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Biology

मल्टीसेलुलर ह्यूमन अल्वेलर मॉडल एपिथेलियल कोशिकाओं और प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं से बना है जो हैज़र्ड असेसमेंट के लिए है

Published: May 6, 2020 doi: 10.3791/61090
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Adolphe Merkle Institute, University of Fribourg
* These authors contributed equally

Summary

यहां प्रस्तुत प्राथमिक मानव रक्त मोनोसाइट अलगाव के साथ-साथ मैक्रोफेज और डेंड्रिटिक कोशिकाओं और असेंबली में उनके भेदभाव के लिए एक बहुकोशिकीय मानव फेफड़ों के मॉडल में एपिथेलियल कोशिकाओं के साथ एक प्रोटोकॉल है। प्रोइनफ्लेमेटरी उत्तेजनाओं के संपर्क में आने पर, ताजा अलग या गल मोनोसाइट्स से विभेदित प्रतिरक्षा कोशिकाओं से बनी प्रतिरक्षा कोशिकाओं की जैविक प्रतिक्रियाओं की तुलना की जाती है।

Abstract

एक मानव अल्वियोलर सेल कोकल्चर मॉडल को यहां अल्वेलर एपिथेलियल ऊतक बाधा के अनुकरण के लिए वर्णित किया गया है जो अल्वेलर एपिथेलियल प्रकार II कोशिकाओं और दो प्रकार की प्रतिरक्षा कोशिकाओं (यानी, मानव मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज [एमडीएम] और डेंड्रिटिक कोशिकाओं [एमडीडीसी] से बना है। बहुकोशिकीय मॉडल को कोडांतरण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। Alveolar epithelial कोशिकाओं (A549 सेल लाइन) बड़े हो रहे है और दो कक्ष कुओं में पारगम्य आवेषण पर जलमग्न परिस्थितियों में विभेदित, तो विभेदित एमडीएम और एमडीडीसी के साथ संयुक्त । अंत में, कोशिकाओं को कई दिनों के लिए एक एयर-लिक्विड इंटरफेस के संपर्क में हैं। चूंकि मानव प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं को मानव बफी कोट से अलग करने की आवश्यकता होती है, इसलिए प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर विधि को दर्जी करने के लिए या तो ताजा या गल मोनोसाइट्स से विभेदित प्रतिरक्षा कोशिकाओं की तुलना की जाती है। तीन आयामी मॉडल, या तो हौसले से अलग या गल मोनोसाइट-व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ अल्वियोलर कोशिकाओं से बना है, साइटोकिन (इंटरल्यूकिंस 6 और 8) में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाने के लिए प्रोइनफ्लेमेटरी उत्तेजनाओं (लिपोपॉलिसाकराइड और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर α) के संपर्क में अनुपचारित सेल की तुलना में जारी करें । दूसरी ओर, कॉकल्चर में देखी गई साइटोकिन रिलीज के बीच कोई सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर नहीं है। इससे पता चलता है कि प्रस्तुत मॉडल एमडीएम और एमडीडीसी की उपस्थिति में प्रोइनफ्लेमेटरी उत्तेजनाओं के लिए उत्तरदायी है जो ताजा या गल परिधीय रक्त मोनोसाइट्स (पीबीएमएस) से विभेदित है। इस प्रकार, यह एयरोसोलाइज्ड दवाओं या नैनोमैटेरियल्स सहित विभिन्न पदार्थों के लिए तीव्र जैविक प्रतिक्रिया की जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।

Introduction

इन विट्रो फेफड़ों की कोशिका संस्कृतियां एयरोसोल 1 के खतरों का आकलन करने के लिए लागत प्रभावी, मजबूत और अच्छी तरह सेनियंत्रितप्लेटफार्म प्रदान करती हैं। मानव अल्वियोलर न्यूमोसाइट्स के लिए एक मॉडल सेल प्रणाली के रूप में, पल्मोनरी एडेनोकार्सिनोमा से अलग एपिथेलियल ए 549 सेल लाइन का उपयोग अक्सर 2 कियाजाताहै। ये कोशिकाएं अल्वियोलर क्षेत्र 3 से स्क्वैमस प्रकार II एपिथेलियल कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करती हैं औरखतरे और विषाक्तता आकलन के लिए व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली फेफड़ों की कोशिका रेखा हैं1,4,5,6,,7,8,9,,10।, A549 सेल लाइन में अल्वेलर एपिथेलियल टाइप II कोशिकाओं की प्रासंगिक विशेषताएं हैं, जैसे कि घनी पैक फॉस्फोलिपिड3युक्त विशेषता लैमेलर निकायों की उपस्थिति।

यह दिखाया गया है कि जब कोशिकाओं को एयर-लिक्विड इंटरफेस (अली) में सुसंस्कृत किया जाता है, तो सर्फेक्टेंट हवा से उजागर एपिथेलियल कोशिकाओं के एपिकल साइड पर जारी किया जाता है, जिससे सतह तनाव11,12, 13,को कम कियाजाताहै।, यह सुविधा नैनोमटेरियल श्वसन खतरा और विषाक्तता जांच में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। एक बार अल्वियोलर क्षेत्र में सांस लेने वाले नैनोमैटेरियल्स/टॉक्सिकंट्स को जमा कर दिया जाता है, वे पहले फेफड़े के सर्फेक्टेंट के साथ बातचीत करते हैं और जलीय हाइपोफेज में गीला बलों द्वारा विस्थापित होते हैं, जहां फेफड़े की कोशिकाओं के साथ बातचीत14,,15होती है। यद्यपि A549 कोशिकाएं एक मोनोलेयर बनाती हैं (जो अली में खेती किए जाने पर बाद के समय बिंदुओं पर मल्टीलेयर में अधिक बढ़ सकती हैं) और सर्फेक्टेंट का उत्पादन करती हैं, एक दोष उनका अपर्याप्त तंग जंक्शन गठन है, जिसके परिणामस्वरूप कम ट्रांसेपिथेलियल विद्युत प्रतिरोध मूल्य होते हैं, लेकिन फिर भी अंतरकोशिकीय (नैनो) कणों के स्थानांतरण16,17,,18के खिलाफ एक कार्यात्मक बाधा पेश करते हैं।,

फेफड़ों में, विभिन्न प्रकार की प्रतिरक्षा कोशिका आबादी होती है, जिसमें फैगोसाइटिक और पेशेवर एंटीजन-पेश कोशिकाएं (यानी, मैक्रोफेज और डेंड्रिटिक कोशिकाएं) शामिल हैं जो सीधे सेल-सेल संपर्क या इंटरसेलुलर सिग्नलिंग के माध्यम से होम्योपैथी को नियंत्रित करने और बनाए रखने के लिए संवाद करती हैं। मैक्रोफेज और डेंड्रिटिक कोशिकाएं क्रिटिकल सहज प्रतिरक्षा प्रभावक और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया19के सर्जक हैं। एपिथेलियम के भीतर या उसके नीचे रहने वाली डेंड्रिटिक कोशिकाएं एंटीजन को पकड़ने के लिए ल्यूमेन को एपिथेलियम में फलाव पैदा कर सकती हैं। Alveolar मैक्रोफेज एपिथेलियम की एपिकल सतह पर स्थित हैं और प्रहरी कोशिकाओं के रूप में कार्य करते हैं, जो विदेशी सामग्री के साथ-साथ बैक्टीरियल, वायरल और फंगल संक्रमणों के खिलाफ पहले सेलुलर रक्षा का प्रतिनिधित्व करते हैं। उनकी फेनोटाइपिक प्लास्टिसिटी ऐसी उत्तेजनाओं के जवाब में प्रोमिन्फ्लेमेटरी प्रतिक्रियाओं को तेजी से शामिल करने के साथ-साथ विरोधी भड़काऊ (यानी, निरोधात्मक) प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करने में तेजी से शामिल होने की अनुमति देती है20।

मानव अल्वियोलर एपिथेलियल ऊतक बाधा का अनुकरण करने के लिए, हमने क्रमशः17,एपिकल और बेसल पक्षों पर मानव रक्त मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (एमडीएम) और डेंड्रिटिक कोशिकाओं (एमडीडीसी) के साथ पूरक A549 कोशिकाओं के साथ एक ट्रिपल कोकल्चर मॉडल की स्थापना की। अली में इस मॉडल की खेती पहले16,यहां तक कि 72 घंटे के बाद एक्सपोजर21तक की सूचना दी गई है। जलमग्नस्थितियोंकी तुलना में अली के संपर्क में आने वाली सेल संस्कृति में कार्बन नैनोट्यूब एक्सपोजर के लिए तीव्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में काफी वृद्धि हुई थी । कोकल्चर मॉडल, सुसंस्कृत और अली में विभिन्न सामग्रियों के संपर्क में, पहले जिंक ऑक्साइड, 23 ग्राफीन से संबंधित सामग्री24,सोने के नैनोकणों25, 26, कार्बन नैनोट्यूब2621,,और ज्वालामुखी राख और डीजल निकास कणों27के लिए जोखिम पर साइटोटॉक्सिकिटी, ऑक्सीडेटिव तनाव और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ।21

इसके अलावा, इन विट्रो मानव फेफड़ों के मॉडल में प्रतिरक्षा प्रभावक कोशिकाओं के रूप में मैक्रोफेज और डेंड्रिटिक कोशिकाओं की महत्वपूर्ण भूमिका की पुष्टि की गई है। विशेष रूप से, मोनोकल्चर सिस्टम7की तुलना में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की उपस्थिति में मॉडल में एक बढ़ी हुई प्रोइनफ्लेमेटरी प्रतिक्रिया देखी गई। प्राथमिक मोनोसाइट-व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं का उपयोग करने की संभावित कमियां पीबीएमएस की सीमित पहुंच के साथ-साथ दाता-से-दाता भिन्नता हैं। इन संभावित कमियों के समाधान के रूप में, यहां प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल है जो सेल संस्कृति मॉडल असेंबली के लिए हौसले से अलग पीबीएमएस28 का क्रायोप्रिजर्वेशन शुरू करता है। इस अध्ययन का उद्देश्य मानव बफी कोट से पीबीएमएस के अलगाव सहित 3 डी मानव अल्वियोलर एपिथेलियल ऊतक मॉडल असेंबली को प्रदर्शित करना है। प्रोइन्फ्लेमेटरी उत्तेजनाओं के प्रति जवाबदेही की तुलना एमडीएम और एमडीडीसी से बने मॉडल से की जाती है जो ताजा पीबीएमएस से अलग होते हैं या जमे हुए/गल गए पीबीएमएस से अलग होते हैं ।

अपरीक्षित मानव रक्त नमूनों के साथ काम करने में एचआईवी (मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस), हेपेटाइटिस बी और हेपेटाइटिस सी जैसे संक्रामक रोगों के संभावित संचरण को रोकने के लिए विशिष्ट देखभाल शामिल है । इसलिए, दस्ताने, गाउन, मास्क और आंखों की सुरक्षा जैसे व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपायों का उपयोग महत्वपूर्ण है और अच्छी प्रयोगशाला अभ्यास सिद्धांतों के अनुसार होना चाहिए। ये सुरक्षा संभावित संक्रामक तरल पदार्थों के लिए त्वचा या श्लेष्म झिल्ली को उजागर करने के जोखिम को कम करती है। इसके अतिरिक्त, बफी कोट और पीबीएम से निपटने में शामिल लोगों के लिए, हेपेटाइटिस बी वायरस के खिलाफ टीकाकरण अनिवार्य है, और एंटीबॉडी एंटी हेपेटाइटिस बी के रक्त टाइटर स्तर १०० आईयू/एल (देश-विशिष्ट विधायी आवश्यकताओं को संबोधित करने की आवश्यकता से ऊपर होना चाहिए) । इसके अलावा, सभी काम जैव शिक्षा स्तर 2 प्रयोगशालाओं में किया जाना चाहिए (देश विशिष्ट विधायी आवश्यकताओं को संबोधित करने की जरूरत है) । प्रयोगशाला के वातावरण में काम करने और कचरे की हैंडलिंग सहित स्तनधारी सेल संस्कृति से निपटने से जुड़ी मानक स्वास्थ्य और सुरक्षा सावधानियों को पूरे प्रोटोकॉल का संचालन करते समय अपनाया जाना चाहिए ।

Protocol

मानव रक्त से अलग प्राथमिक मोनोसाइट्स शामिल काम सार्वजनिक स्वास्थ्य स्विट्जरलैंड के लिए संघीय कार्यालय की समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था (संदर्भ संख्या: 611-1, मेलडुंग A110635/2) एडॉल्फे Merkle संस्थान के लिए ।

1. मानव बफी कोट से परिधीय रक्त मोनोसाइट्स (पीबीएमएस) का अलगाव

नोट: निम्नलिखित अनुभाग एक बफी कोट के १ ५० एमएल बैग से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन करता है, बर्न, स्विट्जरलैंड में स्विस ट्रांसफ्यूजन सेंटर से खरीदा ।

  1. रिएजेंट्स की तैयारी
    1. 100 मिली लीटर चुंबकीय पृथक्करण बफर प्रति बफी कोट तैयार करें: 0.5% [w/v] गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए; फॉस्फेट-बफर खारा [पीबीएस]) में 2 एमएम एथिलीनडाइमाइन्टेट्रासेटिक एसिड (EDTA) के साथ, और पीएच = 7.2, बाँझ फिल्टर के साथ 0.22 μm प्रक्रिया के दौरान 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    2. सेल कल्चर मीडियम (सीसीएम): आरपीएमआई 1640 10% के साथ [v/v] भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% [v/v] एल-ग्लूटामाइन (यहां, 2 m L-ग्लूटामाइन), और 1% [v/v] पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (यहां, १०० इकाइयां/एमएल पेनिसिलिन और १०० माइक्रोग्राम/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन) ।
      नोट: प्रत्येक अभिवाक की आवश्यक राशि निम्नलिखित चरणों में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या पर निर्भर करती है।
  2. पीबीएमएस का अलगाव
    नोट: उपयोग से पहले सभी ग्लास और प्लास्टिकवेयर को निष्फल करने की आवश्यकता है। सुरक्षा कारणों से, कांच के बर्तनों के साथ चोट के जोखिम को कम करने के लिए मानव रक्त नमूनों को संभालते समय प्लास्टिकवेयर के उपयोग की सिफारिश की जाती है।
    1. बफी कोट युक्त बैग के नली अंत को खोलने के लिए कैंची का उपयोग करें।
    2. बैग की नली के माध्यम से बैग की सामग्री को सीधे दो शंकुकेंद्री 50 एमएल ट्यूब (~ 25 एमएल प्रत्येक) में डालकर बफी कोट वितरित करें।
    3. धीरे डालना या ट्यूबों में pBS पिपेट करने के लिए ५० एमएल की मात्रा तक पहुंचने । ट्यूब को धीरे-धीरे 3x उल्टा करके सामग्री मिलाएं।
    4. प्रत्येक ताजा ट्यूब में मिश्रण के 25 एमएल पाइपिंग करके बफी कोट-पीबीएस मिश्रण को चार नए 50 एमएल शंकुल सेंट्रलाइज ट्यूब में विभाजित करें।
    5. धीरे-धीरे 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके बफी कोट-पीबीएस मिश्रण के नीचे घनत्व ढाल माध्यम के 13 एमएल रखें। पिपेट धारक से भरे हुए पिपेट को अलग करें और तुरंत बफी कोट-पीबीएस मिश्रण में घनत्व ढाल माध्यम के किसी भी अतिरिक्त रिसाव को रोकने के लिए अंगूठे के साथ पिपेट के ऊपरी उद्घाटन को प्लग करें।
      नोट: अंगूठे के साथ ऊपरी खोलने होल्डिंग, शंकुकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे भरा पिपेट रखें ताकि घनत्व ढाल माध्यम धीरे-धीरे बफी कोट-पीबीएस मिश्रण के नीचे बहती है, जिससे पिपेट के अंदर घनत्व ढाल माध्यम का लगभग 1 एमएल छोड़ दें।
    6. बफी कोट-पीबीएस मिश्रण वाले अन्य तीन ट्यूबों के साथ चरण 1.2.5 दोहराएं।
    7. सेंट्रलाइज सभी चार ट्यूबों में 20 मिनट के लिए मिश्रण 1,000 x ग्राम और 25 डिग्री सेल्सियस पर धीमी ब्रेकिंग मोड पर होता है। अपकेंद्रित्रीकरण के लिए सुरक्षात्मक ढक्कन वाले धारकों का उपयोग करें।
    8. प्रत्येक ट्यूब के ढक्कन को खोलें, एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके प्लाज्मा और प्लेटलेट्स युक्त ऊपरी परत को हटा दें, और बायोहैजार्ड तरल अपशिष्ट कंटेनर में निपटाएं।
    9. परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल परत को इकट्ठा करने के लिए एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें, जो प्लाज्मा और घनत्व ढाल मध्यम परतों के बीच एक सफ़ेद टर्बिड छोटे अंश (मोटाई में ~ 2-3 मिमी) के रूप में दिखाई देता है। गोली में नीचे लाल रक्त कोशिकाएं होती हैं। नीचे सबसे परत बनाने वाले एरिथ्रोसाइट्स को स्थानांतरित करने से बचें। सभी चार ट्यूबों के लिए इसे दोहराएं।
      नोट: परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं में पीबीएमएस और लिम्फोसाइट्स होते हैं। पीबीएमएस को बाद में चुंबकीय सीडी 14 + सेपरेशन के दौरान लिम्फोसाइट्स से अलग किया जाएगा।
    10. पूल परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को चार ट्यूबों से दो 50 एमएल ट्यूब में।
    11. पीबीएस से 50 एमएल तक दो ट्यूब भरें और ढक्कन से कवर करें।
    12. एक बायोहैजार्ड तरल अपशिष्ट कंटेनर में मूल चार ट्यूबों से बचे हुए एरिथ्रोसाइट्स और प्लाज्मा को त्यागें।
    13. सेंट्रलाइज 500 एक्स जी पर 8 मिनट के लिए दो ट्यूब और नियमित सेंट्रलाइज स्पीड पर 18-20 डिग्री सेल्सियस।
    14. अपकेंद्रित्र के बाद, एक सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ सुपरनेट को हटा दें और इसे बायोहैजार्ड तरल अपशिष्ट कंटेनर में त्याग दें।
    15. सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके पीबीएस की 5 एमएल के साथ कोशिकाओं को फिर से रीसुस्ल करें।
    16. सेल निलंबन को एक 50 एमएल शंकुल सेंट्रलाइज ट्यूब में पूल करें और पीबीएस के साथ 50 एमएल तक भरें।
    17. ट्राइपैन ब्लू (45 माइक्रोन) अपवर्जन विधि का उपयोग करके सेल काउंटर के साथ कोशिकाओं को गिनने के लिए सेल निलंबन के 5 माइक्रोन का उपयोग करें।
    18. एक सेल काउंटर कक्ष में ट्राइपैन ब्लू-पीबीएमएस समाधान के पिपेट 10 माइक्रोन और मानक गिनती प्रोटोकॉल के अनुसार कोशिकाओं की संख्या गिनती। कुल सेल नंबर, सीटीकी गणना करने के लिए समीकरण 1 का उपयोग करें ।
      Equation 1
    19. कोशिकाओं की गिनती के बाद, 50 एमएल ट्यूब को 1.2.13 चरण में किया गया।
  3. CD14 सकारात्मक चयन
    1. धीरे-धीरे प्रत्येक ट्यूब के ढक्कन को खोलें, फिर गोली को परेशान किए बिना सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके सुपरनैट को हटा दें और त्यागें।
    2. चुंबकीय पृथक्करण बफर की गणना की गई राशि (समीकरण 2) जोड़ें (यहां, प्रति 1 x 10 7 कुल कोशिकाओं में बफर के 80 माइक्रोन) और समाधान को ऊपर औरनीचे पाइपिंग करके सेल पेलेट को फिर से खर्च करें।
      Equation 2
    3. समीकरण 3 (यहां, 10 माइक्रोन प्रति 1 x 107 कुल कोशिकाओं) का उपयोग करके सीडी 14 + चुंबकीय मोतियों की इसी मात्रा की गणना करें और उचित मात्रा को पिपेट करें।
      Equation 3
    4. ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं, ढक्कन बंद करें, और समाधान को 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. इनक्यूबेशन पर, चुंबकीय पृथक्करण बफर के साथ 50 एमएल तक ट्यूब भरें।
    6. सेंट्रलाइज जैसा कि चरण 1.2.13 में किया गया है।
    7. कोशिका गोली को परेशान किए बिना एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके सुपरनेट को एस्पिरेट करें और त्यागें।
    8. पिपेट चुंबकीय पृथक्करण बफर (समीकरण 4; यहां, प्रति 1 x 108 कोशिकाओं में बफर की 500 माइक्रोन) और धीरे-धीरे 3x को पाइपिंग करके मिलाएं।
      Equation 4
    9. चुंबकीय पृथक्करण स्टेशन को छिड़काव करके और इसे एक स्टरलाइजिंग एजेंट के साथ पोंछते हुए कीटाणुरहित करें। चुंबकीय पृथक्करण के लिए स्तंभ के साथ लेमिनार प्रवाह हुड में रखें।
    10. चुंबकीय क्षेत्र में चुंबकीय पृथक्करण स्तंभ रखें और धोने और अवेलेबल कोशिकाओं (यानी, अपशिष्ट) को इकट्ठा करने के लिए सीधे कॉलम के नीचे एक खाली 50 एमएल शंकुकेंद्रित्र ट्यूब रखें।
    11. चुंबकीय पृथक्करण बफर के 3 एमएल को कॉलम में पिपिंग करके चुंबकीय पृथक्करण स्तंभ को कुल्ला करें। कॉलम को पूरी प्रक्रिया के दौरान सूखने न दें।
    12. मैग्नेटिक सेपरेशन बफर की 15 एमएल शंकुनीक सेंट्रलाइज ट्यूब और पिपेट 1 एमएल तैयार करें।
    13. चुंबकीय पृथक्करण स्तंभ पर सेल निलंबन (चरण 1.3.8 में तैयार) लागू करें। फिल्टर के तहत 50 एमएल शंकुधारी सेंट्रलाइज ट्यूब में, अवेलेबल कोशिकाओं को इकट्ठा करें जो गुजरी हैं।
      नोट: कॉलम को अवरुद्ध करने से बचने के लिए प्रति कॉलम 2 x10 9 कोशिकाओं से अधिक न करें।
    14. जैसे ही कॉलम जलाशय खाली होता है (यानी जब कोशिकाएं कॉलम से गुजरी हों), एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके चुंबकीय पृथक्करण बफर के 3 एमएल लागू करें और इसे कॉलम के माध्यम से पारित होने दें। इस 3x दोहराएं।
    15. धीरे-धीरे हाथों से खींचकर चुंबकीय विभाजक से चुंबकीय पृथक्करण स्तंभ को हटा दें, फिर इसे 15 एमएल ट्यूब में रखें जिसमें चुंबकीय पृथक्करण बफर (चरण 1.3.12 में तैयार) के पूर्व-पिपेटेड 1 एमएल होते हैं।
    16. स्तंभ में चुंबकीय पृथक्करण बफर के 5 एमएल जोड़ें और स्तंभ में प्लंजर को मजबूती से धकेलकर चुंबकीय रूप से लेबल की कोशिकाओं को बाहर निकालें।
  4. एमडीएम और एमडीडीसी भेदभाव के लिए रीएजेंट तैयारी
    1. चरण 1.2.17 में किए गए ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन विधि का उपयोग करके सेल काउंटर के साथ कोशिकाओं की गणना करें।
    2. आगे के चरणों के लिए सीसीएम या एफबीएस की आवश्यक मात्रा की गणना करें: या तो सीसीएम की मात्रा 1 x 106 कोशिकाओं/एमसीएल (चरण 1.5.1) के सेल घनत्व के अनुरूप है, या एफबीएस की मात्रा 6 x 10 6 कोशिकाओं प्रति 0.96 कोशिकाओं की सेल घनत्व के अनुरूप है एफबीएस (चरण 1.6.3)।
      Equation 5
    3. ढक्कन बंद करें, ट्यूब को सेंट्रलाइज में रखें, और अपकेंद्रित्र के रूप में चरण 1.2.13 में किया जाए। सेल पैलेट को परेशान किए बिना सुपरनेट को हटा दें और त्याग दें। सेल सीडिंग के लिए 1.5 कदम या सेल फ्रीजिंग के लिए चरण 1.6 के लिए आगे बढ़ें।
  5. एमडीएम और एमडीडीसी में पीबीएम सीडिंग और भेदभाव
    1. सीसीएम की गणना की मात्रा में सेल पेलेट को 1.4.2 (यहां, 3x के ऊपर और नीचे पाइपिंग करके 1 x10 6 कोशिकाओं/एमएल) की अंतिम एकाग्रता को फिर से उठाया जाता है।
    2. एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके अलग-अलग शंकुपंचित ट्यूबों में एमडीएम और एमडीडीसी में अंतर करने के उद्देश्य से कोशिकाओं की संख्या पिपेट।
    3. पीबीएमएस के साथ सीसीएम के कारकों में अंतर करना और ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं। अंतर कारकों को इस प्रकार लागू किया जाता है:
      1. एमडीडीसी के लिए: 10 एनजी/एमएल इंटरल्यूकिन-4 (आईएल-4) और 10 एनजी/एमएल ग्रेनोलोसिट-मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) की अंतिम एकाग्रता ।
      2. एमडीएम के लिए: 10 एनजी/एमएल मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) की अंतिम एकाग्रता ।
    4. पिपेट सीसीएम में प्रति अच्छी तरह से निलंबन के 3 एमएल वितरित करके 6 अच्छी तरह से प्लेटों में जोड़ा अंतर कारकों के साथ सेल6 निलंबन (3 x 106 कोशिकाओं/
    5. 6 अच्छी प्लेटों को सेल कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)में रखें और उन्हें सीसीएम को ताज़ा किए बिना 6 दिनों के लिए अंतर करने दें।
      नोट: बफी कोट और प्रायोगिक सेटअप की स्थानीय उपलब्धता के आधार पर भेदभाव 5-8 दिनों से होता है, बशर्ते कि उचित तकनीकों का उपयोग करके भेदभाव दक्षता निर्धारित की जाती है (चर्चा अनुभाग को देखें)।
  6. पीबीएम ठंड
    1. सेल पेलेट को क्रायोप्रोटेक्टिव मीडियम (यहां, एफबीएस और डाइमिथाइल सल्फोक्साइड [डीएमओ; साइटोटॉक्सिक]) में प्रीवायरमेड एफबीएस की मात्रा को पाइप करके 9:1 (v/v) के अनुपात में फिर से खर्च करें । यह 6 x10 6 कोशिकाओं/एमएल की अंतिम कोशिका एकाग्रता से मेल खाती है, 10% DMSO (v/v) के एक और अतिरिक्त पर विचार ।
    2. लैमिनार फ्लो हुड (यानी, तारीख, आइसोलेशन कोड और कोशिकाओं की संख्या रिकॉर्ड) में क्रायोवियल्स की वांछित संख्या को चिह्नित करें।
    3. प्रत्येक क्रायोवियल के लिए शुद्ध एफबीएस (यहां, एफबीएस के 0.9 एमएल में 6 x 106 कोशिकाओं) में सेल निलंबन के पिपेट 0.9 एमएल। इसके बाद, धीरे-धीरे डीएमएसओ के 0.1 एमएल को पिपेट करें और क्रायोवियल्स को 3x के ऊपर और नीचे करके निलंबन को अच्छी तरह से मिलाएं।
    4. क्रायोवियल्स को सेल-फ्रीजिंग कंटेनर में स्थानांतरित करें और तुरंत इसे 24 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
    5. 24 घंटे के बाद, क्रायोवियल्स को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर और कंटेनर से हटा दें और उन्हें सेल स्टोरेज के लिए उपयुक्त तरल नाइट्रोजन टैंक में रखें।
  7. पीबीएम विगलन और एमडीएम और एमडीडीसी में भेदभाव
    1. पानी के स्नान (~ 20-30 मिनट) में सभी आवश्यक अभिकर् ती को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    2. गल कोशिकाओं की संख्या के अनुरूप 6 अच्छी तरह से प्लेटों की उचित संख्या तैयार करें (यहां, प्रति 1.8 x 10 7 कोशिकाओं,यानी 3 क्रायोवियल्स) एक प्लेट। एसेप्टिक परिस्थितियों में प्रत्येक अच्छी तरह से सीसीएम के पिपेट 2 एमएल। पीएच को बराबरी करने की अनुमति देने के लिए 15 मिनट के लिए इनक्यूबेटर (5% सीओ2,37 डिग्री सेल्सियस) में प्लेटें रखें।
    3. एक तरल नाइट्रोजन टैंक से जमे हुए कोशिकाओं के साथ क्रायोवियल की आवश्यक मात्रा लें और सेल निलंबन की एक समान विगलन सुनिश्चित करने के लिए धीरे-धीरे उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान (1-2 मिनट) में घूमता है।
    4. पानी के स्नान से क्रायोवियल निकालें और एक स्टरलाइजिंग एजेंट के साथ दूषित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि एजेंट ढक्कन और ओ-रिंग के साथ बातचीत नहीं करता है।

      नोट: इसके बाद, सभी चरणों को एसेप्टिक परिस्थितियों में पूरा किया जाना चाहिए।
    5. गल जाने वाले क्रायोवियल्स की संख्या के अनुरूप 15 एमएल शंकुकीय अपकेंद्रित्र ट्यूबों की उचित संख्या तैयार करें (यहां, 6 x 106 कोशिकाएं/ट्यूब)। प्रत्येक ट्यूब में प्रीवार्म्ड सीसीएम का पिपेट 9 एमएल।
    6. पिपेट धीरे-धीरे (ड्रॉप-बाय-ड्रॉप) क्रायोवियल की सामग्री को सीसीएम युक्त ट्यूब में। ढक्कन बंद करें, प्रत्येक ट्यूब के लिए दोहराएं, और नियमित अपकेंद्रित्र गति से 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
    7. पैलेट को बिना परेशान किए ही सुपरनेट को छोड़ दें।
    8. प्रत्येक ट्यूब से गोली को फिर से उठाया (जिसमें एक क्रायोवियल से कोशिकाएं होती हैं) प्रीवार्म्ड सीसीएम के 2 एमएल में एक सीरोलॉजिकल पिपेट (3 x 106 कोशिकाओं/एमएल के अनुरूप कोशिका घनत्व) का उपयोग करके पाइपिंग करके।
    9. प्रत्येक ट्यूब से, एक 6 अच्छी तरह से तैयार सीसीएम के 2 एमएल युक्त दो कुओं (1 मिलीएल प्रति अच्छी तरह) में पुनर्नक्षित कोशिकाओं को पिपेट6 करने के लिए 3 x 106 कोशिकाओं के एक सेल घनत्व तक पहुंचने/ अन्य सभी ट्यूबों के लिए इसे दोहराएं।
    10. धारा 1.5.3 में वर्णित भेदभाव के साथ आगे बढ़ें।
    11. 6 अच्छी प्लेटों को सेल कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)में रखें और उन्हें सीसीएम को ताज़ा किए बिना 6 दिनों के लिए अंतर करने दें।

2. मानव अल्वियोलर एपिथेलियल ऊतक का ट्रिपल सेल कोकल्चर मॉडल

नोट: यह अनुभाग 12 वेल प्लेट आवेषण के अनुरूप वॉल्यूम और सेल नंबरों पर निर्देश प्रदान करताहै। चित्रा 1 मॉडल असेंबली के लिए एक प्रस्तावित समय रेखा का सारांश देता है।

  1. एपिथेलियल सेल (A549 सेल लाइन) सीडिंग
    1. आपूर्तिकर्ता (एईटीसी) द्वारा प्रदान की गई सिफारिशों के अनुसार एपिथेलियल कोशिकाओं को संस्कृति। संक्षेप में, सीसीएम में कोशिकाओं को 80% सेल कन्फ्यूशियस (लगभग, 2x-3x प्रति सप्ताह) पर उपसंस्कृति।
      नोट: उपसंस्कृति A549 कोकल्चर मॉडल संरचना से पहले कम से कम चार मार्ग के लिए, 5-25 की एक मार्ग सीमा में A549 कोशिकाओं का उपयोग कर.
    2. 12 अच्छी प्लेटों में प्रीवार्म्ड सीसीएम के पिपेट 1.5 एमएल (कुओं की संख्या मॉडल की वांछित संख्या से मेल खाती है)।
    3. निष्फल चिमटी का उपयोग करके 12 अच्छी तरह से प्लेट के कुओं में व्यक्तिगत 12 अच्छी तरह से सेल संस्कृति सम्मिलित करता है।
    4. सबकुनृणान प्रोटोकॉल के अनुसार एक फ्लास्क से कोशिकाओं को अलग करना (यानी, एक अलग एजेंट का उपयोग करके, चरण 1.2.13 में किए गए अपकेंद्रित्र द्वारा एजेंट को हटा दें)। A549 के अंतिम सेल एकाग्रता के अनुरूप सीसीएम की उपयुक्त मात्रा में पुनर्सुस्ल व्यय (यहां, 50 x 104 कोशिकाएं/एमएल; प्रति डालने सेल निलंबन की 0.5 एमएल, यानी 25 x 104 कोशिकाएं/डालने, जो 27.8 x 104 कोशिकाओं/सेमी2)के बीज घनत्व से मेल खाती है।
    5. 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके डालने के एपिकल साइड में सेल सस्पेंशन (यानी, 25 x10 4 सेल/डालने) का पिपेट 0.5 एमएल।
    6. प्लेटों को ढक्कन से ढक कर 4 दिनों के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)में रखें।
      नोट: नियमित रूप से एक चरण के विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत A549 कोशिकाओं की उदारता की जांच करें ।
  2. एमडीडीसी सीडिंग
    1. एमडीडीसी युक्त 6 अच्छी तरह से प्लेटों में असंबद्ध कोशिकाओं के साथ सीसीएम को एस्पिरेट करें।
    2. प्रत्येक कुएं में ताजा प्रीवार्म्ड सीसीएम का 1 एमएल जोड़ें।
    3. प्रत्येक कुएं से सेल स्क्रैपर, अलग (स्क्रैप) अनुयायी एमडीडीसी का उपयोग करें, धीरे-धीरे सीसीएम 3x के मौजूदा 1 एमसीएल के साथ कुओं को धोएं, और उन्हें एक शंकुकेंद्रित ट्यूब में मिलाएं।
    4. सेल निलंबन के 10 माइक्रोन और ट्राइपैन ब्लू समाधान के 10 माइक्रोन का उपयोग करके ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन विधि का उपयोग करके सेल काउंटर के साथ कोशिकाओं की गणना करें।
    5. 1.2.13 चरण में किए गए सेल निलंबन को सेंट्रलाइज करें।
    6. पुनर्पिणन के लिए आवश्यक सीसीएम वॉल्यूम की गणना करें (समीकरण 5):
      आवश्यक एमडीडीसी घनत्व = 42 x 104 कोशिकाएं/ प्रत्येक सम्मिलन के लिए 6.3 x 104 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, जो 7 x 104 सेल/सेमी2 (यहां, 150 माइक्रोल के एक वरीयता प्राप्त कोशिका घनत्व से मेल खाती है, जो चरण 2.2.10 में0.9 सेमी 2 पर जोड़ा गया है।) ।
      सेल पुनर्पेंशन के लिए सीसीएम वॉल्यूम (वीएम; समीकरण 5):
      Equation 8
    7. धीरे-धीरे आवेषण पर A549 बढ़ने के साथ 12 अच्छी प्लेटों के ऊपरी कक्ष से सीसीएम को हटा दें और त्यागें।
    8. निष्फल चिमटी का उपयोग करके बाँझ पेट्री डिश में एक उल्टा स्थिति में A549 कोशिकाओं के साथ आवेषण रखें। पीबीएस के साथ एक शंकुकेंद्रितीय अपकेंद्रित्र ट्यूब (50 एमएल) तैयार करें और सेल स्क्रैपर को पूर्व-गीला करें।
    9. डालने की बेसल सतह से A549 कोशिकाओं को कुरेदना (यानी, उल्टा स्थिति में ऊपरी हिस्सा), जो आवेषण के छिद्रों के माध्यम से विकसित होना चाहिए।
      नोट: व्यक्तिगत नमूनों को खुरचने के बीच पीबीएस (एक ट्यूब में तैयार) के साथ स्क्रैपर कुल्ला और प्रक्रिया के दौरान गीला रखने के लिए ।
    10. अपकेंद्रित्र (चरण 2.2.5) पर, सुपरनेट को एस्पिरेट और त्यागें, फिर एमडीडीसी गोली को सीसीएम (चरण 2.2.6) की गणना की गई राशि में फिर से तैयार करें और 3x ऊपर और नीचे पिपेट करें।
    11. प्रत्येक सम्मिलन के शीर्ष पर सेल निलंबन का पिपेट 150 माइक्रोन ताकि डालने की पूरी बेसल सतह समान रूप से तरल से ढकी हो और बुलबुले न हो।
    12. एक ढक्कन के साथ पकवान को कवर करें और 70 मिनट के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखें। सेल कल्चर प्लेट्स (जहां आवेषण शुरू में रखे गए हैं) से सीसीएम को एस्पिरेट करें, इसे बायोहैजार्ड लिक्विड वेस्ट में छोड़ दें, और प्रत्येक कुएं में ताजा सीसीएम के 1.5 एमएल पिपेट करें। प्लेट को ढक्कन से ढककर सेल इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)में रखें।
      नोट: कोशिकाओं को सूखने से बचने के लिए ऊपर उल्लिखित समय अवधि से अधिक न करें।
    13. इनक्यूबेशन के बाद, ध्यान से प्रत्येक डालें को निष्फल चिमटी के साथ पकड़ें और उन्हें एक साधारण स्थिति में सीसीएम युक्त प्लेटों में रखें। प्लेट को ढक्कन से ढक कर सेल इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)में वापस कर दें।
  3. मैक्रोफेज (एमडीएम) सीडिंग
    1. प्रीव्यूगेटेड एमडीएम युक्त 6 अच्छी प्लेटें लें। उन्हें सेल इनक्यूबेटर से लेमिनार फ्लो हुड में रखें।
    2. 6 अच्छी तरह से प्लेटों में उगाए जाने वाले असंबद्ध एमडीएम के साथ सीसीएम को एस्पिरेट और त्यागें, और प्रत्येक कुएं में ताजा प्रीवार्म्ड सीसीएम का 1 मिलियन का पिपेट करें।
    3. सेल स्क्रैपर का उपयोग करके, धीरे-धीरे व्यक्तिगत कुओं से अनुयायी एमडीएम को हटा दें (जैसा कि एमडीडीसी के लिए चरण 2.2.3 में किया गया है)।
    4. एक अच्छी तरह से या ट्यूब में ट्राइपैन नीले रंग के पिपेट 10 माइक्रोन और 1:1 (v/v) के अंतिम कमजोर पड़ने को प्राप्त करने के लिए एमडीएम निलंबन के 10 μL जोड़ें । उचित मतगणना प्रोटोकॉल का उपयोग करके एमडीएम की संख्या गिनें।
    5. 1.2.13 चरण में किए गए सेल निलंबन को सेंट्रलाइज करें।
    6. आवश्यक मात्रा की गणना करें (समीकरण 6):
      आवश्यक एमडीएम घनत्व = सीसीएम में 2.5 x10 4 कोशिकाएं/एमएल (यहां, प्रत्येक सम्मिलन के लिए 0.5 एमएल सीसीएम में1.25 x 10 4 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, जो 1.4 x 104 सेल/सेमी2के वरीयता प्राप्त सेल घनत्व से मेल खाती है।
      Equation 10(6)
    7. अपकेंद्रित्र होने पर, सुपरनेट को एस्पिरेट करें और त्यागें, सीसीएम (चरण 2.3.6) की गणना की गई मात्रा में एमडीएम गोली को फिर से तैयार करें, और 3x ऊपर और नीचे पिपेट करें।
    8. 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके ए 549 और एमडीडीसी (सीधे एपिथेलियल कोशिकाओं पर नहीं) के साथ सेल कल्चर आवेषण की दीवार पर एमडीएम निलंबन (चरण 2.3.7 में तैयार) के 0.5 एमएल को ध्यान से पिपेट करें। ढक्कन के साथ प्लेटों को कवर करें और 24 घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)में रखें।
  4. एयर-लिक्विड इंटरफेस (अली) में कोकल्चर मॉडल का हस्तांतरण
    1. 24 घंटे (± 2 एच) के अंत में एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में इकट्ठे मॉडल की इनक्यूबेशन अवधि, कोशिका संस्कृति आवेषण और कुओं से दोनों apical और बेसल भागों से सीसीएम को त्यागना और त्यागना।
    2. निष्फल चिमटी का उपयोग करके, कुओं से व्यक्तिगत आवेषण उठाएं और 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से ताजा प्रीवार्म सीसीएम के पिपेट 0.6 एमएल उठाएं। डालने के एपिकल साइड में सीसीएम न जोड़ें।
    3. ढक्कन के साथ प्लेटों को कवर करें और आगे के उपयोग से पहले 24 घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)में रखें।

3. चयनित सकारात्मक नियंत्रणों के संपर्क में (प्रोइनफ्लेमेटरी प्रतिक्रिया को प्रेरित करने के लिए ज्ञात उत्तेजनाएं)

नोट: एक ज्ञात प्रोिनफ्लेमेटरी उत्तेजना एंडोटॉक्सिन लिपोपोलिसाकराइड (एलपीएस)7 और प्रोइनफ्लेमेटरी साइटोकाइन ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर α (टीएनएफ-α) 7 के लिए कोकल्चर मॉडल का एक्सपोजर मॉडल की जवाबदेही को समझाने के लिए कियाजाता है। इसके अलावा, एक डिटर्जेंट (ट्राइटन एक्स-100) के संपर्क में एक लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज़ (एलडीएच) परख की संवेदनशीलता की पुष्टि करने के लिए प्रयोग किया जाता है।

  1. सकारात्मक नियंत्रण समाधान तैयार करें: एलपीएस स्टॉक (आसुत पानी में 1 मिलीग्राम/एमएल), टीएनएफ-α स्टॉक (आसुत पानी में 100 μg/ml) और ट्राइटन-एक्स 100 (पीबीएस में 2% [v/v]) ।
  2. अली स्थितियों पर कूकल्चर मॉडल के 24 घंटे इनक्यूबेशन पर, बेसल डिब्बे से सुपरनेट को एस्पिरेट और त्याग दें। निष्फल चिमटी का उपयोग करके, कुओं से व्यक्तिगत आवेषण उठाएं और प्रत्येक कुएं में ताजा प्रीवार्म्ड सीसीएम के पिपेट 0.6 एमएल करें।
  3. सीसीएम में स्टॉक को शंकुकेंद्रित्र ट्यूबों में कमजोर करके व्यक्तिगत सकारात्मक नियंत्रण कार्य समाधान तैयार करें: 1 μg/mL एलपीएस, 1 μg/mL TNF-α, और 0.2% ट्राइटन-एक्स 100। वॉल्यूम परीक्षण आवेषण की संख्या के अनुरूप है (यहां, 100 μL/डालने)। 3x ऊपर और नीचे पाइपिंग करके समाधानों को अच्छी तरह से मिलाएं।
  4. सेल कल्चर डालने की दीवार पर धीरे-धीरे पाइपिंग करके प्रत्येक सकारात्मक नियंत्रण समाधान के 100 μL लागू करें। अच्छी तरह से प्लेट को ढक्कन के साथ कवर करें और सेल कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में 24घंटे के लिए रखें। इनक्यूबेशन पर, चिमटी का उपयोग करके व्यक्तिगत आवेषण पकड़कर डालने के एपिकल साइड पर तरल को एस्पिरेट और त्यागें।
  5. बेसल डिब्बों में सीसीएम एकत्र करें और आगे एलडीएच विश्लेषण के लिए 1) 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, कोशिका झिल्ली टूटना-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिकिटी को दर्शाता है, और/या 2) एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसोरबेंट परख (एलिसा) के माध्यम से प्रोटीन रिलीज के आगे विश्लेषण के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करते हैं । किट आपूर्तिकर्ता सिफारिशों के अनुसार परख चलाएं।
  6. सीसीएम को हटाने पर, पीबीएस 3x के साथ आवेषण धोएं और सेल कल्चर आवेषण पर कोशिकाओं को 4% [w/v] पैराफॉर्मल्डिहाइड (पीबीएस में, कमरे के तापमान पर 15 मिनट) में ठीक करें, यह सुनिश्चित करके कि दोनों डालने वाले पक्ष पीएफए समाधान के साथ अच्छी तरह से कवर किए गए हैं। बाद में पीएफए को हटाने के लिए पीबीएस के साथ 3x धोएं। आगे इम्यूनोदाता के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में डूबे नमूनों को स्टोर करें (इस विधि का एक उदाहरण पहले17वर्णित किया गया है)।

Representative Results

एल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं से बना मानव फेफड़ों के कूँण मॉडल, या तो ताजा या जमे हुए एमडीडीसी और एमडीएम जनक (यहां, मानव परिधीय रक्त-व्युत्पन्न मोनोसाइट्स) से इकट्ठे किए गए थे। जैसा कि चित्रा 1में प्रस्तुत किया गया है, A549 कोशिकाओं को मोनोसाइट अलगाव/विगलन से जुड़े पहले खंड के 3 दिन बाद वरीयता प्राप्त किया गया था । 6 दिनों के भेदभाव के बाद, विभेदित एमडीएम गोल आकार का दिखाई दिया, जबकि एमडीडीसी ने अवलोकन फलाव के साथ एक अधिक विस्तारित आकार का गठन किया। वे समूह के रूप में भी दिखाई दिए, खासकर जब ताजा मोनोसाइट्स(चित्र 2, चित्र 3)से अलग हो जाते हैं। एपिथेलियल कोशिकाओं ने झिल्ली आवेषण(चित्रा 4)पर विकास के 3 दिनों के बाद कोशिकाओं की एक घनी कोशिका परत बनाई, जब cocultures इकट्ठे किए गए थे। कोडांतरण के 24 घंटे और अली शर्तों के अधीन होने के एक अतिरिक्त 24 घंटे के बाद, cocultures जोखिम के लिए तैयार किया गया ।

3 डी सेल संस्कृति मॉडल की जवाबदेही एक छद्म-अली दृष्टिकोण का उपयोग कर ज्ञात प्रोइनफ्लेमेटरी उत्तेजनाओं के संपर्क में आने पर जांच की गई थी, जैसा कि पहले29वर्णित है। प्रोइनफ्लेमेटरी उत्तेजनाओं, एलपीएस और टीएनएफ-α को हवा से उजागर सेल मॉडल की एपिकल सतह पर कम मात्रा (100 माइक्रोएल) में जोड़ा गया था। समानांतर में, साइटोटॉक्सिकिटी के उपाय के रूप में झिल्ली टूटने की अनुपस्थिति का आकलन एलडीएच परख के माध्यम से किया गया था। बेसल डिब्बे के सीसीएम में एलडीएच रिलीज में एक महत्वपूर्ण वृद्धि झिल्ली टूटना, एक डिटर्जेंट ट्राइटन-एक्स 100(चित्रा 5)के लिए सकारात्मक नियंत्रण के संपर्क में आने पर देखी गई। इन परिणामों ने एक साइटोटॉक्सिक पदार्थ के लिए मॉडल की जवाबदेही साबित की, जबकि एलडीएच रिलीज में कोई वृद्धि टीएनएफ-α या एलपीएस के साथ एपिकल उत्तेजना पर नहीं देखी गई।

या तो ताजा या पहले जमे हुए PBMs के साथ इकट्ठे नमूनों में LDH के विभिन्न मापा मूल्यों के लिए एक संभावित कारण नमूना भंडारण के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । ताजा पीबीएमएस से नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर लंबे समय तक संग्रहीत किए गए थे; इसलिए, एलडीएच एंजाइम की गतिविधि गिर सकती है। विशेष रूप से, एलडीएच सीसीएम में केवल 4 दिनों तक स्थिर है; इस प्रकार, सुपरनेटेंट को इकट्ठा करने के बाद नवीनतम 2 दिनों में परख करने की सिफारिश की जाती है। वैकल्पिक रूप से, संग्रह के बाद सीधे सुपरनेटेंट को फ्रीज करना संभव है। हालांकि, यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि ठंड एलडीएच की एंजाइमेटिक गतिविधि को कम कर सकती है।

बेसल सीसीएम में प्रोइनफ्लेमेटरी मध्यस्थों (यहां, टीएनएफ-α और इंटरल्यूकिंस 6 [आईएल-6] और 8 [आईएल-8]) का स्राव एलिसा के माध्यम से निर्धारित किया गया था। सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण (पी एंड एलटी; 0.05, वन-वे एनोवा) आईएल-6 और आईएल-8 की रिहाई में संबंधित अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में एलपीएस-और टीएनएफ-α-उपचारित नमूनों में देखा गया, साथ ही सेल संस्कृति मॉडल में या तो पीबीएमएस स्रोत(चित्रा 6)से इकट्ठे हुए। हालांकि बेसल सीसीएम में सभी परीक्षण किए गए साइटोकिन्स की सांद्रता (पीजी/एमएल) ताजा पीबीएम से बनी cocultures में अधिक थी, लेकिन दो cocultures और मोनोकल्चर के बीच मतभेद सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं थे (पी और जीटी; ०.०५)(चित्र 6)। 2डी एपिथेलियल सेल कल्चर के संबंध में कोकल्चर मॉडल के अतिरिक्त मूल्य की पुष्टि करने के लिए, A549 मोनोकल्चर भी एलपीएस या टीएनएफ-α के संपर्क में थे। जैसा कि उम्मीद थी, A549 मोनोकल्चर से सभी जांच मध्यस्थों की रिहाई दोनों सहसंस्कृति मॉडल की तुलना में कम थी; हालांकि, उनके बीच का अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं था (पी एंड जीटी; 0.05, वन-वे एनोवा)।

3 डी मानव अल्वियोलर एपिथेलियल ऊतक बाधा के सेलुलर आकृति विज्ञान कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (एलएसएम) के माध्यम से मूल्यांकन किया गया था। प्रत्येक मॉडल की संरचना की कल्पना करने के लिए, कोकल्चर मॉडल (एमडीएम) के भीतर मैक्रोफेज परिपक्व मैक्रोफेज मार्कर 25F9 से सना हुआ था। एमडीडीसी सीडी 83 से सना हुआ था, जो सक्रिय डेंड्रिटिक कोशिकाओं30के लिए एक महत्वपूर्ण मार्कर है। सेलुलर आकृति विज्ञान के बारे में, गल पीबीएमएस का उपयोग करने वालों की तुलना में ताजा पीबीएमएस से एमडीएम और एमडीडीसी का उपयोग करके कोकल्चर मॉडलों के बीच कोई अंतर नहीं देखा गया था। एलपीएस-और टीएनएफ-α-उजागर cocultures में, दोनों ताजा और जमे हुए प्रतिरक्षा कोशिकाओं से बना है, LSM छवियों में एक बाधित epithelial परत मनाया गया था, जो अनुपचारित कोशिकाओं में मामला नहीं था(चित्रा 7, चित्रा 8)।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध समय रेखा। 3 डी कोकल्चर मॉडल तैयारी, असेंबली और एप्लिकेशन (परीक्षण पदार्थ के संपर्क में) की प्रस्तुति। अली = एयर-लिक्विड इंटरफेस, एमडीडीसी = मोनोसाइट-व्युत्पन्न डेंड्रिटिक कोशिकाएं, एमडीएम = मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज, पीबीएमएस = परिधीय रक्त मोनोसाइट्स। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2: नए पीबीएमएस से अलग एमडीएम और एमडीडीसी। ताजा पीबीएम (सेल अलगाव के 6 दिन बाद) से विभेदित(ए)एमडीएम और(बी)एमडीडीसी की चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी छवि। एमडीएम गोल आकार के होते हैं, जबकि एमडीडीसी अक्सर समूह के रूप में मनाए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: जमे हुए पीबीएमएस से एमडीएम और एमडीडीसी अलग। गल पीबीएमएस (विगलन के 6 दिन बाद) से विभेदित(ए)एमडीएम और(बी)एमडीडीसी की चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी छवि। एमडीएम गोल आकार के होते हैं, लेकिन कुछ लम्बी कोशिकाओं को देखा जा सकता है। एमडीडीसी भी फलाव के साथ गोल आकार के दिखाई देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: झिल्ली आवेषण पर एपिथेलियल कोशिकाओं का विकास। चरण के विपरीत एक झिल्ली पर बढ़ रही है A549 की सूक्ष्मकॉपी छवि बोने के 4 दिन बाद एक झिल्ली डालें, कोशिकाओं की एक घनी परत बनाने । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: साइटोटॉक्सिकिटी परिणाम झिल्ली टूटना आधारित (LDH) परख के माध्यम से जांच की । डेटा अनुपचारित कोशिकाओं पर एक गुना वृद्धि के रूप में प्रस्तुत किया है (मतलब ± एसडी, एन = 3, तारांकन अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में सांख्यिकीय महत्वपूर्ण वृद्धि को दर्शाता है, * * पी & 0.01, *****p< 0.0001)। हरे रंग के मॉडल में नए पीबीएमएस से एमडीएम और एमडीडीसी का प्रतिनिधित्व किया जाता है, और गल गए पीबीएमएस से इकट्ठे हुए बैंगनी मॉडलों में प्रतिनिधित्व किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6: सहसंस्कृतियों और मोनोकल्चर में प्रोइनफ्लेमेरेटरी प्रतिक्रियाएं। प्रोइनफ्लेमेटरी मध्यस्थ (टीएनएफ-α, आईएल-6, और आईएल-8) एलपीएस या टीएनएफ-α के साथ 24 घंटे की चुनौती पर cocultures में जारी करते हैं। डेटा अनुपचारित कोशिकाओं के सापेक्ष के रूप में प्रस्तुत किया जाता है (मतलब ± एसडी, एन = 3, **p & 0.01, ***p< 0.001, ****p< 0.0001)। हरे रंग के मॉडल में नए पीबीएमएस से एमडीएम और एमडीडीसी का प्रतिनिधित्व किया जाता है, और गल गए पीबीएमएस से इकट्ठे हुए बैंगनी मॉडलों में प्रतिनिधित्व किया जाता है। ग्रे A549 मोनोकल्चर का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: ताजा प्रतिरक्षा कोशिकाओं से बना कॉकल्चर की आकृति विज्ञान। ताजा पीबीएमएस से एमडीएम और एमडीडीसी का उपयोग करके मॉडल के एपिकल पक्षों के xz अनुमानों के साथ कोकलरी मॉडल के एपिकल और बेसल पक्षों की एलएसएम छवियां। सियान न्यूक्लियी (डीएपीआई) का प्रतिनिधित्व करता है, मैजेंटा साइटोस्केलेटन (रोडामाइन-फ्लायोडिन) का प्रतिनिधित्व करता है, सफेद एमडीएम (25F9) का प्रतिनिधित्व करता है, और ग्रीन एमडीडीसी (सीडी 83) का प्रतिनिधित्व करता है। सफेद तीर एमडीएम को दर्शाता है, जबकि हरा तीर एमडीडीसी को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: जमे हुए प्रतिरक्षा कोशिकाओं से बना cocultures की आकृति विज्ञान। इसी xz अनुमानों के साथ coculture मॉडल के apical पक्ष के एलएसएम छवियां, और गल PBMs से एमडीएम और एमडीडीसी का उपयोग कर मॉडल के बेसल पक्ष । सियान नाभिक (DAPI) का प्रतिनिधित्व करता है, मैजेंटा साइटोस्केलेटन (रोडामाइन-हल्लोइडिन) का प्रतिनिधित्व करता है, सफेद एमडीएम (25F9) का प्रतिनिधित्व करता है, और हरे रंग एमडीडीसी (सीडी ८३) का प्रतिनिधित्व करता है । सफेद तीर एमडीएम को दर्शाता है, जबकि हरा तीर एमडीडीसी को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

रसायनों और दवाओं सहित उपन्यास सामग्रियों के उभरते उत्पादन, धीरे-धीरे इन विट्रो मॉडल की आवश्यकता बढ़ जाती है। पशु परीक्षण,32के प्रतिस्थापन, कमी और शोधन के तीन सिद्धांतों का अनुपालन करने के लिए, इन विट्रो सेल मॉडल दवा या सामग्री की कार्रवाई8,9,10, 11,11के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए प्रतिस्थापन और कमी पहलू के बारे में शक्तिशाली उपकरण बन गए हैं।, यहां प्रस्तुत प्रतिरक्षा कोशिकाओं का उपयोग करके बहुकोशिकीय मॉडल को कोडांतरण करने का एक विस्तृत प्रोटोकॉल है जो पहले जमे हुए मोनोसाइट्स से या तो हौसले से अलग या गल जाते हैं। यह भी बताया अली में मॉडल की खेती है । अंत में, प्रोटोकॉल प्रोइनफ्लेमेटरी उत्तेजनाओं के संपर्क का एक उदाहरण दिखाता है और ताजा या जमे हुए मोनोसाइट्स वाले दो मॉडलों की प्रतिक्रिया की तुलना करता है।

पारंपरिक जलमग्न,एक्सपोजर7,22,31की तुलना में अली परिस्थितियों में विकसित और उजागर मॉडलों की बढ़ी हुई जटिलता के अतिरिक्त मूल्य की पुष्टि और औचित्य सिद्ध करने के लिए विभिन्न अध्ययन किए गए हैं । एपिथेलियल कोशिकाओं की मोनोकल्चर की तुलना में कोकल्चर में उच्च प्रोइनफ्लेमेटरी प्रतिक्रिया का अवलोकन पिछले अध्ययन की पुष्टि करता है। अध्ययन में प्रस्तुत कॉकल्चर मॉडल (एलपीएस के साथ उत्तेजित) का उपयोग किया गया और A549 मोनोकल्चर समकक्ष मॉडल7की तुलना में टीएनएफ और आईएल1बी के जीन अभिव्यक्ति स्तरों पर उच्च प्रतिक्रिया दिखाई गई। दूसरी ओर, दोनों मॉडलों ने A549 मोनोकल्चर की तुलना में मापा प्रोइनफ्लेमेटरी मध्यस्थ रिलीज मूल्यों के भीतर उच्च भिन्नता दिखाई। यह जैविक पुनरावृत्ति (यानी, एक पुनरावृत्ति, एक दाता) के भीतर विभिन्न दानदाताओं (बफी कोट) से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के उपयोग से समझाया जा सकता है, जैसा कि पहले7दिखाया गया था। यदि वांछित है, तो प्रतिकृति के बीच विविधताओं को 1 से दूर किया जा सकता है) एक ही दाता या 2 से गल गए पीबीएमएस का उपयोग करके) कोशिकाओं को ठंडा करने से पहले विभिन्न दानदाताओं से PBMs पूलिंग, फिर प्रत्येक पुनरावृत्ति में एक ही पूल का बाद में उपयोग। अधिक जैविक पुनरावृत्ति सहित भी सिफारिश की जाती है।

सेल-फ्रीजिंग तकनीक को एक महत्वपूर्ण कदम माना जा सकता है; हालांकि, यह फेनोटाइपिक और कार्यात्मक विश्लेषण के लिए कोशिकाओं के संरक्षण के लिए एक आम प्रयोगशाला प्रक्रिया है। विभिन्न अध्ययनों से पता चला है कि जमे हुए पीबीएमएस की गुणवत्ता उनके अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है, और एक उपयुक्त ठंड तकनीक28,,32को समान कोशिकाओं के साथ बाद के परख की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। प्रोटोकॉल का संशोधन PBMs को फ्रीज करके किया जा सकता है, जो प्रायोगिक सेटअप में लचीलापन प्रदान करता है, क्योंकि बफी कोट की उपलब्धता आमतौर पर सीमित होती है। ताजा अलग लोगों पर जमे हुए PBMs (कई शीशियों में) का उपयोग करने का एक और लाभ यह है कि वे बाद के प्रयोगों में भी 1 साल के बाद इस्तेमाल किया जा सकता है । यह दाता के संभावित मुद्दे को कम कर देता है दाता परिवर्तनशीलता अगर यह एक प्रयोगात्मक में एक वांछित या आवश्यक पैरामीटर है ।

13 महीनों तक के बाद किए गए अंतरअधिकारी तुलना के परिणाम बताते हैं कि पीबीएमएस, जब तरल नाइट्रोजन टैंक में ठीक से संग्रहीत होता है, तो सेल व्यवहार्यता या सेल रिकवरी33पर किसी भी प्रभाव के बिना लंबी अवधि में उपयोग किया जा सकता है। लंबे भंडारण समय (1 वर्ष से अधिक) एक प्रयोग करने से पहले सेल व्यवहार्यता और सेल जवाबदेही के सावधानीपूर्वक सत्यापन पर संभव हो सकता है। इसके अलावा, तरल नाइट्रोजन टैंक में तापमान हर समय स्थिर रहना चाहिए। क्रायोप्रीवित पीबीएमएस की व्यवहार्यता को प्रभावित करने वाला मुख्य कारक 10%-20% (v/v)28की इष्टतम एकाग्रता के साथ डीएमसो एकाग्रता पाया गया । ठंड के संभावित हानिकारक प्रभावों को कम करने के लिए, प्रोटीन, एफबीएस या बीएसए के विभिन्न स्रोतों (40% से 100%34तक एकाग्रता की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ) अक्सर प्राकृतिक सुरक्षात्मक घटकों के रूप में ठंड माध्यम में जोड़े जाते हैं जो सेल अस्तित्व को बढ़ा सकते हैं।

डीएमएसओ की उच्च साइटोटॉक्सिक क्षमता के कारण, एफबीएस में पीबीएमएस को तितर-बितर करने के लिए पहले सिफारिश की जाती है, फिर एफबीएस में पहले से फैले पीबीएमएस में डीएमएसओ को जोड़ें। विशेष रूप से, हालांकि उच्च एफबीएस सांद्रता (>40%) सेल व्यवहार्यता में कोई सुधार नहीं दिखाया, एक ही समय में, वे कोशिकाओं को नुकसान नहीं हुआ28. फिर भी, सीमित बफी कोट उपलब्धता के मुद्दों पर काबू पाने के लिए फ्रीजिंग मोनोसाइट्स एक संभावित दृष्टिकोण है। हालांकि, यदि ताजा पीबीएमएस से एमडीडीसी और एमडीएम का उपयोग वांछित है, तो प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग किया जा सकता है और अलगाव,7,16, 17, 35, 36,,37 के बाद7,,5-8दिनों का उपयोग किया जा36सकताहै।17 यदि प्रायोगिक योजना की अनुमति देता है, तो एमडीडीसी और एमडीएम दोनों में कम से कम 6 दिनों के भेदभाव की सिफारिश की जाती है। हालांकि, एक ही प्रयोग में विभिन्न पुनरावृत्ति के बीच स्थिरता, उनके विशिष्ट सतह मार्कर अभिव्यक्ति के नियमित निरीक्षण के साथ, महत्वपूर्ण हैं । भेदभाव के समय के बाद एलपीएस जैसे प्रोइनफ्लेमेटरी उत्तेजना के प्रति जवाबदेही की भी नियमित रूप से जांच की जानी चाहिए ।

A549 सेल लाइन का उपयोग करके कई जांचें अली में की गई हैं, या तो मोनोकल्चर के रूप में या अन्य सेल प्रकारों (मैक्रोफेज, डेंड्रिटिक कोशिकाओं, या फाइब्रोब्लास्ट) के साथ संयुक्त 3 डी कोकल्चर मॉडल22, 24,,29,,,38में।29 इस 3 डी कोकल्चर मॉडल का उपयोग करके, साइटोटॉक्सिकिटी, ऑक्सीडेटिव तनाव, या (नैनो-) सामग्रियों के प्रोइनफ्लेमेटरी प्रभावों की,जांच 72 घंटे1, 17,21, 24,,,,2129तक की गई है।29 वीवो ऊतक में मॉडल की समानता पहले मॉडल16के कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग इमेजिंग के आधार पर जांच की गई है । मॉडल को कोडांतरण करते समय, सेल प्रसार (जो यहां प्रस्तुत मॉडल में A549 को प्रभावित कर सकता है) के साथ-साथ प्राथमिक (प्रसार नहीं) प्रतिरक्षा कोशिकाओं (यहां, एमडीडीसी और एमडीएम) के प्रदर्शन पर विचार करना महत्वपूर्ण है। यह भी विचार करना महत्वपूर्ण है कि सभी सीडी 14 सकारात्मक मोनोसाइट्स एमडीडीसी और एमडीएम में अंतर नहीं करते हैं, और कोशिकाएं संलग्न और निलंबित दोनों रूपों में मौजूद हो सकती हैं। कोसंस्कृति असेंबली की प्रकृति के आधार पर (यहां, दोनों सेल प्रकारों को मौजूदा एपिथेलियल परत से संलग्न करने की आवश्यकता होती है), दोनों प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों की केवल अनुयायी उप-आबादी का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। इसके अतिरिक्त, एलपीएस के लिए मोनोसाइट्स, एमडीडीसी और एमडीएम मोनोकल्चर जवाबदेही के नियमित विश्लेषण, और विशिष्ट सतह मार्कर (सीडी 14, सीडी 163, सीडी 86, सीडी 93, या सीडी 206, डेटा नहीं दिखाए गए) की अभिव्यक्ति ने सुझाव दिया है कि 6 और 7 दिनों का भेदभाव इष्टतम समय बिंदु हैं।

यद्यपि मानव फेफड़ों में अल्वियोलर एपिथेलियल कोशिकाओं की एक यथार्थवादी संख्या ~ 160,000 कोशिकाओं/सेमी2से मेल खाती है, लेकिन मॉडल में गिने जाने वाले A549 कोशिकाओं की संख्या ~ 1,000,000 कोशिकाओं/सेमी2 है 9 दिनों के बाद16,,18पर सुसंस्कृत । इस प्रकार, इस इन विट्रो मॉडल की सीमाओं पर विचार करने की आवश्यकता है। सबसे पहले, एपिथेलियल कोशिकाओं का घनत्व बढ़ती झिल्ली पर एक ढुलमुल परत बनाने की उनकी क्षमता के आधार पर स्थापित किया गया था। यह भी उल्लेख करना महत्वपूर्ण है कि A549 एक क्यूबोइडल रूप के साथ एक एपिथेलियल प्रकार II सेल का प्रतिनिधित्व करता है, एपिथेलियल प्रकार I कोशिकाओं के विपरीत, जो फ्लैट और आउटस्प्रेड हैं। दूसरी ओर, साहित्य के आधार पर प्रतिरक्षा कोशिकाओं की आवश्यक संख्या स्थापित की गई थी और इस प्रोटोकॉल में सेल संख्या/सतह,क्षेत्र39,40,41के रूप में प्रस्तुत किया गया था।, 400 कोशिकाओं/मिमी 2 (4 कोशिकाओं/सेमी22) 16 की सीमा में एमडीडीसी का कोशिका घनत्व 500-750 कोशिकाओं/मिमी 2 (5-7 कोशिकाओं/सेमी2) के स्थिर-राज्य कोशिका घनत्व के बराबर है जो वीवो अध्ययन39में से सूचित किया गया है।2 इस मॉडल में एमडीएम का घनत्व मानव अल्वियोलर क्षेत्र40में वीवो की स्थिति में समान है।

परिपक्व मैक्रोफेज मार्कर स्टेनिंग (25F9) दोनों एपिकल साइड (जहां एमडीएम मौजूद हैं) के साथ-साथ बेसल साइड (यानी, डेंड्रिटिक कोशिकाओं की साइट पर) में देखा गया था। झिल्ली आवेषण छिद्रों के माध्यम से प्रतिरक्षा कोशिकाओं का स्थानांतरण संभव है और इस मॉडल16का उपयोग करके भी देखा गया है, जो धुंधला तीव्रता में मनाया मतभेदों को समझा सकता है। हालांकि, एक और संभावित स्पष्टीकरण यह है कि परिपक्व मैक्रोफेज मार्कर को डेंड्रिटिक कोशिकाओं पर भी व्यक्त किया जा सकता है, लेकिन अभिव्यक्ति अत्यधिक दाता-विशिष्ट42है। इसके अलावा, एमडीएम(चित्रा 7, चित्रा 8)में 25F9 अभिव्यक्ति की तीव्रता बहुत अधिक है। प्रोइनफ्लेमेटरी उत्तेजनाओं (एलपीएस और टीएनएफ-α) दोनों कोकल्चर(चित्र 7, चित्रा 8)में फेफड़े के एपिथेलियल बैरियर की अखंडता को प्रभावित किया। यह पिछले प्रकाशनों43,,44 के आधार पर अपेक्षित था जिसमें यह दर्शाया गया था कि प्रोिनफ्लेमेटरी साइटोकिन्स और बैक्टीरियल उत्पाद एपिथेलियल बाधाओं की अखंडता को बाधित करते हैं।

मानव अल्वियोलर एपिथेलियम का 3 डी बहुकोशिकीय मॉडल, जो पहले,17 में स्थापितऔर विशेषता है, ने विट्रो,21, 24, 25,,2445में जैविक प्रतिक्रियाओं (यानी, तीव्र प्रोइनफ्लेमेटरी प्रतिक्रियाओं, ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिक्रिया, कण वितरण और सेलुलर संचार) का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली और उपयोगी उपकरण के रूप में कार्य किया है।25 परिणाम कोकल्चर मॉडल की उत्तरदायीता की पुष्टि करते हैं ताकि उत्तेजक उत्तेजनाओं (यहां, एलपीएस और टीएनएफ-α) को आगे बढ़ने के लिए कहा जा सके। ताजा PBMs से प्रतिरक्षा कोशिकाओं का उपयोग करते समय प्रतिक्रिया थोड़ी बढ़ गई थी; हालांकि, ताजा बनाम गल पीबीएमएस का उपयोग करके cocultures के बीच कोई सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। इसके अलावा, दोनों कोकल्चर मॉडल की प्रोइनफ्लेमेटरी प्रतिक्रियाएं एक ही (अली) स्थितियों के तहत खेती की गई एपिथेलियल सेल मोनोकल्चर की तुलना में अधिक थीं। संक्षेप में, प्रोटोकॉल एमडीएम और एमडीडीसी में भेदभाव के लिए या तो ताजा या गल पीबीएमएस का उपयोग करके 3 डी मानव अल्वोलार एपिथेलियल ऊतक कॉकल्चर मॉडल की असेंबली का वर्णन करता है। यह दिखाया गया है कि दोनों मॉडल प्रोइनफ्लेमेटरी उत्तेजनाओं के लिए अत्यधिक उत्तरदायी हैं; इसलिए, वे संभावित खतरे और विषाक्तता आकलन के लिए शक्तिशाली उपकरण के रूप में काम कर सकते हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक चित्रा 3 में कोकल्चर योजना के लिए डॉ मिगुएल स्पुच-कलवर और क्रिटिकल रीडिंग के लिए डॉ बेदिया बेगम कराकोक को धन्यवाद देना चाहते हैं । इस अध्ययन को गश्ती परियोजना, यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम द्वारा अनुदान समझौते के तहत कोई 760813, और एडॉल्फे मर्कल फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था। बी.डी. वित्तीय सहायता के लिए पीटर एंड ट्राडल एंगेलहॉर्न फाउंडेशन को धन्यवाद देता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benchmark microplate reader does not have to be specific, for example BioRad, Cressier, Switzerland
Cell culture Incubator does not have to be specific
Cell freezing container (for example Mr. Frosty) does not have to be specific
Centrifuge does not have to be specific
Confocal laser scanning microscope does not have to be specific, for example Zeiss LSM 710 meta
Heamatocytometer, or automatic cell counter does not have to be specific
Laminar bio-safety hood class II does not have to be specific
MultiStand Macs (Macs Cell Separator) Miltenyi, Germany 130-042-303
pH meter does not have to be specific
Phase contrast inverted light microscope does not have to be specific
Pipette boy, pipettors (different volumes) do not have to be specific
Scissors do not have to be specific
Vacuum pump does not have to be specific
Water bath does not have to be specific
Disposable small equipment/glassware Catalogue Number
15 mL and 50 mL conical centrifuge tubes does not have to be specific
6- and 12-well cell culture plates, flat bottom, low evaporation lid, sterile Falcon, Switzerland 353046 and 353043
Cell culture inserts, transparent PET membrane, 12-well, 3 μm pore size Falcon, Switzerland 353181
Cell scrapper does not have to be specific, for example VWR, Switzerland 353085
Cryovials do not have to be specific
Glass autoclaved Petri Dishes do not have to be specific
LS Columns Miltenyi, Germany 130-042-401
Sterile filtration cup for vacuum filtration, 0.2 μm pore size does not have to be specific, for example VWR, Switzerland 10040-446
Sterile Lab Bottle compatible with Filtration cup (min. 100 mL) does not have to be specific
Sterile pipettes do not have to be specific
Chemicals
Bovine serum albumine (BSA) Sigma-Aldrich, Switzerland A7030-100g
CD14+ MicroBeads human - magnetic beads Miltenyi, Germany 130-097-052
Deattachnig agent Trypsin-EDTA, 0.05%, phenol red Gibco, Switzerland 25300054
Density gradient medium Lymphoprep Alere Technologies AS, Norway 1114547
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich, Switzerland D2438
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich, Switzerland E6758-100g
Fetal bovine serum (heat inactivated) Gibco, Switzerland 10270-106
Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), premium grade Miltenyi, Germany 130-093-864
Human Interleukin 4 (IL-4), premium grade Miltenyi, Germany 130-095-373
Human macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), premium grade Miltenyi, Germany 130-096-485
L-glutamine Gibco, Switzerland 25030-024
Lipopolysaccharid (LPS) from Escherichia coli Sigma-Aldrich, Switzerland 4524-5mg
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich, Switzerland 158127
Penicilin-Streptomycin Gibco, Switzerland 15140-122
Phosphate Buffer Saline (PBS) Gibco, Switzerland 10010-015
Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI) Gibco, Switzerland 42401-018
Triton X-100 Sigma-Aldrich, Switzerland T8787
Trypan blue solution (0.4%) Sigma Aldrich, Switzerland
Tumor necrosis factor alpha (TNF-α) Immunotools 11343015
Assays used for cytotoxicity, (pro-)inflammatory response
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) Roche, Switzerland 11644793001
Human IL-6 DuoSet ELISA R&D, Biotechne, Switzerland DY206
Human IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA R&D, Biotechne, Switzerland DY208
Immunostaining
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), concentration 2 μg/mL Sigma-Aldrich, Switzerland 10236276001
Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugated, concentration 20 μg/mL Abcam, UK ab150115
Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L) Dylight 488 conjugated, concentration 10 μg/mL Agrisera, Sweden AS09 633
Mature Macrophage Marker Monoclonal Antibody, concentration 50 μg/mL eBioScience, Thermo Fischer, Switzerland 14-0115-82
Phalloidin rhodamine, concentration 0.264 µM Molecular Probes, Life Technologies, Switzerland R415
Recombinant Anti-CD83 antibody, 1:50 dillution Abcam, UK ab244204

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जीव विज्ञान अंक 159 मानव फेफड़ों कोसंस्कृतियों 3 डी मानव cocultures एयर-लिक्विड इंटरफेस मानव परिधीय रक्त मोनोसाइट्स के अलगाव प्राथमिक मैक्रोफेज और डेंड्रिटिक कोशिकाओं क्रायोप्रीवित प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं
मल्टीसेलुलर ह्यूमन अल्वेलर मॉडल एपिथेलियल कोशिकाओं और प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं से बना है जो हैज़र्ड असेसमेंट के लिए है
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Barosova, H., Drasler, B.,… More

Barosova, H., Drasler, B., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B. Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment. J. Vis. Exp. (159), e61090, doi:10.3791/61090 (2020).

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