Nuvarande metoder för att mäta alkoholkänslighet i Drosophila är utformade för att testa grupper av flugor. Vi presenterar en enkel, billig, hög genomströmning analys för att bedöma alkohol sedering känslighet i ett stort antal enstaka flugor. Metoden kräver inte specialiserade verktyg och kan utföras i alla laboratorier med gemensamma material.
Drosophila melanogaster ger en utmärkt modell för att studera den genetiska underbyggnad av alkohol känslighet. I motsats till studier i mänskliga populationer tillåter Drosophila-modellen strikt kontroll över genetisk bakgrund, och praktiskt taget obegränsat antal individer av samma genotyp kan födas upp snabbt under välkontrollerade miljöförhållanden utan lagstadgade restriktioner och till relativt låg kostnad. Flugor som utsätts för etanol genomgår fysiologiska och beteendemässiga förändringar som liknar mänsklig alkoholförgiftning, inklusive förlust av postural kontroll, sedering och utveckling av tolerans. Här beskriver vi en enkel, billig, hög genomströmningsanalys för bedömning av alkoholsederingskänslighet i ett stort antal enstaka flugor. Analysen är baserad på videoinspelning av enstaka flugor som introduceras utan anestesi i 24-brunnscellodlingsplattor i en uppsättning som möjliggör synkron initiering av alkoholexponering. Systemet gör det möjligt för en enda person att samla in individuella etanolsederingsdata på så många som 2 000 flugor inom en 8 h arbetsperiod. Analysen kan i princip utvidgas för att bedöma effekterna av exponering för flyktiga ämnen och tillämpas för att mäta effekterna av akut toxicitet hos flyktiga ämnen på andra insekter, inklusive andra flugarter.
National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism rapporterar att 2015 drabbades uppskattningsvis 16 miljoner människor i USA av överdriven alkoholkonsumtion, som betecknades som “alkoholmissbruk”. Alkoholmissbruk orsakar ett brett spektrum av negativa fysiologiska effekter och är en viktig dödsorsak i USA. Hos människor, minskad känslighet, eller en låg nivå av svar på alkohol, har en stark genetisk komponent och är associerad med en högre risk att utveckla alkoholmissbruk störningar1,2,3,4. Genetiska riskstudier på humanpopulationer är utmanande på grund av populationsblandning, olika utvecklingshistorik och miljöexponeringar och beroende av självrapporterade frågeformulär för att kvantifiera alkoholrelaterade fenotyper, som ofta blandas ihop med andra neuropsykiatriska tillstånd.
Drosophila melanogaster ger en utmärkt modell för att studera den genetiska underbyggnad av alkohol känslighet5,6,7,8. Drosophila-modellen tillåter strikt kontroll över genetisk bakgrund, och praktiskt taget obegränsat antal individer av samma genotyp kan födas upp snabbt under välkontrollerade miljöförhållanden utan lagstadgade begränsningar och till relativt låga kostnader. Förutom offentligt tillgängliga mutationer och RNAi-linjer som riktar sig mot en majoritet av generna i genomet, har tillgången på Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP), en population av 205 inavlade vildhärledda linjer med kompletta genomsekvenser, möjliggjort genomomfattande associationsstudier9,10. Sådana studier har identifierat genetiska nätverk i samband med effekter på utvecklingstid och lönsamhet vid utvecklingsexponering för etanol11,12. Evolutionärt bevarande av grundläggande biologiska processer gör det möjligt att dra översättningsinfereringar genom att lägga människans ortologer ovanpå sina motsvarigheter i flugan.
Flugor som utsätts för etanol genomgår fysiologiska och beteendemässiga förändringar som liknar mänsklig alkoholförgiftning, inklusive förlust av postural kontroll8, sedering, och utveckling av tolerans13,,14,15. Alkoholinducerad sedering i Drosophila kan kvantifieras med hjälp av inebriometers. Dessa är 122 cm långa vertikala glaspelare med sneda nätpartitioner som flugor kan fästa16,17,18. En grupp på minst 50 flugor (kön kan analyseras separat) införs i toppen av kolonnen och utsätts för etanolångor. Flugor som förlorar postural kontroll faller genom kolonnen och samlas in med 1 min mellanrum. Den genomsnittliga elutiontiden fungerar som ett mått på känslighet för alkoholförgiftning. När flugor utsätts för alkohol en andra gång efter att ha återhämtat sig från den första exponeringen, kan de utveckla tolerans, vilket framgår av en förskjutning i genomsnittlig elueringstid13,15,19,20. Medan inebriometer analyser har lett till identifiering av gener, genetiska nätverk och cellulära vägar i samband med alkohol sedering känslighet och utveckling av tolerans12,13,,14,21, analysen är tidskrävande, låg genomströmning, och ineffektiva för att mäta alkoholkänslighet i enstaka flugor.,
Alternativa etanolsedationsanalyser som inte kräver den utarbetade inebriometerupplägget möjliggör bekvämare mätningar men som fortfarande är begränsade i genomströmning och kräver i allmänhet analyser av grupper av flugor i stället förindividerna 21,,22,23,,24,25. Bedömning av enskilda flugor minimerar risken för störande effekter på grund av gruppinteraktioner, såsom de som härrör från sociala beteenden. Här presenterar vi en enkel, billig, hög genomströmningsanalys för bedömning av alkoholsederingskänslighet i ett stort antal enstaka flugor.
Här presenterar vi en enkel, billig och hög genomströmning metod för att bedöma sedering tid på grund av etanol exponering i Drosophila melanogaster. Till skillnad från många nuvarande metoder, som kräver gruppanalyser, gör denna analys det möjligt för en enda person att samla in individuella sederingstidsdata för ~2 000 flugor inom en 8 h-arbetsperiod. Vi fann att en enda person kan få 48 flugor för sederingstid i ca 5 min. I den här takten kan 2 000 flugor göras i cirka 4 timmar, men poängsättning kan göras senare. Med vår analys, den inspelade sederingstiden för de flesta flugor varierar från 5-15 min vid en exponering för 1 ml 100% etanol. Lägre koncentrationer av etanol eller mindre leveransvolymer kommer att resultera i längre sederingstider.
Nuvarande metoder för bedömning av sederingstiden kräver testning av ett stort antal flugor utan att lätt möjliggöra mätningar på enskilda individer15,,16,,17,,18,,19,,20,,21,22,23,,24,,25,26. Många nuvarande sedering och känslighet analyser förlitar sig på ST5022,23,24, den tidpunkt vid vilken 50% av flugorna är sövda till följd av etanol exponering. Även om erhålla ST50 för grupper av flugor var inte den primära motivationen för att utveckla denna analys, videoinspelningar visar högre nytta jämfört med nuvarande metoder, eftersom inspelningarna kan användas för att fastställa ST50 för grupper av individuellt testade flugor och för att mäta andelen flugor som uppfyller ett visst kriterium (t.ex. förlust av postural kontroll) när som helst. Det bör noteras att sådana videoanalyser skulle kräva ytterligare tid.
Till skillnad från nuvarande inebriometer analyser, den metod vi beskriver kräver inte specialiserade verktyg för att ställa in och kan utföras i alla laboratorium med hjälp av vanliga material. Med denna metod har vi fått tillförlitliga och konsekventa sederingstider för enskilda flugor. Analysen kan i princip utvidgas för att bedöma effekterna av exponering för flyktiga ämnen. Analysen kan också användas för att mäta effekterna av akut toxicitet hos flyktiga ämnen på andra insekter, inklusive andra flugarter. Individuella sederingstidsdata kan användas för att bedöma omfattningen av fenotypisk variation inom en population, såsom DGRP.
Vi använde små insektsskärmsnät för att förhindra direkt kontakt med etanollösningen samtidigt som tillräckliga mängder etanolångor kunde nå flugan. Lagret av vit cheesecloth ovanpå skärmen mesh ger visuell kontrast mellan flugan och ytan nedan och ser till att flugor inte fastnar i skärmen mesh, vilket kan leda till tvetydig bestämning av förlust av postural kontroll. Kommersiellt tillgängliga membran som är porösa till vatten och luft gav inkonsekventa resultat och var otillräckligt genomdyvbara för etanolångor. Vi använde avsiktligt små insektsskärmsnät eftersom det är ett jämnt poröst material som minimerar variationen i etanolexponering som ett resultat av flugposition inom en brunn. Ändringar kan göras i detta protokoll baserat på tillgängliga material, även om vi rekommenderar en kontrollerad beteendekammare, tillgång till 90%-100% etanol nära flugan, och enhetlig etanol exponering.
Fly position inom cellen kultur plattor bör randomiseras mellan replikerar för att undvika positionella bias. För större experiment som kräver användning av denna analys under flera dagar och därför är föremål för miljövariationer som kan påverka analysresultat (t.ex. förändringar i barometertryck)27, rekommenderar vi starkt att flugor testas vid samma tidpunkt varje dag och randomiseras både inom och över dagar, särskilt om olika linjer och/eller kön ska jämföras med varandra.
Den metod vi utvecklat är bäst lämpad för att mäta effekten av akut alkoholexponering men är inte lämplig för att erhålla konsumtionsdata eller modelleringsberoende. Alkohol sedering känslighet data som erhållits från denna analys kan dock integreras med andra mått på alkoholrelaterade fenotyper. En begränsning av systemet är att den vertikala höjden på standard cellodlingsplattor möjliggör vertikal flugrörelse som inte lätt kan spåras av video för detaljerad bedömning av övergripande aktivitet eller förflyttning. Denna begränsning påverkar dock inte en korrekt bedömning av sederingstiden. Vid användning av flugor av olika genotyper (t.ex. i DGRP-härledda utavlade populationer28), möjliggör denna analys också hämtning av enskilda flugor för att samla pooler av flugor med kontrasterande fenotyper för bulk-DNA-sekvensering och extrem QTL-kartläggning29,30. Sammantaget tillåter denna analys snabb, billig insamling av alkoholsederingsdata på ett stort antal enstaka flugor.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av bidrag DA041613 och GM128974 från National Institutes of Health till TFCM och RRHA.
24-well Cell Culture Plates | Corning | 3526 | Flat-bottomed; will house flies throughout assay |
Aspirator | |||
Cheesecloth | Genesee Scientific | 53-100 | Widely available. |
Ethanol | Decon Labs | V1001 | Widely available. |
Flexible Plastic Cutting Board (Plate Cover) | Walmart | 550098612 | Any flat plastic that can slide easily and cover a 24-well plate completely. Flexible plastic cutting board works well. |
Gauze (for aspirator) | Honeywell North | 67622 | Widely available. |
Illumination Pad | Amazon (AGPtek) | ASIN B00YA9GP0G | Any light pad to provide contrast is suitable. |
Jumbo Craft Sticks | Michaels | 10334892 | Any craft stick at least 7 cm long is suitable. |
P1000 Pipette Tip (for aspirator) | Genesee Scientific | 24-165RL | Any P1000 pipette tip is suitable. |
Serological Pipette (for aspirator) | Genesee Scientific | 12-104 | |
Small Insect Screen Mesh | Lowe's (Saint-Gobain ADFORS) | 89322 | Any small insect screen mesh is suitable. |
Testing Chamber | Interior space dimension big enough to encompass light pad. Can be constructed from a polystyrene box. | ||
Tygon Tubing (for aspirator) | Grainger | 9CUG7 | Widely available. |
Video Camera | Canon | 1959C001AA | Any video camera is suitable. |