Presenteras här är ett protokoll för primära mänskliga blod monocyten isolering samt deras differentiering till makrofager och dendritiska celler och montering med epitelceller i en flercelliga mänskliga lungmodell. Biologiska svar av kokulturer som består av immunceller som är differentierade från antingen nyligen isolerade eller tinade monocyter, vid exponering för proinflammatory stimuli, jämförs.
En human alveolära cell coculture modell beskrivs här för simulering av alveolära epitelial vävnad barriären består av alveolära epitelial typ II celler och två typer av immunceller (dvs. humanmonocyte-härledda makrofager [MDM] och dendritiska celler [MDDCs]). Ett protokoll för montering av flercelliga modellen tillhandahålls. Alveolar epitelceller (A549 cellinje) odlas och differentieras under nedsänkta förhållanden på genomsläppliga skär i två-kammare brunnar, sedan kombineras med differentierade MDM och MDDCs. Slutligen utsätts cellerna för ett luft-flytande gränssnitt i flera dagar. Eftersom människans primära immunceller måste isoleras från mänskliga buffy rockar, immunceller differentierade från antingen färska eller tinade monocyter jämförs för att skräddarsy metoden baserat på experimentella behov. De tredimensionella modellerna, som består av alveolära celler med antingen nyisolerade eller tinade monocyter härledda immunceller, visar en statistiskt signifikant ökning av cytokin (interleukins 6 och 8) frisättning vid exponering för proinflammatory stimuli (lipopolysackarid och tumörnekrosfaktor α) jämfört med obehandlade celler. Å andra sidan finns det ingen statistiskt signifikant skillnad mellan cytokinfrisättningen som observerats i kokulturerna. Detta visar att den presenterade modellen är lyhörd för proinflammatory stimuli i närvaro av MDM och MDDC differentierade från färska eller tinade perifert blod monocyter (PBM). Således är det ett kraftfullt verktyg för undersökningar av akut biologiskt svar på olika ämnen, inklusive aerosoliserade läkemedel eller nanomaterial.
In vitro-lungcellkulturer erbjuder kostnadseffektiva, robusta och välkontrollerade plattformar för att bedöma riskerna med aerosoler1. Som en modell cell system för mänskliga alveolar pneumocyter, epitelial A549 celllinjen isolerade från en pulmonell adenokarcinom används ofta2. Dessa celler representerar skivepitelceller typ II från alveolarregionen3 och är en allmänt använd lungcellslinje för faro- och toxicitetsbedömning1,4,5,6,7,8,9,10. A549-cellen har relevanta drag av alveolära epiteltyp II-celler, såsom förekomsten av karakteristiska lamellära kroppar som innehåller tätt packade fosfolipider3.
Det har visat sig att när cellerna odlas vid ett luft-flytande gränssnitt (ALI), är ytaktiva frigörs på den apikala sidan av luftexponerade epitelceller, vilket minskarytspänningen 11,12,13. Denna funktion är särskilt viktig i nanomaterial respiratorisk fara och toxicitet undersökningar. När inandas nanomaterial/toxgifter deponeras i regionen alveolar, interagerar de först med pulmonell tensid och förskjuts genom vätningskrafter in i den vattenhaltiga hypofasen, där interaktionen med lungceller sker14,15. Även om A549 celler bildar en monolayer (som kan överväxa i flerskikt vid senare tidpunkter när odlas på ALI) och producera ytaktiva, är en nackdel deras otillräckliga snäva korsningen bildning, vilket resulterar i låga transepithelial elektriska motstånd värden, men fortfarande presenterar en funktionell barriär mot intercellular (nano)partiklar flyttning16,17,18.
I lungorna finns en mängd immuncellpopulationer, inklusive fagocytiska och professionella antigenpresenterande celler (dvs. makrofager och dendritiska celler) som direkt kommunicerar genom cell-cellkontakt eller intercellulär signalering för att kontrollera och bibehålla homeostas. Makrofager och dendritiska celler är kritiska medfödda immuneffektorer och initiatorer av det adaptiva immunsvaret19. Dendritiska celler som bor inom eller under epitelet kan bilda utsprång över epitelet till lumen för att fånga antigener. Alveolar makrofager ligger på den apikala ytan av epitelet och fungerar som sentinel celler, som representerar den första cellulära försvar mot främmande material samt bakteriella, virala och svampinfektioner. Deras fenotypiska plasticitet möjliggör snabbt induktion av proinflammatory reaktioner som svar på sådana stimuli samt skiftande i utlösande antiinflammatoriska (dvs, hämmande) reaktioner20.
För att simulera den mänskliga alveolära epitelvävnadsbarriären, etablerade vi en trippel coculture modell med A549 celler kompletteras med humant blod monocyte-derived makrofager (MDM) och dendritiska celler (MDDC) på de apikala och basala sidorna, respektive17. Odling av denna modell vid ALI har tidigare rapporterats16, även upp till 72 h efter exponering21. Akut immunsvar mot kolnanorörexponeringar förbättrades signifikant i cellodling som exponerades för ALI jämfört med under vatten22. Den kokultur modell, odlade och exponeras för olika material på ALI, har tidigare använts för att undersöka cytotoxicitet, oxidativ stress och inflammatoriska svar vid exponeringar för zinkoxid,23 grafen-relaterade material24, guld nanopartiklar25,26, kol nanorör21, och vulkanisk aska och diesel avgaserpartiklar 27.
Vidare har den viktiga rollen av makrofager och dendritiska celler som immun effector celler i en in vitro mänskliga lungmodell bekräftats. I synnerhet observerades ett ökat proinflammatory svar i modellen endast i närvaro av immunceller i jämförelse med monokultur system7. Potentiella nackdelar med att använda primära monocyte-derived immunceller är den begränsade tillgängligheten av PBM samt givare-till-givare variation. Som en lösning på dessa potentiella nackdelar, presenteras här är ett protokoll införa kryokonservering av nyligen isolerade PBM28 för cellodlingen modell församlingen. Syftet med denna studie är att visa 3D mänskliga alveolära epitelial vävnad modell församling, inklusive isolering av PBM från mänskliga buffy rockar. Lyhördheten för proinflammatory stimuli jämförs med den modell som består av MDM och MDDC differentierade från färska PBM eller differentierade från frysta/tinade PBM.
Att arbeta med oprövade humana blodprover innebär särskild vård för att förhindra potentiell överföring av infektionssjukdomar, såsom HIV (humant immunbristvirus), hepatit B och hepatit C. Därför är användningen av personliga skyddsåtgärder såsom handskar, kappor, masker, och ögonskydd avgörande och måste vara i enlighet med god laboratoriesed principer. Dessa skydd minskar risken för att utsätta huden eller slemhinnorna för potentiellt smittsamma vätskor. För dem som arbetar med att hantera buffy rockar och PBM är dessutom vaccination mot hepatit B-viruset obligatoriskt, och blod titer nivåer av antikroppar anti-hepatit B måste vara över 100 IU / L (landsspecifika lagstiftningskrav måste åtgärdas). Dessutom måste allt arbete utföras i laboratorier på biosäkerhetsnivå 2 (landsspecifika lagstiftningskrav måste åtgärdas). Standard hälso- och säkerhetsföreskrifter som är förknippade med arbete i laboratoriemiljö och hantering av däggdjurscellodling, inklusive hantering av avfall, bör antas när hela protokollet bedrivs.
Framväxande produktion av nya material, inklusive kemikalier och läkemedel, ökar gradvis behovet av prediktiva in vitro-modeller. För att följa de tre principerna för ersättning, minskning, och förfining av djurförsök32, in vitro-cellmodeller har blivit kraftfulla verktyg när det gäller ersättning och minskning aspekt för att belysa mekanismer av ett läkemedels eller materials åtgärder8,9,10,11. Presenteras här är ett detaljerat protokoll för montering av flercelliga modellen med hjälp av immunceller som antingen är nyligen isolerade eller tinas från tidigare frysta monocyter. Också beskrivit är odlingen av modellera på ALI. Slutligen illustrerar protokollet ett exempel på exponering för proinflammatory stimuli och jämför svaret från de två modellerna som innehåller antingen färska eller frysta monocyter.
Olika studier har utförts för att bekräfta och motivera mervärdet av den förstärkta komplexiteten hos de modeller som odlas och exponeras under ALI-förhållanden jämfört med konventionell nedsänkt exponering7,22,31. Observation av det högre proinflammatory svaret i kokulturer jämfört med monokulturer av epitelceller bekräftar en tidigare studie. Studien använde den presenterade kokulturmodellen (stimulerad med LPS) och visade ett högre svar på genuttrycksnivåer av TNF och IL1B jämfört med A549 monokulturekvivalentmodell 7. Å andra sidan visade båda modellerna högre variationer inom uppmätt proinflammatory mediator release värden jämfört med A549 monokulturer. Detta kan förklaras av användningen av immunceller från olika donatorer (buffy coats) inom biologiska upprepningar (dvs. en upprepning, en donator), som tidigare visats7. Om så önskas, kan variationerna bland replikat övervinnas genom 1) med hjälp av tinade PBM från samma givare eller 2) pooling PBM från olika givare innan frysning av cellerna, sedan efterföljande användning av samma pool i varje upprepning. Inklusive fler biologiska upprepningar rekommenderas också.
Cell-frysningstekniken kan betraktas som ett kritiskt steg; det är dock ett vanligt laboratorieförfarande för att bevara celler för fenotypisk och funktionell analys. Olika studier har visat att kvaliteten på frysta PBM är avgörande för deras överlevnad, och en lämplig frysning teknik är nyckeln till framgång för efterföljande analyser med samma celler28,32. Ändring av protokollet kan utföras genom att frysa PBM: er, vilket ger flexibilitet i den experimentella setup, eftersom tillgången på buffy rockar är oftast begränsad. En annan fördel med att använda frysta PBM(i flera injektionsflaska) framför nyisosolerade sådana är att de kan användas i efterföljande experiment även efter 1 år. Detta minskar den potentiella frågan om givare-till-givare variabilitet om detta är en önskad eller krävs parameter i ett experimentellt.
Utfall av en interlaboratorisk jämförelse som utförts efter upp till 13 månader visar att PBM, när de förvaras på rätt sätt i en tank för flytande kväve, kan användas under en lång period utan någon effekt på cellernas viabilitet eller cellåtervinning33. Längre lagringstider (över 1 år) kan vara möjliga vid noggrann validering av cellernas viabilitet och cellresponsivitet innan du utför ett experiment. Även temperaturen i tanken flytande kväve måste förbli stabil hela tiden. Den viktigaste faktorn som påverkar livskraften hos kryobeserverade PBM:er konstaterades vara DMSO-koncentration, med en optimal koncentration på 10%–20 % (v/v)28. För att minimera potentiellt skadliga effekter av frysning, olika källor av proteiner, FBS eller BSA (med ett brett spektrum av koncentration från 40% upp till 100 %34) ofta läggs till frysmediet som naturliga skyddande komponenter som kan öka cellernas överlevnad.
På grund av den höga cytotoxiska potentialen hos DMSO, rekommenderas det först att sprida PBM i FBS, sedan lägga DMSO till PBM redan spridda i FBS. Noterbart är att även om högre FBS-koncentrationer (>40%) visade inte någon förbättring av cellernas livskraft, samtidigt, de inte orsaka skada på cellerna28. Ändå är frysning monocyter en möjlig strategi för att övervinna frågor av begränsad buffy coat tillgänglighet. Om man däremot önskar användningen av MDDC och MDM från färska PBM-skivor kan immuncellerna differentieras och användas 5–8 dagar efterisoleringen 7,16,17,35,36,37. Om försöksplaneringen tillåter, rekommenderas minst 6 dagars differentiering i både MDDC och MDM: er. Men konsekvens mellan olika upprepningar i samma experiment, tillsammans med rutinmässiga inspektioner av deras specifika ytmarköruttryck, är avgörande. Den lyhördhet för en proinflammatory stimulans, såsom LPS, efter differentieringstiden bör också regelbundet kontrolleras.
Många undersökningar med hjälp av A549 cellinje har utförts vid ALI, antingen som en monokultur eller kombineras med andra celltyper (makrofager, dendritiska celler, eller fibroblaster) i 3D-kokultur modell22,24,29,38. Med hjälp av denna 3D-kokultur modell, cytotoxicitet, oxidativ stress, eller proinflammatory effekterna av (nano-)material har undersökts för upp till 72 h1,17,21,24,29. Modellens likhet med in vivo vävnad har tidigare undersökts utifrån konfokal laserscanning av modellen16. Vid montering av modellen är det viktigt att beakta både cellproliferation (som kan påverka A549 i modellen som presenteras här) samt prestanda för de primära (inte proliferera) immunceller (här, MDDC och MDM: er). Det är också viktigt att tänka på att inte alla CD14 positiva monocyter differentiera till MDDC och MDM, och att cellerna kan finnas i både bifogade och suspenderade former. Baserat på kokulturens typ församling (här, båda celltyperna behöver fästa till det befintliga epitelskiktet), rekommenderas att endast använda de vidhäftande subpopulationerna av båda immuncelltyperna. Dessutom har rutinmässiga analyser av monocyter, MDDC och MDM monokultur lyhördhet för LPS, och uttryck för specifika ytmarkörer (CD14, CD163, CD86, CD93 eller CD206, data som inte visas) har föreslagit att 6 och 7 dagar av differentiering är de optimala tidpunkterna.
Även om ett realistiskt antal alveolära epitelceller i mänskliga lungor motsvarar ~160 000 celler/cm2, är antalet A549-celler som räknas i modellen ~1 000 000 celler/cm2 efter 9 dagar odladepå insatsen 16,18. Således måste denna in vitro-modells begränsningar beaktas. För det första fastställdes tätheten av epitelceller baserat på deras förmåga att bilda ett konfluentskikt på det växande membranet. Det är också viktigt att nämna att A549 representerar en epitelial typ II-cell med en cuboidal form, i motsats till epitelial typ I celler, som är platt och outspread. Å andra sidan fastställdes det erforderliga antalet immunceller baserat på litteraturen och presenterades i detta protokoll som cellnummer/yta39,40,41. Celltätheten hos MDDC:er i intervallet 400 celler/mm2 (4 celler/cm2)16 är jämförbar med den steady-state celldensiteten på 500–750 celler/mm2 (5- 7 celler/cm2) som rapporteras från in vivo-studierna39. Tätheten av MDMs i denna modell är inom samma intervall av in vivo situationen i den mänskliga alveolar regionen40.
Mogna macrophage markör färgning (25F9) observerades både i den apikala sidan (där MDMs är närvarande) samt basala sidan (dvs. på platsen för dendritiska celler). Flyttning av immunceller genom membranet skär porerna är möjligt och har också observerats med hjälp av denna modell16, vilket kan förklara de observerade skillnaderna i färgning intensiteter. En annan möjlig förklaring är dock att den mogna makrofagmarkören också kan uttryckas på dendritiska celler, men uttrycket är mycket givarspecifikt42. Också, intensiteten i 25F9 uttrycket är mycket högre i MDMs (Figur 7, Figur 8). Både proinflalymatiska stimuli (LPS och TNF-α) påverkade lungepitelets integritet i båda kokulturerna (figur 7, figur 8). Detta förväntades baserat på tidigarepublikationer 43,44 visar att proinflammatory cytokiner och bakterieprodukter störa integriteten av epitelbarriärer.
3D-multicellulär modell av den mänskliga alveolära epitel, etablerade och kännetecknastidigare 17, har fungerat som ett kraftfullt och användbart verktyg för att bedöma biologiska svar (dvs, akut proinflammatory reaktioner, oxidativ stressrespons, partikel distribution, och cellulär kommunikation) in vitro21,24,25,45. Resultaten bekräftar responsivness av kokultur modeller till proinflammatory stimuli (här, LPS och TNF-α). Svaret ökade något när man använde immunceller från färska PBM; det dock inte fanns någon statistiskt signifikant skillnad mellan kokulturer med färska vs. tinade PBM. Vidare var de proinflameriska reaktionerna hos båda kokulturmodellerna högre än de för monokulturer av epitelcell som odlades under samma (ALI) förhållanden. Sammanfattningsvis beskriver protokollet monteringen av en 3D mänskliga alveolära epitelial vävnad kokultur modell med antingen färska eller tinade PBM för differentiering till MDM och MDDCs. Det visas att båda modellerna är mycket lyhörda för proinflammatory stimuli; därför kan de fungera som kraftfulla verktyg för potentiella faro- och toxicitetsbedömningar.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Dr Miguel Spuch-Calvar för kokultur systemet i figur 3 och till Dr Bedia Begum Karakocak för kritisk läsning. Denna studie stöddes av PATROLS-projektet, Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 inom ramen för bidragsavtal nr 760813, och av Adolphe Merkle Foundation. B.D. tackar Peter und Traudl Engelhorn stiftelsen för ekonomiskt stöd.
Benchmark microplate reader | does not have to be specific, for example BioRad, Cressier, Switzerland | ||
Cell culture Incubator | does not have to be specific | ||
Cell freezing container (for example Mr. Frosty) | does not have to be specific | ||
Centrifuge | does not have to be specific | ||
Confocal laser scanning microscope | does not have to be specific, for example | Zeiss LSM 710 meta | |
Heamatocytometer, or automatic cell counter | does not have to be specific | ||
Laminar bio-safety hood class II | does not have to be specific | ||
MultiStand Macs (Macs Cell Separator) | Miltenyi, Germany | 130-042-303 | |
pH meter | does not have to be specific | ||
Phase contrast inverted light microscope | does not have to be specific | ||
Pipette boy, pipettors (different volumes) | do not have to be specific | ||
Scissors | do not have to be specific | ||
Vacuum pump | does not have to be specific | ||
Water bath | does not have to be specific | ||
Disposable small equipment/glassware | Catalogue Number | ||
15 mL and 50 mL conical centrifuge tubes | does not have to be specific | ||
6- and 12-well cell culture plates, flat bottom, low evaporation lid, sterile | Falcon, Switzerland | 353046 and 353043 | |
Cell culture inserts, transparent PET membrane, 12-well, 3 μm pore size | Falcon, Switzerland | 353181 | |
Cell scrapper | does not have to be specific, for example VWR, Switzerland | 353085 | |
Cryovials | do not have to be specific | ||
Glass autoclaved Petri Dishes | do not have to be specific | ||
LS Columns | Miltenyi, Germany | 130-042-401 | |
Sterile filtration cup for vacuum filtration, 0.2 μm pore size | does not have to be specific, for example VWR, Switzerland | 10040-446 | |
Sterile Lab Bottle compatible with Filtration cup (min. 100 mL) | does not have to be specific | ||
Sterile pipettes | do not have to be specific | ||
Chemicals | |||
Bovine serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich, Switzerland | A7030-100g | |
CD14+ MicroBeads human – magnetic beads | Miltenyi, Germany | 130-097-052 | |
Deattachnig agent Trypsin-EDTA, 0.05%, phenol red | Gibco, Switzerland | 25300054 | |
Density gradient medium Lymphoprep | Alere Technologies AS, Norway | 1114547 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich, Switzerland | D5879_1L | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Switzerland | E6758-100g | |
Fetal bovine serum (heat inactivated) | Gibco, Switzerland | 10270-106 | |
Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), premium grade | Miltenyi, Germany | 130-093-864 | |
Human Interleukin 4 (IL-4), premium grade | Miltenyi, Germany | 130-095-373 | |
Human macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), premium grade | Miltenyi, Germany | 130-096-485 | |
L-glutamine | Gibco, Switzerland | 25030-024 | |
Lipopolysaccharid (LPS) from Escherichia coli | Sigma-Aldrich, Switzerland | 4524-5mg | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Switzerland | 158127 | |
Penicilin-Streptomycin | Gibco, Switzerland | 31870-025 | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco, Switzerland | 14190-094 | |
Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI) | Gibco, Switzerland | 11875093 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Switzerland | T8787 | |
Trypan blue solution (0.4%) | Sigma Aldrich, Switzerland | ||
Tumor necrosis factor alpha (TNF-α) | Immunotools | 11343015 | |
Assays used for cytotoxicity, (pro-)inflammatory response | |||
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche, Switzerland | 11644793001 | |
Human IL-6 DuoSet ELISA | R&D, Biotechne, Switzerland | DY206 | |
Human IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA | R&D, Biotechne, Switzerland | DY208 | |
Immunostaining | |||
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), concentration 2 μg/mL | Sigma-Aldrich, Switzerland | 28718-90-3 | |
Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugated, concentration 20 μg/mL | Abcam, UK | ab150115 | |
Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L) Dylight 488 conjugated, concentration 10 μg/mL | Agrisera, Sweden | AS09 633 | |
Mature Macrophage Marker Monoclonal Antibody, concentration 50 μg/mL | eBioScience, Thermo Fischer, Switzerland | 14-0115-82 | |
Phalloidin rhodamine, concentration 0.264 µM | Molecular Probes, Life Technologies, Switzerland | R415 | |
Recombinant Anti-CD83 antibody, 1:50 dillution | Abcam, UK | ab244204 |