Summary

Hög genomströmning metod för mätning av alkohol Sedering Tid för enskilda Drosophila melanogaster

Published: April 20, 2020
doi:

Summary

Nuvarande metoder för att mäta alkoholkänslighet i Drosophila är utformade för att testa grupper av flugor. Vi presenterar en enkel, billig, hög genomströmning analys för att bedöma alkohol sedering känslighet i ett stort antal enstaka flugor. Metoden kräver inte specialiserade verktyg och kan utföras i alla laboratorier med gemensamma material.

Abstract

Drosophila melanogaster ger en utmärkt modell för att studera den genetiska underbyggnad av alkohol känslighet. I motsats till studier i mänskliga populationer tillåter Drosophila-modellen strikt kontroll över genetisk bakgrund, och praktiskt taget obegränsat antal individer av samma genotyp kan födas upp snabbt under välkontrollerade miljöförhållanden utan lagstadgade restriktioner och till relativt låg kostnad. Flugor som utsätts för etanol genomgår fysiologiska och beteendemässiga förändringar som liknar mänsklig alkoholförgiftning, inklusive förlust av postural kontroll, sedering och utveckling av tolerans. Här beskriver vi en enkel, billig, hög genomströmningsanalys för bedömning av alkoholsederingskänslighet i ett stort antal enstaka flugor. Analysen är baserad på videoinspelning av enstaka flugor som introduceras utan anestesi i 24-brunnscellodlingsplattor i en uppsättning som möjliggör synkron initiering av alkoholexponering. Systemet gör det möjligt för en enda person att samla in individuella etanolsederingsdata på så många som 2 000 flugor inom en 8 h arbetsperiod. Analysen kan i princip utvidgas för att bedöma effekterna av exponering för flyktiga ämnen och tillämpas för att mäta effekterna av akut toxicitet hos flyktiga ämnen på andra insekter, inklusive andra flugarter.

Introduction

National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism rapporterar att 2015 drabbades uppskattningsvis 16 miljoner människor i USA av överdriven alkoholkonsumtion, som betecknades som “alkoholmissbruk”. Alkoholmissbruk orsakar ett brett spektrum av negativa fysiologiska effekter och är en viktig dödsorsak i USA. Hos människor, minskad känslighet, eller en låg nivå av svar på alkohol, har en stark genetisk komponent och är associerad med en högre risk att utveckla alkoholmissbruk störningar1,2,3,4. Genetiska riskstudier på humanpopulationer är utmanande på grund av populationsblandning, olika utvecklingshistorik och miljöexponeringar och beroende av självrapporterade frågeformulär för att kvantifiera alkoholrelaterade fenotyper, som ofta blandas ihop med andra neuropsykiatriska tillstånd.

Drosophila melanogaster ger en utmärkt modell för att studera den genetiska underbyggnad av alkohol känslighet5,6,7,8. Drosophila-modellen tillåter strikt kontroll över genetisk bakgrund, och praktiskt taget obegränsat antal individer av samma genotyp kan födas upp snabbt under välkontrollerade miljöförhållanden utan lagstadgade begränsningar och till relativt låga kostnader. Förutom offentligt tillgängliga mutationer och RNAi-linjer som riktar sig mot en majoritet av generna i genomet, har tillgången på Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP), en population av 205 inavlade vildhärledda linjer med kompletta genomsekvenser, möjliggjort genomomfattande associationsstudier9,10. Sådana studier har identifierat genetiska nätverk i samband med effekter på utvecklingstid och lönsamhet vid utvecklingsexponering för etanol11,12. Evolutionärt bevarande av grundläggande biologiska processer gör det möjligt att dra översättningsinfereringar genom att lägga människans ortologer ovanpå sina motsvarigheter i flugan.

Flugor som utsätts för etanol genomgår fysiologiska och beteendemässiga förändringar som liknar mänsklig alkoholförgiftning, inklusive förlust av postural kontroll8, sedering, och utveckling av tolerans13,,14,15. Alkoholinducerad sedering i Drosophila kan kvantifieras med hjälp av inebriometers. Dessa är 122 cm långa vertikala glaspelare med sneda nätpartitioner som flugor kan fästa16,17,18. En grupp på minst 50 flugor (kön kan analyseras separat) införs i toppen av kolonnen och utsätts för etanolångor. Flugor som förlorar postural kontroll faller genom kolonnen och samlas in med 1 min mellanrum. Den genomsnittliga elutiontiden fungerar som ett mått på känslighet för alkoholförgiftning. När flugor utsätts för alkohol en andra gång efter att ha återhämtat sig från den första exponeringen, kan de utveckla tolerans, vilket framgår av en förskjutning i genomsnittlig elueringstid13,15,19,20. Medan inebriometer analyser har lett till identifiering av gener, genetiska nätverk och cellulära vägar i samband med alkohol sedering känslighet och utveckling av tolerans12,13,,14,21, analysen är tidskrävande, låg genomströmning, och ineffektiva för att mäta alkoholkänslighet i enstaka flugor.,

Alternativa etanolsedationsanalyser som inte kräver den utarbetade inebriometerupplägget möjliggör bekvämare mätningar men som fortfarande är begränsade i genomströmning och kräver i allmänhet analyser av grupper av flugor i stället förindividerna 21,,22,23,,24,25. Bedömning av enskilda flugor minimerar risken för störande effekter på grund av gruppinteraktioner, såsom de som härrör från sociala beteenden. Här presenterar vi en enkel, billig, hög genomströmningsanalys för bedömning av alkoholsederingskänslighet i ett stort antal enstaka flugor.

Protocol

1. Konstruktion av provningsutrustningen Skapa en kartongmall stor som en 24-brunnscellodlingsplatta genom att spåra runt plattan på kartong och skära ut det angivna området. Skär en bit litet insektsskärmsnät storleken på cellodlingsplattan med hjälp av kartongmallen från steg 1.1. Förbered en 24-brunnscellodlingsplatta genom att placera en liten linje av varmt lim runt omkretsen på toppen av plattan med hjälp av en hot glue gun och fästa skärmnätet ovanpå de öppna brunnarna. Säkra en träbåt pinne till var och en av tre sidor av samma cell kultur platta från steg 1,3 med hjälp av en varm limpistol. Den modifierade cellodlingsplattan bör nu likna det skyltdiagram som visas i figur 1A och den experimentella inställning som visas i figur 2.OBS: Förbered minst lika många cellodlingsplattor som får plats i filmkamrarna (se nedan). Figur 1: Diagram över provningsapparaten och filmkammaren. (A) Övre diagram. Testapparatens över-, sido- och framsida visas. En skärm mesh lägger platt ovanpå en 24-brunn cell kultur platta. Trähantverkspinnarna, som representeras av pilspetsarna, är fästa vid tre intilliggande sidor för stabilitet och anpassningshjälp, två på sidan av brunnsplattan med sex brunnar och en på sidan av plattan med fyra brunnar. Alla tillbehör är varmlimmade på apparaten. (B) Nedre diagram. Den övre, sida och främre vyer av analysen set-up visas, respektive. En slits skärs i lådans högra sida, från öppningen för locket till öppningens baksida, med botten av slitsnivån till den inre ytan. Hålet på toppen av lådan, ytan parallellt med marken, är centrerad för maximal videoexponering. Den skuggade rutan representerar videokameran. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 2: Foto av analyssystemet. Videokameran placeras ovanpå polystyrenkammaren, med linsen insatt i utskärningshålet, illustrerad i diagrammen i figur 1B. Två uppsättningar av modifierade 24-brunns cellodlingsplattor vilar ovanpå en belysningsdyna som sätts in i en slits genom sidan av kammaren. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 2. Konstruktion av filmkammaren Skapa en filmkammare genom att skära ett hål storleken på videokameralinsen på sidan av en polystyren låda. Skär en extra slits bredden på belysningsdynan i motsatt sida av polystyren rutan. Filmkammaren ska likna den filmkammare som visas i figur 1B och figur 2. Förbered filmkammaren för användning genom att sätta in belysningsdynan i slitsen och placera kameran i linshålet ovanför belysningsdynan. Placera alla material och utför alla efterföljande tester i en kontrollerad miljö, helst en beteendekammare med cirka 30 % luftfuktighet, 25 °C temperatur, enhetligt luftflöde och ljudnivåer som är mindre än 65 dB. 3. Förberedelse av testapparat och flugor Pipettera 1 ml 100% etanol genom skärmnätet in i varje brunn. Torka skärmnätet med en bit cheesecloth. Skär två bitar av cheesecloth dimensionerna av cellodlingsplattan med hjälp av kartongmallen som skapats i steg 1.1. Placera dem ovanpå det torra skärmnätet på den modifierade cellodlingsplattan som innehåller etanol från steg 3.2. Skapa en liten bit tunn, flexibel plastskärbräda genom att spåra runt kartongmallen som skapats i steg 1.1 som en allmän guide och utöka det spårade området med 1–2 cm på en av kortsidorna. Klipp ut det utökade spårade området från den tunna, flexibla plastskärbrädan. Efter skärning, se till att plasten fortfarande passar mellan de tre trä hantverkspinnarna på testapparaten, men hänger av ena änden med 1-2 cm. (Valfritt) Om en aspirator behöver skapas, montera en aspirator som den som visas i figur 3 genom att först skära en P1000 pipettspets på mitten. Sätt in stycket med en större diameter i ena änden av en ~ 30 cm bit flexibel slang för att fungera som ett munstycke. Figur 3: En flugspirator där flugor samlas upp med ett utbytbart munstycke fäst vid flexibla slangar och en bred rörbar serologisk pipett med en gasvävproppi bomull. Operatören kan aspirera en enda fluga i pipetten för överföring utan anestesi. Klicka här för att se en större version av denna siffra. (Valfritt) För att slutföra aspirator montering, täcka den breda änden av en 10 cm bit serologiska pipett med gasväv för att förhindra flugor från att komma in i slangen och sätt in pipetten, gasväv först, i den öppna änden av slangen för att fungera som en flugkammare. Aspiratorn bör likna den som visas i figur 3. Med hjälp av en aspirator (Figur 3, steg 3.5 och 3.6), aspirera en fluga per brunn i en separat 24-brunn cell kultur platta. Använd den flexibla plasten för att täcka alla brunnar som innehåller tidigare sugs flugor. Registrera brunnspositionen och all relevant genotyp eller fenotypinformation för varje fluga. Håll den flexibla plasten i jämnhöjd med toppen av cellodlingsplattan som innehåller flugorna för att förhindra att de kommer ut och invertera plattan på toppen av den modifierade cellodlingsplattan med etanolen. Arket av flexibel plast bör vila på toppen av ark cheesecloth. Rikta inverterad cellodlingsplatta som innehåller flugor med hjälp av hantverkspinnarna för att säkerställa att varje brunn med etanol ligger i linje med varje brunn som innehåller en fluga. Den experimentella inställningen bör likna figur 2. 4. Testa flugorna Se till att belysningsdynan är tänd med full ljusstyrka för maximal visuell kontrast. Börja spela in med videokameran. För att exponera flugorna till etanol, ta försiktigt bort plasten från mellan brunnsplattan och testapparaten, var noga med att inte lossa ostduken. Avsluta videoinspelningen när alla flugor har förlorat postural kontroll. När det misstänks att alla flugor har förlorat postural kontroll, peka fast i mitten av plattan för att säkerställa att alla flugor har fullständig förlust av postural kontroll. Om det finns rörelse, fortsätt att spela in. Fortsätt att knacka regelbundet (var 1–2 minut) tills ingen rörelse inträffar. (Valfritt) För att snabbt återställa flugorna, ta bort endast den övre plattan från testapparaten, avslöjar sövda flugor som vilar på ostduken. Aspirera individ flyger in i utvalda behållare för återvinning. Byt ut etanolen i de modifierade cellodlingsplattorna mot 1 ml färsk 100 % etanol minst 1x i timmen för att kontrollera avdunstning och befuktning av etanol och för att bibehålla en jämn etanolexponering under hela analysen. Torka skärmnätet med cheesecloth. Upprepa för så många prover som önskas.OBS: För högsta genomströmning, aspirera nästa omgång av flugor i nya cell kultur plattor under videoinspelning. Protokollet kan pausas här, eftersom videoinspelningen kan granskas senare. 5. Bestämning av flygsedertid Spela in sederingstid för varje enskild fluga genom att titta på videoinspelningen. Sederingstiden definieras som det ögonblick en fluga förlorar fullständig postural kontroll och rörelseförmåga. Det rekommenderas att titta på filmen i omvänd och spela in den tid som flugan börjar röra sig för att säkerställa noggrannhet.

Representative Results

Två 24-brunns mikrotiterplattor kan generera data samtidigt på 48 enskilda flugor inom så lite som 10 min. Tabell 1 listar mätningar av etanolsederingstider för 48 enskilda flugor, män och honor separat, av två DGRP-linjer med olika känslighet för alkoholexponering vid utvecklingstid och lönsamhet13. Flugor av linje RAL_555 var mindre känsliga än linje RAL_177 (figur 4, Tabell 2; p < 0,0001, ANOVA). Hanar och kvinnor i RAL_177 uppvisade ingen sexuellt dimorfa effekt (figur 4, tabell 2; p > 0.1, ANOVA), medan honorna av linje RAL_555 var mindre känsliga för etanolexponering än hanarna (figur 4, tabell 2; p < 0,006, ANOVA). Det stora antalet flugor som kan mätas samtidigt och förmågan att mäta kön och olika linjer samtidigt kan öka noggrannheten genom att minska fel på grund av miljövariationer. A. Etanol SederingStid (er) B. Etanol SederingStid (er) Kvinnor Män Kvinnor Män 414 365 477 423 568 309 937 742 622 460 331 498 201 384 498 411 523 626 791 619 197 467 455 562 228 364 333 440 403 267 504 744 513 570 582 506 440 416 404 408 422 384 970 540 369 865 533 492 888 283 285 322 369 287 595 550 606 392 544 345 1079 519 315 393 376 284 418 709 553 308 477 388 718 287 432 275 206 411 366 564 558 385 576 377 598 337 398 279 631 372 437 692 578 460 511 412 241 398 364 347 374 808 665 729 484 532 425 354 229 423 534 386 396 628 312 576 305 334 531 506 388 488 451 523 322 533 682 638 420 560 548 379 252 529 375 427 330 540 1045 741 708 832 509 472 674 401 303 401 307 311 394 675 381 477 449 784 303 453 351 429 525 262 540 690 520 556 495 226 258 483 302 389 562 319 356 615 336 454 524 590 346 426 385 416 596 287 626 678 840 634 677 509 Tabell 1: Mätningar av etanolsederingstider (s) av enskilda flugor av (A) DGRP-linjer RAL_177 och B RAL_555 för separata kön ( n= 48). B Se även tabell 2, figur 4. Figur 4: Alkoholsederingstider för DGRP-linjer RAL_177 och RAL_555. Staplarna representerar medel och felstaplarna SEM (n = 48). Sederingstider för RAL_177 flugor var mindre än för RAL_55 flugor (p < 0,0001, ANOVA). Enskilda datapunkter anges i tabell 1. Ytterligare statistiskt signifikanta skillnader mellan könen och raderna anges i texten och i tabell 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Analys Källa till variation Df Ss F-värde P-värde Full modell poolad Linje 1 769627 34.869 <0,0001 Sex 1 105001 4.757 0.0304 Linje x Sex 1 86021 3.897 0.0498 Fel 188 4149491 Reducerad modell honor Linje 1 685126 23.58 <0,0001 Fel 94 2730718 Reducerade modell hanar Linje 1 170522 11.3 0.0011 Fel 94 1418774 Minskad modell RAL_177 Sex 1 473 0.023 0.8800 Fel 94 1943741 Minskad modell RAL_555 Sex 1 190549 8.12 0.0054 Fel 94 2205751 Tabell 2: Analyser av variansen för sederingstid över kön och DGRP-linje. Den modell som användes var Y = μ + L + S + LxS + ε, där μ är det totala medelvärdet, L är den fasta effekten av DGRP-linjen (RAL_177, RAL_555), S är den fasta effekten av kön (man, kvinna), LxS är interaktionstiden (fast), och ε är feltermen. Modellerna Y = μ + L + ε och Y = μ + S + ε användes för de reducerade modellerna. Line, Sex och line x Sex interaktion termen var alla betydande i hela modellen på α < 0,05. Reducerade modeller efter kön och DGRP linje RAL_555 var också betydande vid α < 0,01. Se även tabell 1, figur 4. df = frihetsgrader, SS = Typ I Summor kvadrater.

Discussion

Här presenterar vi en enkel, billig och hög genomströmning metod för att bedöma sedering tid på grund av etanol exponering i Drosophila melanogaster. Till skillnad från många nuvarande metoder, som kräver gruppanalyser, gör denna analys det möjligt för en enda person att samla in individuella sederingstidsdata för ~2 000 flugor inom en 8 h-arbetsperiod. Vi fann att en enda person kan få 48 flugor för sederingstid i ca 5 min. I den här takten kan 2 000 flugor göras i cirka 4 timmar, men poängsättning kan göras senare. Med vår analys, den inspelade sederingstiden för de flesta flugor varierar från 5-15 min vid en exponering för 1 ml 100% etanol. Lägre koncentrationer av etanol eller mindre leveransvolymer kommer att resultera i längre sederingstider.

Nuvarande metoder för bedömning av sederingstiden kräver testning av ett stort antal flugor utan att lätt möjliggöra mätningar på enskilda individer15,,16,,17,,18,,19,,20,,21,22,23,,24,,25,26. Många nuvarande sedering och känslighet analyser förlitar sig på ST5022,23,24, den tidpunkt vid vilken 50% av flugorna är sövda till följd av etanol exponering. Även om erhålla ST50 för grupper av flugor var inte den primära motivationen för att utveckla denna analys, videoinspelningar visar högre nytta jämfört med nuvarande metoder, eftersom inspelningarna kan användas för att fastställa ST50 för grupper av individuellt testade flugor och för att mäta andelen flugor som uppfyller ett visst kriterium (t.ex. förlust av postural kontroll) när som helst. Det bör noteras att sådana videoanalyser skulle kräva ytterligare tid.

Till skillnad från nuvarande inebriometer analyser, den metod vi beskriver kräver inte specialiserade verktyg för att ställa in och kan utföras i alla laboratorium med hjälp av vanliga material. Med denna metod har vi fått tillförlitliga och konsekventa sederingstider för enskilda flugor. Analysen kan i princip utvidgas för att bedöma effekterna av exponering för flyktiga ämnen. Analysen kan också användas för att mäta effekterna av akut toxicitet hos flyktiga ämnen på andra insekter, inklusive andra flugarter. Individuella sederingstidsdata kan användas för att bedöma omfattningen av fenotypisk variation inom en population, såsom DGRP.

Vi använde små insektsskärmsnät för att förhindra direkt kontakt med etanollösningen samtidigt som tillräckliga mängder etanolångor kunde nå flugan. Lagret av vit cheesecloth ovanpå skärmen mesh ger visuell kontrast mellan flugan och ytan nedan och ser till att flugor inte fastnar i skärmen mesh, vilket kan leda till tvetydig bestämning av förlust av postural kontroll. Kommersiellt tillgängliga membran som är porösa till vatten och luft gav inkonsekventa resultat och var otillräckligt genomdyvbara för etanolångor. Vi använde avsiktligt små insektsskärmsnät eftersom det är ett jämnt poröst material som minimerar variationen i etanolexponering som ett resultat av flugposition inom en brunn. Ändringar kan göras i detta protokoll baserat på tillgängliga material, även om vi rekommenderar en kontrollerad beteendekammare, tillgång till 90%-100% etanol nära flugan, och enhetlig etanol exponering.

Fly position inom cellen kultur plattor bör randomiseras mellan replikerar för att undvika positionella bias. För större experiment som kräver användning av denna analys under flera dagar och därför är föremål för miljövariationer som kan påverka analysresultat (t.ex. förändringar i barometertryck)27, rekommenderar vi starkt att flugor testas vid samma tidpunkt varje dag och randomiseras både inom och över dagar, särskilt om olika linjer och/eller kön ska jämföras med varandra.

Den metod vi utvecklat är bäst lämpad för att mäta effekten av akut alkoholexponering men är inte lämplig för att erhålla konsumtionsdata eller modelleringsberoende. Alkohol sedering känslighet data som erhållits från denna analys kan dock integreras med andra mått på alkoholrelaterade fenotyper. En begränsning av systemet är att den vertikala höjden på standard cellodlingsplattor möjliggör vertikal flugrörelse som inte lätt kan spåras av video för detaljerad bedömning av övergripande aktivitet eller förflyttning. Denna begränsning påverkar dock inte en korrekt bedömning av sederingstiden. Vid användning av flugor av olika genotyper (t.ex. i DGRP-härledda utavlade populationer28), möjliggör denna analys också hämtning av enskilda flugor för att samla pooler av flugor med kontrasterande fenotyper för bulk-DNA-sekvensering och extrem QTL-kartläggning29,30. Sammantaget tillåter denna analys snabb, billig insamling av alkoholsederingsdata på ett stort antal enstaka flugor.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av bidrag DA041613 och GM128974 från National Institutes of Health till TFCM och RRHA.

Materials

24-well Cell Culture Plates Corning 3526 Flat-bottomed; will house flies throughout assay
Aspirator
Cheesecloth Genesee Scientific 53-100 Widely available.
Ethanol Decon Labs V1001 Widely available.
Flexible Plastic Cutting Board (Plate Cover) Walmart 550098612 Any flat plastic that can slide easily and cover a 24-well plate completely. Flexible plastic cutting board works well.
Gauze (for aspirator) Honeywell North 67622 Widely available.
Illumination Pad Amazon (AGPtek) ASIN B00YA9GP0G Any light pad to provide contrast is suitable.
Jumbo Craft Sticks Michaels 10334892 Any craft stick at least 7 cm long is suitable.
P1000 Pipette Tip (for aspirator) Genesee Scientific 24-165RL Any P1000 pipette tip is suitable.
Serological Pipette (for aspirator) Genesee Scientific 12-104
Small Insect Screen Mesh Lowe's (Saint-Gobain ADFORS) 89322 Any small insect screen mesh is suitable.
Testing Chamber Interior space dimension big enough to encompass light pad. Can be constructed from a polystyrene box.
Tygon Tubing (for aspirator) Grainger 9CUG7 Widely available.
Video Camera Canon 1959C001AA Any video camera is suitable.

References

  1. Heath, A. C., et al. Genetic differences in alcohol sensitivity and the inheritance of alcoholism risk. Psychological Medicine. 29 (5), 1069-1081 (1999).
  2. Schuckit, M. A., Smith, T. L. The relationships of a family history of alcohol dependence, a low level of response to alcohol and six domains of life functioning to the development of alcohol use disorders. Journal of Studies on Alcohol. 61 (6), 827-835 (2000).
  3. Trim, R. S., Schuckit, M. A., Smith, T. L. The relationships of the level of response to alcohol and additional characteristics to alcohol use disorders across adulthood: a discrete-time survival analysis. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33 (9), 1562-1570 (2009).
  4. Schuckit, M. A., Smith, T. L. Onset and course of alcoholism over 25 years in middle class men. Drug and Alcohol Dependence. 113 (1), 21-28 (2011).
  5. Morozova, T. V., Mackay, T. F. C., Anholt, R. R. H. Genetics and genomics of alcohol sensitivity. Molecular Genetics and Genomics. 289 (3), 253-269 (2014).
  6. Heberlein, U., Wolf, F. W., Rothenfluh, A., Guarnieri, D. J. Molecular genetic analysis of ethanol intoxication in Drosophila melanogaster. Integrative and Comparative Biology. 44 (4), 269-274 (2004).
  7. Engel, G. L., Taber, K., Vinton, E., Crocker, A. J. Studying alcohol use disorder using Drosophila melanogaster in the era of ‘Big Data’. Behavioral and Brain Functions. 15 (1), 7 (2019).
  8. Singh, C. M., Heberlein, U. Genetic control of acute ethanol-induced behaviors in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 24 (8), 1127-1136 (2000).
  9. Mackay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
  10. Huang, W., et al. Natural variation in genome architecture among 205 Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel lines. Genome Research. 24 (7), 1193-1208 (2014).
  11. Morozova, T. V., et al. A Cyclin E centered genetic network contributes to alcohol-induced variation in Drosophila development. G3. 8 (8), 2643-2653 (2018).
  12. Morozova, T. V., et al. Polymorphisms in early neurodevelopmental genes affect natural variation in alcohol sensitivity in adult drosophila. BMC Genomics. 16, 865 (2015).
  13. Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. Functional ethanol tolerance in Drosophila. Neuron. 28 (1), 261-271 (2000).
  14. Berger, K. H., Heberlein, U., Moore, M. S. Rapid and chronic: two distinct forms of ethanol tolerance in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 28 (10), 1469-1480 (2004).
  15. Morozova, T. V., Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. Transcriptional response to alcohol exposure in Drosophila melanogaster. Genome Biology. 7 (10), 95 (2006).
  16. Weber, K. E. An apparatus for measurement of resistance to gas-phase agents. Drosophila Information Service. 67, 91-93 (1988).
  17. Weber, K. E., Diggins, L. T. Increased selection response in larger populations. II. Selection for ethanol vapor resistance in Drosophila melanogaster at two population sizes. Genetics. 125 (3), 585-597 (1990).
  18. Cohan, F. M., Graf, J. D. Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance. Evolution. 39 (2), 278-293 (1985).
  19. Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436 (7052), 845-847 (2005).
  20. Morozova, T. V., Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. Phenotypic and transcriptional response to selection for alcohol sensitivity in Drosophila melanogaster. Genome Biology. 8 (10), 231 (2007).
  21. Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: Translational potential of systems genetics. Genetics. 83, 733-745 (2009).
  22. Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33 (10), 1794-1805 (2009).
  23. Sandhu, S., Kollah, A. P., Lewellyn, L., Chan, R. F., Grotewiel, M. An inexpensive, scalable behavioral assay for measuring ethanol sedation sensitivity and rapid tolerance in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (98), e52676 (2015).
  24. Urizar, N. L., Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. Drosophila homer is required in a small set of neurons including the ellipsoid body for normal ethanol sensitivity and tolerance. The Journal of Neuroscience. 27 (17), 4541-4551 (2007).
  25. Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T., Heberlein, U. High-resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 22 (24), 11035-11044 (2002).
  26. Cohan, F. M., Hoffmann, A. A. Genetic divergence under uniform selection. II. Different responses to selection for knockdown resistance to ethanol among Drosophila melanogaster populations and their replicate lines. Genetics. 114 (1), 145-164 (1986).
  27. Pohl, J. B., et al. Circadian genes differentially affect tolerance to ethanol in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 37 (11), 1862-1871 (2013).
  28. Huang, W., et al. Epistasis dominates the genetic architecture of Drosophila quantitative traits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 15553-15559 (2012).
  29. Ehrenreich, I. M., et al. Dissection of genetically complex traits with extremely large pools of yeast segregants. Nature. 464 (7291), 1039-1042 (2010).
  30. Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. The road less traveled: From genotype to phenotype in flies and humans. Mammalian Genome. 29, 5-23 (2018).

Play Video

Cite This Article
Sass, T. N., MacPherson, R. A., Mackay, T. F. C., Anholt, R. R. H. High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (158), e61108, doi:10.3791/61108 (2020).

View Video