Summary
Empleamos un protocolo geológico (coring) de muestreo para adquirir muestras óseas corticales de tamaño uniforme para experimentos SRμCT desde el aspecto anterior de la femora humana. Este método es mínimamente destructivo, eficiente, resulta en muestras cilíndricas que minimizan los artefactos de imagen de formas de muestra irregulares y mejora la visualización y análisis microarquiitectural.
Abstract
El hueso es un tejido dinámico y mecánicamente activo que cambia de estructura sobre la vida útil humana. Los productos del proceso de remodelación ósea han sido estudiados sustancialmente utilizando técnicas bidimensionales tradicionales. Los recientes avances en la tecnología de imágenes de rayos X a través de tomografía micro-computarizada de escritorio (μCT) y tomografía micro-computarizada de radiación sincrotrón (SRμCT) han permitido la adquisición de escaneos tridimensionales de alta resolución (3D) de un campo de visión más grande (FOV) que otras técnicas de imágenes 3D (por ejemplo, SEM) proporcionando una imagen más completa de las estructuras microscópicas dentro del hueso cortical humano. Sin embargo, la muestra debe centrarse con precisión dentro del FOV para limitar la aparición de artefactos de rayas conocidos por afectar el análisis de datos. Estudios anteriores han reportado la adquisición de bloques óseos rectilíneas de forma irregular que resultan en artefactos de imágenes debido a bordes irregulares o truncamiento de imagen. Hemos aplicado un protocolo de muestreo geológico (coring) para adquirir especímenes de núcleo óseo cortical de tamaño consistente para experimentos SRμCT desde el aspecto anterior de la femora humana. Este método de coring es eficiente y mínimamente destructivo para el tejido. Crea muestras cilíndricas uniformes que disminuyen los artefactos de imagen por naturaleza de ser isométricos durante la rotación y proporcionan una longitud de trayecto uniforme para los haces de rayos X a lo largo del escaneo. El procesamiento de imágenes de datos tomográficos de rayos X de muestras con forma irregular y de cored confirma el potencial de la técnica para mejorar la visualización y el análisis de la microarquitectura ósea cortical. Un objetivo de este protocolo es ofrecer un método confiable y repetible para la extracción de núcleos óseos corticales que es adaptable para varios tipos de experimentos de imágenes óseas de alta resolución. Un objetivo general de la obra es crear una adquisición de hueso cortical estandarizado para SRμCT que sea asequible, consistente y directa. Este procedimiento puede ser adaptado por investigadores en campos relacionados que comúnmente evalúan materiales compuestos duros como antropología biológica, geociencias o ciencias materiales.
Introduction
Con los recientes avances en la tecnología de imágenes, ahora es factible adquirir datos de imágenes de rayos X con muy alta resolución. Los sistemas micro-CT de escritorio (μCT) son el estándar actual para el hueso canceloso por imágenes debido a su naturaleza no destructiva1. Sin embargo, cuando las características microestructurales por imágenes del hueso cortical, el uso de μCT ha sido más limitado. Debido a las restricciones de resolución, los sistemas de escritorio no pueden alcanzar la resolución necesaria para crear imágenes de características microestructurales más pequeñas que los poros corticales, como las lagunas de osteocitos. Para esta aplicación, SRμCT es ideal debido a la mayor resolución de estos sistemas1. Por ejemplo, los experimentos en la Fuente de Luz Canadiense (CLS) en las líneas de haz de imágenes y terapia biomédicas (BMIT)2 han producido imágenes con voxels de hasta 0,9 μm. Estudios previos1,3,4,5 han utilizado esta resolución para adquirir proyecciones y posteriores renderizaciones tridimensionales (3D) a partir de especímenes óseos corticales de huesos largos humanos(Figura 1)para cuantificar la densidad de lacunar de osteocitos4,6,7,8,9 y variación en la forma de lacunar y tamaño3 a lo largo de la vida humana y entre los sexos. Otros estudios han demostrado la presencia de bandas de osteones en humanos10,un fenómeno previamente reconocido como asociado sólo con mamíferos no humanos en la literatura antropológica forense.
Para lograr una resolución excepcional, el haz de rayos X debe centrarse finamente dentro del campo de visión (FOV), que a menudo limita el tamaño máximo de la muestra a unos pocos milímetros de diámetro. Actualmente, no ha habido procedimientos completos y estandarizados descritos en la literatura que describa la adquisición de muestras óseas que cumplan estas restricciones. El centrado de muestras dentro del FOV es fundamental para garantizar que 1) la muestra permanezca centrada a medida que gira 180° durante la toma de imágenes, y 2) artefactos de escaneo son limitados ya que no hay truncamiento de imagen. En otras palabras, ninguna porción de la muestra fuera del FOV interfiere con el haz que entra en su punto focal dentro del FOV. Si esto ocurre, el algoritmo de reconstrucción se ve privado de algunos de los datos de atenuación necesarios para una reconstrucción totalmente correcta. Vale la pena señalar además que los escaneos de 360° (rotación completa) minimizan los efectos del endurecimiento del haz, pero aumentan los artefactos causados por la desalineación y el movimiento de la muestra durante la toma de imágenes. Por lo tanto, mientras que una exploración de 360° normalmente generará datos más limpios, el tiempo de imagen se duplica y por lo tanto se debe abordar un compromiso entre el costo experimental y la calidad de los datos.
Un aspecto importante y a menudo pasado por alto de los experimentos de imágenes óseas es la técnica de preparación de muestras precisa y replicable realizada antes de la exploración. Los estudios que incorporan métodos SRμCT en sus experimentos mencionan brevemente su protocolo de muestreo, pero los autores proporcionan poco o ningún detalle con respecto a la metodología particular utilizada para reunir sus especímenes. Muchos de estos estudios mencionan el corte de bloques óseos rectilíneos de dimensiones arbitrarias, pero generalmente no proporcionan más información sobre las herramientas o materiales de incrustación utilizados3,4,10,11,12,13,14. Algunos investigadores utilizan comúnmente herramientas rotativas portátiles (por ejemplo, Dremel) para eliminar bloques rectilíneas de hueso de una región de interés (ROI)3,4,10,11,12,13,14. Este método da como resultado muestras de tamaño no uniforme que pueden ser mayores que la FOV, lo que aumenta la probabilidad de artefactos de exploración y truncamiento de imagen. Estos especímenes a menudo requieren más refinación utilizando una sierra de diamantes y obleas de precisión (por ejemplo, Buehler Isomet). La adquisición de muestras con dimensiones coherentes (hasta las dos centésimas/mm) es fundamental para garantizar que los datasets adquiridos sean de la más alta calidad y que los resultados posteriores sean replicables.
La limitada notificación de la metodología de adquisición de muestras añade una capa adicional de dificultad al intentar emplear y/o validar métodos realizados en un estudio anterior. Actualmente, los investigadores deben ponerse en contacto directamente con los autores para obtener más detalles sobre sus procedimientos de muestreo. El protocolo detallado aquí proporciona a los investigadores biomédicos una técnica de muestreo completamente documentada, replicable y rentable. El objetivo principal de este artículo es proporcionar un tutorial completo sobre cómo adquirir muestras de núcleo óseo cortical de tamaño consistente utilizando una prensa de perforación de molino y broca de diamante para la visualización y extracción precisas de datos microarquiitecturales. Este método se modifica a partir de procedimientos utilizados para recoger rutinariamente cilindros uniformes de diámetro pequeño (1-5 mm) de bloques de materiales duros en mecánica de roca de alta presión15,16,17,18,19.
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Protocol
Todos los especímenes procedían de donantes cadavéricos embalsamados de la Universidad de Toledo, la Facultad de Medicina y Ciencias de la Vida y la Universidad Médica del Noreste de Ohio (NEOMED), con el consentimiento informado del propio donante o de los parientes más cercanos del donante. La Junta de Revisión Institucional para la Protección de los Sujetos Humanos (IRB) de la Universidad de Akron consideró que estos especímenes estaban exentos de una revisión completa del IRB, ya que no se adquirieron de individuos vivos. La información demográfica, incluida la edad, el sexo y la causa de la muerte, estaba disponible para todos los donantes. Los individuos seleccionados no tenían condiciones de afectación ósea documentadas ni exposición a regímenes de tratamiento que pudieran haber afectado la remodelación ósea en el momento de la muerte. Se obtuvieron muestras óseas corticales de femora de machos y hembras modernos cadavéricos con edades que oscilaban entre los 19 y los 101 años de edad (media = 73,9 años). El árbol medio femoral ha sido estudiado extensamente incluyendo exámenes de variación en porosidad cortical20,21,22,23,24 y densidad material del tejido óseo25,26,27,y por lo tanto se ha convertido en un sitio comúnmente utilizado para análisis microestructurales.
1. Adquisición y maceración de tejidos
- Utilice una sierra oscilante equipada con una hoja de carburo de corte a presión (para materiales compuestos) para adquirir ~7,5 cm bloques óseos de la mitad de las diafisias de la femora izquierda.
- Remoje los bloques femorales en un plato de vidrio apto para horno lleno de una enzima proteasa en polvo y solución de agua del grifo durante 1 h en una incubadora situada a 45 °C.
- Después de la incubación, retire cuidadosamente los tejidos blandos y periosteum restantes utilizando disección contundente o herramientas dentales.
NOTA: Evite el uso de herramientas afiladas (por ejemplo, bisturí) para eliminar los tejidos blandos. Tales instrumentos pueden causar daños en el hueso que se detectan en las exploraciones μCT, afectando la preservación de la muestra y la calidad de los datos de escaneo. - Retire los desechos u oclusiones en la cavidad medular colocando bloques óseos en un limpiador ultrasónico durante 5-10 minutos con 20:1 partes de agua del grifo a la solución de limpieza (ver Tabla de Materiales)o usando un hilo dental de agua portátil (por ejemplo, Waterpik).
- Sumerja el bloque óseo en una taza de espécimen y llénelo con un 70% de etanol. Deje que el hueso se empape durante al menos 24 horas para eliminar los lípidos.
NOTA: Los xilenos también se pueden utilizar para eliminar los lípidos. El remojo prolongado en xilenos, sin embargo, puede hacer que el hueso sea quebradizo o calcáreo, ya que es un emulsionante. - Después de 24 horas, retire los bloques óseos del etanol y deje secar al aire a temperatura ambiente durante 24-48 horas.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
2. Sección de tejidos
- Coloque una diapositiva de microscopio de vidrio de 75 x 25 mm sobre una placa caliente situada a 140 °C. Derretir una generosa cantidad de resina epoxi térmica (ver Tabla de Materiales)en el centro de la diapositiva.
- Si se preparan secciones delgadas adicionales para la microscopía (<50 μm), es posible que sea necesario incrustar el bloque óseo en una epoxi de dos partes para preservar la trabeculae. Además, al implementar este protocolo para muestras frágiles (por ejemplo, hueso diagenético o especímenes altamente trabecularizados) es necesario incrustar muestras en una epoxi.
NOTA: Las muestras óseas utilizadas en este protocolo fueron recuperadas de muestras cadavéricas embalsamadas. Si se recogen muestras frescas en la autopsia o en una caja quirúrgica para examinar las estructuras de tejidos blandos (por ejemplo, vasculatura) a través de SRμCT, la impregnación con epoxi puede inducir daños en dichos tejidos. En estos casos, se recomienda un adhesivo alternativo o medio de montaje (por ejemplo, cinta de doble cara, arcilla de modelado).
- Si se preparan secciones delgadas adicionales para la microscopía (<50 μm), es posible que sea necesario incrustar el bloque óseo en una epoxi de dos partes para preservar la trabeculae. Además, al implementar este protocolo para muestras frágiles (por ejemplo, hueso diagenético o especímenes altamente trabecularizados) es necesario incrustar muestras en una epoxi.
- Presione el aspecto inferior del bloque óseo en la resina epoxi térmica en la diapositiva del microscopio, con la longitud del hueso perpendicular a la diapositiva. Cambie la muestra de un lado a otro para cubrir la parte inferior del hueso y asegurar una adhesión segura a la diapositiva.
- Deje reposar la muestra montada en la placa caliente durante ~5 min para permitir que el epoxi térmico se agache en poros y/o grietas.
NOTA: El epoxi en la diapositiva debe estar libre de burbujas para una mejor adherencia. Para eliminar burbujas, cambie la muestra hacia adelante y hacia atrás en la diapositiva. Las burbujas a menudo se forman debido al agua y/o etanol atrapado dentro del hueso escapando y evaporándose. - Retire el tobogán con la muestra montada de la placa caliente usando fórceps contundentes y deje enfriar a temperatura ambiente durante ~ 10 minutos. Retire cualquier epoxi del borde de la diapositiva usando una cuchilla de afeitar para asegurarse de que el mandril agarre adecuadamente la diapositiva.
- Coloque la diapositiva con la muestra adherida a un mandril deslizante de vidrio y monte el mandril en el brazo giratorio de una sierra de sección de velocidad lenta (consulte Tabla de materiales, Figura 2).
NOTA: Mientras que una sierra Buehler IsoMet se empleó en este protocolo, hay disponibles otras sierras de sección de precisión que podrían utilizarse en lugar del IsoMet (por ejemplo, Leco, Exakt, Smartcut, CT3, Buehler Petrothin, Well Diamond Wire). - Ajuste el brazo giratorio utilizando el dial de posicionamiento para asegurarse de que la hoja entra en contactos y transecciona la muestra. Coloque la muestra de tal forma que se corte una sección transversal del hueso perpendicular a su longitud.
- Agregue pesas al otro lado del brazo de corte para contrarrestar el peso del brazo.
NOTA: Si se utiliza un contrapeso insuficiente, la muestra puede soportar la hoja y hacer que la hoja se fracture. - Agregue el líquido de corte (20:1 partes de agua al líquido de corte) al receptáculo líquido de la sierra.
- Asegure firmemente la hoja de oblea de diamante y asegúrese de que el nivel de fluido sumerja la porción de corte de la hoja. Ajuste la velocidad a 200 RPM y baje lentamente la muestra sobre la hoja (Figura 3).
- Asegúrese de que la hoja y el mandril no se tambalee y/o rebote. Si se observa un movimiento excesivo, detenga inmediatamente la sierra y apriete el conjunto de la hoja y/o del brazo del mandril antes de reanudar el corte. Agregue contrapesos adicionales si el mandril se mueve agresivamente hacia arriba y hacia abajo. El movimiento excesivo, incluido el movimiento visible de lado a lado, puede hacer que la hoja se fracture.
- La primera sección gruesa es un "corte de residuos" para proporcionar una superficie bien definida paralela a cada corte adicional. Después del corte inicial de residuos, levante el brazo giratorio y mueva el mandril hacia la hoja de 5 mm usando el dial de posicionamiento. Con este método se pueden recoger más secciones gruesas (~1 mm) para microscopía.
NOTA: Con el fin de ahorrar tejido valioso, se puede omitir el corte de residuos. Sin embargo, al seccionar una muestra con un borde desigual, es fundamental que el pico de la muestra se alinee tangencialmente hasta el borde de la broca de perforación.- Asegúrese de tener en cuenta el kerf de la hoja al seccionar. Por ejemplo, para obtener una sección de 5 mm de una hoja que tiene un kerf de 0,5 mm, mueva la muestra y tire 5,5 mm hacia la hoja.
- Una vez completada la sección, coloque el tobogán de vidrio con la muestra montada en una placa caliente para fundir la epoxi térmica. Esto permite la eliminación rápida de los bloques óseos de la diapositiva.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
3. Perforación de muestras
- Monte secciones óseas de 5 mm hasta la parte inferior de una lata de aluminio poco profunda (~8 cm de diámetro) utilizando la técnica de unión epoxi térmica como se describe en los pasos 2.2-2.4.
- Coloque lata en una mesa de máquina XY de la prensa de perforación del molino (consulte Tabla de materiales)y apriete las abrazaderas fijadoras de mano (Figura 4).
- Inserte la broca de perforación con punta de diamante del joyero de eje hueco de diámetro interior de 2 mm (consulte Tabla de materiales)en el mandril de perforación del molino. Ajuste el limitador de profundidad para evitar el corte a través de la lata (Figura 5).
- Alinee el aspecto anterior central de la muestra ósea debajo de la broca evitando el contacto cercano con el periosteum, el endosteum o las áreas altamente trabecularizadas.
NOTA: La selección automatizada de cortices femorales de parte media anterior no es factible, ya que el grosor cortical varía entre los individuos, especialmente con el aumento de la edad. - Llene la lata con agua destilada para cubrir completamente la muestra. Esto evita la acumulación de calor, la quema de la muestra y/o el daño a la broca durante el encinamiento.
NOTA: Para evaluar la posibilidad de daños por calor causados por el corte, se utilizó un termómetro infrarrojo para lograr lecturas de temperatura del agua destilada, ya que la broca de perforación penetró primero en la superficie de los huesos. La temperatura varió en 1 °C, de 22.9 a 23.9 ° C entre las diez muestras cored para esta prueba. Por lo tanto, argumentamos que el daño inducido por calor es insignificante. - Para los primeros casos de contacto entre la broca central y el hueso, aplique presión suave para usar un anillo en la superficie superior del hueso. Esto evita la desviación de la broca al principio del proceso de perforación y garantiza la correcta colocación de la broca.
- Durante el coring, levante la broca dentro y fuera de la muestra mientras mantiene la punta de la broca debajo de la superficie del agua. Continúe con esta técnica cada pocos segundos para eliminar el polvo óseo atrapado y asegurarse de que los desechos no ocluyen la broca.
NOTA: Si el núcleo está formando una forma cónica, es probable que se deba a 1) lo que no permite suficiente tiempo para eliminar el polvo óseo de la broca, y 2) el corte está ocurriendo demasiado rápido. El aumento de la velocidad puede romper piezas grandes de la muestra y pulverizar el aspecto superior. - Una vez completado el cordón, el núcleo óseo resultante puede quedar alojado en la broca de taladro hueco (Figura 6). Utilice un par de fórceps de punta fina o una pequeña llave Allen para desalojar el núcleo del bit (Figura 2).
- Almacene la muestra de cored en un tubo de microcentrífuga etiquetado en un lugar fresco y seco hasta que se muestre.
4. Rutinas de procesamiento de imágenes para evaluar los parámetros microarquiitecturales óseos a partir de núcleos óseos corticales
- Reconstrucción de imágenes μCT
- Descargue e instale la última versión de NRecon en https://www.bruker.com/products/microtomography.html para la reconstrucción de las imágenes de proyección SRμCT.
- Seleccione el acceso directo NRecon en el escritorio y aparecerá el GPUReconServer asociado.
- Abra el conjunto de datos deseado en la ventana emergente. Si no aparece la ventana, seleccione el icono de carpeta en la esquina superior izquierda de la ventana del visionador de datos.
- Seleccione la primera proyección de la adquisición de SRμCT. En Salida, elimine las selecciones para Usar ROI y Escalas ON.
- Elija el destino del archivo de reconstrucción. Seleccione Examinar y cree una nueva carpeta denominada Recon. El formato de archivo seleccionado debe ser BMP(8).
- Comprobar compensación de desalineación.
NOTA: Esta estimación suele estar cerca de corregirse. El renderizado 3D aproximado se puede ajustar manualmente moviendo las flechas hacia arriba y hacia abajo para desplazar las imágenes superpuestas para que los bordes derecho e izquierdo se alineen lo más estrechamente posible. - En Configuración, elija las selecciones deseadas para aplicar los algoritmos Suavizado, Endurecimiento de vigas, Rotación CS, Objeto mayor que FOV y Artefactos de anillo.
- Ajuste el histograma en Salida seleccionando Automático.
NOTA: La imagen resultante puede ser tenue. - Seleccione Iniciar para comenzar a procesar la reconstrucción.
- Utilice la nomenclatura estándar para los índices de lacunar canal/osteocito28. Estos pueden incluir: volumen total de tejido VOI (TV), volumen del canal (Ca.V), número total de canales (Ca.N), diámetro medio del canal (Ca.Dm), porosidad cortical (Ca.V/TV), dado como porcentaje, número total de lagunas (N.Lc) y volumen medio de lacunares (Lc.V), entre otros. Para determinar la densidad de lacunar por mm3 (N.Lc/BV), el volumen óseo (BV) se calcula como volumen total menos volumen de canal (TV-Ca.V).
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
- Recopilación de datos microarquiitecturales de imágenes reconstruidas
- Descargue e instale la última versión de CTAnalyser en https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html para el análisis de parámetros microarquiitecturales.
NOTA: La versión gratuita de CTAnalyser es limitada en funcionalidad. Por lo tanto, se recomienda comprar una licencia completa para realizar análisis más detallados. - Bajo | de imagen Propiedades | Cambiar tamaño de píxel, asegúrese de que el tamaño del píxel coincide con el del protocolo de imágenes μCT aplicado.
NOTA: Si edita imágenes en ImageJ o en un programa similar, tenga en cuenta que al guardar, se modificará el encabezado incrustado en el archivo TIFF y el software de análisis modificará el tamaño de píxel al importar el conjunto de datos. - Seleccione Procesamiento personalizado para crear una lista de tareas (véase Materiales suplementarios) para analizar la microarquitectura ósea desde el dataset de exploración. Un protocolo general para los parámetros de red de osteocitos lacunar utilizando plugins propiedad de CTAnalyser sigue aquí:
NOTA: La lista de tareas del complemento funciona bien para los conjuntos de datos donde el ejemplo es el único asunto visible en el FOV. Si el espacio vacío rodea la muestra, se requiere la aplicación de un ROI. De lo contrario, los valores recopilados en análisis 3D y análisis de objetos individuales se reducirán artificialmente.- Vuelva a cargar las imágenes para restablecer y/o ajustar cualquier modificación (por ejemplo, desde la edición en ImageJ o similar) antes de abrir el menú Procesamiento personalizado en el software de análisis.
- Para reducir el ruido en las imágenes, aplique un filtro gaussiano de paso bajo en espacio 3D con un núcleo redondo y un radio de 2-3.
NOTA: Esta configuración se aplicó a los conjuntos de datos de los experimentos SRμCT notificados mediante pruebas de prueba y errores. El objetivo era obtener las reconstrucciones de la mejor calidad para los datos. Ajuste los ajustes de reconstrucción para adaptarse a cada configuración experimental única. - Aplique un umbral global de escala de grises a las imágenes seleccionando valores bajos y altos para resaltar los canales vasculares. Las rodajas reconstruidas que se ven en las figuras 8B y 8D representan un umbral de ejemplo de 0-155.
NOTA: Al igual que el paso 4.2.3.2, la configuración de umbral aplicada aquí se eligió a través de una prueba extensa y un error. Se deben ajustar los umbrales para cada configuración experimental y el sistema de imágenes μCT utilizado. - Despeckle (denoise) para eliminar las motas blancas en el espacio 3D que están dentro del rango de tamaño de píxel volumétrico (voxel) de lacuna de osteocitos con el fin de aislar canales solamente.
NOTA: Para una exploración SRμCT de hueso cortical humano tomada a 0,9 μm de tamaño de píxel, el límite inferior para lacunae de osteocitos es de 13 voxels. - Despeckle para eliminar cualquier mota negra en el espacio 2D para eliminar artefactos en los canales. Estos pueden ser bastante grandes en 2D, eliminando así las características que son <15.000 píxeles.
- Dilatar los poros en el espacio 3D utilizando la función de operación morfológica con un núcleo redondo de 2 o 3 radios, dependiendo de la calidad de las imágenes, con el fin de aislar cualquier tejido blando atrapado en los canales.
- Realice una función Despeckle adicional utilizando los mismos ajustes que el paso 4.2.3.5. con el fin de eliminar los tejidos blandos aislados dentro de los canales.
- Erosione la dilatación del paso 4.2.3.6. utilizando una función de operación morfológica utilizando un núcleo redondo con 2 o 3 radios. El radio para este paso debe hacer juego el radio utilizado en el procedimiento 4.2.3.6.
- Ejecute análisis 3D y seleccione qué parámetros calcular para el volumen de canales vasculares. Por lo general, los valores básicos proporcionarán suficiente información.
- Guarde las imágenes procesadas con Guardar mapas de bits en una subcarpeta personalizada del directorio.
NOTA: Si se crea una imagen de reconstrucción 3D a partir de las imágenes procesadas utilizando un programa como Amira/Avizo, Libélula, Drishti, etc., se recomienda guardar las imágenes como monocromáticas (1 bit). - Calcule el número de canales vasculares y describa su tamaño, forma y orientación utilizando la función Análisis de objetos individuales.
- Repita los pasos 4.2.3.1 – 4.2.3.3. para restablecer la imagen para el análisis de lacunar de osteocitos.
- Elimine las motas blancas en el espacio 3D mediante la función Despeckle, asegurándose de que estos artefactos sean más pequeños que el límite inferior de tamaño de lacunar. Este paso elimina el ruido de la exploración que puede parecer poros corticales, preservando al mismo tiempo la verdadera laguna de osteocitos. Para escaneos SRμCT humanos de tamaño de píxeles de 0,9 μm, este límite inferior es de 13 voxels.
- Despeckle una vez más para eliminar las motas blancas que son más grandes que el límite superior del tamaño de lacunar. Para los datasets SRμCT humanos con la configuración enumerada en el paso 4.2.3.13, este límite es de 2743 voxels.
- Realizar análisis 3D para extraer información microestructural relativa a la laguna de osteocito específicamente.
- Seleccione Guardar mapas de bits para guardar las imágenes procesadas con el fin de aislar las lagunas de osteocitos.
- Realice análisis de objetos individuales para calcular el número de osteocitos en 3D dentro del volumen de interés (VOI) seleccionado.
NOTA: Una vez establecida y probada la lista de tareas, CTAnalyser tiene una función de administrador de lotes (BatMan) que se puede emplear para acelerar la extracción de datos y garantizar un procesamiento uniforme de imágenes. Una lista de tareas con configuración de ejemplo para Procedimiento 4.2.3. se pueden encontrar en los Materiales Suplementarios.
- Descargue e instale la última versión de CTAnalyser en https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html para el análisis de parámetros microarquiitecturales.
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Representative Results
El método descrito de muestreo básico demostró ser altamente eficaz y eficiente. La perforación de muestras utilizando este protocolo permitió la adquisición de muestras de tamaño consistente de >300 para experimentos en la línea de haz CLS BMIT-BM2,con un FOV de ~2 mm a 1,49 μm de tamaño voxel. Para validar la consistencia del diámetro del núcleo, se tomaron tres mediciones a lo largo de la longitud (superior, media, inferior) de un subconjunto de núcleos femorales anteriores humanos (n= 69). El diámetro medio de los núcleos fue de 1,96 ± 0,11 mm, y el adelgazamiento medio a lo largo de la longitud del núcleo fue de 0,06 ± 0,06 mm/mm Con el fin de enfatizar la aplicabilidad a otros materiales compuestos duros, intentamos este método en muestras de dolomita (n= 32) dando como resultado un diámetro medio de 1,06 ± 0,02 mm. El adelgazamiento a lo largo de la longitud de la muestra central se registró como 0,01 ± 0,005 mm/mm. Las cifras representativas que comparan el flujo de trabajo de procesamiento de imágenes de una muestra con núcleo y una adquirida mediante una herramienta rotativa (por ejemplo, Dremel), como se describe en el paso 4.2.3, se pueden ver en la Figura 7. El corte de muestra utilizando la herramienta rotativa común mostró un mayor número de canales (Ca.N) y laguna (Lc.N), y una disminución del diámetro medio del canal (Ca.Dm), el volumen del canal (Ca.V) y la porosidad cortical (Ca.V/TV) en comparación con la muestra de cored. Si bien algunas de estas diferencias pueden deberse a la variación microestructural ósea entre individuos, el mayor número de canales y lagunas extraídas del dataset de herramientas rotativas probablemente aumentaron artificialmente debido a artefactos de escaneo y ruido (Figura 7). Los datos de porosidad recogidos del paso 4.2.3.9 para cada muestra se encuentran en la Tabla 1. Vale la pena señalar que aunque el protocolo de perforación disminuye los artefactos observados en las exploraciones SRμCT, las figuras cargadas de artefactos de menor calidad de los experimentos de bloques óseos rectilíneas(Figura 7A)representan un problema multifacno. Ciertos artefactos (por ejemplo, señales de contraste de fase) pueden haber sido causados por instalaciones de sincrotrón o problemas específicos de la línea de haz. Los parámetros de escaneado para conjuntos representativos de experimentos y las figuras asociadas(Figuras 7A, 7B)se pueden encontrar en los Materiales Suplementarios (Tablas S1, S2).
Las imágenes de micro-TC sincrotrón recopiladas a partir de muestras de cored suprimieron con éxito artefactos de escaneo, como se demostró anteriormente, incluidos los artefactos de rayas. El posterior procesamiento de imágenes confirmó el potencial de la técnica para mejorar la visualización de la microarquitectura ósea cortical. Por ejemplo, se observaron diferencias de mineralización, una mejor delineación de los límites osteonales y una visualización consistente de los tejidos blandos dentro de los canales vasculares(Figuras 8C, 8D). Este último es crítico para el procesamiento de imágenes, ya que la visualización parcial de los tejidos blandos dentro de los canales puede resultar en cálculos inexactos de porcentaje de porosidad y espesor del poro, ya que los poros no están completamente llenos. Los límites de las lagunas de osteocito también se mejoraron debido a la disminución de la birreferencia, lo que permitió la cuantificación de los parámetros de forma. Las ventajas potenciales de la técnica de perforación descrita incluyen facilidad para centrar la muestra en el FOV, reducción de los requisitos analíticos y visualización consistente de los tejidos blandos dentro de los canales vasculares.
Procedimientos similares se han utilizado con éxito para núcleo de cristales individuales de ortopyroxeno18,magnesita policristalina19 y otros materiales geológicos15,16,17 para experimentos de deformación de rocas de alta presión. Estos experimentos requieren núcleos en orientaciones específicas en relación con ejes cristalinos en cristales individuales18 o cristales alineados en rocas policristalinas19 con el fin de determinar fortalezas específicas de la orientación. Los enfoques descritos anteriormente se han utilizado primero para crear losas orientadas y, posteriormente, recoger múltiples núcleos cilíndricos uniformes para series de experimentos de deformación. Estos métodos se pueden utilizar para recoger núcleos de cualquier material duro, como hueso, cerámica o gafas. Por ejemplo, la metodología anterior podría ser aplicada por antropólogos biológicos para evaluar núcleos de regiones específicas dentro del hueso cortical y sus ejes biomecánicos asociados (por ejemplo, tensión/compresión).
Figura 1. VOI cilíndrico de un fémur humano de eje medio humano izquierdo. Se visualizan una sola rebanada reconstruida SRμCT de un núcleo entero a partir de un fémur humano de eje medio humano izquierdo (hembra de 21 años)(A),y representaciones 3D de un VOI cilíndrico de superior (B) y vistas anteriores (C). Las proyecciones se tomaron a 0,9 μm, con canales vasculares resaltados en rojo y lacuna de osteocito en gris. Las barras de escala denotan 0,25 mm (A) y 0,02 mm (B,C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Una muestra femoral de eje medio (5 mm de espesor) montada en un portaobjetos de microscopio de vidrio con epoxi térmico (ver Tabla de Materiales) y asegurada a un mandril deslizante de vidrio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Mandril deslizante de vidrio con espécimen montado asegurado en el brazo giratorio de una sierra de sección de baja velocidad (ver Tabla de Materiales) antes de la sección. La posición lateral del brazo giratorio en relación con la hoja de sierra y la velocidad de sección (RPM) se muestran en las filas superior e inferior de la pantalla LCD, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Una sección femoral de 5 mm montada en una lata de aluminio y asegurada a una mesa de máquina de prensado de molino XY utilizando abrazaderas fijadoras en preparación para el corte. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. La prensa de perforación de molino empleada en el protocolo ideado (A). La flecha identifica el limitador de profundidad, lo que evita que la broca penetre profundamente en la muestra o a través de la parte inferior de la lata (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Una sección transversal de hueso femoral de 5 mm después de la adquisición del núcleo desde el aspecto anterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. Rebanadas reconstruidas SRμCT individuales del aspecto anterior del fémur izquierdo a partir de dos individuos. La muestra (A) fue seccionada utilizando una herramienta rotativa común y (B) se adquirió utilizando el método de coring descrito aquí. Cada sector se compara con su contraparte segmentada (C y D). Tenga en cuenta la facilidad de aislar la porosidad cortical en la muestra de cored(D)en lugar de la muestra reunida con la herramienta rotativa (C). Esto se evidencia aún más en los renders 3D de los canales vasculares de cada muestra (E y F). El ruido alrededor de la periferia de B es evidente y el espécimen abandona el FOV, lo que resulta en mayores desafíos durante el procesamiento de imágenes. La barra de escala del panel (D) denota 250 μm para paneles (A-D). Las barras de escala de los paneles (E y F) denotan 700 y 600 μm, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8. Un ROI representativo de una muestra adquirida con una herramienta rotativa (A-C) y un cored utilizando el método presentado aquí (D-F). Los paneles (A) y (D) representan el ROI designado de los escaneos SRμCT. Los paneles (B) y (E) representan la etapa de procesamiento utilizada para aislar y extraer parámetros de canal vascular. En la parte superior derecha del panel (B) hay objetos extraños (flechas) que han sido clasificados como canales vasculares por software de procesamiento de imágenes. Los paneles (C) yF) representan la etapa de procesamiento utilizada para aislar y extraer lagunas. Las barras de escala denotan 0,1 mm para todos los paneles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Volumen de tejido (TV) | Volumen del canal (Ca.V) | Superficie del canal (Ca.S) | Porosidad cortical (Ca.V/TV) | Superficie del canal al volumen de tejido (Ca.S/TV) | Diámetro medio del canal (Ca.Dm) | Separación media del canal (Ca.sp) | No. de Canales (Ca.N) | No. de Lacunae (Lc.N) | Densidad de poros (Poros/TV) | |
| Unidades | mm³ | mm³ | Omp | % | 1/mm | Μm | Μm | # | # | poros/μm³ |
| Corte rotario | 0.15861 | 0.01780 | 0.00287 | 11.23 | 0.01808 | 51.05 | 122.81 | 459 | 64662 | 0.00041 |
| Cored (Este método) | 0.15747 | 0.02451 | 0.00216 | 15.56 | 0.01373 | 120.73 | 145.38 | 76 | 30531 | 0.00019 |
Tabla 1. Resultados representativos para el paso 4.2.3.9 de la herramienta rotativa y los especímenes con núcleo visualizados en la Figura 8. Tenga en cuenta la disminución de Ca.V, Ca.V/TV, Ca.Dm, número de poros y densidad de poros para la muestra de corte rotativo, así como el aumento del número de canales vasculares y lagunas. Los artefactos de escaneo parcialmente inducidos por la muestra cortada irregularmente probablemente contribuyeron a un aumento artificial de lacunas y poros corticales.
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Discussion
No ha habido un protocolo integral y estandarizado para adquirir muestras uniformes y cilíndricas de núcleo óseo cortical para imágenes SRμCT de alta resolución con configuraciones limitadas de FOV. El protocolo detallado aquí llena ese vacío proporcionando un tutorial completo sobre cómo adquirir muestras de núcleo óseo cortical de tamaño consistente para imágenes SRμCT y la posterior visualización y extracción precisas de datos microarquiitecturales. Hemos demostrado que nuestro protocolo proporciona un método más estandarizado y fiable para la adquisición de núcleos óseos corticales que descripciones anteriores de la sección de bloques óseos rectilíneares de dimensiones arbitrarias. Por lo tanto, los investigadores que se han basado en herramientas rotativas portátiles (por ejemplo, Dremel) para eliminar bloques de hueso de tamaño irregular probablemente experimentaron tiempos de configuración de muestras mucho más largos durante la toma de imágenes y mayores errores en la extracción de umbrales y poros corticales durante el análisis. Esta discrepancia pone de relieve la necesidad y la importancia de este protocolo estandarizado con respecto a la preparación de muestras óseas, la visualización y análisis posteriores, y la interpretación de resultados.
El procedimiento descrito aquí puede ser adaptado por investigadores en campos relacionados que comúnmente evalúan el tejido óseo como antropólogos biológicos y arqueólogos. Sin embargo, no se presentaron especímenes óseos diagenéticos ni arqueológicos/históricos para el protocolo de investigación descrito. La digénesis, en geología, se refiere a alteraciones de un material (por ejemplo, hueso) después de la deposición y puede abarcar cambios causados por medios físicos, químicos o biológicos29,30. El agua subterránea, los hongos y otras infiltraciones microbianas pueden actuar como agentes diagenéticos y alterar la micromorfología del tejido óseo31. Estos especímenes pueden requerir pasos procedimentales adicionales antes de la perforación, como la incrustación en metacrilato metilo (MMA) o una resina epoxi de dos partes. La incrustación de los bloques femorales no era necesaria para los experimentos descritos debido a la naturaleza densa del hueso cortical femoral, y el hecho de que los especímenes cadavéricos fueron embalsamados poco después de la muerte. Sin embargo, si se evalúan elementos esqueléticos frágiles y su trabeculae (por ejemplo, costillas), recomendamos incrustar todo el bloque óseo antes de la perforación.
Todos los tejidos óseos evaluados en este estudio fueron embalsamados mientras estaban frescos. Los autores no tuvieron acceso a la combinación específica de productos químicos utilizados durante el proceso de embalsamamiento, aunque los productos químicos de conservación comúnmente incluyen formaldehído, etanol, fenol, etilenglicol y glutaraldehído. Los datos antropológicos forenses que documentan los cambios en la microestructura de los huesos saturados de formaldehído son limitados, aunque Freidlander32 demostró que la fijación del formaldehído no altera la morfología de ciertas características, incluidos los canales haversianos y los osteones secundarios. La saturación de formaldehído, sin embargo, ha documentado efectos sobre ciertas propiedades mecánicas y características de fractura de hueso no humano como resistencia al impacto y resistencia a la fractura33,34.
Hemos informado de un método para la perforación de muestras óseas corticales antes de la toma de imágenes con sistemas de rayos X de alta resolución (SRμCT). Este método es rentable, debido al hecho de que los materiales y equipos pueden provendrse de ferreterías locales, eficientes y garantiza un tamaño de muestra uniforme entre los especímenes. Esperamos que nuestras sugerencias reduzcan las consultas relacionadas con la forma en que las muestras deben ser adquiridas, cored y analizadas para SRμCT, ya que la literatura existente sigue siendo escasa y carece de detalles críticos sobre la preparación y el análisis posterior. Nuestro objetivo principal es motivar a los investigadores a aplicar este protocolo de perforación como procedimiento estandarizado para la investigación de imágenes óseas de alta resolución. Esperamos además que las dificultades antes mencionadas que experimentamos en el desarrollo de esta técnica alivie las preguntas comunes y proporcionen orientación para la solución de problemas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
La investigación descrita en este artículo se realizó en las instalaciones del BMIT en la Fuente de Luz canadiense, que cuenta con el apoyo de la Fundación canadiense para la Innovación, las Ciencias Naturales y el Consejo de Investigación de Ingeniería de Canadá, la Universidad de Saskatchewan, el Gobierno de Saskatchewan, Western Economic Diversification Canada, el Consejo Nacional de Investigación de Canadá y los Institutos Canadienses de Investigación de la Salud. Los autores quisieran agradecer a los científicos de la fuente de luz canadiense, en particular a Adam Webb, Denise Miller, Sergey Gasilov y Ning Zu por la asistencia en la configuración y solución de problemas de los sistemas de microscopios SkyScan SRμCT y de haz blanco. También queremos agradecer a Beth Dalzell de la Facultad de Medicina y Ciencias de la Vida de la Universidad de Toledo y al Dr. Jeffrey Wenstrup de la Universidad Médica del Noreste de Ohio por el acceso a muestras cadavéricas para este estudio. JM Andronowski cuenta con el apoyo de fondos de investigación de puesta en marcha proporcionados por la Universidad de Akron y una beca del Instituto Nacional de Investigación y Desarrollo de la Justicia en Ciencias Forenses con fines de justicia penal (2018-DU-BX-0188). RA Davis cuenta con el apoyo de una asistente de posgrado proporcionada por la Universidad de Akron. Los equipos y suministros utilizados para el corte y la aserración fueron comprados por fondos de puesta en marcha proporcionados por la Universidad de Akron y la subvención de la NSF EAR-1624242 a CW Holyoke.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-1/8" plunge cutting carbide for composites | Warrior | 61812 | 28.6mm plunge |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 3.8 Liters |
| Blunt-tipped forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Centrifuge tubes | ThermoFisher | 55398 | |
| Crystalbond 509-3 Epoxy | Ted Pella | 821-3 | |
| CTAnalyser | Bruker microCT | v.1.15.4.0 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html |
| Dental Tool Kit | Amazon | 787269885110 | |
| Diamond wafering saw blade for composite material | Buehler | #11-4247 | |
| Drill Press | Jet Mill/Drill | 350017 | Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem |
| Fine-tipped forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fixturing clamps for XY machine table for mill/drill | MSC Industrial Supply | #04804571 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26005 | 75x50mm slides, 1mm thick |
| Glass slide chuck | Buehler | #112488 | Large enough to hold 75x50mm glass slides |
| Hot plate capable of reaching 140 °C | ThermoScientific | HP88850105 | |
| Incubator | NAPCO | Model 4200 | |
| Isocut Fluid | Buehler | 111193032 | Lubricant; 30mL |
| Jeweler's diamond coring drill bit | Otto Frei | #119.050 | 2mm inner diameter hollow stem coring bit |
| NRecon | Bruker microCT | v.1.6.10.2 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html |
| Oscillating saw | Harbor Freight | 62866 | |
| Oven-safe glass dishes | Pyrex | 1117715 | Glass food storage container |
| Precision slow-speed saw (Isomet 1000) | Buehler | 111280160 | |
| Razor blades | Amazon | 25181 | |
| Shallow aluminum tins | Amazon | B01MRWLD0R | ~8cm diameter |
| Specimen cups | Amazon | 616784425436 885334344729 | |
| Tergazyme detergent | Alconox | 1304-1 | 1.8kg box |
| Ultrasonic cleaner | MTI Corporation | KJ201508006 |
References
- Andronowski, J. M., Crowder, C., Soto Martinez, M. Recent advancements in the analysis of bone microstructure: New dimensions in forensic anthropology. Forensic Sciences Research. 3 (4), 278-293 (2018).
- Wysokinski, T. W., et al. Beamlines of the biomedical imaging and therapy facility at the Canadian light source - part 3. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 775, 1-4 (2015).
- Carter, Y., Suchorab, J. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Normal variation in cortical osteocyte lacunar parameters in healthy young males. Journal of Anatomy. 225 (3), 328-336 (2014).
- Carter, Y., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Femoral osteocyte lacunar density, volume and morphology in women across the lifespan. Journal of Structural Biology. 183 (3), 519-526 (2013).
- Langer, M., et al. X-Ray Phase Nanotomography Resolves the 3D Human Bone Ultrastructure. PLoS ONE. 7 (8), 35691 (2012).
- Peyrin, F., Dong, P., Pacureanu, A., Langer, M. Micro- and Nano-CT for the Study of Bone Ultrastructure. Current Osteoporosis Reports. 12 (4), 465-474 (2014).
- Dong, P., et al. 3D osteocyte lacunar morphometric properties and distributions in human femoral cortical bone using synchrotron radiation micro-CT images. Bone. 60, 172-185 (2014).
- Gauthier, R., et al. 3D micro structural analysis of human cortical bone in paired femoral diaphysis, femoral neck and radial diaphysis. Journal of Structural Biology. 204 (2), 182-190 (2018).
- Giuliani, A., et al. Bisphosphonate-related osteonecrosis of the human jaw: A combined 3D assessment of bone descriptors by histology and synchrotron radiation-based microtomography. Oral Oncology. 82, 200-202 (2018).
- Andronowski, J. M., Pratt, I. V., Cooper, D. M. L. Occurrence of osteon banding in adult human cortical bone. American Journal of Physical Anthropology. 164 (3), 635-642 (2017).
- Andronowski, J. M., Mundorff, A. Z., Pratt, I. V., Davoren, J. M., Cooper, D. M. L. Evaluating differential nuclear DNA yield rates and osteocyte numbers among human bone tissue types: A synchrotron radiation micro-CT approach. Forensic Science International: Genetics. 28, 211-218 (2017).
- Britz, H. M., et al. Prolonged unloading in growing rats reduces cortical osteocyte lacunar density and volume in the distal tibia. Bone. 51 (5), 913-919 (2012).
- Maggiano, I. S., et al. Three-dimensional reconstruction of Haversian systems in human cortical bone using synchrotron radiation-based micro-CT: morphology and quantification of branching and transverse connections across age. Journal of Anatomy. 228 (5), 719-732 (2016).
- Cooper, D. M. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Hallgrímsson, B. Three-dimensional microcomputed tomography imaging of basic multicellular unit-related resorption spaces in human cortical bone. The Anatomical Record Part A: Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 228 (7), 806-816 (2006).
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J., Ulrich, C.
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K.
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J.
- Raterron, P., Fraysse, G., Girard, J., Holyoke, C. W. Strength of orthoenstatite single crystals at mantle pressure and temperature and comparison with olivine. Earth and Planetary Science Letters. 450, 326-336 (2016).
- Millard, J. W., et al.
- Thomas, C. D. L., Feik, S. A., Clement, J. G. Regional variation of intracortical porosity in the midshaft of the human femur: age and sex differences. Journal of Anatomy. 206 (2), 115-125 (2005).
- Jowsey, J.
- Martin, R. B., Pickett, J. C., Zinaich, S. Studies of skeletal remodeling in aging men. Clinical Orthopaedics and Related Research. (149), 268-282 (1980).
- Martin, R. B., Burr, D. B. Mechanical implications of porosity distribution in bone of the appendicular skeleton. Orthopedic Transactions. 8, 342-343 (1984).
- Bousson, V., et al. Distribution of Intracortical Porosity in Human Midfemoral Cortex by Age and Gender. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (7), 1308-1317 (2001).
- Goldman, H. M., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Bromage, T. G. Relationships among microstructural properties of bone at the human midshaft femur. Journal of Anatomy. 206 (2), 127-139 (2005).
- De Micheli, P. O., Witzel, U. Microstructural mechanical study of a transverse osteon under compressive loading: The role of fiber reinforcement and explanation of some geometrical and mechanical microscopic properties. Journal of Biomechanics. 44 (8), 1588-1592 (2011).
- Martin, R. B., Boardman, D. L. The effects of collagen fiber orientation, porosity, density, and mineralization on bovine cortical bone bending properties. Journal of Biomechanics. 26 (9), 1047-1054 (1993).
- Cooper, D. M. L., Turinsky, A. L., Sensen, C. W., Hallgrímsson, B. Quantitative 3D analysis of the canal network in cortical bone by micro-computed tomography. The Anatomical Record Part B: The New Anatomist. 274 (1), 169-179 (2003).
- Crowder, C., Heinrich, J., Stout, S. D. Rib histomorphometry for adult age estimation. Forensic Microscopy for Skeletal Tissues: Methods and Protocols. , 109-127 (2012).
- Pfeiffer, S.
- Bone Hedges, R. E. M.
- Friedlander, H. The use of formaldehyde imbedded human remains in experimental procedures. , Available from: https://capa-acap.net/sites/default/files/basic-page/capa_2017_program_final_no_cover.pdf (2017).
- Currey, J. D., Brear, K., Zioupos, P., Reilly, G. C. Effect of formaldehyde fixation on some mechanical properties of bovine bone. Biomaterials. 16 (16), 1267-1271 (1995).
- Asaka, T., Kikugawa, H. Effect of formaldehyde solution on fracture characteristics of bovine femoral compact bone. Journal of the Japan Institute of Metals. 69 (8), 711-714 (2005).
