Behavior

व्यक्तिगत ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के अल्कोहल सेडक्शन समय को मापने के लिए उच्च-थ्रूपुट विधि

Published: April 20, 2020 doi: 10.3791/61108

Tatum N. Sass*¹, Rebecca A. MacPherson*¹, Trudy F. C. Mackay¹, Robert R. H. Anholt¹

¹Department of Genetics and Biochemistry and Center for Human Genetics, Clemson University

* These authors contributed equally

Summary

ड्रोसोफिला में अल्कोहल संवेदनशीलता को मापने के लिए वर्तमान तरीके मक्खियों के समूहों का परीक्षण करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। हम एक मक्खियों की बड़ी संख्या में शराब सेडान संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए एक सरल, कम लागत, उच्च थ्रूपुट परख पेश करते हैं । विधि विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है और आम सामग्री का उपयोग कर किसी भी प्रयोगशाला में किया जा सकता है।

Abstract

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर शराब संवेदनशीलता के आनुवंशिक आधार का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रदान करता है। मानव आबादी में अध्ययन के विपरीत, ड्रोसोफिला मॉडल आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर सख्त नियंत्रण की अनुमति देता है, और एक ही जीनोटाइप के व्यक्तियों की लगभग असीमित संख्या नियामक प्रतिबंधों के बिना और अपेक्षाकृत कम लागत पर अच्छी तरह से नियंत्रित पर्यावरणीय स्थितियों के तहत तेजी से पाला जा सकता है । इथेनॉल के संपर्क में आने वाली मक्खियों को शारीरिक और व्यवहार परिवर्तनों से गुजरना पड़ता है जो मानव शराब के नशे के समान होते हैं, जिसमें आसनीय नियंत्रण की हानि, आदितीकरण और सहिष्णुता का विकास शामिल है। यहां, हम एक मक्खियों की बड़ी संख्या में शराब सेडेशन संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए एक सरल, कम लागत, उच्च थ्रूपुट परख का वर्णन करते हैं। परख एक सेट-अप में 24-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों में संज्ञाहरण के बिना पेश की गई एकल मक्खियों की वीडियो रिकॉर्डिंग पर आधारित है जो शराब जोखिम की समकालिक दीक्षा को सक्षम बनाता है। यह प्रणाली एक व्यक्ति को 8 घंटे की कार्य अवधि के भीतर 2,000 मक्खियों पर व्यक्तिगत इथेनॉल सेडेशन डेटा एकत्र करने में सक्षम बनाती है। परख, सिद्धांत रूप में, किसी भी अस्थिर पदार्थ के संपर्क के प्रभाव का आकलन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है और अन्य मक्खी प्रजातियों सहित अन्य कीड़ों पर अस्थिर की तीव्र विषाक्तता के प्रभाव को मापने के लिए लागू किया जाता है।

Introduction

शराब के दुरुपयोग और शराब पर राष्ट्रीय संस्थान की रिपोर्ट है कि २०१५ अत्यधिक शराब की खपत में, "शराब का उपयोग विकार" के रूप में नामित, संयुक्त राज्य अमेरिका में एक अनुमान १६,०००,००० लोगों को प्रभावित किया । शराब के दुरुपयोग प्रतिकूल शारीरिक प्रभाव की एक विस्तृत श्रृंखला का कारण बनता है और अमेरिका में मौत का एक प्रमुख कारण है मनुष्यों में, संवेदनशीलता में कमी, या शराब के प्रति प्रतिक्रिया का एक निम्न स्तर, एक मजबूत आनुवंशिक घटक होता है और शराब के उपयोग के विकारों^{को विकसित}करने के उच्च जोखिम से जुड़ा होता है^1,^2,^,^3,^4।⁴ मानव आबादी पर आनुवंशिक जोखिम अध्ययन जनसंख्या मिश्रण, विविध विकासात्मक इतिहास और पर्यावरण जोखिम के कारण चुनौतीपूर्ण हैं, और शराब से संबंधित फेनोटाइप की मात्रा निर्धारित करने के लिए स्वयं-रिपोर्ट प्रश्नावली पर निर्भरता, जो अक्सर अन्य न्यूरोसाइकियाट्रिक स्थितियों के साथ चकित होते हैं।

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर ^,अल्कोहल संवेदनशीलता⁵,⁶,⁷^,^,⁸के आनुवंशिक आधार का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रदान करता है । ड्रोसोफिला मॉडल आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर सख्त नियंत्रण की अनुमति देता है, और एक ही जीनोटाइप के व्यक्तियों की लगभग असीमित संख्या नियामक प्रतिबंधों के बिना और अपेक्षाकृत कम लागत पर अच्छी तरह से नियंत्रित पर्यावरणीय स्थितियों के तहत तेजी से पाला जा सकता है । सार्वजनिक रूप से उपलब्ध उत्परिवर्तन ों और आरएनएआई लाइनों के अलावा जो जीनोम में अधिकांश जीनों को लक्षित करते हैं, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर जेनेटिक रेफरेंस पैनल (DGRP), पूर्ण जीनोम दृश्यों के साथ 205 नस्ल जंगली-व्युत्पन्न लाइनों की आबादी की उपलब्धता, जीनोम-वाइड एसोसिएशन अध्ययन^9,^,¹⁰सक्षम है। इस तरह के अध्ययनों ने विकास के समय पर पड़ने वाले प्रभावों और इथेनॉल¹¹^,12 के विकास पर व्यवहार्यता से जुड़े आनुवंशिक^{नेटवर्कों की}पहचान की है । मौलिक जैविक प्रक्रियाओं का विकासवादी संरक्षण अनुवादीय निष्कर्षों को उनके फ्लाई समकक्षों पर मानव ऑर्थोलोग्स को सुपरथोपकर तैयार करने में सक्षम बनाता है।

इथेनॉल के संपर्क में आने वाली मक्खियों को शारीरिक और व्यवहार परिवर्तनों से गुजरना पड़ता है जो मानव शराब के नशे के समान होते हैं, जिसमें आसनीय नियंत्रण^8,सेडेशन की हानि और सहिष्णुता का विकास^13,^,^14,^,¹⁵शामिल है। ड्रोसोफिला में अल्कोहल प्रेरित सेडक्शन को एरेब्रिओमीटर का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है। ये 122 सेमी लंबे ऊर्ध्वाधर कांच के स्तंभ हैं जिनमें तिरछा जाल विभाजन होता है जिससे मक्खियां¹⁶^,¹⁷^,¹⁸को संलग्न कर सकती हैं । कॉलम के शीर्ष में कम से कम 50 मक्खियों (लिंगों का अलग से विश्लेषण किया जा सकता है) का एक समूह पेश किया जाता है और इथेनॉल वाष्प के संपर्क में आता है। मक्खियों कि स्तंभ के माध्यम से आसनीय नियंत्रण गिर खो देते हैं और 1 मिन अंतराल पर एकत्र किए जाते हैं। मतलब elution समय शराब के नशे के प्रति संवेदनशीलता का एक उपाय के रूप में कार्य करता है। जब मक्खियों को पहले एक्सपोजर से उबरने के बाद दूसरी बार शराब के संपर्क में आता है, तो वे सहिष्णुता विकसित कर सकते हैं, जैसा कि मतलब एल्यूशन समय^13,^,^15,^,^19,^,²⁰में बदलाव से स्पष्ट है। जबकि इनेब्रियोमीटर परख जीन, आनुवंशिक नेटवर्क, और सेलुलर शराब से छुटकारा संवेदनशीलता और सहिष्णुता के विकास के साथ जुड़े रास्तों की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया है^12,^,^13,^,^14,^,^21,परख समय लेने वाली है, कम थ्रूपुट, और एक मक्खियों में शराब संवेदनशीलता को मापने के लिए अप्रभावी ।

वैकल्पिक इथेनॉल सेडेशन परख ों में कहा गया है कि अधिक सुविधाजनक मापन के लिए विस्तृत एरेब्रिओमीटर सेट -अप की अनुमति की आवश्यकता नहीं है , लेकिन अभी भी थ्रूपुट में सीमित हैं और आम तौर पर^21,^,^22,^,²³^,²⁴^,²⁵व्यक्तियों के बजाय मक्खियों के समूहों के विश्लेषण की आवश्यकता होती है । एकल मक्खियों का आकलन समूह बातचीत के कारण भ्रामक प्रभावों की क्षमता को कम करता है, जैसे कि सामाजिक व्यवहार से उपजी। यहां, हम एक मक्खियों की बड़ी संख्या में शराब सेडेशन संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए एक सरल, कम लागत, उच्च थ्रूपुट परख पेश करते हैं।

Protocol

1. परीक्षण उपकरण का निर्माण

कार्डबोर्ड टेम्पलेट बनाएं कार्डबोर्ड पर प्लेट के चारों ओर ट्रेस करके और निर्धारित क्षेत्र को काटकर 24-अच्छी तरह से सेल कल्चर प्लेट का आकार।
चरण 1.1 से कार्डबोर्ड टेम्पलेट का उपयोग करके सेल कल्चर प्लेट के आकार को छोटे कीट स्क्रीन जाल का एक टुकड़ा काटें।
एक गर्म गोंद बंदूक का उपयोग कर प्लेट के शीर्ष के परिधि के चारों ओर गर्म गोंद की एक छोटी सी लाइन रखकर और खुले कुओं के शीर्ष पर स्क्रीन जाल affixing द्वारा एक 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट तैयार करें ।
एक गर्म गोंद बंदूक का उपयोग कर कदम 1.3 से एक ही सेल संस्कृति प्लेट के तीन पक्षों में से प्रत्येक के लिए एक लकड़ी के शिल्प छड़ी सुरक्षित करें। संशोधित सेल कल्चर प्लेट अब फिगर 1ए में दिखाए गए प्लेट आरेख और एक्सिडेंट 2में दिखाए गए प्रायोगिक सेटअप के समान होना चाहिए ।
नोट: फिल्माने कक्षों में फिट होगा के रूप में कई सेल संस्कृति प्लेटों के रूप में तैयार (नीचे देखें) ।

चित्र 1: परीक्षण तंत्र और फिल्मांकन कक्ष का चित्र। (A)ऊपरी आरेख। परीक्षण तंत्र के शीर्ष, पक्ष और सामने के दृश्य क्रमशः दिखाए जाते हैं। एक स्क्रीन जाल एक 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट के शीर्ष पर फ्लैट देता है । लकड़ी के शिल्प चिपक जाती है, तीर द्वारा प्रतिनिधित्व, स्थिरता और संरेखण सहायता के लिए तीन आसन्न पक्षों से जुड़े हुए हैं, छह कुओं के साथ अच्छी तरह से थाली के किनारे पर दो और चार कुओं के साथ थाली के किनारे पर एक । सभी अनुलग्नकों गर्म उपकरण पर चिपके हुए हैं। (ख)लोअर डायग्राम। परख सेट-अप के शीर्ष, पक्ष और सामने के दृश्य क्रमशः दिखाए जाते हैं। एक भट्ठा बॉक्स के दाईं ओर में काटा जाता है, ढक्कन के लिए खोलने से खोलने के पीछे तक, भट्ठा स्तर के नीचे के साथ आंतरिक सतह तक। बॉक्स के शीर्ष पर छेद, जमीन के समानांतर सतह, अधिकतम वीडियो एक्सपोजर के लिए केंद्रित है। छायांकित बॉक्स वीडियो कैमरे का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 2: परख प्रणाली की तस्वीर । वीडियो कैमरा पॉलीस्टीरिन चैंबर के शीर्ष पर रखा गया है, जिसमें कट-आउट होल में डाला गया लेंस है, जो चित्रा 1Bके चित्र ों में सचित्र है। संशोधित 24-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों के दो सेट एक रोशनी पैड के शीर्ष पर आराम करते हैं जो कक्ष के किनारे के माध्यम से एक भट्ठा में डाला जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

2. फिल्मांकन कक्ष का निर्माण

पॉलीस्टीरिन बॉक्स के किनारे वीडियो कैमरा लेंस के आकार को काटकर एक फिल्मांकन कक्ष बनाएं। पॉलीस्टीरिन बॉक्स के विपरीत दिशा में रोशनी पैड की चौड़ाई को एक अतिरिक्त काट ें। फिल्मांकन कक्ष चित्रा 1B और चित्रा 2में दिखाया फिल्माने चैंबर के समान होना चाहिए ।
भट्ठा में रोशनी पैड डालने और रोशनी पैड के ऊपर लेंस छेद में कैमरे की स्थिति द्वारा उपयोग के लिए फिल्माने कक्ष तैयार करें।
सभी सामग्रियों को रखें और एक नियंत्रित वातावरण में बाद के सभी परीक्षण करें, अधिमानतः लगभग 30% आर्द्रता, 25 डिग्री सेल्सियस तापमान, समान एयरफ्लो और शोर का स्तर 65 डीबी से कम के साथ एक व्यवहार कक्ष।

3. परीक्षण उपकरण और मक्खियों की तैयारी

प्रत्येक कुएं में स्क्रीन जाल के माध्यम से 100% इथेनॉल का पिपेट 1 एमएल।
चीज़क्लोथ के टुकड़े के साथ स्क्रीन जाल को सुखा लें।
कदम 1.1 में बनाए गए कार्डबोर्ड टेम्पलेट का उपयोग करके सेल कल्चर प्लेट के आयामों को चीज़क्लोथ के दो टुकड़ों में काट ें। उन्हें चरण 3.2 से इथेनॉल युक्त संशोधित सेल संस्कृति प्लेट के सूखे स्क्रीन जाल के शीर्ष पर रखें।
एक सामान्य गाइड के रूप में चरण 1.1 में बनाए गए कार्डबोर्ड टेम्पलेट के आसपास ट्रेस करके और छोटे पक्षों में से एक पर 1-2 सेमी द्वारा ट्रेस किए गए क्षेत्र का विस्तार करके पतली, लचीला प्लास्टिक कटिंग बोर्ड का एक छोटा टुकड़ा बनाएं। पतली, लचीला प्लास्टिक काटने बोर्ड से विस्तारित पता लगाया क्षेत्र बाहर काट ें । काटने के बाद, सुनिश्चित करें कि प्लास्टिक अभी भी परीक्षण उपकरण पर तीन लकड़ी के शिल्प चिपक जाती है के बीच फिट बैठता है, लेकिन 1-2 सेमी से एक छोर से लटका हुआ है।
(वैकल्पिक) यदि एक एस्पिरेटर बनाने की आवश्यकता है, तो पहले आधे में P1000 पिपेट टिप काटकर चित्रा 3 में दिखाए गए एक उम्मीदवार को इकट्ठा करें। मुखपत्र के रूप में सेवा करने के लिए लचीले ट्यूबिंग के ~ 30 सेमी टुकड़े के एक छोर में एक बड़े व्यास के साथ टुकड़ा डालें।

चित्रा 3: एक फ्लाई एस्पिरेटर जिसमें मक्खियों को लचीला ट्यूबिंग से जुड़ा एक विनिमेय मुखपत्र और एक कपास धुंध डाट के साथ एक विस्तृत बोर सीरोलॉजिकल पिपेटके साथ एकत्र किया जाता है। ऑपरेटर संज्ञाहरण के बिना हस्तांतरण के लिए पिपेट में एक भी फ्लाई को एस्पिरेट कर सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

(वैकल्पिक) एस्पिरेटर असेंबली को पूरा करने के लिए, मक्खियों को ट्यूबिंग में आने से रोकने और पिपेट डालने से रोकने के लिए धुंध के साथ सीरोलॉजिकल पिपेट के 10 सेमी के टुकड़े के व्यापक अंत को कवर करें, पहले, एक फ्लाई चैंबर के रूप में सेवा करने के लिए ट्यूबिंग के खुले अंत में गाज। आकांक्षी को चित्रा 3में दिखाए गए समान होना चाहिए ।
एक एस्पिरेटर(चित्रा 3,चरण 3.5 और 3.6) का उपयोग करना, एक अलग 24-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट में प्रति अच्छी तरह से फ्लाई एस्पिरेट। पहले से एस्पिरेटेड मक्खियों वाले किसी भी कुओं को कवर करने के लिए लचीले प्लास्टिक का उपयोग करें। प्रत्येक फ्लाई की अच्छी स्थिति और किसी भी प्रासंगिक जीनोटाइप या फेनोटाइप जानकारी रिकॉर्ड करें।
उनके भागने को रोकने और इथेनॉल के साथ संशोधित सेल संस्कृति प्लेट के शीर्ष पर प्लेट उलटा करने के लिए मक्खियों युक्त सेल संस्कृति प्लेट के शीर्ष के साथ लचीला प्लास्टिक फ्लश पकड़ो। लचीला प्लास्टिक की चादर चीज़क्लोथ की चादरों के ऊपर आराम किया जाना चाहिए। शिल्प का उपयोग कर मक्खियों युक्त उल्टे सेल संस्कृति प्लेट को संरेखित करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि इथेनॉल के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से एक फ्लाई युक्त प्रत्येक अच्छी तरह से संरेखित हो।
प्रायोगिक सेटअप चित्र ा 2जैसा होना चाहिए ।

4. मक्खियों का परीक्षण

सुनिश्चित करें कि रोशनी पैड अधिकतम दृश्य विपरीत के लिए पूर्ण चमक पर जलाया जाता है। वीडियो कैमरे से रिकॉर्डिंग शुरू करें।
मक्खियों को इथेनॉल के लिए बेनकाब करने के लिए, ध्यान से अच्छी प्लेट और परीक्षण तंत्र के बीच से प्लास्टिक को हटा दें, ध्यान रखें कि चीज़क्लोथ को उखाड़ फेंकना न हो।
सभी मक्खियों के आसनीय नियंत्रण खो चुके हैं, एक बार वीडियो रिकॉर्डिंग समाप्त करें। एक बार यह संदेह होने के बाद कि सभी मक्खियों ने आसनीय नियंत्रण खो दिया है, प्लेट के केंद्र में मजबूती से टैप करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सभी मक्खियों को आसनीय नियंत्रण का पूरा नुकसान हो। यदि आंदोलन होता है, तो रिकॉर्ड जारी रखें। जब तक कोई आंदोलन न हो (हर 1-2 मिन) समय-समय पर टैप करते रहें।
(वैकल्पिक) मक्खियों को जल्दी से ठीक करने के लिए, परीक्षण उपकरण से केवल शीर्ष प्लेट को हटा दें, चीज़क्लोथ पर आराम कर रही सेडेट मक्खियों का खुलासा करें। एस्पिरेट व्यक्ति वसूली के लिए चुने हुए कंटेनरों में उड़ता है।
संशोधित सेल संस्कृति प्लेटों में इथेनॉल को प्रतिस्थापित करें 1 मिलीएल ताजा 100% इथेनॉल के साथ कम से कम 1x इथेनॉल वाष्पीकरण और इथेनॉल के आर्द्रीकरण के लिए नियंत्रित करने और परख भर में लगातार इथेनॉल जोखिम बनाए रखने के लिए। चीज़क्लोथ के साथ स्क्रीन जाल को सुखा लें।
वांछित के रूप में कई नमूनों के लिए दोहराएं।
नोट: उच्चतम थ्रूपुट के लिए, वीडियो रिकॉर्डिंग के दौरान नई सेल संस्कृति प्लेटों में मक्खियों के अगले दौर को एस्पिरेट करें। प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है, क्योंकि वीडियो रिकॉर्डिंग की समीक्षा बाद में की जा सकती है।

5. फ्लाई बेहोश समय का निर्धारण

वीडियो रिकॉर्डिंग देखकर प्रत्येक व्यक्ति के लिए रिकॉर्ड विच्छेदन समय। Sedation समय पल एक मक्खी पूर्ण आसनीय नियंत्रण और लोकोमोटर क्षमता खो देता है के रूप में परिभाषित किया गया है । फिल्म को रिवर्स में देखने और सटीकता सुनिश्चित करने के लिए उड़ान शुरू होने वाले समय को रिकॉर्ड करने की सिफारिश की जाती है।

Representative Results

दो 24-अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेटें 10 मिनट के भीतर 48 व्यक्तिगत मक्खियों पर एक साथ डेटा उत्पन्न कर सकती हैं। तालिका 1 48 व्यक्तिगत मक्खियों, पुरुषों और महिलाओं के लिए इथेनॉल सेडेशन समय के माप को अलग-अलग सूचीबद्ध करती है, दो DGRP लाइनों में से दो DGRP लाइनों में से विकास समय और व्यवहार्यता¹³पर शराब जोखिम के लिए विभिन्न संवेदनशीलताएं हैं। लाइन RAL_555 की मक्खियां लाइन RAL_177(चित्रा 4, टेबल 2;पी एंड एलटी; 0.0001, एनोवा) की तुलना में कम संवेदनशील थीं। RAL_177 के पुरुषों और महिलाओं ने कोई यौन रूप से मंद प्रभाव नहीं दिखाया(चित्र4, तालिका 2;पी एंड जीटी;०.१, एनोवा), जबकि लाइन RAL_555 की महिलाएं पुरुषों की तुलना में इथेनॉल एक्सपोजर के प्रति कम संवेदनशील थीं(चित्रा 4, तालिका 2;पी एंड एलटी; ०.००६, ANOVA) । मक्खियों की बड़ी संख्या जिसे एक साथ मापा जा सकता है और लिंगों और विभिन्न लाइनों को संगति से मापने की क्षमता पर्यावरणीय भिन्नता के कारण त्रुटि को कम करके सटीकता बढ़ा सकती है।

एक.	इथेनॉल सेडेशन टाइम (एस)						बी.	इथेनॉल सेडेशन टाइम (एस)
	महिलाओं			पुरुषों				महिलाओं			पुरुषों
	414	365	477	423	568	309		937	742	622	460	331	498
	201	384	498	411	523	626		791	619	197	467	455	562
	228	364	333	440	403	267		504	744	513	570	582	506
	440	416	404	408	422	384		970	540	369	865	533	492
	888	283	285	322	369	287		595	550	606	392	544	345
	1079	519	315	393	376	284		418	709	553	308	477	388
	718	287	432	275	206	411		366	564	558	385	576	377
	598	337	398	279	631	372		437	692	578	460	511	412
	241	398	364	347	374	808		665	729	484	532	425	354
	229	423	534	386	396	628		312	576	305	334	531	506
	388	488	451	523	322	533		682	638	420	560	548	379
	252	529	375	427	330	540		1045	741	708	832	509	472
	674	401	303	401	307	311		394	675	381	477	449	784
	303	453	351	429	525	262		540	690	520	556	495	226
	258	483	302	389	562	319		356	615	336	454	524	590
	346	426	385	416	596	287		626	678	840	634	677	509

तालिका 1: अलग लिंगों के लिए ए(ए) डीजीआरपी लाइनों RAL_177 और (बी) RAL_555 की व्यक्तिगत मक्खियों के इथेनॉल सेडेशन समय(एस)का मापन।. तालिका 2, चित्रा 4भी देखें ।

चित्रा 4: dGRP लाइनों के शराब से छुटकारा समय RAL_177 और RAL_555 । बार का मतलब है और त्रुटि सलाखों SEM (n = 48) का प्रतिनिधित्व करते हैं। मक्खियों RAL_177 के लिए विच्छेदन समय RAL_55 मक्खियों (पी एंड एलटी; 0.0001, एनोवा) के लिए उन लोगों की तुलना में कम था। तालिका 1में व्यक्तिगत डेटा बिंदुइंगदिए जाते हैं । पाठ और तालिका 2में लिंगों और रेखाओं के बीच अतिरिक्त सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर दर्शाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

विश्लेषण	भिन्नता का स्रोत	लोमो	एस एस	एफ-वैल्यू	पी-वैल्यू
पूर्ण मॉडल पूल्ड	लाइन	1	769627	34.869	<0.0001
	लिंग	1	105001	4.757	0.0304
	लाइन एक्स सेक्स	1	86021	3.897	0.0498
	त्रुटि	188	4149491
कम मॉडल महिलाओं	लाइन	1	685126	23.58	<0.0001
कम मॉडल महिलाओं	त्रुटि	94	2730718
कम मॉडल पुरुष	लाइन	1	170522	11.3	0.0011
कम मॉडल पुरुष	त्रुटि	94	1418774
कम मॉडल RAL_177	लिंग	1	473	0.023	0.8800
कम मॉडल RAL_177	त्रुटि	94	1943741
कम मॉडल RAL_555	लिंग	1	190549	8.12	0.0054
कम मॉडल RAL_555	त्रुटि	94	2205751

तालिका 2:सेक्स और डीजीआरपी लाइन में सेडेशन समय के लिए विचरण का विश्लेषण। इस्तेमाल किया गया मॉडल वाई = μ + L + S + LxS + εथा, जहां μ समग्र मतलब है, एल DGRP लाइन (RAL_177, RAL_555), एस का निश्चित प्रभाव है सेक्स (पुरुष, महिला), एलएक्सएस इंटरैक्शन टर्म (फिक्स्ड) है, और ε त्रुटि शब्द है। S मॉडल वाई = μ + L + ε और Y = μ + S + ε कम मॉडल के लिए इस्तेमाल किया गया। लाइन, सेक्स, और लाइन एक्स सेक्स इंटरैक्शन टर्म α < 0.05 पर पूर्ण मॉडल में सभी महत्वपूर्ण थे। सेक्स और डीजीआरपी लाइन RAL_555 द्वारा कम मॉडल भी α < ०.०१ में महत्वपूर्ण थे । तालिका 1, चित्रा 4भी देखें । df = स्वतंत्रता की डिग्री, एसएस = प्रकार मैं चौकों की रकम।

Discussion

यहां, हम ड्रोसोफिला मेलानोगैस्टरमें इथेनॉल एक्सपोजर के कारण सेडक्शन समय का आकलन करने के लिए एक सरल, सस्ती और उच्च-थ्रूपुट विधि प्रस्तुत करते हैं। कई वर्तमान तरीकों के विपरीत, जिन्हें समूह विश्लेषण की आवश्यकता होती है, यह परख एक व्यक्ति को 8 घंटे की कार्य अवधि के भीतर ~ 2,000 मक्खियों के लिए व्यक्तिगत सेडेशन समय डेटा एकत्र करने में सक्षम बनाता है। हमने पाया कि एक व्यक्ति लगभग 5 मिन में सेडेशन समय के लिए 48 मक्खियों का स्कोर कर सकता है। इस दर पर, लगभग 4 घंटे में 2,000 मक्खियों को बनाए जा सकते हैं, हालांकि स्कोरिंग बाद में आयोजित की जा सकती है। हमारी परख के साथ, अधिकांश मक्खियों के लिए रिकॉर्ड किया गया सेडेशन समय 100% इथेनॉल के 1 मिलील के संपर्क में 5-15 किमी से होता है। इथेनॉल या छोटे वितरण की मात्रा की कम सांद्रता के परिणामस्वरूप लंबे समय तक सेडेशन समय होगा।

आद्य काल का आकलन करने के लिए वर्तमान तरीकों के लिए बड़ी संख्या में मक्खियों का परीक्षण करना होता है , बिना आसानी से एकल व्यक्तियों पर^{माप न हो 15}^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,20 ,²¹^,^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶.²¹ कई वर्तमान आसीन और संवेदनशीलता परसों ST50^22,^,^23,^,²⁴पर भरोसा करते हैं, जिस समय बिंदु पर 50% मक्खियों को इथेनॉल एक्सपोजर के परिणामस्वरूप दिया जाता है। यद्यपि मक्खियों के समूहों के लिए एसटी50 प्राप्त करना इस परख को विकसित करने के लिए प्राथमिक प्रेरणा नहीं थी, वीडियो रिकॉर्डिंग वर्तमान तरीकों की तुलना में उच्च उपयोगिता प्रदर्शित करती है, क्योंकि रिकॉर्डिंग का उपयोग व्यक्तिगत रूप से परीक्षण की गई मक्खियों के समूहों के लिए ST50 का पता लगाने और किसी भी समय किसी दिए गए मापदंड (जैसे, आसनीय नियंत्रण की हानि) को मापने के लिए किया जा सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस तरह के वीडियो विश्लेषण के लिए अतिरिक्त समय की आवश्यकता होगी ।

वर्तमान इनेब्रियोमीटर परख के विपरीत, हम जिस विधि का वर्णन करते हैं, उसे स्थापित करने के लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं होती है और आम सामग्रियों का उपयोग करके किसी भी प्रयोगशाला में किया जा सकता है। इस विधि का उपयोग करके, हमने व्यक्तिगत मक्खियों के लिए विश्वसनीय और सुसंगत विच्छेदन समय प्राप्त किया है। परख, सिद्धांत रूप में, किसी भी अस्थिर पदार्थ के संपर्क के प्रभाव का आकलन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है । परख अन्य मक्खी प्रजातियों सहित अन्य कीड़ों पर अस्थिर की तीव्र विषाक्तता के प्रभाव को मापने के लिए भी लागू किया जा सकता है। डीजीआरपी जैसी आबादी के भीतर फेनोटाइपिक भिन्नता की सीमा का आकलन करने के लिए व्यक्तिगत सेडेशन टाइम डेटा का उपयोग किया जा सकता है।

हमने इथेनॉल समाधान के साथ सीधे संपर्क को रोकने के लिए छोटे कीट स्क्रीन जाल का उपयोग किया, जबकि पर्याप्त मात्रा में इथेनॉल वाष्प को फ्लाई तक पहुंचने की अनुमति दी। स्क्रीन जाल के शीर्ष पर सफेद चीज़क्लोथ की परत फ्लाई और नीचे की सतह के बीच दृश्य विपरीत प्रदान करती है और यह सुनिश्चित करती है कि मक्खियों को स्क्रीन जाल में पकड़ा न जाए, जिससे आसनीय नियंत्रण के नुकसान का अस्पष्ट निर्धारण हो सकता है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध झिल्ली जो पानी और हवा के लिए असुरक्षित हैं, ने असंगत परिणाम दिए और इथेनॉल वाष्प के लिए अपर्याप्त रूप से दंडित किए गए थे। हमने जानबूझकर छोटे कीट स्क्रीन जाल का उपयोग किया क्योंकि यह एक समान रूप से असुरक्षित सामग्री है जो एक कुएं के भीतर फ्लाई पोजीशन के परिणामस्वरूप इथेनॉल एक्सपोजर में भिन्नता को कम करती है। उपलब्ध सामग्रियों के आधार पर इस प्रोटोकॉल में संशोधन किए जा सकते हैं, हालांकि हम एक नियंत्रित व्यवहार कक्ष, फ्लाई के करीब 90%-100% इथेनॉल तक पहुंच और समान इथेनॉल एक्सपोजर की सलाह देते हैं।

सेल संस्कृति प्लेटों के भीतर उड़ान भरने की स्थिति स्थितीय पूर्वाग्रह से बचने के लिए प्रतिकृति के बीच यादृच्छिक होना चाहिए। बड़े प्रयोगों के लिए जिन्हें कई दिनों में इस परख के उपयोग की आवश्यकता होती है और इसलिए पर्यावरणीय भिन्नता के अधीन हैं जो परख के परिणामों (उदाहरण के लिए, बैरोमेट्रिक दबाव में परिवर्तन) को प्रभावित कर सकते हैं)^27,हम दृढ़ता से अनुशंसा करते हैं कि मक्खियों का परीक्षण हर दिन एक ही समय में किया जाए और दोनों दिनों के भीतर और पूरे दिनों यादृच्छिक हो, खासकर यदि विभिन्न लाइनों और/या लिंगों की तुलना एक दूसरे के खिलाफ की जानी है।

हमारे द्वारा विकसित विधि तीव्र अल्कोहल एक्सपोजर के प्रभाव को मापने के लिए सबसे उपयुक्त है लेकिन खपत डेटा या मॉडलिंग की लत प्राप्त करने के लिए उपयुक्त नहीं है। हालांकि, इस परख से प्राप्त अल्कोहल सेअधिक संवेदनशीलता डेटा को शराब से संबंधित फेनोटाइप के अन्य उपायों के साथ एकीकृत किया जा सकता है। सिस्टम की एक सीमा यह है कि मानक सेल संस्कृति प्लेटों की ऊर्ध्वाधर ऊंचाई ऊर्ध्वाधर फ्लाई आंदोलन के लिए अनुमति देती है जिसे समग्र गतिविधि या लोकोमोशन के विस्तृत मूल्यांकन के लिए वीडियो द्वारा आसानी से ट्रैक नहीं किया जा सकता है। हालांकि, यह सीमा सेडेशन समय के सटीक आकलन को प्रभावित नहीं करती है। विभिन्न जीनोटाइप (उदाहरण के लिए, DGRP-व्युत्पन्न आउटब्रीड आबादी²⁸⁾की मक्खियों का उपयोग करते समय, यह परख भी व्यक्तिगत मक्खियों को थोक डीएनए अनुक्रमण और चरम क्यूटीएल मानचित्रण^29,^,³⁰के लिए विषम फेनोटाइप के साथ मक्खियों के पूल इकट्ठा करने में सक्षम बनाता है। कुल मिलाकर, यह परख एक मक्खियों की बड़ी संख्या पर शराब से छुटकारा डेटा के तेजी से, सस्ती संग्रह की अनुमति देता है ।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस कार्य को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों से टीएफसीएम व आरआरएचए को अनुदान डीए041613 व जीएम 128974 द्वारा समर्थन दिया गया।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well Cell Culture Plates	Corning	3526	Flat-bottomed; will house flies throughout assay
Aspirator
Cheesecloth	Genesee Scientific	53-100	Widely available.
Ethanol	Decon Labs	V1001	Widely available.
Flexible Plastic Cutting Board (Plate Cover)	Walmart	550098612	Any flat plastic that can slide easily and cover a 24-well plate completely. Flexible plastic cutting board works well.
Gauze (for aspirator)	Honeywell North	67622	Widely available.
Illumination Pad	Amazon (AGPtek)	ASIN B00YA9GP0G	Any light pad to provide contrast is suitable.
Jumbo Craft Sticks	Michaels	10334892	Any craft stick at least 7 cm long is suitable.
P1000 Pipette Tip (for aspirator)	Genesee Scientific	24-165RL	Any P1000 pipette tip is suitable.
Serological Pipette (for aspirator)	Genesee Scientific	12-104
Small Insect Screen Mesh	Lowe's (Saint-Gobain ADFORS)	89322	Any small insect screen mesh is suitable.
Testing Chamber			Interior space dimension big enough to encompass light pad. Can be constructed from a polystyrene box.
Tygon Tubing (for aspirator)	Grainger	9CUG7	Widely available.
Video Camera	Canon	1959C001AA	Any video camera is suitable.