Summary
Presenteras här är ett protokoll för primära mänskliga blod monocyten isolering samt deras differentiering till makrofager och dendritiska celler och montering med epitelceller i en flercelliga mänskliga lungmodell. Biologiska svar av kokulturer som består av immunceller som är differentierade från antingen nyligen isolerade eller tinade monocyter, vid exponering för proinflammatory stimuli, jämförs.
Abstract
En human alveolära cell coculture modell beskrivs här för simulering av alveolära epitelial vävnad barriären består av alveolära epitelial typ II celler och två typer av immunceller (dvs. humanmonocyte-härledda makrofager [MDM] och dendritiska celler [MDDCs]). Ett protokoll för montering av flercelliga modellen tillhandahålls. Alveolar epitelceller (A549 cellinje) odlas och differentieras under nedsänkta förhållanden på genomsläppliga skär i två-kammare brunnar, sedan kombineras med differentierade MDM och MDDCs. Slutligen utsätts cellerna för ett luft-flytande gränssnitt i flera dagar. Eftersom människans primära immunceller måste isoleras från mänskliga buffy rockar, immunceller differentierade från antingen färska eller tinade monocyter jämförs för att skräddarsy metoden baserat på experimentella behov. De tredimensionella modellerna, som består av alveolära celler med antingen nyisolerade eller tinade monocyter härledda immunceller, visar en statistiskt signifikant ökning av cytokin (interleukins 6 och 8) frisättning vid exponering för proinflammatory stimuli (lipopolysackarid och tumörnekrosfaktor α) jämfört med obehandlade celler. Å andra sidan finns det ingen statistiskt signifikant skillnad mellan cytokinfrisättningen som observerats i kokulturerna. Detta visar att den presenterade modellen är lyhörd för proinflammatory stimuli i närvaro av MDM och MDDC differentierade från färska eller tinade perifert blod monocyter (PBM). Således är det ett kraftfullt verktyg för undersökningar av akut biologiskt svar på olika ämnen, inklusive aerosoliserade läkemedel eller nanomaterial.
Introduction
In vitro-lungcellkulturer erbjuder kostnadseffektiva, robusta och välkontrollerade plattformar för att bedöma riskerna med aerosoler1. Som en modell cell system för mänskliga alveolar pneumocyter, epitelial A549 celllinjen isolerade från en pulmonell adenokarcinom används ofta2. Dessa celler representerar skivepitelceller typ II från alveolarregionen3 och är en allmänt använd lungcellslinje för faro- och toxicitetsbedömning1,4,5,6,7,8,9,10. A549-cellen har relevanta drag av alveolära epiteltyp II-celler, såsom förekomsten av karakteristiska lamellära kroppar som innehåller tätt packade fosfolipider3.
Det har visat sig att när cellerna odlas vid ett luft-flytande gränssnitt (ALI), är ytaktiva frigörs på den apikala sidan av luftexponerade epitelceller, vilket minskarytspänningen 11,12,13. Denna funktion är särskilt viktig i nanomaterial respiratorisk fara och toxicitet undersökningar. När inandas nanomaterial/toxgifter deponeras i regionen alveolar, interagerar de först med pulmonell tensid och förskjuts genom vätningskrafter in i den vattenhaltiga hypofasen, där interaktionen med lungceller sker14,15. Även om A549 celler bildar en monolayer (som kan överväxa i flerskikt vid senare tidpunkter när odlas på ALI) och producera ytaktiva, är en nackdel deras otillräckliga snäva korsningen bildning, vilket resulterar i låga transepithelial elektriska motstånd värden, men fortfarande presenterar en funktionell barriär mot intercellular (nano)partiklar flyttning16,17,18.
I lungorna finns en mängd immuncellpopulationer, inklusive fagocytiska och professionella antigenpresenterande celler (dvs. makrofager och dendritiska celler) som direkt kommunicerar genom cell-cellkontakt eller intercellulär signalering för att kontrollera och bibehålla homeostas. Makrofager och dendritiska celler är kritiska medfödda immuneffektorer och initiatorer av det adaptiva immunsvaret19. Dendritiska celler som bor inom eller under epitelet kan bilda utsprång över epitelet till lumen för att fånga antigener. Alveolar makrofager ligger på den apikala ytan av epitelet och fungerar som sentinel celler, som representerar den första cellulära försvar mot främmande material samt bakteriella, virala och svampinfektioner. Deras fenotypiska plasticitet möjliggör snabbt induktion av proinflammatory reaktioner som svar på sådana stimuli samt skiftande i utlösande antiinflammatoriska (dvs, hämmande) reaktioner20.
För att simulera den mänskliga alveolära epitelvävnadsbarriären, etablerade vi en trippel coculture modell med A549 celler kompletteras med humant blod monocyte-derived makrofager (MDM) och dendritiska celler (MDDC) på de apikala och basala sidorna, respektive17. Odling av denna modell vid ALI har tidigare rapporterats16, även upp till 72 h efter exponering21. Akut immunsvar mot kolnanorörexponeringar förbättrades signifikant i cellodling som exponerades för ALI jämfört med under vatten22. Den kokultur modell, odlade och exponeras för olika material på ALI, har tidigare använts för att undersöka cytotoxicitet, oxidativ stress och inflammatoriska svar vid exponeringar för zinkoxid,23 grafen-relaterade material24, guld nanopartiklar25,26, kol nanorör21, och vulkanisk aska och diesel avgaserpartiklar 27.
Vidare har den viktiga rollen av makrofager och dendritiska celler som immun effector celler i en in vitro mänskliga lungmodell bekräftats. I synnerhet observerades ett ökat proinflammatory svar i modellen endast i närvaro av immunceller i jämförelse med monokultur system7. Potentiella nackdelar med att använda primära monocyte-derived immunceller är den begränsade tillgängligheten av PBM samt givare-till-givare variation. Som en lösning på dessa potentiella nackdelar, presenteras här är ett protokoll införa kryokonservering av nyligen isolerade PBM28 för cellodlingen modell församlingen. Syftet med denna studie är att visa 3D mänskliga alveolära epitelial vävnad modell församling, inklusive isolering av PBM från mänskliga buffy rockar. Lyhördheten för proinflammatory stimuli jämförs med den modell som består av MDM och MDDC differentierade från färska PBM eller differentierade från frysta/tinade PBM.
Att arbeta med oprövade humana blodprover innebär särskild vård för att förhindra potentiell överföring av infektionssjukdomar, såsom HIV (humant immunbristvirus), hepatit B och hepatit C. Därför är användningen av personliga skyddsåtgärder såsom handskar, kappor, masker, och ögonskydd avgörande och måste vara i enlighet med god laboratoriesed principer. Dessa skydd minskar risken för att utsätta huden eller slemhinnorna för potentiellt smittsamma vätskor. För dem som arbetar med att hantera buffy rockar och PBM är dessutom vaccination mot hepatit B-viruset obligatoriskt, och blod titer nivåer av antikroppar anti-hepatit B måste vara över 100 IU / L (landsspecifika lagstiftningskrav måste åtgärdas). Dessutom måste allt arbete utföras i laboratorier på biosäkerhetsnivå 2 (landsspecifika lagstiftningskrav måste åtgärdas). Standard hälso- och säkerhetsföreskrifter som är förknippade med arbete i laboratoriemiljö och hantering av däggdjurscellodling, inklusive hantering av avfall, bör antas när hela protokollet bedrivs.
Protocol
Arbetet som inbegriper primära monocyter som isolerades från människablod, var godkänt av kommittén av det federala kontoret för allmän hälsa Schweitz (hänvisa till numrerar: 611-1, Meldung A110635/2) för Adolpheen Merkle institut.
1. Isolering av perifert blodmonocyter (PBM) från humana buffy rockar
OBS: Följande avsnitt beskriver isolering av immunceller från en 50 mL påse med en buffy coat, köpt från schweiziska transfusionscentret i Bern, Schweiz.
- Beredning av reagenser
- Förbered 100 mL av magnetisk separationsbuffert per buffy coat: 0,5% [w/v] bovint serumalbumin (BSA; i fosfatbuffrad saltlösning [PBS]) med 2 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA), och justera till pH = 7,2, sterilt filter med 0,22 μm porstorlek). Håll vid 4 °C under hela proceduren.
- Förbered cellodlingsmediet (CCM): RPMI 1640 med 10% [v/v] fetalt bovint serum (FBS), 1% [v/v] L-glutamin (här, 2 mM L-glutamin), och 1% [v/v] penicillin-streptomycin (här, 100 enheter/mL penicillin och 100 μg/mL streptomycin).
OBS: Den erforderliga mängden av varje reagens beror på antalet celler som ska seedas i följande steg.
- Isolering av PBM
OBS: Allt glas och plastgods behöver steriliseras före användning. Av säkerhetsskäl rekommenderas användning av plastvaror vid hantering av blodprov från människa för att minska risken för skador med glas.- Använd sax för att skära upp slangänden på påsen som innehåller buffy coat.
- Fördela buffy pälsen genom att hälla påsens innehåll genom påsens kanal direkt i två koniska centrifug 50 mL rör (~ 25 mL vardera).
- Häll försiktigt eller pipettera PBS i rören för att nå 50 mL-volymer. Blanda innehållet genom att vrida röret försiktigt upp och ner 3x.
- Dela upp buffy coat-PBS-blandningen i fyra nya koniska centrifugeringrör på 50 mL genom pipettering av 25 mL av blandningen i varje färskt rör.
- Låg långsamt 13 mL av densitet gradient medium under buffy coat-PBS blandningen med hjälp av en 10 mL serologiska pipett. Lossa den fyllda pipetten från pipetthållaren och anslut omedelbart den övre öppningen av pipetten med en tumme för att förhindra att densitetsgradientmediet läcker ut ytterligare i buffy coat-PBS-blandningen.
OBS: Håll den övre öppningen med tummen, placera den fyllda pipetten längst ner på det koniska centrifugröret så att densitetsgradientmediet långsamt flyter under buffy coat-PBS-blandningen, och lämna ca 1 mL av densitetsgradientmediet inuti pipetten. - Upprepa steg 1.2.5 med de tre andra rören som innehåller buffy coat-PBS-blandningen.
- Centrifugera alla fyra rören som innehåller blandningarna i 20 min vid 1 000 x g och 25 °C vid ett långsamt bromsläge. Använd hållare med skyddslock för centrifugering.
- Öppna locket på varje rör, avlägsna det övre skiktet som innehåller plasma och trombocyter med hjälp av en serologisk pipett, och kassera i en behållare för biologiskt riskat flytande avfall.
- Använd en serologisk pipet för att samla det mononukleära celllagret för perifert blod, som framträder som en vitaktig grumlig liten fraktion (~2–3 mm i tjocklek) mellan plasman och densitetsgradientmedietskikten. Pelleten innehåller röda blodkroppar i botten. Undvik att överföra erytrocyter som utgör botten-mest lager. Upprepa detta för alla fyra rören.
OBS: Mononukleära celler med perifert blod består av PBM och lymfocyter. PBM kommer att separeras från lymfocyter senare under magnetiska CD14 + separation. - Pool perifert blod mononukleära celler från fyra rör i två 50 mL rör.
- Fyll upp de två rören med PBS till 50 mL och täck med lock.
- Kassera de överblivna erytrocyterna och plasman från de ursprungliga fyra rören i en behållare för flytande avfall av biologiskt risk.
- Centrifugera de två rören i 8 min vid 500 x g och 18–20 °C vid en vanlig centrifughastighet.
- Efter centrifugeringen, avlägsna supernatanten med en serologisk pipett och kassera den i en behållare för biohazard flytande avfall.
- Resuspend cellerna med 5 mL PBS med hjälp av en serologisk pipett.
- Poola cellupphängena i ett 50 mL koniskt centrifugrör och fyll till 50 mL med PBS.
- Använd 5 μL av cellupphängningen för att räkna cellerna med en cellräknare med hjälp av utslagningsmetoden trypanblå (45 μL).
- Pipett 10 μL av trypan blå-PBM-lösningen i en cellräknare och räkna antalet celler per standardräkningsprotokollet. Använd ekvation 1 för att beräkna det totala cellnumret, CT.
- Efter att ha räknat cellerna centrifuger 50 mL-röret som gjort i steg 1.2.13.
- CD14-positivt urval
- Öppna försiktigt locket på varje rör, ta sedan bort och kassera supernatanten med hjälp av en serologisk pipett utan att störa pelleten.
- Tillsätt den beräknade mängden (Ekvation 2) av magnetisk separationsbuffert (här, 80 μL buffert per 1 x 107 totala celler) och återanvänd cellpelletsen genom pipettering av lösningen uppåt och nedåt.
- Beräkna med hjälp av Ekvation 3 (här, 10 μL per 1 x 107 totala celler) motsvarande volym av CD14 + magnetiska pärlor och pipettera lämplig volym.
- Blanda väl genom pipettering upp och ner, stäng locket, och inkubera lösningen vid 4 °C i 15 min.
- Vid inkubation fyller du röret upp till 50 mL med magnetisk separationsbuffert.
- Centrifugera som gjort i steg 1.2.13.
- Aspirera och kassera supernatanten med hjälp av en serologisk pipett utan att störa cellpelletsen.
- Pipettera motsvarande mängd magnetisk separationsbuffert (Ekvation 4; här, 500 μL buffert per 1 x 108 celler) och blanda försiktigt genom pipettering uppåt och nedåt 3x.
- Desinficera den magnetiska separationsstationen genom att spruta och torka av den med ett steriliserande medel. Placera i laminär flödeshuven tillsammans med kolonnen för magnetisk separation.
- Placera den magnetiska separationskolumnen i magnetfältet och placera ett tomt 50 mL koniskt centrifugrör direkt under kolonnen för uppsamling av tvätten och omärkta celler (dvs. avfall).
- Skölj den magnetiska separationskolumnen genom att pipettera 3 mL av magnetisk separationsbuffert i kolonnen. Låt inte kolonnen torka ut under hela proceduren.
- Förbered ett 15 mL koniskt centrifugrör och pipettering 1 mL av magnetisk separationsbuffert.
- Applicera cellupphängningen (förberedd i steg 1.3.8) på den magnetiska separationskolumnen. I 50 mL koniska centrifugröret under filtret, samla omärkta celler som passerade igenom.
OBS: Överskrid inte 2 x 109 celler per kolumn för att undvika blockering av kolonnen. - Så snart kolonnbehållaren är tom (dvs. när cellerna har passerat genom kolonnen), applicera 3 mL magnetisk separationsbuffert med hjälp av en serologisk pipett och låt den passera genom kolonnen. Upprepa detta 3x.
- Avlägsna den magnetiska separationskolumnen från den magnetiska avskiljaren genom att försiktigt dra med händerna, placera den sedan i ett 15 mL-rör som innehåller förpietad 1 mL magnetisk separationsbuffert (förberett i steg 1.3.12).
- Tillsätt 5 mL av magnetisk separationsbuffert till kolonnen och spola ut de magnetiskt märkta cellerna genom att trycka in kolven ordentligt i kolonnen.
- Reagensberedning för MDM- och MDDC-differentiering
- Räkna cellerna med en cellräknare med metoden för trypan blå uteslutning som gjort i steg 1.2.17.
- Beräkna de nödvändiga volymerna av CCM eller FBS för ytterligare steg enligt följande: antingen volymen av CCM som motsvarar en celltäthet på 1 x 106 celler/mL (steg 1.5.1), eller volymen av FBS som motsvarar en celltäthet på 6 x 106 celler per 0,9 mL FBS (steg 1.6.3).
- Stäng locket, placera röret i centrifugen, och centrifug som gjort i steg 1.2.13. Ta bort och kassera supernatanten utan att störa cellpelletsen. Gå vidare till steg 1,5 för cellsådd eller steg 1,6 för cellfrysning.
- PBM-sådd och differentiering till MDM och MDDC
- Resuspend cell pelleten i den beräknade volymen av CCM som beräknats i steg 1.4.2 (här, en slutlig koncentration av 1 x 106 celler/mL) genom pipettering upp och ner 3x.
- Pipettera antalet celler som är avsedda att differentiera till MDM och MDDCs i separata koniska centrifugrör med hjälp av en serologisk pipett.
- Pipette differentiera dela upp till CCMEN med PBMs och blandning väl, genom att pipettera upp och besegrar. Differentierande faktorer tillämpas på följande sätt:
- För MDDC: slutlig koncentration av 10 ng/mL interleukin-4 (IL-4) och 10 ng/mL granulocyte-makrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF).
- För MDM: slutlig koncentration av 10 ng/mL makrofagkolonistimulerande faktor (M-CSF).
- Pipettera cellupphängningar i CCM med de tillagda differentierande faktorerna i 6 brunnsplattor genom att fördela 3 mL av suspensionen per brunn (motsvarar 3 x 106 celler/brunn, dvs., 1 x 106 celler/mL).
- Placera de 6 brunnsplattorna i en inkubator för cellodling (37 °C, 5% CO2) och låt dem skilja i 6 dagar utan att uppfräsa CCM.
OBS: Differentiering varierar från 5–8 dagar beroende på den lokala tillgängligheten av buffy rockar och experimentella setup, förutsatt att differentieringseffektiviteten bestäms med hjälp av lämpliga tekniker (se diskussionsavsnittet).
- PBM frysning
- Resuspend cell pelleten i ett cryoprotective medium (här, FBS och dimetylsulfoxid [DMSO; cytotoxisk]) vid ett förhållande av 9:1 (v/v) genom pipettering en volym av förvärmda FBS. Detta motsvarar en slutlig cellkoncentration på 6 x 106 celler/mL, med tanke på ytterligare ett tillägg på 10% DMSO (v/v).
- Markera önskat antal kryoceller i laminär flödeshuven (dvs. registrera datum, isoleringskod och antal celler).
- Pipett 0,9 mL cell suspension i ren FBS (här, 6 x 106 celler i 0,9 mL av FBS) till varje cryovial. Därefter långsamt pipettera 0,1 mL DMSO och blanda suspensionen väl genom att vrida cryovials upp och ner 3x.
- Överför kryoialerna till en cell-frysning behållare och omedelbart ställa in den på -80 °C i 24 h.
- Efter 24 h, ta bort kryocellerna från frysen och behållaren -80 °C och placera dem i den flytande kvävetank som är lämplig för celllagring.
- PBM upptining och differentiering till MDM och MDDCs
- Värm alla de reagenser som krävs till 37 °C i ett vattenbad (~20–30 min).
- Förbered lämpligt antal 6 brunnsplattor som motsvarar antalet tinade celler (här, en platta per 1,8 x 107 celler, dvs 3 kryokroppar). Pipett 2 mL CCM till varje brunn under aseptiska förhållanden. Placera plattor i inkubatorn (5 % CO2, 37 °C) i 15 min för att låta pH-värdet ekvilo.
- Ta den erforderliga mängden kryoceller med frusna celler från en flytande kvävetank och snurra dem försiktigt i ett vattenbad på 37 °C (1–2 min) för att säkerställa jämn upptining av cellupphängningen.
- Ta bort kryoialen från vattenbadet och dekontaminera med ett steriliseringsmedel, vilket säkerställer att medlet inte interagerar med locket och O-ringen.
OBS: Härom, alla steg måste slutföras under aseptiska förhållanden. - Förbered lämpligt antal av 15 mL koniska centrifugrör som motsvarar antalet kryoceller som ska tinas (här, 6 x 106 celler/rör). Pipett 9 mL förvärmd CCM i varje rör.
- Pipett långsamt (droppe-för-droppe) innehållet i kryoialen i ett rör som innehåller CCM. Stäng locket, upprepa för varje rör, och centrifug vid 200 x g i 5 min vid en vanlig centrifughastighet.
- Kassera supernatanten utan att störa pelleten.
- Resuspend pelleten från varje rör (som innehåller celler från en cryovial) i 2 mL av förkrigade CCM genom pipettering upp och ner med hjälp av en serologisk pipett (celldensitet motsvarande 3 x 106 celler/mL).
- Från varje rör, pipettera de återanvända cellerna i två brunnar (1 mL per brunn) av en 6 brunnsplatta som innehåller 2 mL av tidigare beredd CCM för att nå en celltäthet på 3 x 106 celler/brunn (motsvarande en slutlig koncentration på 1 x 106 celler/mL). Upprepa detta för alla andra rör.
- Fortsätt med differentiering enligt beskrivningen i avsnitt 1.5.3.
- Placera de 6 brunnsplattorna i en inkubator för cellodling (37 °C, 5% CO2) och låt dem skilja i 6 dagar utan att uppfräsa CCM.
2. Trippel cell kokultur modell av mänskliga alveolära epitelvävnad
OBS: I detta avsnitt ges anvisningar om volymer och cellnummer som motsvarar 12 brunnsplåtsinsatser. Bild 1 sammanfattar en föreslagen tidslinje för modellmontering.
- Sådd för epitelcell (A549 cellinje)
- Odla epitelcellerna enligt de rekommendationer som leverantören (ATTC) tillhandahåller. Kortfattat, subkultur cellerna i CCM vid 80% cellkonfluensi (ungefär, 2x–3x per vecka).
OBS: Subkultur A549 för minst fyra passager före kokulturmodellsammansättningen, med hjälp av A549-celler i ett passageområde på 5–25. - Pipett 1,5 mL förvärmd CCM till 12 brunnsplattor (antalet brunnar motsvarar önskat antal modeller).
- Placera enskilda 12 väl cellodling skär i brunnar av en 12 väl platta med steriliserad pincett.
- Lossa cellerna från en kolv enligt subcultivationprotokollet (dvs. med hjälp av ett avstickande medel, avlägsna medlet genom centrifuger som görs i steg 1.2.13). Resuspend i lämplig volym av CCM motsvarande den slutliga cellkoncentrationen av A549 (här, 50 x 104 celler/mL; 0,5 mL cell suspension per insats, dvs 25 x 104 celler/skär, vilket motsvarar sådddensitet på 27,8 x 104 celler/cm2).
- Pipett 0,5 mL av cellupphängningen (dvs. 25 x 104 celler/insats) i den apikala sidan av skäret med hjälp av en 1 mL-pipett.
- Täck plattorna med lock och placera dem i en inkubator för cellodling (37 °C, 5 % CO2) i 4 dagar.
OBS: Kontrollera regelbundet sammanflödet av A549-celler under ett faskontrastmikroskop.
- Odla epitelcellerna enligt de rekommendationer som leverantören (ATTC) tillhandahåller. Kortfattat, subkultur cellerna i CCM vid 80% cellkonfluensi (ungefär, 2x–3x per vecka).
- MDDC-sådd
- Aspirera CCM med obundna celler i de 6 brunnsplattor som innehåller MDDC.
- Tillsätt 1 mL färsk förkrigsförvarad CCM till varje brunn.
- Använd en cellskrapa, lossa (skrapa) vidhäftande MDDC:er från varje brunn, tvätta försiktigt brunnarna med de befintliga 1 mL CCM 3x, och kombinera dem till ett koniskt centrifugrör.
- Räkna cellerna med en cellräknare med metoden trypan blue exclusion med hjälp av 10 μL cell suspension och 10 μL trypan blå lösning.
- Centrifugera cellupphängningen som gjort i steg 1.2.13.
- Beräkna CCM-volymen som krävs för återfpension (ekvation 5):
Nödvändig MDDC-densitet = 42 x 104 celler/mL; varje skär kräver 6,3 x 104 celler, vilket motsvarar en sådd celltäthet på 7 x 104 cell/cm2 (här, 150 μL som tillsätts på 0,9 cm2 i steg 2.2.10.).
CCM-volym för cellresuspension (Vm; Ekvation 5):
- Aspirera försiktigt och kassera CCM från den övre kammaren av 12 brunnsplattor med växande A549 på skären.
- Placera inläggen med A549-celler i upp och nedvänd position i en steril petriskål med steriliserad pincett. Förbered ett koniskt centrifugrör (50 mL) med PBS och förfukta en cellskrapa.
- Skrapa bort A549-celler från skärets basala yta (dvs. den övre delen vid upp och neråt läge), som ska växa genom skärens porer.
OBS: Skölj skrapan med PBS (beredd i ett rör) mellan skrapa enskilda prover och hålla den våt under hela förfarandet. - Vid centrifugering (steg 2.2.5), aspirera och kassera supernatanten, återispers sedan MDDC-pelleten i den beräknade mängden CCM (steg 2.2.6) och pipett uppåt och nedåt 3x.
- Pipett 150 μL av cellupphängningen ovanpå varje skär så att hela insatsens basala yta är lika täckt med vätskan och inte innehåller bubblor.
- Täck skålen med lock och lägg i en cellkulturinkubator i 70 min. Aspirera CCM från cellodlingsplattorna (där skären ursprungligen har placerats), kassera den i ett biohazard flytande avfall, och pipettera 1,5 mL färsk CCM i varje brunn. Täck plattan med lock och lägg i cellinkubatorn (37 °C, 5% CO2).
OBS: Överskrid inte den tidsperiod som nämns ovan för att undvika att cellerna torkas ut. - Efter inkubationen håller du noggrant varje insats med steriliserad pincett och placerar dem till plattorna som innehåller CCM i en vanlig position. Täck plattan med lock och återför den till cellinkubatorn (37°C, 5% CO2).
- Utsäde av makrofag (MDM)
- Ta 6 brunnsplattor som innehåller predifferentierade MDMs. Placera dem från cellinkubatorn till en laminär flödeshuva.
- Aspirera och kassera CCM med obundna MDMs odlas i 6 brunnsplattor, och pipett 1 mL färsk förvärmd CCM i varje brunn.
- Med hjälp av en cellskrapa avlägsnar du försiktigt vidhäftande MDM:er från enskilda brunnar (vilket görs i steg 2.2.3 för MDDC:erna).
- Pipett 10 μL trypan blå i en brunn eller ett rör och tillsätt 10 μL av MDM-suspensionen för att uppnå den slutliga utspädningen på 1:1 (v/v). Räkna antalet MDM:er med hjälp av lämpligt inventeringsprotokoll.
- Centrifugera cellupphängningen som gjort i steg 1.2.13.
- Beräkna den volym som krävs (ekvation 6):
Krävs MDM densitet = 2,5 x 104 celler/ mL i CCM (här kräver varje skär 1,25 x 104 celler i 0,5 mL CCM, vilket motsvarar en sådd celldensitet på 1,4 x 104 cell/cm2).
(6) - Vid centrifugering, aspirera och kassera supernatanten, återispersera MDM-pelleten i den beräknade mängden CCM (steg 2.3.6), och pipetten uppåt och nedåt 3x.
- Försiktigt pipettera 0,5 mL av MDM-fjädringen (förberedd i steg 2.3.7) på väggen i cellodlingsinsatserna med A549 och MDDC (inte direkt på epitelceller) med hjälp av en 1 mL-pipett. Täckplattor med lock och lägg i en inkubator för cellodling (37 °C, 5 % CO2) i 24 h.
- Överföring av kokulturmodell till luft-flytande gränssnitt (ALI)
- Vid slutet av den monterade modellens 24 h (±2 h) inkubationstid i en inkubator för cellodlingar aspirera och kassera CCM från både apikala och basala delar av cellodlingsinsatser och från brunnarna.
- Med hjälp av steriliserade pincett, lyft enskilda skär från brunnarna och pipetten 0,6 mL färsk förvärmd CCM till varje brunn med hjälp av en 1 mL-pipett. Lägg inte till CCM på den apikala sidan av skäret.
- Täckplattor med lock och lägg i en inkubator för cellodling (37 °C, 5 % CO2) för 24 h föregående vidare användning.
(6)3. Exponering för utvalda positiva kontroller (kända stimuli för att inducera proinflammatory svar)
OBS: Exponering av de kokultur modeller till en känd proinflammatory stimulus endotoxin lipopolysackarid (LPS)7 och proinflammatory cytokin tumör nekros faktor α (TNF-α)7 används för att illustrera lyhördhet för modellen. Vidare används exponering för ett tvättmedel (Triton X-100) för att bekräfta känsligheten hos en laktatdehydrogenas (LDH) analys.
- Förbered de positiva kontrolllösningarna: LPS-lager (1 mg/mL i destillerat vatten), TNF-α-bestånd (100 μg/mL i destillerat vatten) och Triton-X 100 (2% [v/v] i PBS).
- Vid 24 h inkubation av kokultur modellen vid ALI villkor, aspirera och kassera supernatanten från basalfacket. Med hjälp av steriliserad pincett, lyft enskilda skär från brunnarna och pipetten 0,6 mL färsk förvärmd CCM i varje brunn.
- Förbered individuella positiva kontroller arbetslösningar genom att späda ut lagren i CCM i koniska centrifugrör enligt följande: 1 μg/mL LPS, 1 μg/mL TNF-α, och 0,2% Triton-X 100. Volymerna motsvarar antalet testade skär (här, 100 μL/skär). Blanda lösningarna väl genom att pipettera upp och ner 3x.
- Applicera 100 μL av varje positiv kontrolllösning genom att långsamt pipettera på cellodlingsinsatsens vägg. Täck brunnsplattan med lock och lägg i cellodlingsinkubatorn (37 °C, 5 % CO2) i 24 h. Vid inkubation, aspirera och kassera vätskan vid den apikala sidan av insatsen genom att hålla enskilda skär med hjälp av pincett.
- Samla CCM i basalfacken och förvara vid 1) 4 °C för ytterligare LDH-analys, betecknande cellmembranbristningsmedierad cytotoxicitet och/eller 2) lagra vid -80 °C för vidare analys av proteinfrisättning via enzymlänkad immunsorbentanalys (ELISA). Kör analyserna enligt rekommendationerna för satsens leverantör.
- Vid avlägsnandet av CCM, tvätta skären med PBS 3x och fixera cellerna på cellodlingsinsatser i 4% [w/v] paraformaldehyd (i PBS, 15 min vid rumstemperatur) genom att säkerställa att båda skärsidorna är väl täckta med PFA-lösning. Därefter tvätta 3x med PBS för att ta bort PFA. Förvara proverna nedsänkta i PBS vid 4 °C för ytterligare immunfärgning (ett exempel på denna metod har beskrivits tidigare17).
Representative Results
Humana lungkokultur modeller, som består av alveolära epitelceller och immunceller, var ihop antingen från färska eller frysta MDDC och MDMs progenitors (här, mänskliga perifert blod-härledda monocyter). Som presenteras i figur 1, A549 celler var seedade 3 dagar efter det första avsnittet omfattar monocyt isolering/upptining. Efter 6 dagar av differentiering, verkade de differentierade MDMs runda-formad, medan MDC bildade en mer långsträckt form med observerbara utsprång. De framträdde också som agglomerat, särskilt när differentierade från färska monocyter (Figur 2, Figur 3). Epitelceller bildade ett tätt celllager av celler efter 3 dagars tillväxt på membraninsatser (Figur 4), när kokulturerna monterades ihop. Efter 24 h av montering och ytterligare 24 h av att utsättas för ALI villkor, var de cocultures förberedda för exponeringar.
Lyhördhet för 3D-cellodlingsmodellerna undersöktes vid exponering för kända proinflammatory stimuli med hjälp av en pseudo-ALI-metod, som beskrivitstidigare 29. De proinflammatory stimuli, LPS och TNF-α, tillsattes i låga volymer (100 μL) på den apikala ytan av den luftexponerade cellmodellen. Parallellt bedömdes frånvaron av membranbristning som ett mått på cytotoxicitet via LDH-analysen. En signifikant ökning av LDH-frisättning i CCM av basalfacket observerades vid exponering för den positiva kontrollen för membranbristning, ett tvättmedel Triton-X 100 (Bild 5). Dessa resultat visade lyhördhet av modellen till en cytotoxisk substans, medan ingen ökning av LDH frisättning observerades vid apikala stimulering med TNF-α eller LPS.
En möjlig orsak till de olika uppmätta värdena för LDH i de prover som monterats med antingen färska eller tidigare frysta PBM-skivor kan hänföras till provlagringen. Prover från färska pbm förvarades under en längre tid vid -80 °C, därför kan aktiviteten hos LDH-enzym sjunka. Noterbart är LDH stabilt i endast upp till 4 dagar i CCM; således rekommenderas att utföra analysen den senaste 2 dagar efter insamling av supernatanterna. Alternativt är det möjligt att frysa ner supernatanterna direkt efter kollektionen. Det är dock viktigt att tänka på att frysning kan minska den enzymatiska aktiviteten hos LDH.
Utsöndring av proinflammatory medlare (här, TNF-α och interleukins 6 [IL-6] och 8 [IL-8]) in i den basala CCMen kvantifierades via ELISA. Statistiskt signifikanta (p < 0,05, enkelriktade ANOVA) ökningar i utsättningen av IL-6 och IL-8 observerades i både LPS- och TNF- α- behandlade prover jämfört med respektive obehandlade celler, samt i de cellodlingsmodeller som samlats från antingen PBM-källa (figur 6). Även om koncentrationerna (pg/mL) av alla testade cytokiner i den basala CCM var högre i de kokulturer som består av färska PBM, var inte skillnaderna mellan de två kokulturerna och monokulturerna statistiskt signifikanta (p > 0,05) (figur 6). För att bekräfta mervärdet av kokultur modeller med avseende på en 2D epitelial cell kultur, A549 monokulturer var också utsatta för LPS eller TNF-α. Som väntat var frisläppandet av alla undersökta medlare från A549 monokulturer lägre jämfört med båda coculture modeller; även om skillnaden mellan dem inte var statistiskt signifikant (p > 0,05, enkelriktad ANOVA).
Cellulära morfologi av 3D mänskliga alveolära epitelial vävnad barriär bedömdes via confocal laser scanning microscopy (LSM). För att visualisera sammansättningen av varje modell, var makrofager inom de coculture modeller (MDMs) färgas med mogna makrofag markör 25F9. MDC var färgas med CD83, som är en viktig markör för aktiverade dendritiska celler30. När det gäller cellulär morfologi observerades ingen skillnad mellan de coculture modeller med MDMs och MDDCs från färska PBM jämfört med dem som använder tinade PBM. I LPS- och TNF-α-exponerade kokulturer, båda sammansatta av färska och frysta immunceller, observerades ett stört epitelskikt i LSM-bilder, vilket inte var fallet i obehandlade celler (Figur 7, Figur 8).
Bild 1: Schematisk tidslinje för protokollet. Presentation av 3D-modellmodellen förberedelse, montering, och tillämpning (exponering för ett testat ämne). ALI = luft-flytande gränssnitt, MDDCs = monocyte-härledda dendritiska celler, MDMs = monocyte-derived makrofager, PBM = perifert blod monocyter. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: MDM och MDDCs differentierade från färska PBM. Faskontrastmikroskopibild av differentierade (A) MDM och (B) MDDCs från färska PBM(6 dagar efter cellisolering). MDMs är rundformade, medan MDDC ofta observeras som agglomerat. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: MDM och MDDCs differentierade från frysta PBM.S. Faskontrastmikroskopibild av differentierade (A) MDM och (B) MDDCs från tinade PBM(6 dagar efter upptining). MDMs är rundformade, men vissa avlånga celler kan observeras. MDC visas också rundformade med utsprång. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Epitelceller tillväxt på membraninsatser. Faskontrast mikroskopi bild av konfluent A549 växer på ett membran infoga 4 dagar efter seedning, bildar ett tätt lager av celler. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Cytotoxicitetsresultat som undersökts via membranbristningsbaserad (LDH) analys. Uppgifterna presenteras som en vikökning över obehandlade celler (medelvärde ± SD, n = 3, asterisk betecknar statistiskt signifikant ökning jämfört med obehandlade celler, **p < 0,01, ****p < 0,0001). I gröna modeller MDMs och MDDCs från färska PBM representeras, och i lila modeller som monteras från tinade PBM representeras. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 6: Proinflalyma reaktioner i kokulturerna och monokulturerna. De proinflameratoriska medlarna (TNF-α, IL-6 och IL-8) release i coculturesna på 24 h utmaning med LPS eller TNF-α. Uppgifterna presenteras som relativa till obehandlade celler (medelvärde ± SD, n = 3, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001). I gröna modeller MDMs och MDDCs från färska PBM representeras, och i lila modeller som monteras från tinade PBM representeras. Grå färg föreställer A549 monocultures. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 7: Morfologi av kokulturer som består av färska immunceller. LSM bilder av apikala och basala sidor av den coculture modellen med xz prognoser av apikala sidor av modellen med MDMs och MDDCs från färska PBM. Cyan representerar atomkärnor (DAPI), magenta representerar cytoskelett (rhodamine-phalloidin), vit representerar MDM (25F9), och grönt representerar MDDCs (CD 83). Den vita pilen betecknar MDM, medan den gröna pilen betecknar MDDC. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 8: Morfologi av kokulturer som består av frysta immunceller. LSM bilder av den apikala sidan av den coculture modellen med motsvarande xz prognoser, och basala sidan av modellen med MDMs och MDDCs från tinade PBM. Cyan representerar atomkärnor (DAPI), magenta representerar cytoskelett (rhodamine-phalloidin), vit representerar MDM (25F9), och grönt representerar MDDCs (CD 83). Den vita pilen betecknar MDM, medan den gröna pilen betecknar MDDC. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Discussion
Framväxande produktion av nya material, inklusive kemikalier och läkemedel, ökar gradvis behovet av prediktiva in vitro-modeller. För att följa de tre principerna för ersättning, minskning, och förfining av djurförsök32, in vitro-cellmodeller har blivit kraftfulla verktyg när det gäller ersättning och minskning aspekt för att belysa mekanismer av ett läkemedels eller materials åtgärder8,9,10,11. Presenteras här är ett detaljerat protokoll för montering av flercelliga modellen med hjälp av immunceller som antingen är nyligen isolerade eller tinas från tidigare frysta monocyter. Också beskrivit är odlingen av modellera på ALI. Slutligen illustrerar protokollet ett exempel på exponering för proinflammatory stimuli och jämför svaret från de två modellerna som innehåller antingen färska eller frysta monocyter.
Olika studier har utförts för att bekräfta och motivera mervärdet av den förstärkta komplexiteten hos de modeller som odlas och exponeras under ALI-förhållanden jämfört med konventionell nedsänkt exponering7,22,31. Observation av det högre proinflammatory svaret i kokulturer jämfört med monokulturer av epitelceller bekräftar en tidigare studie. Studien använde den presenterade kokulturmodellen (stimulerad med LPS) och visade ett högre svar på genuttrycksnivåer av TNF och IL1B jämfört med A549 monokulturekvivalentmodell 7. Å andra sidan visade båda modellerna högre variationer inom uppmätt proinflammatory mediator release värden jämfört med A549 monokulturer. Detta kan förklaras av användningen av immunceller från olika donatorer (buffy coats) inom biologiska upprepningar (dvs. en upprepning, en donator), som tidigare visats7. Om så önskas, kan variationerna bland replikat övervinnas genom 1) med hjälp av tinade PBM från samma givare eller 2) pooling PBM från olika givare innan frysning av cellerna, sedan efterföljande användning av samma pool i varje upprepning. Inklusive fler biologiska upprepningar rekommenderas också.
Cell-frysningstekniken kan betraktas som ett kritiskt steg; det är dock ett vanligt laboratorieförfarande för att bevara celler för fenotypisk och funktionell analys. Olika studier har visat att kvaliteten på frysta PBM är avgörande för deras överlevnad, och en lämplig frysning teknik är nyckeln till framgång för efterföljande analyser med samma celler28,32. Ändring av protokollet kan utföras genom att frysa PBM: er, vilket ger flexibilitet i den experimentella setup, eftersom tillgången på buffy rockar är oftast begränsad. En annan fördel med att använda frysta PBM(i flera injektionsflaska) framför nyisosolerade sådana är att de kan användas i efterföljande experiment även efter 1 år. Detta minskar den potentiella frågan om givare-till-givare variabilitet om detta är en önskad eller krävs parameter i ett experimentellt.
Utfall av en interlaboratorisk jämförelse som utförts efter upp till 13 månader visar att PBM, när de förvaras på rätt sätt i en tank för flytande kväve, kan användas under en lång period utan någon effekt på cellernas viabilitet eller cellåtervinning33. Längre lagringstider (över 1 år) kan vara möjliga vid noggrann validering av cellernas viabilitet och cellresponsivitet innan du utför ett experiment. Även temperaturen i tanken flytande kväve måste förbli stabil hela tiden. Den viktigaste faktorn som påverkar livskraften hos kryobeserverade PBM:er konstaterades vara DMSO-koncentration, med en optimal koncentration på 10%–20 % (v/v)28. För att minimera potentiellt skadliga effekter av frysning, olika källor av proteiner, FBS eller BSA (med ett brett spektrum av koncentration från 40% upp till 100 %34) ofta läggs till frysmediet som naturliga skyddande komponenter som kan öka cellernas överlevnad.
På grund av den höga cytotoxiska potentialen hos DMSO, rekommenderas det först att sprida PBM i FBS, sedan lägga DMSO till PBM redan spridda i FBS. Noterbart är att även om högre FBS-koncentrationer (>40%) visade inte någon förbättring av cellernas livskraft, samtidigt, de inte orsaka skada på cellerna28. Ändå är frysning monocyter en möjlig strategi för att övervinna frågor av begränsad buffy coat tillgänglighet. Om man däremot önskar användningen av MDDC och MDM från färska PBM-skivor kan immuncellerna differentieras och användas 5–8 dagar efterisoleringen 7,16,17,35,36,37. Om försöksplaneringen tillåter, rekommenderas minst 6 dagars differentiering i både MDDC och MDM: er. Men konsekvens mellan olika upprepningar i samma experiment, tillsammans med rutinmässiga inspektioner av deras specifika ytmarköruttryck, är avgörande. Den lyhördhet för en proinflammatory stimulans, såsom LPS, efter differentieringstiden bör också regelbundet kontrolleras.
Många undersökningar med hjälp av A549 cellinje har utförts vid ALI, antingen som en monokultur eller kombineras med andra celltyper (makrofager, dendritiska celler, eller fibroblaster) i 3D-kokultur modell22,24,29,38. Med hjälp av denna 3D-kokultur modell, cytotoxicitet, oxidativ stress, eller proinflammatory effekterna av (nano-)material har undersökts för upp till 72 h1,17,21,24,29. Modellens likhet med in vivo vävnad har tidigare undersökts utifrån konfokal laserscanning av modellen16. Vid montering av modellen är det viktigt att beakta både cellproliferation (som kan påverka A549 i modellen som presenteras här) samt prestanda för de primära (inte proliferera) immunceller (här, MDDC och MDM: er). Det är också viktigt att tänka på att inte alla CD14 positiva monocyter differentiera till MDDC och MDM, och att cellerna kan finnas i både bifogade och suspenderade former. Baserat på kokulturens typ församling (här, båda celltyperna behöver fästa till det befintliga epitelskiktet), rekommenderas att endast använda de vidhäftande subpopulationerna av båda immuncelltyperna. Dessutom har rutinmässiga analyser av monocyter, MDDC och MDM monokultur lyhördhet för LPS, och uttryck för specifika ytmarkörer (CD14, CD163, CD86, CD93 eller CD206, data som inte visas) har föreslagit att 6 och 7 dagar av differentiering är de optimala tidpunkterna.
Även om ett realistiskt antal alveolära epitelceller i mänskliga lungor motsvarar ~160 000 celler/cm2, är antalet A549-celler som räknas i modellen ~1 000 000 celler/cm2 efter 9 dagar odladepå insatsen 16,18. Således måste denna in vitro-modells begränsningar beaktas. För det första fastställdes tätheten av epitelceller baserat på deras förmåga att bilda ett konfluentskikt på det växande membranet. Det är också viktigt att nämna att A549 representerar en epitelial typ II-cell med en cuboidal form, i motsats till epitelial typ I celler, som är platt och outspread. Å andra sidan fastställdes det erforderliga antalet immunceller baserat på litteraturen och presenterades i detta protokoll som cellnummer/yta39,40,41. Celltätheten hos MDDC:er i intervallet 400 celler/mm2 (4 celler/cm2)16 är jämförbar med den steady-state celldensiteten på 500–750 celler/mm2 (5- 7 celler/cm2) som rapporteras från in vivo-studierna39. Tätheten av MDMs i denna modell är inom samma intervall av in vivo situationen i den mänskliga alveolar regionen40.
Mogna macrophage markör färgning (25F9) observerades både i den apikala sidan (där MDMs är närvarande) samt basala sidan (dvs. på platsen för dendritiska celler). Flyttning av immunceller genom membranet skär porerna är möjligt och har också observerats med hjälp av denna modell16, vilket kan förklara de observerade skillnaderna i färgning intensiteter. En annan möjlig förklaring är dock att den mogna makrofagmarkören också kan uttryckas på dendritiska celler, men uttrycket är mycket givarspecifikt42. Också, intensiteten i 25F9 uttrycket är mycket högre i MDMs (Figur 7, Figur 8). Både proinflalymatiska stimuli (LPS och TNF-α) påverkade lungepitelets integritet i båda kokulturerna (figur 7, figur 8). Detta förväntades baserat på tidigarepublikationer 43,44 visar att proinflammatory cytokiner och bakterieprodukter störa integriteten av epitelbarriärer.
3D-multicellulär modell av den mänskliga alveolära epitel, etablerade och kännetecknastidigare 17, har fungerat som ett kraftfullt och användbart verktyg för att bedöma biologiska svar (dvs, akut proinflammatory reaktioner, oxidativ stressrespons, partikel distribution, och cellulär kommunikation) in vitro21,24,25,45. Resultaten bekräftar responsivness av kokultur modeller till proinflammatory stimuli (här, LPS och TNF-α). Svaret ökade något när man använde immunceller från färska PBM; det dock inte fanns någon statistiskt signifikant skillnad mellan kokulturer med färska vs. tinade PBM. Vidare var de proinflameriska reaktionerna hos båda kokulturmodellerna högre än de för monokulturer av epitelcell som odlades under samma (ALI) förhållanden. Sammanfattningsvis beskriver protokollet monteringen av en 3D mänskliga alveolära epitelial vävnad kokultur modell med antingen färska eller tinade PBM för differentiering till MDM och MDDCs. Det visas att båda modellerna är mycket lyhörda för proinflammatory stimuli; därför kan de fungera som kraftfulla verktyg för potentiella faro- och toxicitetsbedömningar.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Miguel Spuch-Calvar för kokultur systemet i figur 3 och till Dr Bedia Begum Karakocak för kritisk läsning. Denna studie stöddes av PATROLS-projektet, Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 inom ramen för bidragsavtal nr 760813, och av Adolphe Merkle Foundation. B.D. tackar Peter und Traudl Engelhorn stiftelsen för ekonomiskt stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benchmark microplate reader | does not have to be specific, for example BioRad, Cressier, Switzerland | ||
| Cell culture Incubator | does not have to be specific | ||
| Cell freezing container (for example Mr. Frosty) | does not have to be specific | ||
| Centrifuge | does not have to be specific | ||
| Confocal laser scanning microscope | does not have to be specific, for example | Zeiss LSM 710 meta | |
| Heamatocytometer, or automatic cell counter | does not have to be specific | ||
| Laminar bio-safety hood class II | does not have to be specific | ||
| MultiStand Macs (Macs Cell Separator) | Miltenyi, Germany | 130-042-303 | |
| pH meter | does not have to be specific | ||
| Phase contrast inverted light microscope | does not have to be specific | ||
| Pipette boy, pipettors (different volumes) | do not have to be specific | ||
| Scissors | do not have to be specific | ||
| Vacuum pump | does not have to be specific | ||
| Water bath | does not have to be specific | ||
| Disposable small equipment/glassware | Catalogue Number | ||
| 15 mL and 50 mL conical centrifuge tubes | does not have to be specific | ||
| 6- and 12-well cell culture plates, flat bottom, low evaporation lid, sterile | Falcon, Switzerland | 353046 and 353043 | |
| Cell culture inserts, transparent PET membrane, 12-well, 3 μm pore size | Falcon, Switzerland | 353181 | |
| Cell scrapper | does not have to be specific, for example VWR, Switzerland | 353085 | |
| Cryovials | do not have to be specific | ||
| Glass autoclaved Petri Dishes | do not have to be specific | ||
| LS Columns | Miltenyi, Germany | 130-042-401 | |
| Sterile filtration cup for vacuum filtration, 0.2 μm pore size | does not have to be specific, for example VWR, Switzerland | 10040-446 | |
| Sterile Lab Bottle compatible with Filtration cup (min. 100 mL) | does not have to be specific | ||
| Sterile pipettes | do not have to be specific | ||
| Chemicals | |||
| Bovine serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich, Switzerland | A7030-100g | |
| CD14+ MicroBeads human - magnetic beads | Miltenyi, Germany | 130-097-052 | |
| Deattachnig agent Trypsin-EDTA, 0.05%, phenol red | Gibco, Switzerland | 25300054 | |
| Density gradient medium Lymphoprep | Alere Technologies AS, Norway | 1114547 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich, Switzerland | D2438 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Switzerland | E6758-100g | |
| Fetal bovine serum (heat inactivated) | Gibco, Switzerland | 10270-106 | |
| Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), premium grade | Miltenyi, Germany | 130-093-864 | |
| Human Interleukin 4 (IL-4), premium grade | Miltenyi, Germany | 130-095-373 | |
| Human macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), premium grade | Miltenyi, Germany | 130-096-485 | |
| L-glutamine | Gibco, Switzerland | 25030-024 | |
| Lipopolysaccharid (LPS) from Escherichia coli | Sigma-Aldrich, Switzerland | 4524-5mg | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Switzerland | 158127 | |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco, Switzerland | 15140-122 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco, Switzerland | 10010-015 | |
| Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI) | Gibco, Switzerland | 42401-018 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Switzerland | T8787 | |
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma Aldrich, Switzerland | ||
| Tumor necrosis factor alpha (TNF-α) | Immunotools | 11343015 | |
| Assays used for cytotoxicity, (pro-)inflammatory response | |||
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche, Switzerland | 11644793001 | |
| Human IL-6 DuoSet ELISA | R&D, Biotechne, Switzerland | DY206 | |
| Human IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA | R&D, Biotechne, Switzerland | DY208 | |
| Immunostaining | |||
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), concentration 2 μg/mL | Sigma-Aldrich, Switzerland | 10236276001 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugated, concentration 20 μg/mL | Abcam, UK | ab150115 | |
| Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L) Dylight 488 conjugated, concentration 10 μg/mL | Agrisera, Sweden | AS09 633 | |
| Mature Macrophage Marker Monoclonal Antibody, concentration 50 μg/mL | eBioScience, Thermo Fischer, Switzerland | 14-0115-82 | |
| Phalloidin rhodamine, concentration 0.264 µM | Molecular Probes, Life Technologies, Switzerland | R415 | |
| Recombinant Anti-CD83 antibody, 1:50 dillution | Abcam, UK | ab244204 |
References
- Rothen-Rutishauser, B., Blank, F., Mühlfeld, C., Gehr, P. In vitro models of the human epithelial airway barrier to study the toxic potential of particulate matter. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (8), 1075-1089 (2008).
- Giard, D., et al. In vitro cultivation of human tumors: establishment of cell lines derived from a series of solid tumors. Journal of National Cancer Institute. 51 (5), 1417-1423 (1973).
- Ochs, M., Weibel, E. R., et al. Ch. 2: Functional Design of the Human Lung for Gas Exchange . Fishman's Pulmonary Diseases and Disorders, 5e. Grippi, M. A., et al. , McGraw-Hill Education. (2008).
- Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 Cell Line as a Type II Pulmonary Epithelial Cell Model for Drug Metabolism. Experimental Cell Research. 243 (2), 359-366 (1998).
- Guo, X. Y., Lu, M., Chen, X. Q., He, F. D., Li, A. Correlation study of biological characteristics of non-small cell lung cancer A549 cells after transfecting plasmid by microbubble ultrasound contrast agent. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 9 (6), 582-586 (2016).
- Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS ONE. 11 (10), 0164438 (2016).
- Bisig, C., Voss, C., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B. The crux of positive controls - Proinflammatory responses in lung cell models. Toxicology In Vitro. 54, 189-193 (2019).
- Rothen-Rutishauser, B., et al. A newly developed in vitro model of the human epithelial airway barrier to study the toxic potential of nanoparticles. ALTEX. 25, (2008).
- Braakhuis, H. M., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
- Thai, P., Chen, Y., Dolganov, G., Wu, R. Differential regulation of MUC5AC/Muc5ac and hCLCA-1/mGob-5 expression in airway epithelium. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 33 (6), 523-530 (2005).
- Wu, J., et al. Characterization of air-liquid interface culture of A549 alveolar epithelial cells. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 51 (2), 6950 (2017).
- Shapiro, D. I., Nardone, L. L., Rooney, S. A., Motoyama, E. K., Munoz, J. L. Phospholipid biosynthesis and secretion by a cell line (A549) which resembles type II aleveolar epithelial cells. Biochimica and Biophysica Acta. 530 (2), 197-207 (1978).
- Balis, J., Bumgarner, S. D., Paciga, J. E., Paterson, J. F., Shelley, S. A. Synthesis of lung surfactant-associated glycoproteins by A549 cells: description of an in vitro model for human type II cell dysfunction. Experimental Lung Research. 6 (3-4), 197-213 (1984).
- Schurch, S., Gehr, P., Im Hof, V., Geiser, M., Green, F. Surfactant displaces particles toward the epithelium in airways and alveoli. Respiration Physiology. 80 (1), 17-32 (1990).
- Gehr, P., Schurch, S., Berthiaume, Y., Hof, V. I., Geiser, M. Particle Retention in Airways by Surfactant. Journal of Aerosol Medicine. 3 (1), 27-43 (2009).
- Blank, F., Rothen-Rutishauser, B., Gehr, P. Dendritic Cells and Macrophages Form a Transepithelial Network against Foreign Particulate Antigens. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (6), (2007).
- Rothen-Rutishauser, B. M., Kiama, S. G., Gehr, P. A three-dimensional cellular model of the human respiratory tract to study the interaction with particles. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 32, (2005).
- Blank, F., Rothen-Rutishauser, B. M., Schurch, S., Gehr, P. An optimized in vitro model of the respiratory tract wall to study particle cell interactions. Journal of Aerosol Medicine. 19, (2006).
- Jardine, L., et al. Lipopolysaccharide inhalation recruits monocytes and dendritic cell subsets to the alveolar airspace. Nature Communications. 10 (1), 1999 (2019).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).
- Chortarea, S., et al. Repeated exposure to carbon nanotube-based aerosols does not affect the functional properties of a 3D human epithelial airway model. Nanotoxicology. 9 (8), 983-993 (2015).
- Hilton, G., Barosova, H., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B., Bereman, M. Leveraging proteomics to compare submerged versus air-liquid interface carbon nanotube exposure to a 3D lung cell model. Toxicology In Vitro. 54, 58-66 (2019).
- Brandenberger, C., et al. Effects and uptake of gold nanoparticles deposited at the air-liquid interface of a human epithelial airway model. Toxicology and Applied Pharmacology. 242, (2010).
- Drasler, B., et al. Single exposure to aerosolized graphene oxide and graphene nanoplatelets did not initiate an acute biological response in a 3D human lung model. Carbon. 137, 125-135 (2018).
- Durantie, E., et al. Carbon nanodots: Opportunities and limitations to study their biodistribution at the human lung epithelial tissue barrier. Biointerphases. 13, (2018).
- Brandenberger, C., et al. Quantitative evaluation of cellular uptake and trafficking of plain and polyethylene glycol-coated gold nanoparticles. Small. 6 (15), 1669-1678 (2010).
- Tomašek, I., et al. Combined exposure of diesel exhaust particles and respirable Soufrière Hills volcanic ash causes a (pro-)inflammatory response in an in vitro multicellular epithelial tissue barrier model. Particle and Fibre Toxicology. 13 (1), 67 (2016).
- Nazarpour, R., et al. Optimization of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) Cryopreservation. International Journal of Molecular and Cellular Medicine. 1 (2), 88-93 (2012).
- Endes, C., et al. An in vitro testing strategy towards mimicking the inhalation of high aspect ratio nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), (2014).
- Ju, X., et al. The Analysis of CD83 Expression on Human Immune Cells Identifies a Unique CD83+-Activated T Cell Population. Journal of Immunology. 197 (12), 4613-4625 (2016).
- Lenz, A. G., et al. Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface: A Comparison with Conventional, Submerged Cell-Culture Conditions. BioMed Research International. , 12 (2013).
- Germann, A., Schulz, J. C., Kemp-Kamke, B., Zimmermann, H., von Briesen, H. Standardized serum-free cryomedia maintain peripheral blood mononuclear cell viability, recovery, and antigen-specific T-cell response compared to fetal calf serum-based medium. Biopreservation and Biobanking. 9 (3), 229-236 (2011).
- Weinberg, A., et al. Optimization and Limitations of Use of Cryopreserved Peripheral Blood Mononuclear Cells for Functional and Phenotypic T-Cell Characterization. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (8), 1176 (2009).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. Freshney, R. I. , Wiley-Liss Inc. 321-334 (2005).
- Lehmann, A. B. C., Blank, F., Gehr, P., Rothen-Rutishauser, B. Alternatives to animal testing. Yarmush, M. L., Langer, R. S. , Artech House. 239-260 (2010).
- Steiner, S., et al. Reduction in (pro-)inflammatory responses of lung cells exposed in to diesel exhaust treated with a non-catalyzed diesel particle filter. Atmospheric Environment. 81, 117-124 (2013).
- Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional Profiling of the Human Monocyte-to-Macrophage Differentiation and Polarization: New Molecules and Patterns of Gene Expression. The Journal of Immunology. 177 (10), 7303 (2006).
- Chortarea, S., et al. Profibrotic activity of multi-walled carbon nanotubes upon prolonged exposures in different human lung cell types. Applied In Vitro Toxicology. 5 (1), (2019).
- Holt, P. G. Pulmonary Dendritic Cells in Local Immunity to Inert and Pathogenic Antigens in the Respiratory Tract. Proceedings of the American Thoracic Society. 2 (2), 116-120 (2005).
- Pinkerton, K. E., Gehr, P., Castañeda, A., Crapo, J. D. Comparative Biology of the Normal Lung (Second Edition). Parent, R. A. , Academic Press. 105-117 (2015).
- Crapo, J., Barry, B., Gehr, P., Bachofen, M., Weibel, E. R. Cell number and cell characteristics of the normal human lung. American Review of Respiratory Disease. 126 (2), 332-337 (1982).
- Maniecki, M. B., Møller, H. J., Moestrup, S. K., Møller, B. K. CD163 positive subsets of blood dendritic cells: The scavenging macrophage receptors CD163 and CD91 are coexpressed on human dendritic cells and monocytes. Immunobiology. 211 (6), 407-417 (2006).
- Chignard, M., Balloy, V. Neutrophil recruitment and increased permeability during acute lung injury induced by lipopolysaccharide. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 279 (6), 1083-1090 (2000).
- Coyne, C. B., et al. Regulation of Airway Tight Junctions by Proinflammatory Cytokines. Molecular Biology of the Cell. 13 (9), 3218-3234 (2002).
- Durantie, E., et al. Biodistribution of single and aggregated gold nanoparticles exposed to the human lung epithelial tissue barrier at the air-liquid interface. Particle and Fibre Toxicology. 14 (49), (2017).
