Summary
Vi anvendte en geologisk (coring) prøvetagningsprotokol til at skaffe kortikale knogleprøver af ensartet størrelse til SRμCT-eksperimenter fra det forreste aspekt af menneskelig femora. Denne metode er minimalt destruktiv, effektiv, resulterer i cylindriske prøver, der minimerer billedartefakter fra uregelmæssige prøveformer og forbedrer mikroarkitectural visualisering og analyse.
Abstract
Bone er et dynamisk og mekanisk aktivt væv, der ændrer sig i struktur i løbet af menneskets levetid. Produkterne fra knogleombygningsprocessen er blevet undersøgt væsentligt ved hjælp af traditionelle todimensionelle teknikker. Nylige fremskridt inden for røntgenbilledteknologi via desktop-mikrocomputertomografi (μCT) og synkrotronstråling mikrodatamatiseret tomografi (SRμCT) har gjort det muligt at erhverve tredimensionelle (3D) scanninger i høj opløsning af et større synsfelt (FOV) end andre 3D-billeddannelsesteknikker (f.eks. SEM), der giver et mere komplet billede af mikroskopiske strukturer inden for humane kortikale knoglestrukturer. Prøven skal være præcist centreret i FOV, dog for at begrænse udseendet af streak artefakter kendt for at påvirke dataanalyse. Tidligere undersøgelser har rapporteret indkøb af uregelmæssigt formede retlinede knogleblokke, der resulterer i billeddannelse artefakter på grund af ujævne kanter eller billede afkortning. Vi har anvendt en geologisk prøveudtagningsprotokol (coring) til at skaffe kortikale knoglekerneprøver i konstant størrelse til SRμCT-eksperimenter fra det forreste aspekt af menneskelig femora. Denne coring metode er effektiv og minimalt ødelæggende for væv. Det skaber ensartede cylindriske prøver, der reducerer billeddannelse artefakter af natur af at være isometrisk under rotation og giver en ensartet sti længde for X-ray stråler under hele scanningen. Billedbehandling af røntgentomografiske data fra cored og uregelmæssigt formede prøver bekræfter teknikkens potentiale til at forbedre visualisering og analyse af kortikal knoglemikrarkitektur. Et mål med denne protokol er at levere en pålidelig og repeterbar metode til udvinding af kortikale knoglekerner, der kan tilpasses til forskellige typer knoglebilleddannelseseksperimenter med høj opløsning. Et overordnet mål med arbejdet er at skabe en standardiseret kortikal knogleindkøb for SRμCT, der er overkommelig, konsistent og ligetil. Denne procedure kan yderligere tilpasses af forskere inden for beslægtede områder, der almindeligvis evaluerer hårde kompositmaterialer såsom i biologisk antropologi, geovidenskab eller materialevidenskab.
Introduction
Med de seneste fremskridt inden for billedbehandlingsteknologi er det nu muligt at erhverve røntgenbilleddata med meget høj opløsning. Mikro-CT-systemer til stationære computere (μCT) er den nuværende standard for billeddannelse af cancellous bone på grund af deres ikke-destruktive karakter1. Ved billeddannelse af mikrostrukturelle træk ved kortikale knogler har μCT-brugen imidlertid været mere begrænset. På grund af opløsningsbegrænsninger kan skrivebordssystemer ikke opnå den opløsning, der kræves for at afbilde mikrostrukturelle funktioner, der er mindre end kortikale porer, f.eks. Til denne applikation er SRμCT ideel på grund af den større opløsning af disse systemer1. For eksempel har eksperimenter på den canadiske lyskilde (CLS) på BioMedical Imaging and Therapy (BMIT) beamlines2 produceret billeder med voxels så små som 0,9 μm. Tidligere undersøgelser1,3,4,5 har brugt denne beslutning til at erhverve fremskrivninger og efterfølgende tredimensionale (3D) gør fra kortikale knogleprøver fra mennesker lange knogler ( Figur1) til at kvantificere osteocyt lacunar tæthed4, 6,7,8,9 og variation i lakuner form og størrelse3 på tværs af den menneskelige levetid og mellem kønnene. Yderligere undersøgelser har vist tilstedeværelsen af osteon banding hos mennesker10, et fænomen, der tidligere blev anerkendt for kun at være forbundet med ikke-menneskelige pattedyr i den retsmedicinske antropologiske litteratur.
For at opnå en ekstraordinær opløsning skal røntgenstrålen være fint fokuseret inden for synsfeltet (FOV), som ofte begrænser den maksimale prøvestørrelse til et par millimeter i diameter. I øjeblikket har der ikke været nogen omfattende, standardiserede procedurer, der er beskrevet i litteraturen, der skitserer knogleprøveindkøb, der opfylder disse begrænsninger. Centrering af prøver i FOV er afgørende for at sikre, at 1) prøven forbliver centreret, da den roterer 180 ° under billeddannelse, og 2) scanningsartefakter er begrænsede, da der ikke er nogen billedafkortning. Med andre ord forstyrrer ingen dele af prøven uden for FOV strålen, der kommer ind i dens omdrejningspunkt inde i FOV. Hvis dette sker, fratages genopbygningsalgoritmen nogle af de afdæmpningsdata, der er nødvendige for en helt korrekt rekonstruktion. Det er endvidere værd at bemærke, at 360 ° (fuld rotation) scanninger minimere virkningerne af strålehærdning, men øge artefakter forårsaget af forskydning og prøve bevægelse under billeddannelse. Mens en 360° scanning typisk genererer renere data, fordobles billedtiden, og derfor skal der tages fat på et kompromis mellem eksperimentelle omkostninger og datakvalitet.
Et vigtigt og ofte overset aspekt af knoglebilleddannelseseksperimenter er den nøjagtige og replikerbare prøveforberedelsesteknik, der udføres før scanning. Undersøgelser, der inkorporerer SRμCT-metoder i deres eksperimenter, nævner kort deres prøveudtagningsprotokol, men forfatterne giver lidt eller ingen detaljer om den særlige metode, der anvendes til at indsamle deres prøver. Mange af disse undersøgelser nævner skærende retlinede knogleblokke af vilkårlige dimensioner, men giver generelt ingen yderligere oplysninger om de anvendte værktøjer eller indlejringsmaterialer3,4,10,11,12,13,14. Nogle forskere bruger almindeligvis håndholdte roterende værktøjer (f.eks. Dremel) til at fjerne retlinede knogleblokke fra en region af interesse (ROI)3,4,10,11,12,13,14. Denne metode resulterer i prøver i ikke-ensartet størrelse, der kan være større end FOV, hvilket øger sandsynligheden for scanning af artefakter og billedafkortning. Sådanne prøver kræver ofte yderligere raffinering ved hjælp af en præcisionsdiamant-wafersav (f.eks. Buehler Isomet). Fremskaffelse af prøver med konsistente dimensioner (til 200ths/mm) er afgørende for at sikre, at de erhvervede datasæt er af højeste kvalitet, og at de efterfølgende resultater kan gentages.
Den begrænsede rapportering af stikprøveindkøbsmetoden tilføjer et ekstra lag af vanskeligheder, når man forsøger at anvende og/eller validere metoder, der er udført i en tidligere undersøgelse. I øjeblikket skal forskere kontakte forfatterne direkte for at få yderligere oplysninger om deres prøveudtagningsprocedurer. Den protokol, der er beskrevet her, giver biomedicinske forskere en grundigt dokumenteret, replikerbar og omkostningseffektiv prøvetagningsteknik. Det primære formål med denne artikel er at give en omfattende tutorial om, hvordan man skaffer konsekvent størrelse kortikale knoglekerneprøver ved hjælp af en mølle-borepresse og diamant coring bit for nøjagtig visualisering og udvinding af mikroarchitectural data. Denne metode er ændret fra procedurer, der anvendes til rutinemæssigt at indsamle ensartede, små-diameter (1-5 mm) cylindre fra blokke af hårde materialer i højtryks rock mekanik15,16,17,18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prøver blev hentet fra balsamerede kadaveriske donorer ved University of Toledo, College of Medicine and Life Sciences og Northeast Ohio Medical University (NEOMED), med informeret samtykke fra donoren selv eller donorens pårørende. University of Akron Institutional Review Board for the Protection of Human Subjects (IRB) anså disse enheder for at være undtaget fra fuld IRB-gennemgang, da de ikke blev indkøbt fra levende individer. Demografiske oplysninger, herunder alder, køn og dødsårsag, var tilgængelige for alle donorer. De udvalgte personer havde ikke dokumenteret knoglepåvirkende tilstande eller eksponering for behandlingsregimer, der kan have påvirket knogleombygning på dødstidspunktet. Kortikale knogleprøver blev fremstillet af femora af kadaveriske moderne hanner og hunner i alderen 19 til 101 år (gennemsnit = 73,9 år). Femoral midshaft er blevet undersøgt grundigt, herunder undersøgelser af variation i kortikal porøsitet20,21,22,23,24 og materialetæthed af knoglevæv25,26,27, og er således blevet et almindeligt anvendt sted for mikrostrukturelle analyser.
1. Vævsindkøb og -udblødning
- Brug en oscillerende sav udstyret med et spring skærende hårdmetalblad (til kompositmaterialer) til at skaffe ~ 7,5 cm knogleblokke fra midten af diafyserne i venstre femora.
- Femoralblokke sættes i blød i en ovnsikker glasskål fyldt med et proteaseenzym i pulverform og vand fra hanen i 1 time i en inkubator, der er indstillet til 45 °C.
- Efter inkubation skal du forsigtigt fjerne eventuelle resterende bløde væv og periosteum ved hjælp af stump dissektion eller tandværktøj.
BEMÆRK: Undgå brug af skarpe værktøjer (f.eks. skalpel) til at fjerne blødt væv. Sådanne instrumenter kan forårsage skade på knoglen, som kan påvises ved μCT-scanninger, hvilket påvirker prøvebevarelse og scanningsdatakvalitet. - Fjern snavs eller okklusioner i det medullære hulrum ved at placere knogleblokke i en ultralydsrenser i 5-10 minutter med 20:1 dele vand fra hanen til rengøringsopløsning (se Materialebord)eller ved hjælp af en håndholdt vandtråd (f.eks. Waterpik).
- Fordyb knogleblokken i en prøvekop og fyld med 70% ethanol. Lad knoglen suge i mindst 24 timer for at fjerne lipider.
BEMÆRK: Xylener kan også bruges til at fjerne lipider. Forlænget iblødsætning i xylener kan dog gøre knoglen skør eller kridtagtig, da det er en emulgator. - Efter 24 timer fjernes knogleblokke fra ethanol og lufttørres ved omgivelsestemperatur i 24-48 timer.
BEMÆRK: Protokollen kan være sat på pause her.
2. Vævssektion
- Placer en 75 x 25 mm glasmikroskoprutsjebane på en kogeplade, der er indstillet til 140 °C. Smelt en generøs mængde termisk epoxyharpiks (se Materialetabel)midt på rutsjebanen.
- Hvis der forberedes yderligere tynde sektioner til mikroskopi (<50 μm), kan knogleblokken være nødt til at være indlejret i en todelt epoxy for at bevare trabeculae. Ved gennemførelsen af denne protokol for skrøbelige prøver (f.eks. diagenetisk knogle eller meget trabeculariserede prøver) er det desuden nødvendigt at integrere prøver i en epoxy.
BEMÆRK: Knogleprøver, der anvendes i denne protokol, blev hentet fra balsamerede kadaverprøver. Hvis der indsamles friske prøver ved obduktionen eller fra et kirurgisk tilfælde for at undersøge bløddelsstrukturer (f.eks. vaskulatur) via SRμCT, kan imprægnering med epoxy forårsage skade på sådanne væv. I disse tilfælde anbefales et alternativt klæbemiddel eller monteringsmedium (f.eks. dobbeltsidet tape, modellering af ler).
- Hvis der forberedes yderligere tynde sektioner til mikroskopi (<50 μm), kan knogleblokken være nødt til at være indlejret i en todelt epoxy for at bevare trabeculae. Ved gennemførelsen af denne protokol for skrøbelige prøver (f.eks. diagenetisk knogle eller meget trabeculariserede prøver) er det desuden nødvendigt at integrere prøver i en epoxy.
- Tryk det ringere aspekt af knogleblokken ind i den termiske epoxyharpiks på mikroskopdiaset, med længden af knoglen vinkelret på diaset. Forskyd prøven frem og tilbage for at belægge undersiden af knoglen og sikre sikker vedhæftning til diaset.
- Lad den monterede prøve hvile på kogepladen i ~ 5 minutter, så den termiske epoxy kan væge ind i porer og / eller revner.
BEMÆRK: Epoxyen på rutsjebanen skal være fri for bobler for bedste vedhæftning. Hvis du vil fjerne bobler, skal du flytte prøven frem og tilbage på diaset. Bobler dannes ofte på grund af vand og /eller ethanol fanget i knoglen undslippe og fordampe. - Fjern rutsjebanen med den monterede prøve fra kogepladen ved hjælp af stumpe pincet og lad afkøle ved stuetemperatur i ~ 10 minutter. Fjern epoxyen fra kanten af rutsjebanen ved hjælp af et barberblad for at sikre, at spændepatronen griber tilstrækkeligt fat i rutsjebanen.
- Fastgør rutsjebanen med den klæbende prøve på en glasskøjte, og monter spændepatronen på drejearmen på en sektionssav med langsom hastighed (se Materialetabel, Figur 2).
BEMÆRK: Mens en Buehler IsoMet sav blev anvendt i denne protokol, andre præcisionssektionssave er tilgængelige, der kan bruges i stedet for IsoMet (f.eks. Leco, Exakt, Smartcut, CT3, Buehler Petrothin, Well Diamond Wire). - Juster drejearmen ved hjælp af positionsknappen for at sikre, at klingen kommer i kontakt med og transekterer prøven. Prøveemnet anbringes således, at et tværsnit af knoglen skæres vinkelret på længden.
- Tilsæt vægte til den anden side af skærearmen for at modvirke armens vægt.
BEMÆRK: Hvis der ikke anvendes tilstrækkelig modvægt, kan prøven bære ned på klingen og få klingen til at brække. - Der tilsættes skærevæske (20:1 dele vand til skærevæske) til savens væskebeholder.
- Fastgør diamantskiferbladet tæt, og sørg for, at væskeniveauet nedsænker skæredelen af klingen. Sæt hastigheden til 200 omdrejninger i minuttet, og sænk langsomt prøven ned på klingen (Figur 3).
- Sørg for, at klingen og spændet ikke slingrer og/eller hopper. Hvis der konstateres for stor bevægelse, skal saven straks standses, og klingen og/eller spændearmen strammes, inden der skæres igen. Tilføj yderligere modvægte, hvis patronen aggressivt bevæger sig op og ned. Overdreven bevægelse, herunder synlig bevægelse fra side til side, kan medføre, at klingen brækker.
- Den første tykke sektion er en "affaldssnit" for at give en veldefineret overflade parallelt med hvert yderligere snit. Når det første affald er skåret over, skal du løfte drejearmen og flytte spændepatronen mod klingen 5 mm ved hjælp af positionsknappen. Yderligere tykke sektioner (~1 mm) til mikroskopi kan yderligere indsamles med denne metode.
BEMÆRK: For at spare værdifuldt væv kan affaldssnittet udelades. Ved sektion af en prøve med en ujævn kant er det imidlertid afgørende, at prøveemnets top opstilles tangentielt til kanten af coringboretten.- Sørg for at tage højde for klingens kantsten, når du skærer. For eksempel at få en 5 mm sektion fra et blad, der har en kantsten på 0,5 mm, skal du flytte prøven og chuck 5,5 mm mod bladet.
- Når sektionering er færdig, skal du placere glasrutschebanen med den monterede prøve på en kogeplade for at smelte den termiske epoxy. Dette giver mulighed for hurtig fjernelse af knogleblokke fra diaset.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
3. Prøve coring
- Monter 5 mm knoglesektioner til bunden af en lav aluminiumsform (~8 cm i diameter) ved hjælp af den termiske epoxybindingsteknik som beskrevet i trin 2.2-2.4.
- Anfør tin på et XY-maskinbord i mølleborepressen (se Materialeoversigten),og stram fastgørelsesklemmerne i hånden (figur 4).
- Sæt 2 mm hulakslets juveler med indvendig diameter med diamantspidset coringborebit (se Materialebord)på mølleborepatronen. Juster dybdebegrænseren for at forhindre, at den passer gennem dåsen (Figur 5).
- Det centrale forreste aspekt af knogleprøven under boret justeres, samtidig med at man undgår tæt kontakt med enten periosteum-, endosteum- eller meget trabeculariserede områder.
BEMÆRK: Automatiseret udvælgelse af mid-forreste lårbens cortices er ikke muligt, da kortikal tykkelse varierer blandt individer, især med stigende alder. - Fyld dåsen med destilleret vand for helt at dække prøven. Dette forhindrer varmeophobning, brænding af prøven og/eller beskadigelse af boret under coring.
BEMÆRK: For at vurdere muligheden for varmeskader forårsaget af coring blev der brugt et infrarødt termometer til at opnå temperaturaflæsninger fra det destillerede vand, da coringbitten først trængte ind i knoglernes overflade. Temperaturen varierede med 1 °C fra 22,9 – 23,9 °C blandt de ti prøver, der blev kernehus til denne test. Således hævder vi, at varme-induceret skade er ubetydelig. - For de første par tilfælde af kontakt mellem kernen bit og knogler, anvende blidt tryk for at bære en ring på den overlegne overflade af knoglen. Dette forhindrer afbøjning af boret i begyndelsen af coringprocessen og sikrer korrekt placering af boret.
- Under coring løftes boret ind og ud af prøven, mens bittens spids holdes under vandets overflade. Fortsæt denne teknik med få sekunders mellemrum for at skylle fanget knoglestøv ud og sikre, at snavs ikke er okkluderende boret.
BEMÆRK: Hvis kernen danner en konisk form, skyldes det sandsynligvis 1), at der ikke er tilstrækkelig tid til at skylle knoglestøv fra coring-bitten, og 2) coring sker for hurtigt. Øget hastighed kan afbryde store stykker fra prøven og pulverisere det overlegne aspekt. - Når coring er færdig, kan den resulterende knoglekerne blive anbragt i den hulstilkede borebit(figur 6). Brug et par finspidsede pincet eller en lille Allen-skruenøgle til at løsne kernen fra boret (Figur 2).
- Opbevar coredprøven i et mærket mikrocentrifugerør på et køligt og tørt sted, indtil der er billeder.
4. Billedbehandlingsrutiner til evaluering af knoglemikroarkitektive parametre fra kortikale knoglekerner
- Rekonstruktion af μCT-billeder
- Download og installer den nyeste NRecon-version på https://www.bruker.com/products/microtomography.html til rekonstruktion af SRμCT-projektionsbillederne.
- Vælg NRecon-genvejen på skrivebordet, og den tilknyttede GPUReconServer vises.
- Åbn det ønskede datasæt i pop op-vinduet. Hvis vinduet ikke vises, skal du vælge mappeikonet i øverste venstre hjørne af datavisningsvinduet.
- Vælg den første fremskrivning fra SRμCT-anskaffelsen. Fjern markeringerne for Brug investeringsafkast og Skaler TILunder Output.
- Vælg destinationen for genopbygningsfilen. Vælg Gennemse , og opret en ny mappe med navnet Recon. Det valgte filformat skal være BMP(8).
- Kontroller kompensation for forkert justering.
BEMÆRK: Dette skøn er ofte tæt på korrekt. Den grove 3D-gengivelse kan justeres manuelt ved at flytte pilene op og ned for at flytte de overlappende billeder, så højre og venstre kant justeres så tæt som muligt. - Vælg de ønskede valg under Indstillingerfor at anvende algoritmerne Udjævning, Strålehærdning, CS-rotation, Objekt større end FOV og Ringartefakter.
- Juster histogrammet under Output ved at vælge Auto.
BEMÆRK: Det resulterende billede kan være svagt. - Vælg Start for at starte behandlingen af genopbygningen.
- Brug standardnomenklatur for indekser for kanal/osteocytlaklakunar 28. Disse kan omfatte: det samlede VOI-vævsvolumen (TV), kanalvolumen (Ca.V), det samlede antal kanaler (Ca.N), gennemsnitlig kanaldiameter (Ca.Dm), kortikal porøsitet (Ca.V/TV), angivet som en procentdel, det samlede antal lakuner (N.Lc) og gennemsnitlig lakunevolumen (Lc.V), blandt andre. For at bestemme lakunartætheden pr. mm3 (N.Lc/BV) beregnes knoglevolumen (BV) som samlet volumen minus kanalvolumen (TV-Ca.V).
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
- Indsamling af mikroarkitektive data fra rekonstruerede billeder
- Download og installer den nyeste version af CTAnalyser på https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html til analyse af mikroarchitectural parametre.
BEMÆRK: Den gratis version af CTAnalyser er begrænset i funktionalitet. Derfor anbefales det at købe en fuld licens til at udføre mere detaljerede analyser. - Under | Egenskaber | Skift pixelstørrelse, sørg for, at pixelstørrelsen svarer til størrelsen på den anvendte μCT-billedprotokol.
BEMÆRK: Hvis du redigerer billeder i ImageJ eller et lignende program, skal du være opmærksom på, at når du gemmer, ændres den header, der er integreret i TIFF-filen, og analysesoftwaren ændrer pixelstørrelsen, når datasættet importeres. - Vælg Brugerdefineret behandling for at oprette en opgaveliste (se Supplerende materialer) for at analysere knoglemikrarkitekturen fra scanningsdatasættet. En generel protokol for osteocyte lacunar netværksparametre ved hjælp af plugins proprietære til CTAnalyser følger her:
BEMÆRK: Plugin-opgavelisten fungerer godt for datasæt, hvor prøven er det eneste motiv, der er synligt i FOV. Hvis der er tom plads omkring prøven, kræves der anvendelse af et investeringsafkast. Ellers vil de værdier, der er indsamlet i 3D-analyse og individuel objektanalyse, blive kunstigt reduceret.- Genindlæs billederne for at nulstille og/eller justere eventuelle ændringer (f.eks. fra redigering i ImageJ eller lignende), før du åbner menuen Brugerdefineret behandling i analysesoftwaren.
- For at reducere støj i billederne skal du anvende et gaussisk lavpasfilter i 3D-rum med en rund kerne og en radius på 2-3.
BEMÆRK: Disse indstillinger blev anvendt på datasæt fra de rapporterede SRμCT-eksperimenter gennem forsøgs- og fejltest. Målet var at opnå den bedste kvalitet rekonstruktioner for data. Juster rekonstruktionsindstillingerne, så de passer til hver enkelt unik eksperimentel opsætning. - Anvend en global gråtonetærskel på billederne ved at vælge lave og høje værdier for at fremhæve vaskulære kanaler. De rekonstruerede skiver set i figur 8B og 8D viser et eksempel tærskel på 0-155.
BEMÆRK: I lighed med trin 4.2.3.2 blev de tærskelindstillinger, der anvendes her, valgt gennem omfattende trial and error. Tærskelværdien bør justeres for hvert eksperimentelt set-up- og μCT-billedsystem, der anvendes. - Despeckle (denoise) for at fjerne hvide pletter i 3D-rum, der er inden for volumetrisk pixel (voxel) størrelse vifte af osteocyte lakuner for at isolere kanaler alene.
BEMÆRK: For en SRμCT-scanning af human kortikal knogle taget ved 0,9 μm pixelstørrelse er den nedre grænse for osteocyt lacunae 13 voxel. - Despeckle at fjerne eventuelle sorte pletter i 2D-rummet for at fjerne artefakter i kanalerne. Disse kan være ret store i 2D og dermed fjerne funktioner, der er <15.000 pixels.
- Dilater porerne i 3D-rum ved hjælp af den morfologiske driftsfunktion med en rund kerne på 2 eller 3 radius, afhængigt af billedernes kvalitet, for at isolere ethvert blødt væv fanget i kanaler.
- Udfør en ekstra Despeckle-funktion ved hjælp af de samme indstillinger som trin 4.2.3.5. for at fjerne isoleret blødt væv i kanalerne.
- Dagbladet eroderet fra trin 4.2.3.6. ved hjælp af en morfologisk driftsfunktion ved hjælp af en rund kerne med en radius på enten 2 eller 3. Radius for dette trin skal svare til den radius, der er anvendt i procedure 4.2.3.6.
- Kør 3D-analyse, og vælg, hvilke parametre der skal beregnes for mængden af vaskulære kanaler. Generelt vil de grundlæggende værdier give tilstrækkelige oplysninger.
- Gem de behandlede billeder med Gem bitmaps i en brugerdefineret undermappe i mappen.
BEMÆRK: Hvis du opretter et 3D-rekonstruktionsbillede fra de behandlede billeder ved hjælp af et program som Amira / Avizo, Dragonfly, Drishti osv., anbefales det at gemme billederne som monokrome (1 bit). - Beregn antallet af vaskulære kanaler, og beskriv deres størrelse, form og retning ved hjælp af funktionen Individuel objektanalyse.
- Gentag trin 4.2.3.1 – 4.2.3.3. for at nulstille billedet til osteocyt lacunaranalyse.
- Fjern hvide pletter i 3D-rum ved hjælp af Despeckle-funktionen, hvilket sikrer, at sådanne artefakter er mindre end den nedre grænse for lakunarstørrelse. Dette trin fjerner støj fra scanningen, der kan synes at være kortikale porer, samtidig med at ægte osteocyt lacunae bevares. For humane SRμCT-scanninger på 0,9 μm pixelstørrelse er denne nedre grænse 13 voxel.
- Despeckle igen for at fjerne hvide pletter, der er større end den øvre grænse for lakuner størrelse. For humane SRμCT-datasæt med de indstillinger, der er angivet i trin 4.2.3.13, er denne grænse 2743 voxels.
- Udfør 3D-analyse for at udtrække mikrostrukturelle oplysninger vedrørende osteocyt lacunae specifikt.
- Vælg Gem bitmaps for at gemme de behandlede billeder for at isolere osteocyt lacunae.
- Udfør individuel objektanalyse for at beregne antallet af osteocytter i 3D i den valgte voi (Volume of Interest).
BEMÆRK: Når opgavelisten er udarbejdet og testet, har CTAnalyser en batch manager (BatMan) funktion, som kan anvendes til at fremskynde dataudtrækning og sikre ensartet billedbehandling. En opgaveliste med eksempelindstillinger for procedure 4.2.3. findes i de supplerende materialer.
- Download og installer den nyeste version af CTAnalyser på https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html til analyse af mikroarchitectural parametre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne metode til kerneprøvetagning viste sig at være yderst effektiv. Coring-prøver, der anvender denne protokol, gjorde det muligt at indkøbe prøver i konstant størrelse til forsøg på CLS BMIT-BM-strålelinje2med en FOV på ~2 mm ved 1,49 μm voxel-størrelse. For at validere konsistensen af kernediameteren blev der foretaget tre målinger langs længden (top, midt, bund) af en delmængde af menneskelige forreste lårbenskerner (n= 69). Den gennemsnitlige diameter af kernerne var 1,96 ± 0,11 mm, og den gennemsnitlige udtynding langs kernens længde var 0,06 ± 0,06 mm/mm For at understrege anvendeligheden på andre hårde kompositmaterialer forsøgte vi denne metode på prøver af dolomit (n= 32), hvilket resulterede i en gennemsnitlig diameter på 1,06 ± 0,02 mm. Udtynding langs kerneprøvens længde blev registreret som 0,01 ± 0,005 mm/mm. Repræsentative tal, der sammenligner billedbehandlingsarbejdsgangen for en kerneprøve, og en, der er fremskaffet ved hjælp af et roterende værktøj (f.eks. Dremel), som beskrevet i trin 4.2.3, kan ses i figur 7. Prøveudskæringen ved hjælp af det fælles roterende værktøj udviste et øget antal kanaler (Ca.N) og lakuner (Lc.N) og en nedsat gennemsnitlig kanaldiameter (Ca.Dm), kanalvolumen (Ca.V) og kortikal porøsitet (Ca.V/TV) sammenlignet med coredprøven. Mens nogle af disse forskelle kan skyldes knoglemikrostrukturel variation mellem individer, blev det højere antal kanaler og lakuner udvundet fra rotationsværktøjsdatasættet sandsynligvis kunstigt øget på grund af scanning af artefakter og støj (Figur 7). De porøsitetsdata, der er indsamlet fra trin 4.2.3.9 for hver prøve, findes i tabel 1. Det er værd at bemærke, at selv om coring-protokollen reducerer artefakter observeret i SRμCT-scanninger, repræsenterer de lavere kvalitet, artefaktbelastede tal fra de retlinede knogleblokeksperimenter (Figur 7A) et mangesidet problem. Visse artefakter (f.eks. fasekontrastsignaler) kan være forårsaget af synkroniseringsfunktion eller strålelinjespecifikke problemer. Scanningsparametre for både repræsentative forsøgssæt og de tilhørende tal (Figur 7A, 7B) findes i de supplerende materialer (tabel S1, S2).
Synchrotron mikro-CT billeder indsamlet fra cored prøver held undertrykt scanne artefakter, som vist ovenfor, herunder streak artefakter. Efterfølgende billedbehandling bekræftede teknikkens potentiale til at forbedre visualiseringen af kortikal knoglemikrarkitektur. For eksempel blev mineraliseringsforskelle, forbedret afgrænsning af osteonale grænser og konsekvent visualisering af blødt væv i vaskulære kanaler observeret (Figur 8C, 8D). Sidstnævnte er afgørende for billedbehandling som delvis visualisering af blødt væv i kanaler kan resultere i unøjagtige beregninger af procent porøsitet og pore tykkelse, da porerne ikke er fuldt fyldt. Grænserne for osteocyt lacunae blev også forbedret på grund af nedsat birefringence, hvilket giver mulighed for kvantificering af formparametre. De potentielle fordele ved den beskrevne coring teknik omfatter let at centrere prøven i FOV, reducerede analytiske krav, og konsekvent visualisering af blødt væv i vaskulære kanaler.
Lignende procedurer er blevet anvendt med succes til at kerne enkelte krystaller af orthopyroxene18, polykrystallinsk magnesit19 og andre geologiske materialer15,16,17 for højtryks rock deformation eksperimenter. Disse eksperimenter kræver kerner i specifikke retninger i forhold til krystallografiske akser ienkeltkrystaller 18 eller justerede krystaller i polykrystallinske klipper19 for at bestemme orienteringsspecifikke styrker. De ovenfor beskrevne metoder er blevet anvendt til først at skabe orienterede plader og efterfølgende indsamle flere ensartede, cylindriske kerner til serie af deformationseksperimenter. Disse metoder kan bruges til at indsamle kerner af ethvert hårdt materiale, såsom ben, keramik eller briller. For eksempel kunne ovennævnte metode anvendes af biologiske antropologer til at evaluere kerner fra specifikke regioner inden for kortikale knogler og deres tilknyttede biomekaniske (f.eks. spændings-/kompressionsakser).
Figur 1. Cylindrisk VOI fra en venstre forreste menneskelige mid-aksel lårben. En enkelt SRμCT rekonstrueret skive af en hel kerne fra en venstre forreste menneskelige mid-aksel lårben (21-årig kvinde) (A), og 3D gør af en cylindrisk VOI fra overlegen (B) og forreste synspunkter (C) er visualiseret. Fremskrivninger blev taget ved 0,9 μm, med vaskulære kanaler fremhævet i rød og osteocyt lacunae i grå. Skalastænger betegner 0,25 mm (A) og 0,02 mm (B,C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. En mellemaksel femoral prøve (5 mm tykkelse) monteret på et glas mikroskop dias med termisk epoxy (se Tabel over materialer) og fastgjort til et glas dias chuck. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Glasrutsjepatron med monteret prøve fastgjort til drejearmen på en sektionssav med lav hastighed (se Materialetabel) inden sektionsafsnittet. Drejearmens sidestilling i forhold til savklingen og sektionshastigheden (RPM) vises på henholdsvis lcd-skærmens øverste og nederste rækker. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. En 5 mm lårbenssektion monteret på en aluminiumsdåse og fastgjort til et XY-mølleboremaskinebord ved hjælp af fikseringsklemmer som forberedelse til coring. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Den mølleborepresse, der anvendes i den udarbejdede protokol (A). Pilen identificerer dybdebegrænseren, som forhindrer boret i at trænge dybt ind i prøven eller gennem bunden af dåsen (B). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Et 5 mm lårbens tværsnit efter kerneindkøb fra det forreste aspekt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Enkelt SRμCT rekonstruerede skiver af det forreste aspekt af venstre lårben fra to individer. Prøve (A) blev sektionsopdelt ved hjælp af et almindeligt roterende værktøj, og (B) blev anskaffet ved hjælp af den coring-metode, der er beskrevet her. Hver skive sammenlignes med deres segmenterede modstykke (C og D). Bemærk, hvor let det er at isolere kortikal porøsitet i coredprøven (D) i modsætning til den prøve, der er indsamlet med drejeværktøjet (C). Dette fremgår yderligere af 3D-gengivelserne af de vaskulære kanaler i hver prøve (E og F). Støj omkring periferien af B er tydelig, og prøven forlader FOV, som begge resulterer i øgede udfordringer under billedbehandling. Skalalinjen i panelet (D) angiver 250 μm for paneler (A-D). Skalastængerne i paneler (E og F) angiver henholdsvis 700 og 600 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8. Et repræsentativt investeringsafkast fra en prøve, der er indkøbt med et roterende værktøj (A-C) og et kernehus ved hjælp af den metode, der præsenteres her (D-F). Paneler (A) og (D) repræsenterer det udpegede investeringsafkast fra SRμCT-scanningerne. Paneler (B) og (E) repræsenterer det forarbejdningsstadium, der anvendes til at isolere og udvinde vaskulære kanalparametre. Øverst til højre på panelet (B) er der fremmede objekter (pile), der er klassificeret som vaskulære kanaler af billedbehandlingssoftware. Paneler (C) og (F) repræsenterer det forarbejdningsstadium, der anvendes til at isolere og udvinde lakuner. Skalastænger angiver 0,1 mm for alle paneler. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Vævsvolumen (TV) | Kanalvolumen (Ca.V) | Kanaloverflade (Ca.S) | Kortikal porøsitet (Ca.V/TV) | Kanaloverflade til vævsvolumen (Ca.S/TV) | Gennemsnitlig kanaldiameter (Ca.Dm) | Gennemsnitlig kanaladskillelse (Ca.Sp) | Nej. af kanaler (Ca.N) | Nej. af Lacunae (Lc.N) | Poretæthed (porer/tv) | |
| Enheder | mm³ | mm³ | mm² | % | 1/mm | Μm | Μm | # | # | porer/μm³ |
| Roterende snit | 0.15861 | 0.01780 | 0.00287 | 11.23 | 0.01808 | 51.05 | 122.81 | 459 | 64662 | 0.00041 |
| Cored (Denne metode) | 0.15747 | 0.02451 | 0.00216 | 15.56 | 0.01373 | 120.73 | 145.38 | 76 | 30531 | 0.00019 |
Tabel 1. Repræsentative resultater for trin 4.2.3.9 af roterende værktøj og coredprøver visualiseret i figur 8. Bemærk den reducerede Ca.V, Ca.V/TV, Ca.Dm, antal porer og poretæthed for den roterende snitprøve samt det øgede antal vaskulære kanaler og lakuner. Scan artefakter delvist induceret af ujævnt skåret prøve sandsynligvis bidraget til en kunstig stigning i lakuner og kortikale porer.
Supplerende materialer. Klik her for at downloade disse materialer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der har ikke været nogen omfattende, standardiseret protokol for indkøb af ensartede og cylindriske kortikale knoglekerneprøver til højopløsnings SRμCT-billeddannelse med begrænsede FOV-opsætninger. Protokollen detaljeret her udfylder dette tomrum ved at give en omfattende tutorial om, hvordan man skaffer konsekvent størrelse kortikale knoglekerneprøver til SRμCT billeddannelse og den efterfølgende nøjagtige visualisering og udvinding af mikroarchitectural data. Vi har vist, at vores protokol giver en mere standardiseret og pålidelig metode til at skaffe kortikale knoglekerner end tidligere beskrivelser af sektionsudskæring af retlinede knogleblokke af vilkårlige dimensioner. Således oplevede forskere, der har påberåbt sig håndholdte roterende værktøjer (f.eks. Dremel) for at fjerne uregelmæssigt store knogleblokke, sandsynligvis meget længere prøveopsætningstider under billeddannelse og større fejl i tærskel- og kortikal poreekstraktion under analysen. Denne uoverensstemmelse understreger behovet for og betydningen af denne standardiserede protokol med hensyn til knogleprøveforberedelse, efterfølgende visualisering og analyse og fortolkning af resultater.
Den procedure, der er skitseret her, kan yderligere tilpasses af forskere inden for beslægtede områder, der almindeligvis evaluerer knoglevæv som biologiske antropologer og arkæologer. Ingen diagenetiske eller arkæologiske/historiske knogleprøver blev imidlertid kerneret for den beskrevne forskningsprotokol. Diagenese, i geologi, refererer til ændringer af et materiale (f.eks knogle) efter aflejring og kan omfatte ændringer forårsaget af fysiske, kemiske eller biologiske midler29,30. Grundvand, svampe og anden mikrobiel infiltration kan alle fungere som diagenetiske midler og ændre knoglevæv mikromorfologi31. Sådanne prøver kan kræve yderligere proceduremæssige trin forud for coring, såsom indlejring i methylmethan (MMA) eller en todelt epoxyharpiks. Indlejring af lårbensblokkene var ikke nødvendig for de beskrevne eksperimenter på grund af lårbenets tætte kortikale knogle og det faktum, at kadaverprøver blev balsameret kort efter døden. Hvis du vurderer skrøbelige skeletelementer og deres trabeculae (f.eks ribben), men vi anbefaler at indlejre hele knogleblokken før coring.
Alle knoglevæv evalueret i denne undersøgelse blev balsameret, mens frisk. Forfatterne havde ikke adgang til den specifikke kombination af kemikalier, der anvendes under balsameringsprocessen, selv om konservering kemikalier almindeligvis omfatter formaldehyd, ethanol, phenol, ethylenglycol, og glutaraldehyd. Retsmedicinske antropologiske data, der dokumenterer ændringer i mikrostrukturen af formaldehydmættede knogler, er begrænset, selvom Freidlander32 viste, at formaldehydfiksering ikke ændrer morfologien af visse funktioner, herunder haversiske kanaler og sekundære osteoner. Formaldehydmætning har imidlertid dokumenteret virkninger på visse mekaniske egenskaber og frakturegenskaber hos ikke-menneskelige knogler, såsom slagstyrke og fraktursejhed33,34.
Vi har rapporteret en metode til coring kortikale knogleprøver forud for billeddannelse med høj opløsning røntgensystemer (SRμCT). Denne metode er omkostningseffektiv, fordi materialer og udstyr kan hentes fra lokale isenkræmmere, effektiv, og sikrer en ensartet stikprøvestørrelse på tværs af prøver. Det er vores håb, at vores forslag vil reducere forespørgsler vedrørende, hvordan prøver skal indkøbes, korperes og analyseres for SRμCT, da den eksisterende litteratur forbliver sparsom og mangler kritiske detaljer om forberedelse og efterfølgende analyse. Vores primære mål er at motivere forskere til at anvende denne coring protokol som standardiseret procedure for høj opløsning knogle billeddannelse forskning. Vi håber endvidere, at de førnævnte vanskeligheder, vi oplevede med at udvikle denne teknik, vil afhjælpe almindelige spørgsmål og give vejledning til fejlfinding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forskning beskrevet i dette papir blev udført på BMIT facilitet på den canadiske Light Source, som støttes af Canada Foundation for Innovation, Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, University of Saskatchewan, regeringen i Saskatchewan, Western Economic Diversificering Canada, National Research Council Canada, og den canadiske Institutes of Health Research. Forfatterne vil gerne takke beamline forskere ved den canadiske Light Source, især Adam Webb, Denise Miller, Sergey Gasilov, og Ning Zu for bistand i opsætning og fejlfinding af SkyScan SRμCT og hvid stråle mikroskop systemer. Vi vil også gerne takke Beth Dalzell fra University of Toledo College of Medicine and Life Sciences og Dr. Jeffrey Wenstrup fra Northeast Ohio Medical University for adgang til kadaverprøver til denne undersøgelse. JM Andronowski støttes gennem opstartsforskningsmidler fra University of Akron og et Nationalt Institut for Retfærdighedsforskning og -udvikling inden for retsvidenskab til strafferetlige formål (2018-DU-BX-0188). RA Davis er støttet af en kandidat assistent fra The University of Akron. Udstyr og forsyninger, der anvendes til coring og savning blev købt af start-up midler fra The University of Akron og NSF tilskud EAR-1624242 til CW Holyoke.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-1/8" plunge cutting carbide for composites | Warrior | 61812 | 28.6mm plunge |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 3.8 Liters |
| Blunt-tipped forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Centrifuge tubes | ThermoFisher | 55398 | |
| Crystalbond 509-3 Epoxy | Ted Pella | 821-3 | |
| CTAnalyser | Bruker microCT | v.1.15.4.0 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html |
| Dental Tool Kit | Amazon | 787269885110 | |
| Diamond wafering saw blade for composite material | Buehler | #11-4247 | |
| Drill Press | Jet Mill/Drill | 350017 | Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem |
| Fine-tipped forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fixturing clamps for XY machine table for mill/drill | MSC Industrial Supply | #04804571 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26005 | 75x50mm slides, 1mm thick |
| Glass slide chuck | Buehler | #112488 | Large enough to hold 75x50mm glass slides |
| Hot plate capable of reaching 140 °C | ThermoScientific | HP88850105 | |
| Incubator | NAPCO | Model 4200 | |
| Isocut Fluid | Buehler | 111193032 | Lubricant; 30mL |
| Jeweler's diamond coring drill bit | Otto Frei | #119.050 | 2mm inner diameter hollow stem coring bit |
| NRecon | Bruker microCT | v.1.6.10.2 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html |
| Oscillating saw | Harbor Freight | 62866 | |
| Oven-safe glass dishes | Pyrex | 1117715 | Glass food storage container |
| Precision slow-speed saw (Isomet 1000) | Buehler | 111280160 | |
| Razor blades | Amazon | 25181 | |
| Shallow aluminum tins | Amazon | B01MRWLD0R | ~8cm diameter |
| Specimen cups | Amazon | 616784425436 885334344729 | |
| Tergazyme detergent | Alconox | 1304-1 | 1.8kg box |
| Ultrasonic cleaner | MTI Corporation | KJ201508006 |
References
- Andronowski, J. M., Crowder, C., Soto Martinez, M. Recent advancements in the analysis of bone microstructure: New dimensions in forensic anthropology. Forensic Sciences Research. 3 (4), 278-293 (2018).
- Wysokinski, T. W., et al. Beamlines of the biomedical imaging and therapy facility at the Canadian light source - part 3. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 775, 1-4 (2015).
- Carter, Y., Suchorab, J. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Normal variation in cortical osteocyte lacunar parameters in healthy young males. Journal of Anatomy. 225 (3), 328-336 (2014).
- Carter, Y., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Femoral osteocyte lacunar density, volume and morphology in women across the lifespan. Journal of Structural Biology. 183 (3), 519-526 (2013).
- Langer, M., et al. X-Ray Phase Nanotomography Resolves the 3D Human Bone Ultrastructure. PLoS ONE. 7 (8), 35691 (2012).
- Peyrin, F., Dong, P., Pacureanu, A., Langer, M. Micro- and Nano-CT for the Study of Bone Ultrastructure. Current Osteoporosis Reports. 12 (4), 465-474 (2014).
- Dong, P., et al. 3D osteocyte lacunar morphometric properties and distributions in human femoral cortical bone using synchrotron radiation micro-CT images. Bone. 60, 172-185 (2014).
- Gauthier, R., et al. 3D micro structural analysis of human cortical bone in paired femoral diaphysis, femoral neck and radial diaphysis. Journal of Structural Biology. 204 (2), 182-190 (2018).
- Giuliani, A., et al. Bisphosphonate-related osteonecrosis of the human jaw: A combined 3D assessment of bone descriptors by histology and synchrotron radiation-based microtomography. Oral Oncology. 82, 200-202 (2018).
- Andronowski, J. M., Pratt, I. V., Cooper, D. M. L. Occurrence of osteon banding in adult human cortical bone. American Journal of Physical Anthropology. 164 (3), 635-642 (2017).
- Andronowski, J. M., Mundorff, A. Z., Pratt, I. V., Davoren, J. M., Cooper, D. M. L. Evaluating differential nuclear DNA yield rates and osteocyte numbers among human bone tissue types: A synchrotron radiation micro-CT approach. Forensic Science International: Genetics. 28, 211-218 (2017).
- Britz, H. M., et al. Prolonged unloading in growing rats reduces cortical osteocyte lacunar density and volume in the distal tibia. Bone. 51 (5), 913-919 (2012).
- Maggiano, I. S., et al. Three-dimensional reconstruction of Haversian systems in human cortical bone using synchrotron radiation-based micro-CT: morphology and quantification of branching and transverse connections across age. Journal of Anatomy. 228 (5), 719-732 (2016).
- Cooper, D. M. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Hallgrímsson, B. Three-dimensional microcomputed tomography imaging of basic multicellular unit-related resorption spaces in human cortical bone. The Anatomical Record Part A: Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 228 (7), 806-816 (2006).
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J., Ulrich, C.
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K.
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J.
- Raterron, P., Fraysse, G., Girard, J., Holyoke, C. W. Strength of orthoenstatite single crystals at mantle pressure and temperature and comparison with olivine. Earth and Planetary Science Letters. 450, 326-336 (2016).
- Millard, J. W., et al.
- Thomas, C. D. L., Feik, S. A., Clement, J. G. Regional variation of intracortical porosity in the midshaft of the human femur: age and sex differences. Journal of Anatomy. 206 (2), 115-125 (2005).
- Jowsey, J.
- Martin, R. B., Pickett, J. C., Zinaich, S. Studies of skeletal remodeling in aging men. Clinical Orthopaedics and Related Research. (149), 268-282 (1980).
- Martin, R. B., Burr, D. B. Mechanical implications of porosity distribution in bone of the appendicular skeleton. Orthopedic Transactions. 8, 342-343 (1984).
- Bousson, V., et al. Distribution of Intracortical Porosity in Human Midfemoral Cortex by Age and Gender. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (7), 1308-1317 (2001).
- Goldman, H. M., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Bromage, T. G. Relationships among microstructural properties of bone at the human midshaft femur. Journal of Anatomy. 206 (2), 127-139 (2005).
- De Micheli, P. O., Witzel, U. Microstructural mechanical study of a transverse osteon under compressive loading: The role of fiber reinforcement and explanation of some geometrical and mechanical microscopic properties. Journal of Biomechanics. 44 (8), 1588-1592 (2011).
- Martin, R. B., Boardman, D. L. The effects of collagen fiber orientation, porosity, density, and mineralization on bovine cortical bone bending properties. Journal of Biomechanics. 26 (9), 1047-1054 (1993).
- Cooper, D. M. L., Turinsky, A. L., Sensen, C. W., Hallgrímsson, B. Quantitative 3D analysis of the canal network in cortical bone by micro-computed tomography. The Anatomical Record Part B: The New Anatomist. 274 (1), 169-179 (2003).
- Crowder, C., Heinrich, J., Stout, S. D. Rib histomorphometry for adult age estimation. Forensic Microscopy for Skeletal Tissues: Methods and Protocols. , 109-127 (2012).
- Pfeiffer, S.
- Bone Hedges, R. E. M.
- Friedlander, H. The use of formaldehyde imbedded human remains in experimental procedures. , Available from: https://capa-acap.net/sites/default/files/basic-page/capa_2017_program_final_no_cover.pdf (2017).
- Currey, J. D., Brear, K., Zioupos, P., Reilly, G. C. Effect of formaldehyde fixation on some mechanical properties of bovine bone. Biomaterials. 16 (16), 1267-1271 (1995).
- Asaka, T., Kikugawa, H. Effect of formaldehyde solution on fracture characteristics of bovine femoral compact bone. Journal of the Japan Institute of Metals. 69 (8), 711-714 (2005).
