимо встраивание образцов в эпоксидную смолу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы костей, использованные в этом протоколе, были извлечены из забальзамированного трупа. Если свежие образцы собираются при вскрытии или из хирургического корпуса для изучения структур мягких тканей (например, сосудов) с помощью СРЗКТ, пропитка эпоксидной смолой может привести к повреждению таких тканей. В этих случаях рекомендуется альтернативный клей или монтажная среда (например, двусторонняя лента, моделирование глины).
  2. Нажмите нижний аспект костного блока в термическую эпоксидную смолу на слайде микроскопа, с длиной кости перпендикулярно слайду. Сдвиг образца вперед и назад для того, чтобы покрыть нижнюю часть кости и обеспечить безопасную адгезию слайда.
  3. Пусть установленный образец лежит на горячей пластине в течение 5 минут, чтобы тепловой эпоксидной смолы фитиль в поры и / или трещины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эпоксидная смола на слайде должна быть свободна от пузырьков для лучшего притония. Чтобы удалить пузырьки, переложив образец вперед и назад на слайде. Пузыри часто образуются из-за воды и / или этанола в ловушке внутри кости побега и испарения.
  4. Удалите слайд с установленным образцом из горячей пластины с помощью тупых типсов и дайте остыть при комнатной температуре в течение 10 минут. Удалите любую эпоксидную смолу с края слайда с помощью лезвия бритвы, чтобы обеспечить патрон адекватно захватывает слайд.
  5. Прикрепите слайд с прилипаемым образцом к стеклянному горку патрона и смонтировать патрон к поворотной руке медленной скорости секционные пилы (см. Таблица материалов, Рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как пила Buehler IsoMet была использована в этом протоколе, доступны другие точные секционные пилы, которые могут быть использованы вместо IsoMet (например, Leco, Exakt, Smartcut, CT3, Buehler Petrothin, Well Diamond Wire).
  6. Отрегулируйте поворотную руку с помощью позиционирования циферблата, чтобы обеспечить контакты лезвия и трансектирует образец. Распорежьте образец таким образом, чтобы поперечное сечение кости было разрезано перпендикулярно его длине.
  7. Добавьте веса к далекой стороне режущей рукоятки для того чтобы противопоставить вес рукоятки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если используется недостаточный противовес, образец может нести вниз на лезвие и привести к перелому лезвия.
  8. Добавьте режущей жидкости (20:1 частей воды для резки жидкости) в сосуд жидкости пилы.
  9. Плотно закредить лезвие алмазной пластины и обеспечить уровень жидкости погружает режущей части лезвия. Установите скорость до 200 об/мин и медленно опустите образец на лезвие(рисунок 3).
  10. Убедитесь, что лезвие и патрон не колеблются и/ или подпрыгивая. Если отмечается чрезмерное движение, немедленно остановите пилу и затяните лезвие и/или сборку руки патрона перед возобновлением резки. Добавить дополнительные противовесы, если патрон агрессивно движется вверх и вниз. Чрезмерное движение, включая видимое движение из стороны в сторону, может привести к перелому лезвия.
  11. Первый толстый раздел является "отходы вырезать", чтобы обеспечить четко определенную поверхность параллельно каждому дополнительному разрезу. После первоначального сокращения отходов, поднимите поворотную руку и переместить патрон к лезвию 5 мм с помощью позиционирования циферблата. Дальнейшие толстые секции (1 мм) для микроскопии могут быть дополнительно собраны с помощью этого метода.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы сохранить ценные ткани, сокращение отходов может быть опущено. При разделе образца с неравномерным краем, однако, очень важно, чтобы пик образца быть выстроились касательно к краю coring сверла бит.
    1. Не забудьте учесть бордюр лезвия при разделе. Например, чтобы получить 5-мм секцию из лезвия, которое имеет бордюр 0,5 мм, переместить образец и патрон 5,5 мм к лезвию.
  12. После завершения секционирования поместите стеклянную горку с установленным экземпляром на горячую пластину, чтобы растопить тепловую эпоксидную смолу. Это позволяет быстро удалить костные блоки со слайда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь.

3. Образец coring

  1. Гора 5 мм кости разделы на дно мелкой алюминиевой олова (8 см в диаметре) с использованием тепловой эпоксидной связи техники, как описано в шагах 2,2-2,4.
  2. Поместите олово на стол машины XY мельничного пресса (см. таблицу материалов)и затяните зажимы для фиксации рук(рисунок 4).
  3. Вставьте 2 мм внутреннего диаметра полый вал ювелира алмаз наконечником coring сверла бит (см. Таблица материалов) на мельницу-дрель патрон. Отрегулируйте ограничитеитель глубины, чтобы предотвратить coring через олово(рисунок 5).
  4. Выровнять центральный передний аспект образца кости под сверло бит, избегая при этом тесного контакта либо с периостеем, эндостеем, или высоко трабекуляризованных областях.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Автоматизированный выбор средней передней бедренной кости не представляется возможным, как корковая толщина варьируется среди людей, особенно с увеличением возраста.
  5. Заполните олово дистиллированной водой, чтобы полностью покрыть образец. Это предотвращает накопление тепла, сжигание образца и/или повреждение сверла во время coring.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки возможности теплового повреждения, вызванного coring, инфракрасный термометр был использован для достижения температурных показаний от дистиллированной воды, как коринг бит первый проник на поверхность костей. Температура варьировалась на 1 градус По Цельсию, от 22,9 до 23,9 градусов по Цельсию среди десяти образцов, для этого теста. Таким образом, мы утверждаем, что тепловой ущерб является незначительным.
  6. В течение первых нескольких случаев контакта между ядром бит и кости, применять мягкое давление для того, чтобы носить кольцо на верхней поверхности кости. Это предотвращает отклонение бита сверла в начале процесса coring и обеспечивает правильное размещение бита.
  7. Во время coring, поднимите сверло бит в и из образца, сохраняя кончик бита под поверхностью воды. Продолжить этот метод каждые несколько секунд, чтобы избавиться от захваченных костной пыли и обеспечить мусор не occluding сверла бит.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если ядро формирует коническую форму, это, вероятно, из-за 1) позволяет недостаточно времени, чтобы смыть костную пыль из coring бит, и 2) coring происходит слишком быстро. Повышенная скорость может разорвать большие куски из образца и распылять превосходный аспект.
  8. После того, как coring завершена, в результате костного ядра может стать подал в полых стволовых сверла бит (Рисунок 6). Используйте пару тонко наконечником типсов или небольшой ключ Аллен, чтобы выбить ядро из бита (Рисунок 2).
  9. Храните образец с сердцевиной в маркированной трубке микроцентрифуга в прохладном и сухом месте до визуализации.

4. Процедуры обработки изображений для оценки микроархитектуальных параметров костей из корковых костных ядер

  1. Реконструкция изображений кКТ
    1. Загрузите и установите последнюю версию NRecon https://www.bruker.com/products/microtomography.html для реконструкции проекционных изображений SR-CT.
    2. Выберите ярлык NRecon на рабочем столе и появится связанный GPUReconServer.
    3. Откройте желаемый набор данных во всплывающем окне. Если окно не появляется, выберите значок папки в верхнем левом углу окна dataviewer.
    4. Выберите первый прогноз из приобретения SR-CT. В соответствиис выходом, удалить выделения для использования рентабельности инвестиций и весы ON.
    5. Выберите пункт назначения файла реконструкции. Выберите Просмотр и создайте новую папку под названием Recon. Выбранный формат файла должен быть BMP(8).
    6. Проверьте компенсацию неупоздения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта оценка часто близка к правильной. Грубая 3D визуализация может быть вручную скорректирована путем перемещения стрелки вверх и вниз, чтобы сдвинуть перекрывающиеся изображения так, чтобы правый и левый края выравнивались как можно ближе.
    7. В соответствии снастройками, выбрать желаемые варианты для применения сглаживания , луч упрочнения, CS вращения, объект больше, чем FOV, и кольцо артефакты алгоритмов.
    8. Отрегулируйте гистограмму под выход, выбрав Auto.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полученное изображение может быть тусклым.
    9. Выберите Начало для начала обработки реконструкции.
    10. Используйте стандартную номенклатуру для индексов канала/остеоцита лакунар28. К ним могут относятся: общий объем ткани VOI (TV), объем канала (Ca.V), общее количество каналов (Ca.N), средний диаметр канала (Ca.Dm), корковой пористости (Ca.V/TV), учитывая в процентах, общее количество лакуны (N.Lc), и средний объем лакунара (Lc.V), среди других. Для определения плотности лакунаровна мм 3 (N.Lc/BV) объем кости (BV) рассчитывается как общий объем минус объем канала (TV-Ca.V).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь.
  2. Коллекция микроархитектуальных данных из реконструированных изображений
    1. Скачать и установить последнюю версию CTAnalyser https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html для анализа микроархитектуальных параметров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Бесплатная версия CTAnalyser ограничена в функциональности. Поэтому рекомендуется приобрести полную лицензию для проведения более детального анализа.
    2. Под изображением | Недвижимость | Измените размер пикселя,убедитесь, что размер пикселя совпадает с размером применяемого протокола визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При редактировании изображений в ImageJ или аналогичной программе обратите внимание, что при экономии заголовок, встроенный в файл TIFF, будет изменен, а программное обеспечение для анализа изменит размер пикселей при импорте набора данных.
    3. Выберите Пользовательская обработка для создания списка задач (см. Дополнительные материалы) для анализа микроархитектуры костей из набора данных сканирования. Общий протокол для параметров сети osteocyte lacunar с использованием плагинов, запатентованных CTAnalyser, следует здесь:
      ПРИМЕЧАНИЕ: Список задач плагина хорошо работает для наборов данных, где образец является единственным объектом, видимым в FOV. Если образец окружает пустое пространство, требуется применение roi. В противном случае значения, собранные в 3D-анализе и анализе отдельных объектов, будут искусственно снижены.
      1. Перезагрузить изображения для сброса и/или настройки любых изменений (например, от редактирования в ImageJ или аналогичных) до открытия меню пользовательской обработки в программном обеспечении для анализа.
      2. Чтобы уменьшить шум на изображениях, нанесите госсовский фильтр с низким проходом в 3D-пространстве с круглым ядром и радиусом 2-3.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Эти настройки были применены к набору данных из зарегистрированных экспериментов SR-CT путем проб и ошибок тестирования. Цель состояла в том, чтобы добиться наилучшей реконструкции качества данных. Отрегулируйте настройки реконструкции в соответствии с каждой уникальной экспериментальной установкой.
      3. Примените глобальный серый порог к изображениям, выбрав низкие и высокие значения для выделения сосудистых каналов. Реконструированные ломтики, показанные на рисунках 8B и 8D, изображают пример порога 0-155.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Как и шаг 4.2.3.2, настройки порога, применяемые здесь, были выбраны с помощью обширных проб и ошибок. Пороговые значения должны быть скорректированы для каждой используемой экспериментальной системы визуализации и КТЗ.
      4. Despeckle (денуаз) для удаления белых пятен в 3D пространстве, которые находятся в пределах объема пикселей (voxel) диапазон размеров остеоцитов лакуны для того, чтобы изолировать каналы только.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для сканирования SR-CT человеческой корковой кости, взятой при размере 0,9 мкм пикселя, нижний предел для остеоцитов лакуны составляет 13 вокселей.
      5. Despeckle, чтобы удалить любые черные пятнышки в 2D пространстве, чтобы удалить артефакты в каналах. Они могут быть довольно большими в 2D, таким образом, удалить функции, которые являются lt;15,000 пикселей.
      6. Расширяйте поры в 3D-пространстве с помощью функции морфологической операции с круглым ядром 2 или 3 радиуса, в зависимости от качества изображений, чтобы изолировать любые мягкие ткани, попавшие в каналы.
      7. Выполните дополнительную функцию Despeckle, используя те же настройки, что и шаг 4.2.3.5. для удаления изолированных мягких тканей в каналах.
      8. Разрушить расширение от шага 4.2.3.6. с помощью функции морфологической операции с использованием круглого ядра с радиусом 2 или 3. Радиус для этого шага должен соответствовать радиусу, используемого в Процедуре 4.2.3.6.
      9. Вы запустите 3D-анализ и выберите, какие параметры рассчитать по объему сосудистых каналов. Как правило, основные значения будут предоставлять достаточную информацию.
      10. Сохраните обработанные изображения с помощью Save Bitmaps в пользовательский субфолдер в каталоге.
        ПРИМЕЧАНИЕ: При создании 3D-изображения реконструкции из обработанных изображений с помощью программы, такой как Amira/Avizo, Dragonfly, Drishti и т.д., рекомендуется сохранить изображения как монохромные (1 бит).
      11. Рассчитайте количество сосудистых каналов и опишите их размер, форму и ориентацию с помощью функции анализа отдельных объектов.
      12. Повторите шаги 4.2.3.1 - 4.2.3.3. сбросить изображение для анализа остеоцитов лакунар.
      13. Удалите белые пятнышки в 3D-пространстве с помощью функции Despeckle, гарантируя, что такие артефакты меньше, чем нижний предел размера лакунара. Этот шаг удаляет шум от сканирования, который может показаться корковых пор, сохраняя при этом истинный остеоцит лакуна. Для сканирования SR-CT человека размером 0,9 мкм пикселей этот нижний предел составляет 13 вокелей.
      14. Despeckle еще раз, чтобы удалить белые пятнышки, которые больше, чем верхний предел размера лакунара. Для наборов данных СРЗКТ с настройками, перечисленными в шаге 4.2.3.13, этот предел составляет 2743 вокселей.
      15. Выполните 3D-анализ для извлечения микроструктурной информации, относящейся к остеоцитов лакуна в частности.
      16. Выберите Сохранить Bitmaps для сохранения обработанных изображений для того, чтобы изолировать остеоцита лакуны.
      17. Выполните индивидуальный анализ объектов для расчета количества остеоцитов в 3D в пределах выбранного объема интереса (VOI).
        ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как список задач был создан и протестирован, CTAnalyser имеет функцию пакетного менеджера (BatMan), которая может быть использована для ускорения извлечения данных и обеспечения равномерной обработки изображений. Список задач с настройками примера для процедуры 4.2.3. можно найти в дополнительных материалах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Описанный метод отбора проб ядер оказался высокоэффективным и эффективным. Образцы Coring, использующие этот протокол, позволяли засовывать образцы последовательного размера для экспериментов на луче CLS BMIT-BM2, с FOV в размере 2 мм при размере 1,49 мкм вокселя. Для проверки согласованности диаметра ядра было проведено три измерения по длине (вверху, середину, дно) подмножества передних бедренной кости человека(nNo69). Средний диаметр ядер составил 1,96 ± 0,11 мм, а среднее истончение по длине ядра составило 0,06 ± 0,06 мм/мм. Чтобы подчеркнуть применимость к другим твердым композитным материалам, мы попытались использовать этот метод на образцах доломита(nNo32), в результате чего средний диаметр составил 1,06 ± 0,02 мм. Утончение по длине основного образца было зафиксировано как 0,01 ± 0,005 мм/мм. Репрезентативные цифры, сравнивающие рабочий процесс обработки изображений образца с cored и одного, закупленного с помощью роторного инструмента (например, Dremel), как описано в шаге 4.2.3, можно посмотреть на рисунке 7. Образец разреза с использованием общего роторного инструмента выставлены увеличение числа каналов (Ca.N) и лакуна (Lc.N), а также снижение среднего диаметра канала (Ca.Dm), объем канала (Ca.V), и корковой пористости (Ca.V/TV) по сравнению с кордом образца. Хотя некоторые из этих различий могут быть вызваны изменением микроструктуры костей между отдельными лицами, большее количество каналов и пробелов, извлеченных из набора данных роторного инструмента, вероятно, искусственно увеличилось из-за сканирования артефактов и шума (рисунок 7). Данные о пористости, собранные из шага 4.2.3.9 для каждого образца, находятся в таблице 1. Стоит отметить, что, хотя протокол coring уменьшает артефакты, наблюдаемые в СРЗКТ, низкое качество, нагруженные артефактами фигуры из ректилинейных экспериментов костногоблока (рисунок 7A) представляют собой многогранную проблему. Некоторые артефакты (например, сигналы фазового контраста) могли быть вызваны синхротронным объектом или специфическими проблемами лучевой линии. Параметры сканирования как репрезентативных наборов экспериментов, так и связанных сними цифр (рисунки 7A, 7B) можно найти в дополнительных материалах (таблицы S1, S2).

Синхротронные микро-CT изображения, собранные из образцов cored успешно подавлены артефакты сканирования, как показано выше, в том числе полосы артефактов. Последующая обработка изображений подтвердила потенциал методики улучшения визуализации микроархитектуры корковых костей. Например, наблюдались различия в минерализации, улучшенное разграничение остеональных границ и последовательная визуализация мягких тканей в сосудистых каналах(рисунки 8С, 8D). Последнее имеет решающее значение для обработки изображений, поскольку частичная визуализация мягких тканей в каналах может привести к неточным расчетам процентной пористости и толщины пор, так как поры не заполнены полностью. Границы остеоцитов лакуны были также улучшены за счет снижения бирифринга, что позволяет количественно определить параметры формы. Потенциальные преимущества описанной техники coring включают легкость центрирования образца в FOV, снижение аналитических требований, и последовательную визуализацию мягких тканей в сосудистых каналах.

Аналогичные процедуры были успешно использованы для ядра одиночных кристалловортопироксена 18,поликристаллическогомагнезита 19 идругих геологических материалов 15,16,17 для экспериментов по деформации горных пород высокого давления. Эти эксперименты требуют ядер в конкретных ориентациях относительно кристаллографических осей в одиночныхкристаллах 18 или выровненных кристаллов в поликристаллическихпородах 19 для того, чтобы определить специфические сильные стороны ориентации. Описанные выше подходы были использованы для создания сначала ориентированных плит, а затем для серии экспериментов по деформации собрать несколько однородных цилиндрических ядер. Эти методы могут быть использованы для сбора ядер любого твердого материала, таких как кости, керамика или очки. Например, приведенная выше методология может быть применена биологическими антропологами для оценки ядер из конкретных областей внутри корковой кости и связанных с ними биомеханических (например, напряжения/сжатия) осей.

Figure 1
Рисунок 1. Цилиндрические VOI из левой передней человеческой середине вала бедренной кости.  Один SR-CT реконструированный кусок целого ядра от левой передней человеческой середине вал бедренной кости (21-летняя женщина) (A), и 3D визуализации визуализации цилиндрических VOI от начальника (B) и передние взгляды (C) визуализированы. Прогнозы были приняты на 0,9 мкм, с сосудистыми каналами выделены красным и остеоцитов лакуны в сером цвете. Шкала баров обозначает 0,25 мм(A)и 0,02 мм(B,C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2. Образец бедренной кости среднего вала (толщина 5 мм), установленный на слайде стеклянного микроскопа с тепловой эпоксидной смолой (см. таблицу материалов) и закрепленный на стеклянном слайд-патроне. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3. Стеклянный слайд патрон с установленным образца обеспеченных к поворотной руке низкой скорости секционные пилы (см. Таблица материалов) до раздела. Боковое положение поворотной руки относительно лезвия пилы и скорости сечения (RPM) отображается на верхних и нижних рядах жидкокристаллических дисплеев, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4. 5 мм бедренной секции, установленной на алюминиевой олова и закреплены на XY мельницы буровой машины стол с использованием фиксации зажимы в рамках подготовки к coring. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5. Мельничный буровой пресс, используемый в разработанном протоколе (A). Стрелка определяет ограничитель глубины, который предотвращает проникновение сверла глубоко в образец или через дно олова(B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6. 5 мм бедренной кости поперечного сечения после основных закупок из переднего аспекта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 7
Рисунок 7. Одиночный СРЗКТ реконструировал ломтики переднего аспекта левой бедренной кости от двух особей. Specimen (A) был секционирован с использованием общего роторного инструмента и (B) был закуплен с использованием метода coring, описанного здесь. Каждый срез сравнивается с их сегментированный аналог (C и D). Обратите внимание на легкость изоляции корковой пористости в образце сердцевины (D), в отличие от образца, собранного с помощью роторного инструмента (C). Об этом свидетельствуют далее в 3D рендерах сосудистых каналов каждого образца(E и F). Шум вокруг периферии B очевиден, и образец покидает FOV, что приводит к увеличению проблем при обработке изображений. Шкала бар впанели ( D) обозначает 250 мкм для панелей (A-D). Шкала баров впанелях (E и F) обозначает 700 и 600 мкм, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 8
Рисунок 8. Репрезентативная рентабельность инвестиций из образца, закупленного с помощью роторного инструмента (A-C) и одного cored с использованием метода, представленного здесь (D-F). Панели(A) и (D) представляют назначенную рентабельность инвестиций от сканирования SR'CT. Панели(B) и ( E )представляют собойстадию обработки, используемую для изоляции и извлечения параметров сосудистого канала. В правом верхнем праве панели(B) есть посторонние объекты (стрелки), которые были классифицированы как сосудистые каналы с помощью программного обеспечения обработки изображений. Панели(C)и ( F )представляют собойэтап обработки, используемый для изоляции и извлечения лакуны. Масштаб баров обозначает 0,1 мм для всех панелей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Объем тканей (ТВ) Объем канала (Ca.V) Поверхность канала (Ca.S) Кортикальные пористости (Ca.V/TV) Поверхность канала к объему ткани (Ca.S/TV) Средний диаметр канала (Ca.Dm) Среднее разделение канала (Ca.Sp) Lol каналов (Ca.N) Lol Лакуне (Lc.N) Плотность пор (Pores/TV)
Единиц мм3 мм3 мм2 % 1/мм Мкм Мкм # # поры/м3
Ротари Cut 0.15861 0.01780 0.00287 11.23 0.01808 51.05 122.81 459 64662 0.00041
Коред (Этот метод) 0.15747 0.02451 0.00216 15.56 0.01373 120.73 145.38 76 30531 0.00019

Таблица 1. Репрезентативные результаты для шага 4.2.3.9 роторного инструмента и образцов cored визуализированы на рисунке 8. Обратите внимание на снижение Ca.V., Ca.V/TV, Ca.Dm, количество пор и плотности пор для роторного образца разреза, а также увеличение числа сосудистых каналов и лакуна. Сканирование артефактов, частично вызванных неравномерно вырезанной выборкой, вероятно, способствовало искусственному увеличению лакуна и корковых пор.

Дополнительные материалы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эти материалы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Не было никакого всеобъемлющего, стандартизированного протокола для закупки однородных и цилиндрических образцов корковой кости для изображения СРЗКТ высокого разрешения с ограниченными установками FOV. Протокол, подробно описанный здесь, заполняет эту пустоту, предоставляя всеобъемлющий учебник о том, как закупать последовательно размера образцов корковых костных ядер для визуализации SR-CT и последующей точной визуализации и извлечения микроархитектуральных данных. Мы показали, что наш протокол обеспечивает более стандартизированный и надежный метод закупки корковых костных ядер, чем предыдущие описания секционные ректилинейные костные блоки произвольных размеров. Таким образом, исследователи, которые полагались на портативные роторные инструменты (например, Dremel), чтобы удалить неправильно размера блоков кости, вероятно, опытных гораздо больше времени настройки образца во время изображения и большие ошибки в пороговых и корковых пор извлечения во время анализа. Это несоответствие подчеркивает необходимость и значение этого стандартизированного протокола в отношении подготовки костной выборки, последующей визуализации и анализа, а также интерпретации результатов.

Процедура, изложенная здесь, может быть дополнительно адаптирована исследователями в смежных областях, которые обычно оценивают костную ткань, такие как биологические антропологи и археологи. Однако ни диагенетические, ни археологические/исторические образцы костей не были облежены для описанного протокола исследования. Диагенез, в геологии, относится к изменениям материала (например, кости) после осаждения и может включать в себя изменения, вызванные физическими, химическими илибиологическими средствами 29,30. Наземная вода, грибы и другие микробные инфильтрации могут выступать в качестве диагенетических агентов и изменять микроморфологию костнойткани 31. Такие образцы могут потребовать дополнительных процедурных шагов до coring, таких как встраивание в метил-метакрилат (MMA) или две части эпоксидной смолы. Встраивание бедренной кости не было необходимо для описанных экспериментов из-за плотной природы бедренной корки кости, и тот факт, что трупные образцы были забальзамированы вскоре после смерти. Однако при оценке хрупких скелетных элементов и их трабекулы (например, ребер) мы рекомендуем встроить весь костной блок до coring.

Все костные ткани, оцененные в этом исследовании, были забальзамированы в то время как свежие. Авторы не имели доступа к конкретной комбинации химических веществ, используемых в процессе бальзамирования, хотя сохранение химических веществ обычно включают формальдегид, этанол, фенол, этиленгликоль, и глутаралдегид. Судебно-антропологические данные, документирующий изменения в микроструктуре насыщенных формальдегидом костей, ограничены, хотя Freidlander32 показал, что фиксация формальдегида не изменяет морфологию некоторых особенностей, включая аверсианские каналы и вторичные остеоны. Формальдегид насыщения, однако, документально влияет на некоторые механические свойства и перелом характеристики нечеловеческой кости, такие как сила удара ипрочность перелома 33,34.

Мы сообщили о методе для корирования образцов корковой кости до визуализации с высоким разрешением рентгеновских систем (SR-CT). Этот метод является экономически эффективным, в связи с тем, что материалы и оборудование могут быть собраны из местных магазинов оборудования, эффективным, и обеспечивает единый размер выборки между образцами. Мы надеемся, что наши предложения сократят число запросов, касающихся того, каким образом образцы должны быть закуплены, корарены и проанализированы для СРЗКТ, поскольку существующая литература остается разреженной и не имеет критических деталей в отношении подготовки и последующего анализа. Наша основная цель состоит в том, чтобы мотивировать исследователей применять этот протокол coring в качестве стандартизированной процедуры для исследования костной визуализации высокого разрешения. Мы также надеемся, что вышеупомянутые трудности, с которыми мы столкнулись при разработке этого метода, с облегчением общих вопросов и руководством по устранению неполадок.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgments

Исследования, описанные в настоящем документе, были проведены на объекте BMIT в Канадском источнике света, который поддерживается Канадским фондом инноваций, естественных наук и инженерных исследований Совета Канады, Университета Саскачевана, правительства Саскачевана, Западной экономической диверсификации Канады, Национального исследовательского совета Канады и Канадских институтов исследований в области здравоохранения. Авторы хотели бы поблагодарить ученых-лучей из Канадского источника света, в частности Адама Уэбба, Дениз Миллер, Сергея Гасилова и Нин Цу за помощь в настройке и устранении неполадок в системах SkyScan SR-CT и микроскопов белого луча. Мы также хотели бы поблагодарить Бет Dalzell из Университета Толедо колледжа медицины и наук о жизни и д-р Джеффри Wenstrup из Северо-Восточного Огайо медицинский университет для доступа к трупных образцов для этого исследования. JM Andronowski поддерживается за счет стартовых научно-исследовательских фондов, предоставляемых Университетом Акрона и Национальным институтом исследований и разработок в области судебной медицины для целей уголовного правосудия грант (2018-DU-BX-0188). РА Дэвис поддерживается аспирантом, предоставленным Университетом Акрона. Оборудование и материалы, используемые для coring и распиливания были приобретены на стартовые средства, предоставленные Университетом Акрона и NSF грант EAR-1624242 для CW Холиок.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-1/8" plunge cutting carbide for composites Warrior 61812 28.6mm plunge
70% Ethanol Fisher Scientific BP8201500 3.8 Liters
Blunt-tipped forceps Fisher Scientific 10-300
Centrifuge tubes ThermoFisher 55398
Crystalbond 509-3 Epoxy Ted Pella 821-3
CTAnalyser Bruker microCT v.1.15.4.0 Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html
Dental Tool Kit Amazon 787269885110
Diamond wafering saw blade for composite material Buehler #11-4247
Drill Press Jet Mill/Drill 350017 Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem
Fine-tipped forceps Fisher Scientific 22-327379
Fixturing clamps for XY machine table for mill/drill MSC Industrial Supply #04804571
Glass microscope slides Ted Pella 26005 75x50mm slides, 1mm thick
Glass slide chuck Buehler #112488 Large enough to hold 75x50mm glass slides
Hot plate capable of reaching 140 °C ThermoScientific HP88850105
Incubator NAPCO Model 4200
Isocut Fluid Buehler 111193032 Lubricant; 30mL
Jeweler's diamond coring drill bit Otto Frei #119.050 2mm inner diameter hollow stem coring bit
NRecon Bruker microCT v.1.6.10.2 Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html
Oscillating saw Harbor Freight 62866
Oven-safe glass dishes Pyrex 1117715 Glass food storage container
Precision slow-speed saw (Isomet 1000) Buehler 111280160
Razor blades Amazon 25181
Shallow aluminum tins Amazon B01MRWLD0R ~8cm diameter
Specimen cups Amazon 616784425436 885334344729
Tergazyme detergent Alconox 1304-1 1.8kg box
Ultrasonic cleaner MTI Corporation KJ201508006

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Andronowski, J. M., Crowder, C., Soto Martinez, M. Recent advancements in the analysis of bone microstructure: New dimensions in forensic anthropology. Forensic Sciences Research. 3 (4), 278-293 (2018).
  2. Wysokinski, T. W., et al. Beamlines of the biomedical imaging and therapy facility at the Canadian light source - part 3. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 775, 1-4 (2015).
  3. Carter, Y., Suchorab, J. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Normal variation in cortical osteocyte lacunar parameters in healthy young males. Journal of Anatomy. 225 (3), 328-336 (2014).
  4. Carter, Y., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Femoral osteocyte lacunar density, volume and morphology in women across the lifespan. Journal of Structural Biology. 183 (3), 519-526 (2013).
  5. Langer, M., et al. X-Ray Phase Nanotomography Resolves the 3D Human Bone Ultrastructure. PLoS ONE. 7 (8), 35691 (2012).
  6. Peyrin, F., Dong, P., Pacureanu, A., Langer, M. Micro- and Nano-CT for the Study of Bone Ultrastructure. Current Osteoporosis Reports. 12 (4), 465-474 (2014).
  7. Dong, P., et al. 3D osteocyte lacunar morphometric properties and distributions in human femoral cortical bone using synchrotron radiation micro-CT images. Bone. 60, 172-185 (2014).
  8. Gauthier, R., et al. 3D micro structural analysis of human cortical bone in paired femoral diaphysis, femoral neck and radial diaphysis. Journal of Structural Biology. 204 (2), 182-190 (2018).
  9. Giuliani, A., et al. Bisphosphonate-related osteonecrosis of the human jaw: A combined 3D assessment of bone descriptors by histology and synchrotron radiation-based microtomography. Oral Oncology. 82, 200-202 (2018).
  10. Andronowski, J. M., Pratt, I. V., Cooper, D. M. L. Occurrence of osteon banding in adult human cortical bone. American Journal of Physical Anthropology. 164 (3), 635-642 (2017).
  11. Andronowski, J. M., Mundorff, A. Z., Pratt, I. V., Davoren, J. M., Cooper, D. M. L. Evaluating differential nuclear DNA yield rates and osteocyte numbers among human bone tissue types: A synchrotron radiation micro-CT approach. Forensic Science International: Genetics. 28, 211-218 (2017).
  12. Britz, H. M., et al. Prolonged unloading in growing rats reduces cortical osteocyte lacunar density and volume in the distal tibia. Bone. 51 (5), 913-919 (2012).
  13. Maggiano, I. S., et al. Three-dimensional reconstruction of Haversian systems in human cortical bone using synchrotron radiation-based micro-CT: morphology and quantification of branching and transverse connections across age. Journal of Anatomy. 228 (5), 719-732 (2016).
  14. Cooper, D. M. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Hallgrímsson, B. Three-dimensional microcomputed tomography imaging of basic multicellular unit-related resorption spaces in human cortical bone. The Anatomical Record Part A: Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 228 (7), 806-816 (2006).
  15. Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J., Ulrich, C. Rheology of magnesite: Rheology of Magnesite. Journal of Geophysical Research: Solid Earth. 119 (8), 6534-6557 (2014).
  16. Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K. Reversible water weakening of quartz. Earth and Planetary Science Letters. 374, 185-190 (2013).
  17. Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J. Dislocation creep of polycrystalline dolomite. Tectonophysics. 590, 72-82 (2013).
  18. Raterron, P., Fraysse, G., Girard, J., Holyoke, C. W. Strength of orthoenstatite single crystals at mantle pressure and temperature and comparison with olivine. Earth and Planetary Science Letters. 450, 326-336 (2016).
  19. Millard, J. W., et al. Pressure Dependence of Magnesite Creep. Geosciences. 9 (10), 420 (2019).
  20. Thomas, C. D. L., Feik, S. A., Clement, J. G. Regional variation of intracortical porosity in the midshaft of the human femur: age and sex differences. Journal of Anatomy. 206 (2), 115-125 (2005).
  21. Jowsey, J. Age Changes in Human Bone. Clinical Orthopaedics and Related Research. 17, 210 (1960).
  22. Martin, R. B., Pickett, J. C., Zinaich, S. Studies of skeletal remodeling in aging men. Clinical Orthopaedics and Related Research. (149), 268-282 (1980).
  23. Martin, R. B., Burr, D. B. Mechanical implications of porosity distribution in bone of the appendicular skeleton. Orthopedic Transactions. 8, 342-343 (1984).
  24. Bousson, V., et al. Distribution of Intracortical Porosity in Human Midfemoral Cortex by Age and Gender. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (7), 1308-1317 (2001).
  25. Goldman, H. M., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Bromage, T. G. Relationships among microstructural properties of bone at the human midshaft femur. Journal of Anatomy. 206 (2), 127-139 (2005).
  26. De Micheli, P. O., Witzel, U. Microstructural mechanical study of a transverse osteon under compressive loading: The role of fiber reinforcement and explanation of some geometrical and mechanical microscopic properties. Journal of Biomechanics. 44 (8), 1588-1592 (2011).
  27. Martin, R. B., Boardman, D. L. The effects of collagen fiber orientation, porosity, density, and mineralization on bovine cortical bone bending properties. Journal of Biomechanics. 26 (9), 1047-1054 (1993).
  28. Cooper, D. M. L., Turinsky, A. L., Sensen, C. W., Hallgrímsson, B. Quantitative 3D analysis of the canal network in cortical bone by micro-computed tomography. The Anatomical Record Part B: The New Anatomist. 274 (1), 169-179 (2003).
  29. Crowder, C., Heinrich, J., Stout, S. D. Rib histomorphometry for adult age estimation. Forensic Microscopy for Skeletal Tissues: Methods and Protocols. , 109-127 (2012).
  30. Pfeiffer, S. Paleohistology: Health and disease. Biological Anthropology of the Human Skeleton. , 287-302 (2000).
  31. Bone Hedges, R. E. M. diagenesis: an overview of processes. Archaeometry. 44 (3), 319-328 (2002).
  32. Friedlander, H. The use of formaldehyde imbedded human remains in experimental procedures. , Available from: https://capa-acap.net/sites/default/files/basic-page/capa_2017_program_final_no_cover.pdf (2017).
  33. Currey, J. D., Brear, K., Zioupos, P., Reilly, G. C. Effect of formaldehyde fixation on some mechanical properties of bovine bone. Biomaterials. 16 (16), 1267-1271 (1995).
  34. Asaka, T., Kikugawa, H. Effect of formaldehyde solution on fracture characteristics of bovine femoral compact bone. Journal of the Japan Institute of Metals. 69 (8), 711-714 (2005).

Tags

Биология выпуск 160 Кортикическая кость 3D-изображение Композитные ткани микро-КТ синхротрон обработка изображений
Руководство по секционной обработке, корингу и обработке изображений для закупок и анализа образцов высокой пропускной способности кортикальной кости для синхротронной микро-CT
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Andronowski, J. M., Davis, R. A.,… More

Andronowski, J. M., Davis, R. A., Holyoke, C. W. A Sectioning, Coring, and Image Processing Guide for High-Throughput Cortical Bone Sample Procurement and Analysis for Synchrotron Micro-CT. J. Vis. Exp. (160), e61081, doi:10.3791/61081 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter