Summary
我们采用了地质（科灵）采样方案，从人类粪便的前部获取均匀大小的皮质骨标本，用于SRμCT实验。这种方法具有极小的破坏性、有效性，可产生圆柱形标本，最大限度地减少不规则样本形状的成像伪影物，并改进微结构可视化和分析。
Abstract
骨骼是一种动态和机械活性组织，在人的寿命中改变结构。骨骼重塑工艺的产品已经使用传统的二维技术进行了大量研究。通过桌面微计算断层扫描 （μCT） 和同步加速器辐射微计算断层扫描 （SRμCT） 的 X 射线成像技术的最新进展，使得获得比其他 3D 成像技术（例如 SEM） 更大的视野 （FOV） 高分辨率三维 （FOV） 扫描能够更完整地了解人类皮质骨骼内的微观结构。但是，标本应准确以 FOV 为中心，以限制已知影响数据分析的条纹伪影的外观。先前的研究已经报告采购了不规则形状的直线骨块，这些骨块由于边缘不均匀或图像截断而导致成像。我们应用了地质采样协议（科林），从人类粪便的前部获取一致大小的皮质骨芯标本，用于SRμCT实验。这种腐蚀方法效率高，对组织的破坏力极小。它创建均匀的圆柱形样品，可减少在旋转过程中的等轴测量性质的成像伪影物，并在整个扫描过程中为 X 射线束提供均匀的路径长度。对核心和不规则形状样品的X射线断层图像数据的图像处理证实了该技术改进皮质骨微构造的可视化和分析的潜力。该协议的目标是提供一种可靠且可重复的方法，用于提取皮质骨芯，该方法可适应各种类型的高分辨率骨成像实验。这项工作的首要目标是为 SRμCT 创建一个经济实惠、一致且简单明了的标准化皮质骨骼采购。相关领域的研究人员可以进一步调整这一程序，他们通常评估硬复合材料，如生物人类学、地球科学或材料科学。
Introduction
随着成像技术的最新发展，现在以极高的分辨率获取X射线成像数据是可行的。桌面微CT（μCT）系统是目前成像取消骨骼的标准，由于其无损性质1.然而，当皮质骨的显微结构特征成像时，μCT的使用更加有限。由于分辨率限制，桌面系统无法达到比皮质孔隙小的显微结构特征（如骨细胞孔）所需的分辨率。对于此应用，SRμCT 是理想的，因为这些系统的分辨率更高1。例如，加拿大光源 （CLS） 生物医学成像和治疗 （BMIT） 光束线2上的实验产生了体积小至 0.9 μm 的图像。先前的研究1，3，4，5已经利用这个分辨率从人类长骨皮质骨标本（图1）获得投影和随后的三维（3D）渲染，以量化骨细胞拉库纳尔密度4，6，7，8，9和变化的拉库纳尔形状和大小3在整个人类寿命和性别之间。进一步的研究已经证明，在人类10中存在奥斯丁带，这种现象以前在法医人类学文献中只与非人类哺乳动物有关。
为了实现超常的分辨率，X 射线束必须在视野 （FOV） 内进行精细聚焦，这通常将最大标本大小限制在直径几毫米以内。目前，文献中没有描述符合这些限制的骨样采购的全面、标准化的程序。FOV 中的中心标本对于确保 1） 样本在成像过程中旋转 180° 时保持中心位置至关重要，2） 扫描伪影因有限，因为没有图像截断。换句话说，FOV 以外的样品没有部分干扰光束进入 FOV 内部的焦点。如果发生这种情况，重建算法将被剥夺完全正确的重建所需的一些衰减数据。还值得注意的是，360°（全旋转）扫描将光束硬化的影响降至最低，但增加了成像过程中因错位和样品移动而引起的工件。因此，虽然 360° 扫描通常会生成更清洁的数据，但成像时间会翻倍，因此必须解决实验成本和数据质量之间的妥协问题。
骨成像实验的一个重要和经常被忽视的方面是在扫描前进行的准确和可复制的标本准备技术。将SRμCT方法纳入实验的研究简要地提到了他们的采样方案，但作者对收集标本的特定方法几乎没有提供细节。许多此类研究提到任意尺寸的直线骨块切割，但一般不提供有关使用3、4、10、11、12、13、14的工具或嵌入材料的进一步信息。一些研究人员通常使用手持式旋转工具（如Dremel），从感兴趣的区域（ROI）3、4、10、11、12、13、14中去除直线骨块。此方法可产生可能大于 FOV 的非统一大小的样本，增加了扫描工件和图像截断的可能性。此类标本通常需要使用精密的金刚石晶圆锯（例如布勒伊索梅特）进行进一步精炼。采购尺寸一致的样品（达到百分之二百/毫米）对于确保所获取的数据集质量最高且后续结果可复制至关重要。
样本采购方法的有限报告在尝试使用和/或验证先前研究中执行的方法时增加了一层额外的困难。目前，研究人员必须直接与作者联系，了解其取样程序的更多细节。此处详述的协议为生物医学研究人员提供了一种经过全面记录、可复制且经济高效的采样技术。本文的主要目标是提供一个全面的教程，说明如何使用磨钻压机和金刚石芯位采购大小一致的皮质骨芯样品，从而准确可视化和提取微结构数据。这种方法是从高压岩石力学15、16、17、18、19的硬材料块中常规收集均匀小直径（1-5毫米）圆柱体的程序中修改的。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有标本均来自托莱多大学、医学和生命科学学院以及东北俄亥俄医科大学（NEOMED）的防腐尸体捐赠者，并征得捐赠者本人或捐赠者近亲的知情同意。阿克伦大学保护人类主体机构审查委员会（IRB）认为，这些标本不受IRB的全面审查，因为它们不是从活体个体中获取的。所有捐助者均可获得人口信息，包括年龄、性别和死因。选定的个人没有记录影响骨骼的情况，也没有接触可能影响死亡时骨重塑的治疗方案。皮质骨骼样本取自19至101岁（平均=73.9岁）的现代男性和女性尸体的粪便。股骨中轴已被广泛研究，包括检查皮质孔隙20、21、22、23、24和骨组织25、26、27的物质密度的变化，因此成为微结构分析的常用场所。
1. 组织采购和捣碎
- 使用装有暴跌切割硬质合金刀片（用于复合材料）的振荡锯，从左股骨的中度诊断中获取约 7.5 厘米的骨块。
- 在45°C的孵化器中，将股骨块浸泡在装有粉状蛋白酶的烤箱安全玻璃盘中，然后用自来水溶液浸泡1小时。
- 孵化后，使用钝解剖或牙科工具小心切除剩余的软组织和围产期。
注意：避免使用锋利的工具（如手术刀）去除软组织。此类仪器可能会对 μCT 扫描中检测到的骨骼造成损坏，从而影响标本保存和扫描数据质量。 - 将骨块放入超声波清洁器中5-10分钟，用20：1部分自来水清洗溶液（见 材料表），或使用手持式水牙线（例如水皮），以清除甲状腺中的碎屑或遮挡物。
- 将骨块浸入标本杯中，并填充 70% 的乙醇。让骨头浸泡至少24小时，以去除脂质。
注：海琳也可以用来去除脂质。然而，长时间浸泡在xylenes中可能会使骨骼变得脆或粉笔，因为它是乳化剂。 - 24小时后，从乙醇中去除骨块，在环境温度下进行24-48小时的空气干燥。
注：协议可在此处暂停。
2. 组织剖腹产
- 将 75 x 25 mm 玻璃显微镜滑动放在设置为 140 °C 的热板上。 在滑梯中央熔化大量热环氧树脂（见 材料表）。
- 如果为显微镜（+lt;50 μm）准备额外的薄块，骨块可能需要嵌入两部分环氧树脂中，以保存腹腔。此外，在实施此协议时，脆弱标本（如糖尿病骨或高度创伤标本）将标本嵌入环氧树脂中是必要的。
注：本协议中使用的骨骼样本是从防腐尸体标本中检索的。如果在验尸时或手术箱中收集新鲜标本，通过 SRμCT 检查软组织结构（例如血管），环氧树脂浸渍可能会诱发此类组织的损伤。在这些情况下，建议使用替代粘合剂或安装介质（例如双面胶带、建模粘土）。
- 如果为显微镜（+lt;50 μm）准备额外的薄块，骨块可能需要嵌入两部分环氧树脂中，以保存腹腔。此外，在实施此协议时，脆弱标本（如糖尿病骨或高度创伤标本）将标本嵌入环氧树脂中是必要的。
- 将骨块的劣质部分按入显微镜滑梯上的热环氧树脂中，骨块的长度垂直于滑动。来回移动样品，以便涂覆骨底，并确保与滑梯的安全粘附。
- 让安装的标本在热板上休息约5分钟，让热环氧树脂进入毛孔和/或裂缝。
注意：滑梯上的环氧树脂应无气泡，以获得最佳粘附。要去除气泡，请在幻灯片上来回移动样品。气泡通常由于水和/或乙醇被困在骨头内逸出和蒸发而形成。 - 使用钝力从热板中取出装有标本的滑梯，并在室温下冷却约 10 分钟。使用剃须刀刀片从滑梯边缘取出任何环氧树脂，以确保夹头充分抓住滑梯。
- 将滑梯与粘附的样品连接到玻璃滑块上，并将夹头安装到慢速剖面锯的旋转臂上（见材料表，图 2）。
注：虽然本协议中使用了布勒 IsoMet 锯，但可使用其他精密分节锯来代替 IsoMet（例如，莱科、Exakt、智能切割、CT3、布勒彼得罗辛、井钻石线）。 - 使用定位表盘调整旋转臂，以确保刀片触点并转动样本。放置标本，使骨骼的横截面被切成垂直于其长度。
- 将重量添加到切割臂的远侧，以对抗手臂的重量。
注意：如果使用配重不足，样品可能会压在刀片上，导致刀片断裂。 - 将切割液（20：1 部分水加入切割液）添加到锯的液体容器中。
- 紧紧固定金刚石晶圆刀片，确保流体水平淹没刀片的切割部分。将速度设置为 200 RPM，然后慢慢将样品降低到刀片上（图 3）。
- 确保刀片和夹头不会摆动和/或弹跳。如果注意到过度运动，请立即停止锯子并拧紧刀片和/或夹头手臂组件，然后再恢复切割。添加额外的配重，如果夹头是积极向上和向下移动。过度运动，包括可见的侧向运动，可能导致刀片断裂。
- 第一个厚部分是一个"废物切割"，以提供一个定义明确的表面平行于每个额外的切口。初始废物切割后，抬起旋转臂，使用定位表盘将夹头向刀片移动 5 毫米。进一步厚的部分（约1毫米）显微镜可以进一步收集与此方法。
注：为了保存有价值的组织，可以省略废物削减。然而，当将样品边缘不均匀地分割时，至关重要的是，标本的峰值必须切线排列到芯钻位的边缘。- 分割时一定要考虑到刀片的路缘。例如，要从具有 0.5 mm 的刀片中获取 5 mm 部分，移动样品并将 5.5 mm 朝向刀片。
- 剖面完成后，将玻璃滑梯与安装的标本放在热板上，以熔化热环氧树脂。这允许从幻灯片中快速移除骨块。
注：协议可在此处暂停。
3. 样品芯
- 使用步骤 2.2-2.4 中描述的热环氧结合技术，将 5 毫米骨部分安装到浅铝锡（直径约 8 厘米）底部。
- 将锡放在磨钻机的 XY 机器桌上（见材料表）和手紧固定夹（图 4）。
- 将 2 毫米内径空心轴珠宝商的钻石尖芯钻头（见 材料表）插入磨钻夹头。调整深度限制器，防止通过锡（图5）进行腐蚀。
- 将钻头下方骨样的中央前部对齐，同时避免与围庭、内皮或高度创伤区域密切接触。
注：自动选择前额股骨皮质是不可行的，因为皮质厚度因个体而异，尤其是随着年龄的增长。 - 用蒸馏水填充锡，以完全覆盖样品。这可防止热积聚、样品燃烧和/或在腐蚀期间损坏钻头。
注：为了评估腐蚀引起的热损伤的可能性，当腐蚀位首先穿透骨骼表面时，红外温度计用于实现蒸馏水的温度读数。温度变化1°C，从22.9-23.9°C的10个样本核心为这个测试。因此，我们认为热引起的损害可以忽略不计。 - 对于核心位和骨骼之间接触的最初几个实例，请施加温和的压力，以便在骨骼的上部表面佩戴戒指。这可防止钻头在制芯过程开始时偏转，并确保钻头正确放置。
- 在钻探过程中，将钻头抬入和抬出样品，同时将钻头的尖端保持在水面之下。每隔几秒钟继续此技术，以清除被困的骨尘，并确保碎屑不会遮住钻头。
注意：如果核心正在形成圆锥形，很可能是由于 1） 允许足够的时间从腐蚀位冲洗骨尘，2） 腐蚀发生得太快。提高速度可能会从样品中分离出大块，并粉碎优越的方面。 - 结核完成后，产生的骨芯可能卡在空心钻头（图6）中。使用一对细尖的钳子或一个小艾伦扳手将核心从位（图2）中移出。
- 将核心样品存放在贴有标签的微中心管中，存放在凉爽干燥的位置，直到成像。
4. 评估皮质骨芯骨微结构参数的图像处理程序
- 重建 μCT 图像
- 在 https://www.bruker.com/products/microtomography.html 下载并安装最新的 NRecon 版本，用于重建 SRμCT 投影图像。
- 选择桌面上的 NRecon 快捷方式，并会显示相关的 GPURecon 服务器。
- 在弹出窗口中打开所需的数据集。如果窗口未显示，请选择数据查看器窗口左上角的文件夹图标。
- 从 SRμCT 收购中选择第一个投影。在 输出下，删除 使用投资回报率 和 规模打开的选择。
- 选择重建文件目的地。选择 浏览 并创建一个名为 Recon的新文件夹。选定的文件格式应为 BMP（8）。
- 检查 错位补偿。
注意：此估计通常接近正确。粗糙的 3D 渲染可以通过上下移动箭头来手动调整重叠的图像，以便左右边缘尽可能紧密地对齐。 - 在 "设置"下，选择所需的选择以应用 平滑、 光束硬化、CS 旋转、大于 FOV 的对象和环形工事算法。
- 通过选择自动调整输出下的直方图。
注意：由此产生的图像可能变暗。 - 选择 开始 开始处理重建。
- 使用标准命名为运河/骨细胞拉库纳指数28。这些可能包括：总VOI组织体积（电视）、运河体积（Ca.V）、运河总数（Ca.N）、平均运河直径（Ca.Dm）、皮质孔隙度（Ca.V/TV），按百分比给出的、空白总数（N.Lc）和平均拉库纳体积（Lc.V）等。要确定每毫米3 （N.Lc/BV）的拉库纳尔密度，骨量 （BV） 计算为总体积减去运河体积 （TV-Ca.V）。
注：协议可在此处暂停。
- 从重建的图像收集微结构数据
- 在 https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html 下载并安装最新版本的CT分析仪，以分析微结构参数。
注：CT分析器的免费版本功能有限。因此，建议购买完整的许可证，以进行更详细的分析。 - 在图像|下属性|更改像素大小，确保像素大小与应用的 μCT 成像协议相匹配。
注：如果在 ImageJ 或类似程序中编辑图像，请注意，保存后，将修改 TIFF 文件中嵌入的标题，分析软件在导入数据集时将更改像素大小。 - 选择 自定义处理 以创建任务列表（参见 补充材料）从扫描数据集分析骨骼微结构。使用CT分析仪专有的插件的骨细胞拉库纳网络参数的一般协议如下：
注：插件任务列表适用于样本是 FOV 中唯一可见的主题的数据集。如果标本周围有空空间，则需要应用投资回报率。否则，3D 分析和单个对象分析中收集的值将被人为地降低。- 在分析软件中打开自定义处理菜单之前，重新加载图像以重置和/或调整任何修改（例如，从 ImageJ 或类似内容中编辑）。
- 为了减少图像中的噪音，请在 3D 空间中应用高斯低通滤镜，该滤波器具有圆形内核，半径为 2-3。
注：这些设置通过试验和错误测试应用于所报告的 SRμCT 实验的数据集。目标是为数据获得最高质量的重建。调整重建设置，以适应每个独特的实验设置。 - 通过选择低值和高值来突出血管管，将全球灰度阈值应用于图像。 图 8B 和 8D 中看到的重建切片描绘了 0-155 的示例阈值。
注：类似于步骤 4.2.3.2，此处应用的阈值设置是通过广泛的试错选择的。阈值应针对使用的每个实验设置和 μCT 成像系统进行调整。 - 去斑点 （除臭）去除3D空间中的白色斑点，这些斑点位于骨细胞漆的体积像素（voxel）大小范围内，以便仅隔离运河。
注：对于以0.9 μm像素大小拍摄的人类皮质骨的SRμCT扫描，骨细胞缺陷的下限为13个voxel。 - 去除 2D空间中的任何黑色斑点，以清除运河中的文物。这些在 2D 中可能相当大，从而删除了 <15，000 像素的功能。
- 使用 形态学操作 功能，根据图像质量，利用 2 或 3 半径的圆形内核在 3D 空间中展开毛孔，以分离被困在运河中的任何软组织。
- 使用与步骤 4.2.3.5 相同的设置执行额外的 脱位 功能。以去除运河内孤立的软组织。
- 从步骤 4.2.3.6 中侵蚀除缩。使用具有 2 或 3 半径的圆形内核的 形态学操作 功能。此步骤的半径必须与程序 4.2.3.6 中使用的半径匹配。
- 运行 3D 分析 并选择用于计算血管体积的参数。一般来说，基本值将提供足够的信息。
- 使用 "保存位图" 将已处理的图像保存到目录中的自定义子折叠器中。
注意：如果使用 Amira/Avizo、Dragonfly、Drishti 等程序从已处理的图像中创建 3D 重建图像，则建议将图像保存为单色（1 位）。 - 使用 单个对象分析 功能计算血管管的数量并描述其大小、形状和方向。
- 重复步骤4.2.3.1–4.2.3.3。重置骨细胞拉库纳分析的图像。
- 使用 Despeckle 功能去除 3D 空间中的白色斑点，确保此类工件小于拉库纳尺寸的下限。此步骤可消除扫描中看似皮质毛孔的噪音，同时保留真正的骨细胞缺陷。对于 0.9 μm 像素大小的人类 SRμCT 扫描，此下限为 13 个 voxel。
- 再次去除大于拉库纳大小上限的白色斑点。对于具有步骤 4.2.3.13 中列出的设置的人类 SRμCT 数据集，此限制为 2743 voxels。
- 执行 3D 分析 ，以提取与骨细胞缺陷相关的微观结构信息。
- 选择 "保存位图 "以保存已处理的图像，以便隔离骨细胞缺陷。
- 执行 单个对象分析 ，以在选定的兴趣量 （VOI） 中计算 3D 中的骨细胞数量。
注：任务列表建立并测试后，CT分析器具有批量管理器（BatMan）功能，可用于加速数据提取并确保图像处理均匀。具有程序 4.2.3 示例设置的任务列表。可以在 补充材料中找到。
- 在 https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html 下载并安装最新版本的CT分析仪，以分析微结构参数。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
所述的核心取样方法被证明是高效和高效的。使用此协议的科林标本允许在 CLS BMIT-BM 光束线2上采购 +300 一致大小的样品，FOV 为 +2 mm，尺寸为 1.49μm voxel。为了验证核心直径的一致性，沿人类前股骨核心子集（n=69）的长度（顶部、中间、底部）进行了三次测量。核心的平均直径为1.96±0.11毫米， 核心长度的平均变薄为0.06±0.06毫米/毫米为了强调其他硬复合材料的适用性，我们在多洛米特（n=32）样品上尝试了这种方法，结果平均直径为1.06±0.02毫米。沿核心样品长度的稀释记录为 0.01 ± 0.005 mm/mm。比较第 4.2.3 步中描述的使用旋转工具（例如 Dremel）采购的核心样本和使用旋转工具采购的图像处理工作流程的代表性数字，可在图 7中查看。与核心样品相比，使用普通旋转工具切割的样品显示运河 （Ca.N） 和漆 （Lc.N） 数量增加，平均运河直径 （Ca.Dm）、运河体积 （Ca.V） 和皮质孔隙度 （Ca.V/TV） 减少。虽然其中一些差异可能是由于个体之间的骨骼微结构变化，但从旋转工具数据集中提取的运河和空白数量可能因扫描文物和噪音而人为增加（图7）。每个样本从步骤 4.2.3.9 收集的孔隙度数据位于表 1中。值得注意的是，尽管科林协议减少了在 SRμCT 扫描中观察到的文物，但直线骨块实验 （图 7A）中质量较低、富含工件的数字代表着一个多方面问题。某些工件（例如相位对比信号）可能是由同步加速器设施或光束线特定问题引起的。辅助材料（表 S1、S2）中均可找到具有代表性的实验集和相关数字（数字 7A，7B）的扫描参数。
从核心样本中收集的同步加速器微CT图像成功抑制了扫描伪影，如上图所示，包括条纹文物。随后的图像处理证实了该技术提高皮质骨微结构可视化的潜力。例如，观察到矿化差异、改善的奥斯特尼边界划分以及血管内软组织的一致可视化（图8C，8D）。后者对图像处理至关重要，因为运河内软组织的部分可视化可能导致对百分比孔隙和孔隙厚度的计算不准确，因为孔隙尚未完全填充。骨细胞漆的边界也因双折痕减少而得到改善，从而能够量化形状参数。描述的科林技术的潜在优势包括便于将标本集中到 FOV 中，减少了分析要求，以及血管内软组织的一致可视化。
类似的程序已成功地用于核心单晶的甲氧核素18，多晶镁矿石19等地质材料15，16，17高压岩石变形实验。这些实验要求在单晶体18或多晶岩石19中对齐晶体中相对于晶体轴的特定方向上进行核心，以确定方向特异性强度。上述方法已用于首先创建定向板，然后收集多个均匀的圆柱形内核，用于一系列变形实验。这些方法可用于收集任何硬质材料的核心，如骨骼、陶瓷或玻璃杯。例如，生物人类学家可以应用上述方法来评估皮质骨骼内特定区域的核心及其相关的生物力学（如张力/压缩）轴。
图 1.来自左前人类中轴股骨的圆柱形VOI。 从左前人类中轴股骨（21岁女性）（A）和来自上级（B）和前视图（C）的圆柱形VOI的3D渲染中重建了整个核心的一片。投影在0.9微米，血管管突出红色和骨细胞漆在灰色。刻度条表示 0.25 mm（A）和 0.02 mm（B，C）。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图2。安装在玻璃显微镜上的中轴股骨样品（5毫米厚度）与热环氧树脂（见材料表）一起安装在玻璃显微镜上，并固定在玻璃滑块上。请点击这里查看此数字的较大版本。
图3。玻璃滑块与安装标本固定在低速剖面锯的旋转臂（见材料表）之前，分节。 旋转臂相对于锯片的横向位置和截断速度 （RPM） 分别显示在 LCD 显示屏的顶部和下行。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图4。安装在铝锡上的 5 毫米股骨部分，并固定在 XY 磨钻压机台上，使用固定夹子准备结木。请点击这里查看此数字的较大版本。
图5。设计协议（A）中使用的磨钻压机。箭头识别深度限制器，防止钻头深入样品或穿过锡（B）底部。请点击这里查看此数字的较大版本。
图6。从前方进行核心采购后，5毫米股骨横截面。请点击这里查看此数字的较大版本。
图7。单个 SRμCT 从两个人身上重建了左股骨前部的切片。标本（A） 使用常见的旋转工具进行分割，（B） 使用此处描述的制芯方法采购。每个切片都与它们的分段对应物（C 和 D）进行比较。请注意，与用旋转工具（C）收集的标本相比，在核心样品（D）中分离皮质孔隙的易用性。每个样本（E和F）血管的3D渲染进一步证明了这一点。B 外围的噪音是显而易见的，标本离开 FOV，这两者都会在图像处理过程中增加挑战。面板中的刻度条（D） 表示面板（A-D）为 250μm。面板（E 和 F）中的刻度条分别表示 700 和 600 μm。请点击这里查看此数字的较大版本。
图 8.使用旋转工具 （A-C） 采购的样本和使用此处介绍的方法 （D-F） 获取的具有代表性的 ROI。 面板（A） 和（D） 表示 SRμCT 扫描中指定的 ROI。面板（B） 和（E） 表示用于分离和提取血管参数的处理阶段。在面板（B）的右上角，有被图像处理软件分类为血管管的无关物体（箭头）。面板（C） 和（F） 表示用于分离和提取空白的处理阶段。缩放条表示所有面板的 0.1 mm。 请点击这里查看此数字的较大版本。
| 组织体积（电视） | 运河体积（卡五） | 运河表面 | 皮质孔隙度（电视） | 运河表面到组织体积（CA.S/TV） | 平均运河直径（Ca.Dm） | 平均运河分离（卡斯普） | 大声 笑运河（加州） | 大声 笑拉库纳 （Lc. n） | 孔密度（孔/电视） | |
| 单位 | 毫米* | 毫米* | 毫米 2 | % | 1/毫米 | 微米 | 微米 | # | # | 毛孔/毛孔 |
| 扶轮切割 | 0.15861 | 0.01780 | 0.00287 | 11.23 | 0.01808 | 51.05 | 122.81 | 459 | 64662 | 0.00041 |
| 科里德（此方法） | 0.15747 | 0.02451 | 0.00216 | 15.56 | 0.01373 | 120.73 | 145.38 | 76 | 30531 | 0.00019 |
表 1.旋转工具和核心标本步骤 4.2.3.9 的代表性结果在 图 8中可视化。请注意旋转切削样品的 Ca . V 、 Ca . V / TV 、 Ca . Dm 、孔隙和毛孔密度的降低，以及血管管和数量的增加。部分由不均匀切割的样品引起的扫描文物可能导致人工增加乳层和皮质毛孔。
补充材料。请点击这里下载这些材料。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
对于采购具有有限 FOV 设置的高分辨率 SRμCT 成像的均匀和圆柱形皮质骨芯样品，尚未制定全面、标准化的协议。此处详细的协议通过提供有关如何为 SRμCT 成像采购一致大小的皮质骨芯样本以及随后精确可视化和提取微结构数据的全面教程来填补这一空白。我们已经表明，我们的协议提供了一个更标准化和可靠的方法来采购皮质骨芯比以前描述的截断直线骨块的任意尺寸。因此，依靠手持式旋转工具（例如Dremel）去除不规则大小的骨块的研究人员在成像过程中可能经历了更长的样本设置时间，在分析过程中在阈值和皮质孔隙提取方面出现了更大的错误。这种差异突出了这一标准化协议在骨样准备、后续可视化和分析以及解释结果方面的必要性和意义。
此处概述的程序可能由相关领域的研究人员进一步调整，他们通常评估骨组织，如生物人类学家和考古学家。然而，在描述的研究协议中，没有诊断或考古/历史骨骼标本。在地质学中，二次生成是指沉积后物质（例如骨骼）的改变，可以包括物理、化学或生物手段29、30引起的变化。地下水、真菌和其他微生物渗透都可以作为二代制剂，改变骨组织微生物形态31。此类标本可能需要在编码之前采取额外的程序步骤，例如嵌入甲基甲基丙烯酸酯 （MMA） 或两部分环氧树脂中。由于股骨皮质骨的密集性，以及尸体标本在死后不久被防腐的事实，在上述实验中没有必要嵌入股骨块。但是，如果评估脆弱的骨骼元素及其骨质（如肋骨），我们建议在骨骼之前嵌入整个骨块。
本研究中评估的所有骨组织在新鲜时都进行了防腐。作者无法接触到防腐过程中使用的化学品的具体组合，但保存化学品通常包括甲醛、乙醇、苯酚、乙二醇和谷胱甘肽。记录甲醛饱和骨骼微观结构变化的法医人类学数据是有限的，尽管Freidlander32证明甲醛固定不会改变某些特征的形态，包括哈弗斯运河和二级骨骼。然而，甲醛饱和度记录了对非人类骨骼某些机械特性和骨折特征的影响，如冲击强度和骨折韧性33，34。
我们已经报告了一种用高分辨率X射线系统（SRμCT）进行成像前皮质骨样进行皮质骨样分析的方法。这种方法具有成本效益，因为材料和设备可以从当地五金商店采购，效率高，并确保样品大小均匀。我们希望，我们的建议将减少有关如何为 SRμCT 采购、核心和分析样品的询问，因为现有文献仍然稀少，缺乏有关准备和后续分析的关键细节。我们的主要目标是激励研究人员将此腐蚀协议作为高分辨率骨成像研究的标准化程序。我们进一步希望，我们在开发这项技术时遇到的上述困难能够缓解常见的问题，并为故障排除提供指导。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本论文中描述的研究在加拿大光源BMIT设施进行，该设施得到加拿大创新、自然科学和工程研究理事会、萨斯喀彻温大学、萨斯喀彻温省政府、加拿大西部经济多样化、加拿大国家研究理事会和加拿大卫生研究所的支持。作者要感谢加拿大光源公司的光束线科学家，特别是亚当·韦伯、丹尼斯·米勒、谢尔盖·加西洛夫和宁祖在SkyScan SRμCT和白光束显微镜系统的设置和故障排除方面给予的帮助。我们还要感谢托莱多大学医学和生命科学学院的贝丝·达尔泽尔和东北俄亥俄医科大学的杰弗里·温斯特鲁普博士为这项研究获取尸体样本。JM Andronowski通过阿克伦大学和刑事司法法医学国家司法研究与发展研究所提供的启动研究基金（2018-DU-BX-0188）得到支持。RA戴维斯由阿克伦大学提供的研究生助理支持。用于制芯和锯的设备和用品由阿克伦大学提供的启动资金购买，NSF向CW Holyoke提供EAR-1624242。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-1/8" plunge cutting carbide for composites | Warrior | 61812 | 28.6mm plunge |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 3.8 Liters |
| Blunt-tipped forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Centrifuge tubes | ThermoFisher | 55398 | |
| Crystalbond 509-3 Epoxy | Ted Pella | 821-3 | |
| CTAnalyser | Bruker microCT | v.1.15.4.0 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html |
| Dental Tool Kit | Amazon | 787269885110 | |
| Diamond wafering saw blade for composite material | Buehler | #11-4247 | |
| Drill Press | Jet Mill/Drill | 350017 | Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem |
| Fine-tipped forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fixturing clamps for XY machine table for mill/drill | MSC Industrial Supply | #04804571 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26005 | 75x50mm slides, 1mm thick |
| Glass slide chuck | Buehler | #112488 | Large enough to hold 75x50mm glass slides |
| Hot plate capable of reaching 140 °C | ThermoScientific | HP88850105 | |
| Incubator | NAPCO | Model 4200 | |
| Isocut Fluid | Buehler | 111193032 | Lubricant; 30mL |
| Jeweler's diamond coring drill bit | Otto Frei | #119.050 | 2mm inner diameter hollow stem coring bit |
| NRecon | Bruker microCT | v.1.6.10.2 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html |
| Oscillating saw | Harbor Freight | 62866 | |
| Oven-safe glass dishes | Pyrex | 1117715 | Glass food storage container |
| Precision slow-speed saw (Isomet 1000) | Buehler | 111280160 | |
| Razor blades | Amazon | 25181 | |
| Shallow aluminum tins | Amazon | B01MRWLD0R | ~8cm diameter |
| Specimen cups | Amazon | 616784425436 885334344729 | |
| Tergazyme detergent | Alconox | 1304-1 | 1.8kg box |
| Ultrasonic cleaner | MTI Corporation | KJ201508006 |
References
- Andronowski, J. M., Crowder, C., Soto Martinez, M. Recent advancements in the analysis of bone microstructure: New dimensions in forensic anthropology. Forensic Sciences Research. 3 (4), 278-293 (2018).
- Wysokinski, T. W., et al. Beamlines of the biomedical imaging and therapy facility at the Canadian light source - part 3. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 775, 1-4 (2015).
- Carter, Y., Suchorab, J. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Normal variation in cortical osteocyte lacunar parameters in healthy young males. Journal of Anatomy. 225 (3), 328-336 (2014).
- Carter, Y., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Femoral osteocyte lacunar density, volume and morphology in women across the lifespan. Journal of Structural Biology. 183 (3), 519-526 (2013).
- Langer, M., et al. X-Ray Phase Nanotomography Resolves the 3D Human Bone Ultrastructure. PLoS ONE. 7 (8), 35691 (2012).
- Peyrin, F., Dong, P., Pacureanu, A., Langer, M. Micro- and Nano-CT for the Study of Bone Ultrastructure. Current Osteoporosis Reports. 12 (4), 465-474 (2014).
- Dong, P., et al. 3D osteocyte lacunar morphometric properties and distributions in human femoral cortical bone using synchrotron radiation micro-CT images. Bone. 60, 172-185 (2014).
- Gauthier, R., et al. 3D micro structural analysis of human cortical bone in paired femoral diaphysis, femoral neck and radial diaphysis. Journal of Structural Biology. 204 (2), 182-190 (2018).
- Giuliani, A., et al. Bisphosphonate-related osteonecrosis of the human jaw: A combined 3D assessment of bone descriptors by histology and synchrotron radiation-based microtomography. Oral Oncology. 82, 200-202 (2018).
- Andronowski, J. M., Pratt, I. V., Cooper, D. M. L. Occurrence of osteon banding in adult human cortical bone. American Journal of Physical Anthropology. 164 (3), 635-642 (2017).
- Andronowski, J. M., Mundorff, A. Z., Pratt, I. V., Davoren, J. M., Cooper, D. M. L. Evaluating differential nuclear DNA yield rates and osteocyte numbers among human bone tissue types: A synchrotron radiation micro-CT approach. Forensic Science International: Genetics. 28, 211-218 (2017).
- Britz, H. M., et al. Prolonged unloading in growing rats reduces cortical osteocyte lacunar density and volume in the distal tibia. Bone. 51 (5), 913-919 (2012).
- Maggiano, I. S., et al. Three-dimensional reconstruction of Haversian systems in human cortical bone using synchrotron radiation-based micro-CT: morphology and quantification of branching and transverse connections across age. Journal of Anatomy. 228 (5), 719-732 (2016).
- Cooper, D. M. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Hallgrímsson, B. Three-dimensional microcomputed tomography imaging of basic multicellular unit-related resorption spaces in human cortical bone. The Anatomical Record Part A: Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 228 (7), 806-816 (2006).
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J., Ulrich, C.
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K.
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J.
- Raterron, P., Fraysse, G., Girard, J., Holyoke, C. W. Strength of orthoenstatite single crystals at mantle pressure and temperature and comparison with olivine. Earth and Planetary Science Letters. 450, 326-336 (2016).
- Millard, J. W., et al.
- Thomas, C. D. L., Feik, S. A., Clement, J. G. Regional variation of intracortical porosity in the midshaft of the human femur: age and sex differences. Journal of Anatomy. 206 (2), 115-125 (2005).
- Jowsey, J.
- Martin, R. B., Pickett, J. C., Zinaich, S. Studies of skeletal remodeling in aging men. Clinical Orthopaedics and Related Research. (149), 268-282 (1980).
- Martin, R. B., Burr, D. B. Mechanical implications of porosity distribution in bone of the appendicular skeleton. Orthopedic Transactions. 8, 342-343 (1984).
- Bousson, V., et al. Distribution of Intracortical Porosity in Human Midfemoral Cortex by Age and Gender. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (7), 1308-1317 (2001).
- Goldman, H. M., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Bromage, T. G. Relationships among microstructural properties of bone at the human midshaft femur. Journal of Anatomy. 206 (2), 127-139 (2005).
- De Micheli, P. O., Witzel, U. Microstructural mechanical study of a transverse osteon under compressive loading: The role of fiber reinforcement and explanation of some geometrical and mechanical microscopic properties. Journal of Biomechanics. 44 (8), 1588-1592 (2011).
- Martin, R. B., Boardman, D. L. The effects of collagen fiber orientation, porosity, density, and mineralization on bovine cortical bone bending properties. Journal of Biomechanics. 26 (9), 1047-1054 (1993).
- Cooper, D. M. L., Turinsky, A. L., Sensen, C. W., Hallgrímsson, B. Quantitative 3D analysis of the canal network in cortical bone by micro-computed tomography. The Anatomical Record Part B: The New Anatomist. 274 (1), 169-179 (2003).
- Crowder, C., Heinrich, J., Stout, S. D. Rib histomorphometry for adult age estimation. Forensic Microscopy for Skeletal Tissues: Methods and Protocols. , 109-127 (2012).
- Pfeiffer, S.
- Bone Hedges, R. E. M.
- Friedlander, H. The use of formaldehyde imbedded human remains in experimental procedures. , Available from: https://capa-acap.net/sites/default/files/basic-page/capa_2017_program_final_no_cover.pdf (2017).
- Currey, J. D., Brear, K., Zioupos, P., Reilly, G. C. Effect of formaldehyde fixation on some mechanical properties of bovine bone. Biomaterials. 16 (16), 1267-1271 (1995).
- Asaka, T., Kikugawa, H. Effect of formaldehyde solution on fracture characteristics of bovine femoral compact bone. Journal of the Japan Institute of Metals. 69 (8), 711-714 (2005).
