Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

High-Throughput metode til måling af alkohol sedation Tid af individuelle Drosophila melanogaster

Published: April 20, 2020 doi: 10.3791/61108
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Genetics and Biochemistry and Center for Human Genetics, Clemson University
* These authors contributed equally

Summary

Nuværende metoder til måling af alkoholfølsomhed i Drosophila er designet til at teste grupper af fluer. Vi præsenterer en enkel, billig, høj-throughput assay til vurdering af alkohol sedation følsomhed i stort antal af enkelt fluer. Metoden kræver ikke specialiserede værktøjer og kan udføres i ethvert laboratorium ved hjælp af fælles materialer.

Abstract

Drosophila melanogaster giver en fremragende model til at studere den genetiske fundament af alkohol følsomhed. I modsætning til undersøgelser i befolkningsgrupper giver Drosophila-modellen mulighed for streng kontrol over genetisk baggrund, og stort set ubegrænset antal personer af samme genotype kan opdrættes hurtigt under velkontrollerede miljøforhold uden lovgivningsmæssige restriktioner og til relativt lave omkostninger. Fluer udsat for ethanol undergår fysiologiske og adfærdsmæssige ændringer, der ligner human alkoholforgiftning, herunder tab af postural kontrol, sedation og udvikling af tolerance. Her beskriver vi en enkel, billig, høj-throughput assay til vurdering af alkohol sedation følsomhed i stort antal af enkelt fluer. Analysen er baseret på videooptagelse af enkeltfluer indført uden anæstesi i 24-brønd celle kultur plader i et set-up, der muliggør synkron indledning af alkohol eksponering. Systemet gør det muligt for en enkelt person at indsamle individuelle ethanol sedation data om så mange som 2.000 fluer inden for en 8 timers arbejdsperiode. Analysen kan i princippet udvides til at omfatte en vurdering af virkningerne af eksponering for et flygtigt stof og anvendes til at måle virkningerne af flygtige stoffers akutte toksicitet på andre insekter, herunder andre fluearter.

Introduction

National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism rapporterer, at i 2015 overdreven alkoholforbrug, udpeget som "alkoholbrug lidelse", påvirket en anslået 16 millioner mennesker i USA. Alkoholmisbrug forårsager en bred vifte af negative fysiologiske virkninger og er en væsentlig dødsårsag i USA. Hos mennesker har nedsat følsomhed eller et lavt niveau af respons på alkohol en stærk genetisk komponent og er forbundet med en højere risiko for at udvikle alkoholmisbrugsforstyrrelser1,2,3,4. Genetiske risikoundersøgelser af befolkningsgrupper er udfordrende på grund af blanding af befolkningen, forskellige udviklingshistorieog miljøeksponeringer og afhængighed af selvrapporterede spørgeskemaer til kvantificering af alkoholrelaterede fænotyper, som ofte er forvirrede med andre neuropsykiatriske tilstande.

Drosophila melanogaster er en fremragende model til at studere de genetiske fundamenter af alkohol følsomhed5,6,7,8. Drosophila-modellen giver mulighed for streng kontrol over genetisk baggrund, og stort set ubegrænset antal personer af samme genotype kan opdrættes hurtigt under velkontrollerede miljøforhold uden lovgivningsmæssige restriktioner og til relativt lave omkostninger. Ud over offentligt tilgængelige mutationer og RNAi-linjer, der er målrettet mod et flertal af gener i genomet, har tilgængeligheden af Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP), en population på 205 indavlede vilde linjer med komplette genomsekvenser, muliggjort forbindelsesundersøgelserforhele genomet 9,10. Sådanne undersøgelser har identificeret genetiske netværk i forbindelse med virkninger på udviklingstiden og levedygtigheden ved udvikling af ethanol11,12. Evolutionær bevarelse af grundlæggende biologiske processer gør det muligt translationelle slutninger, der skal drages ved at overlejre menneskelige ortologs på deres flyve modstykker.

Fluer udsat for ethanol undergår fysiologiske og adfærdsmæssige ændringer, der ligner human alkoholforgiftning, herunder tab af postural kontrol8, sedation, og udvikling af tolerance13,14,15. Alkohol induceret sedation i Drosophila kan kvantificeres ved hjælp af inebriometre. Der er tale om 122 cm lange lodrette glassøjler med skrå maskeskillevægge , som fluer kan fastgøre16,17,18. En gruppe på mindst 50 fluer (køn kan analyseres separat) indføres i toppen af kolonnen og udsættes for ethanoldampe. Fluer, der mister postural kontrol falder gennem kolonnen og indsamles med 1 min intervaller. Den gennemsnitlige elueringstid tjener som et mål for følsomhed over for alkoholforgiftning. Når fluer udsættes for alkohol en anden gang efter at være kommet sig efter den første eksponering, kan de udvikle tolerance, som det fremgår af et skift i middelelueringstiden13,15,19,20. Mens inebriometer analyser har ført til identifikation af gener, genetiske netværk, og cellulære veje forbundet med alkohol sedation følsomhed og udvikling af tolerance12,,13,14,21, analysen er tidskrævende, lav-throughput, og ineffektiv til måling af alkohol følsomhed i enkelt fluer.

Alternative ethanolsedationsanalyser , der ikke kræver den omfattende opsætning af inebriometer , giver mulighed for mere bekvemme målinger , men som stadig er begrænsede i overførselsmængde og kræver generelt analyser af grupper af fluer i stedet for individer21,22,23,24,25. Vurdering af enkelte fluer minimerer risikoen for konfunderende effekter på grund af gruppeinteraktioner, f.eks. Her præsenterer vi en enkel, billig, høj-throughput assay til vurdering af alkohol sedation følsomhed i stort antal af enkelt fluer.

Protocol

1. Konstruktion af prøveapparaturet

  1. Opret en papskabelon på størrelse med en 24-brønds cellekulturplade ved at spore rundt om pladen på pap og skære det udpegede område ud.
  2. Skær et stykke lille insektskærm mesh størrelsen af cellekulturpladen ved hjælp af papskabelonen fra trin 1.1.
  3. Forbered en 24-brønd celle kultur plade ved at placere en lille linje af varm lim omkring kanten af toppen af pladen ved hjælp af en varm lim pistol og anbringelse skærmen mesh på toppen af de åbne brønde.
  4. Fastgør et træhåndværk, der klæber til hver af tre sider af den samme cellekulturplade fra trin 1.3 ved hjælp af en varm limpistol. Den modificerede cellekulturplade skal nu ligne det pladediagram, der er vist i figur 1A, og den eksperimentelle opsætning vist i figur 2.
    BEMÆRK: Forbered mindst lige så mange cellekulturplader, som der er plads til i filmkamrene (se nedenfor).

Figure 1
Figur 1: Diagram over testapparatet og filmkammeret. (A) Øvre diagrammer. Henholdsvis testapparatets over- og sidevisning vises. En skærm mesh lægger fladt på toppen af en 24-brønd celle kultur plade. Træhåndværksstavene, repræsenteret ved pilespidserne, er fastgjort til tre tilstødende sider for stabilitet og justering støtte, to på siden af brøndpladen med seks brønde og en på siden af pladen med fire brønde. Alle tilbehør er varmt limet på apparatet. (B) Lavere diagrammer. Den øverste, side, og front visninger af analysen set-up er vist, henholdsvis. En slids skæres i højre side af kassen, fra åbningen for låget til bagsiden af åbningen, med bunden af slidsen niveau til den indre overflade. Hullet på toppen af kassen, overfladen parallelt med jorden, er centreret for maksimal videoeksponering. Den nedtonede boks repræsenterer videokameraet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Fotografi af analysesystemet. Videokameraet er placeret oven på polystyrenkammeret, med linsen indsat i cut-out hul, illustreret i diagrammerne af figur 1B. To sæt modificerede 24-brøndcellekulturplader hviler oven på en belysningspude, der indsættes i en slids gennem siden af kammeret. Klik her for at se en større version af dette tal.

2. Opførelse af filmkammeret

  1. Opret et filmkammer ved at skære et hul på størrelse med videokameralinsen på siden af en polystyrenkasse. Skær en ekstra slids bredden af belysningpad i den modsatte side af polystyren boksen. Filmkammeret skal ligne det filmkammer, der er vist i figur 1B og figur 2.
  2. Gør filmkammeret klar til brug ved at sætte belysningspuden i slidsen og placere kameraet i linsehullet over belysningspuden.
  3. Placer alle materialer og udfør alle efterfølgende test i et kontrolleret miljø, helst et adfærdskammer med ca. 30% fugtighed, 25 °C temperatur, ensartet luftstrøm og støjniveauer under 65 dB.

3. Fremstilling af prøveapparaturet og -fluer

  1. Pipette 1 ml 100% ethanol gennem skærmen mesh i hver brønd.
  2. Tør skærmen mesh med et stykke ostelærred.
  3. Skær to stykker ostelærred dimensionerne af cellekulturpladen ved hjælp af papskabelonen, der blev skabt i trin 1.1. De anbringes oven på det tørre skærmnet på den modificerede cellekulturplade, der indeholder ethanol, fra trin 3.2.
  4. Opret et lille stykke tyndt, fleksibelt plastskærebræt ved at spore rundt om papskabelonen, der blev skabt i trin 1.1 som en generel vejledning og udvide det sporede område med 1-2 cm på en af de korte sider. Skær det udvidede sporede område ud fra det tynde, fleksible plastskærebræt. Efter skæring skal du sørge for, at plasten stadig passer mellem de tre træhåndværkspinde på testapparatet, men hænger den ene ende af med 1-2 cm.
  5. (Valgfrit) Hvis der skal oprettes en aspirator, skal der samles en aspirator som den, der er vist i figur 3, ved først at skære en P1000 pipettespids i halve. Indsæt stykket med en større diameter i den ene ende af en ~ 30 cm stykke fleksibel slange til at tjene som et mundstykke.

Figure 3
Figur 3: En flueaspirator, hvor fluer opsamles med et udskifteligt mundstykke fastgjort til fleksible slanger og en bred bar serologisk pipette med en bomuldsgazeprop. Operatøren kan aspirere en enkelt flue ind i pipetten til overførsel uden anæstesi. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. (Valgfrit) For at fuldføre aspirator samling, dække den brede ende af en 10 cm stykke serologisk pipette med gaze for at forhindre fluer i at komme ind i slangen og indsætte pipette, gaze først, i den åbne ende af slangen til at tjene som en flue kammer. Aspireren skal ligne den, der er vist i figur 3.
  2. Ved hjælp af en aspirator (Figur 3, trin 3,5 og 3,6), aspirerer en flue pr. brønd i en separat cellekulturplade med 24 brønde. Brug den fleksible plast til at dække brønde, der indeholder tidligere indsugningsfluer. Optag brøndpositionen og eventuelle relevante genotype- eller fænotypeoplysninger for hver flue.
  3. Hold den fleksible plast flugt med toppen af cellekulturpladen, der indeholder fluerne for at forhindre deres flugt og vende pladen på toppen af den modificerede cellekulturplade med ethanol. Arket af fleksibel plast skal hvile oven på pladerne af ostelærred. Juster den omvendte cellekulturplade, der indeholder fluer ved hjælp af håndværkspinde, for at sikre, at hver brønd med ethanol flugter med hver brønd, der indeholder en flue.
  4. Den eksperimentelle opsætning skal ligne figur 2.

4. Test af fluer

  1. Sørg for, at belysningspuden lyser ved fuld lysstyrke for at opnå maksimal visuel kontrast. Begynd at optage med videokameraet.
  2. For at udsætte fluerne for ethanol skal du forsigtigt fjerne plasten fra mellem brøndpladen og testapparatet, idet du skal passe på ikke at løsne ostelærredet.
  3. Afslut videooptagelsen, når alle fluer har mistet postural kontrol. Når der er mistanke om, at alle fluer har mistet postural kontrol, skal du trykke fast i midten af pladen for at sikre, at alle fluer har fuldstændig tab af postural kontrol. Hvis der er bevægelse, skal du fortsætte med at optage. Fortsæt med at trykke regelmæssigt (hver 1-2 min), indtil ingen bevægelse opstår.
  4. (Valgfrit) For hurtigt at genvinde fluerne, skal du kun fjerne toppladen fra testapparatet, afslører bedøvede fluer hvilende på ostelærredet. Aspirate enkelte flyver ind i udvalgte beholdere til nyttiggørelse.
  5. Ethanolen udskiftes i de modificerede cellekulturplader med 1 ml frisk 100 % ethanol mindst 1 x hver time for at kontrollere forfordampning og befugtning af ethanolen og for at opretholde en ensartet ethanoleksponering under hele analysen. Tør skærmmasken med ostelærred.
  6. Gentag for så mange prøver som ønsket.
    BEMÆRK: For højeste gennemløb, aspirat den næste runde af fluer i nye celle kultur plader under videooptagelse. Protokollen kan sættes på pause her, da videooptagelsen kan gennemgås senere.

5. Bestemmelse af flyvesedationstid

  1. Optag sedation tid for hver enkelt flyve ved at se videooptagelse. Sedation tid er defineret som det øjeblik en flue mister fuldstændig postural kontrol og bevægelsesevne. Det anbefales at se filmen i bakgear og optage det tidspunkt, hvor fluen begynder at bevæge sig for at sikre nøjagtighed.

Representative Results

To 24-brønd mikrotiter plader kunne generere data samtidig på 48 individuelle fluer inden for så lidt som 10 min. Tabel 1 lister målinger af ethanol sedation gange for 48 individuelle fluer, hanner og hunner separat, af to DGRP linjer med forskellige følsomheder over for alkohol eksponering på udvikling tid og levedygtighed13. Linjefluer RAL_555 var mindre følsomme end linje RAL_177 (figur 4, tabel 2; p < 0,0001, ANOVA). Hanner og hunner af RAL_177 udviste ingen seksuelt dimororfe virkning (figur 4, tabel 2; p > 0,1, ANOVA), mens hunner af linje RAL_555 var mindre følsomme over for ethanoleksponering end hannerne ( figur4, tabel 2; p < 0,006, ANOVA). Det store antal fluer, der kan måles samtidigt, og evnen til at måle køn og forskellige linjer samtidig tikanet kan øge nøjagtigheden ved at reducere fejl på grund af miljøvariation.

A. Ethanol Sedation Time (r) B. Ethanol Sedation Time (r)
Kvinder Mænd Kvinder Mænd
414 365 477 423 568 309 937 742 622 460 331 498
201 384 498 411 523 626 791 619 197 467 455 562
228 364 333 440 403 267 504 744 513 570 582 506
440 416 404 408 422 384 970 540 369 865 533 492
888 283 285 322 369 287 595 550 606 392 544 345
1079 519 315 393 376 284 418 709 553 308 477 388
718 287 432 275 206 411 366 564 558 385 576 377
598 337 398 279 631 372 437 692 578 460 511 412
241 398 364 347 374 808 665 729 484 532 425 354
229 423 534 386 396 628 312 576 305 334 531 506
388 488 451 523 322 533 682 638 420 560 548 379
252 529 375 427 330 540 1045 741 708 832 509 472
674 401 303 401 307 311 394 675 381 477 449 784
303 453 351 429 525 262 540 690 520 556 495 226
258 483 302 389 562 319 356 615 336 454 524 590
346 426 385 416 596 287 626 678 840 634 677 509

Tabel 1: Målinger af sedationstider for ethanol(r) for individuelle fluer af (A) DGRP-linjer RAL_177 og (B) RAL_555 for særskilte køn ( n =48). Se også tabel 2, figur 4.

Figure 4
Figur 4: Sengetider for alkohol sedation for DGRP-linjer RAL_177 og RAL_555. Søjlerne repræsenterer middelværdien og fejllinjerne SEM (n = 48). Sedation gange for RAL_177 fluer var mindre end for RAL_55 fluer (p < 0,0001, ANOVA). De enkelte datapunkter er angivet i tabel 1. Yderligere statistisk signifikante forskelle mellem køn og linjer er angivet i teksten og i tabel 2. Klik her for at se en større version af dette tal.

Analyse Kilde til variation Df Ss F-værdi P-værdi
Fuld model samlet Linje 1 769627 34.869 <0.0001
Køn 1 105001 4.757 0.0304
Linje x Sex 1 86021 3.897 0.0498
Fejl 188 4149491
Reduceret model hunner Linje 1 685126 23.58 <0.0001
Fejl 94 2730718
Reduceret model hanner Linje 1 170522 11.3 0.0011
Fejl 94 1418774
Reduceret model RAL_177 Køn 1 473 0.023 0.8800
Fejl 94 1943741
Reduceret model RAL_555 Køn 1 190549 8.12 0.0054
Fejl 94 2205751

Tabel 2: Analyser af varians for sedation tid på tværs af køn og DGRP linje. Den anvendte model var Y = μ + L + L + LxS + ε, hvor μ er det samlede gennemsnit, L er den faste effekt af DGRP-linjen (RAL_177, RAL_555), S er den faste effekt af køn (mand, kvinde), LxS er interaktionsudtrykket (fast), og ε er fejludtrykket. Modellerne Y = μ + L + ε og Y = μ + S + ε blev anvendt til de reducerede modeller. Line, Sex, og Line x Sex interaktion sigt var alle væsentlige i den fulde model på α < 0,05. Reducerede modeller efter køn og DGRP linje RAL_555 var også betydelige på α < 0,01. Se også tabel 1, figur 4. df = frihedsgrader, SS = Type I Summer of Squares.

Discussion

Her præsenterer vi en enkel, billig og høj-throughput metode til vurdering af sedation tid på grund af ethanol eksponering i Drosophila melanogaster. I modsætning til mange nuværende metoder, som kræver gruppeanalyser, gør denne analyse det muligt for en enkelt person at indsamle individuelle sedationstidsdata for ~ 2.000 fluer inden for en 8 timers arbejdsperiode. Vi fandt ud af, at en enkelt person kan score 48 fluer for sedation tid i omkring 5 min. Med denne hastighed kan 2.000 fluer scores på cirka 4 timer, men scoring kan gennemføres senere. Med vores analyse, den registrerede sedation tid for de fleste fluer spænder fra 5-15 min ved en eksponering til 1 ml 100% ethanol. Lavere koncentrationer af ethanol eller mindre leveringsmængder vil resultere i længere sedation gange.

De nuværende metoder til vurdering af sedationstiden kræver test af et stort antal fluer uden let at muliggøre målinger på enkeltindivider15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Mange nuværende sedation og følsomhed assays stole på ST5022,23,24, det tidspunkt, hvor 50% af fluerne er bedøvet som følge af ethanol eksponering. Selv om opnåelse af ST50 for grupper af fluer ikke var den primære motivation for at udvikle denne analyse, viser videooptagelserne højere nytte i forhold til de nuværende metoder, da optagelserne kan bruges til at fastslå ST50 for grupper af individuelt testede fluer og til at måle procentdelen af fluer, der opfylder et givet kriterium (f.eks. tab af postural kontrol) til enhver tid. Det skal bemærkes, at sådanne videoanalyser ville kræve ekstra tid.

I modsætning til nuværende inebriometer analyser, den metode, vi beskriver ikke kræver specialiserede værktøjer til at oprette og kan udføres i ethvert laboratorium ved hjælp af fælles materialer. Ved hjælp af denne metode har vi opnået pålidelige og ensartede sedation gange for individuelle fluer. Analysen kan i princippet udvides til at vurdere virkningerne af eksponering for et flygtigt stof. Analysen kan også anvendes til at måle virkningerne af akut toksicitet af flygtige stoffer på andre insekter, herunder andre fluearter. Individuelle sedationstidsdata kan bruges til at vurdere omfanget af fænotypiskvariation inden for en population, f.eks.

Vi brugte små insektskærmnet for at forhindre direkte kontakt med ethanolopløsningen, samtidig med at vi tillod tilstrækkelige mængder ethanoldampe at nå fluen. Laget af hvid ostelærred oven på skærmmasken giver visuel kontrast mellem fluen og overfladen nedenfor og sikrer, at fluer ikke bliver fanget i skærmmasken, hvilket kan føre til tvetydig bestemmelse af tab af postural kontrol. Kommercielt tilgængelige membraner, der er porøse til vand og luft gav inkonsekvente resultater og var utilstrækkeligt gennemtrængelige til ethanol dampe. Vi har bevidst brugt små insekt skærm mesh, fordi det er et ensartet porøst materiale, der minimerer variation i ethanol eksponering som følge af flyve position i en brønd. Ændringer kan foretages i denne protokol baseret på tilgængelige materialer, selv om vi anbefaler en kontrolleret adfærdsmæssige kammer, adgang til 90% -100% ethanol tæt på fluen, og ensartet ethanol eksponering.

Flyve position inden for cellekultur plader bør randomiseres mellem replikater for at undgå positionelle bias. For større forsøg, der kræver brug af denne analyse på tværs af flere dage og derfor er underlagt miljømæssige variationer, der kan påvirke assay resultater (f.eks ændringer i barometertryk)27, anbefaler vi kraftigt, at fluer testes på samme tidspunkt hver dag og randomiseres både inden for og på tværs af dage, især hvis forskellige linjer og / eller køn skal sammenlignes med hinanden.

Den metode, vi udviklede, er bedst egnet til at måle effekten af akut alkoholeksponering, men er ikke egnet til at opnå forbrugsdata eller modelleringsafhængighed. Data om alkoholsedation sedation følsomhed fra denne analyse kan dog integreres med andre foranstaltninger af alkoholrelaterede fænotyper. En begrænsning af systemet er, at den lodrette højde af standard celle kultur plader giver mulighed for lodret flyve bevægelse, der ikke umiddelbart kan spores ved video til detaljeret vurdering af den samlede aktivitet eller bevægelse. Denne begrænsning påvirker dog ikke en nøjagtig vurdering af sedationstiden. Når du bruger fluer af forskellige genotyper (f.eks. i DGRP-afledte udbredde populationer28), gør denne analyse det også muligt at hente individuelle fluer for at indsamle puljer af fluer med kontrasterende fænotyper til bulk-DNA-sekvensering og ekstrem QTL-kortlægning29,30. Samlet set denne analyse tillader hurtig, billig indsamling af alkohol sedation data om et stort antal af enkelt fluer.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud DA041613 og GM128974 fra National Institutes of Health til TFCM og RRHA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well Cell Culture Plates Corning 3526 Flat-bottomed; will house flies throughout assay
Aspirator
Cheesecloth Genesee Scientific 53-100 Widely available.
Ethanol Decon Labs V1001 Widely available.
Flexible Plastic Cutting Board (Plate Cover) Walmart 550098612 Any flat plastic that can slide easily and cover a 24-well plate completely. Flexible plastic cutting board works well.
Gauze (for aspirator) Honeywell North 67622 Widely available.
Illumination Pad Amazon (AGPtek) ASIN B00YA9GP0G Any light pad to provide contrast is suitable.
Jumbo Craft Sticks Michaels 10334892 Any craft stick at least 7 cm long is suitable.
P1000 Pipette Tip (for aspirator) Genesee Scientific 24-165RL Any P1000 pipette tip is suitable.
Serological Pipette (for aspirator) Genesee Scientific 12-104
Small Insect Screen Mesh Lowe's (Saint-Gobain ADFORS) 89322 Any small insect screen mesh is suitable.
Testing Chamber Interior space dimension big enough to encompass light pad. Can be constructed from a polystyrene box.
Tygon Tubing (for aspirator) Grainger 9CUG7 Widely available.
Video Camera Canon 1959C001AA Any video camera is suitable.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heath, A. C., et al. Genetic differences in alcohol sensitivity and the inheritance of alcoholism risk. Psychological Medicine. 29 (5), 1069-1081 (1999).
  2. Schuckit, M. A., Smith, T. L. The relationships of a family history of alcohol dependence, a low level of response to alcohol and six domains of life functioning to the development of alcohol use disorders. Journal of Studies on Alcohol. 61 (6), 827-835 (2000).
  3. Trim, R. S., Schuckit, M. A., Smith, T. L. The relationships of the level of response to alcohol and additional characteristics to alcohol use disorders across adulthood: a discrete-time survival analysis. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33 (9), 1562-1570 (2009).
  4. Schuckit, M. A., Smith, T. L. Onset and course of alcoholism over 25 years in middle class men. Drug and Alcohol Dependence. 113 (1), 21-28 (2011).
  5. Morozova, T. V., Mackay, T. F. C., Anholt, R. R. H. Genetics and genomics of alcohol sensitivity. Molecular Genetics and Genomics. 289 (3), 253-269 (2014).
  6. Heberlein, U., Wolf, F. W., Rothenfluh, A., Guarnieri, D. J. Molecular genetic analysis of ethanol intoxication in Drosophila melanogaster. Integrative and Comparative Biology. 44 (4), 269-274 (2004).
  7. Engel, G. L., Taber, K., Vinton, E., Crocker, A. J. Studying alcohol use disorder using Drosophila melanogaster in the era of 'Big Data'. Behavioral and Brain Functions. 15 (1), 7 (2019).
  8. Singh, C. M., Heberlein, U. Genetic control of acute ethanol-induced behaviors in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 24 (8), 1127-1136 (2000).
  9. Mackay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
  10. Huang, W., et al. Natural variation in genome architecture among 205 Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel lines. Genome Research. 24 (7), 1193-1208 (2014).
  11. Morozova, T. V., et al. A Cyclin E centered genetic network contributes to alcohol-induced variation in Drosophila development. G3. 8 (8), Bethesda, Md. 2643-2653 (2018).
  12. Morozova, T. V., et al. Polymorphisms in early neurodevelopmental genes affect natural variation in alcohol sensitivity in adult drosophila. BMC Genomics. 16, 865 (2015).
  13. Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. Functional ethanol tolerance in Drosophila. Neuron. 28 (1), 261-271 (2000).
  14. Berger, K. H., Heberlein, U., Moore, M. S. Rapid and chronic: two distinct forms of ethanol tolerance in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 28 (10), 1469-1480 (2004).
  15. Morozova, T. V., Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. Transcriptional response to alcohol exposure in Drosophila melanogaster. Genome Biology. 7 (10), 95 (2006).
  16. Weber, K. E. An apparatus for measurement of resistance to gas-phase agents. Drosophila Information Service. 67, 91-93 (1988).
  17. Weber, K. E., Diggins, L. T. Increased selection response in larger populations. II. Selection for ethanol vapor resistance in Drosophila melanogaster at two population sizes. Genetics. 125 (3), 585-597 (1990).
  18. Cohan, F. M., Graf, J. D. Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance. Evolution. 39 (2), 278-293 (1985).
  19. Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436 (7052), 845-847 (2005).
  20. Morozova, T. V., Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. Phenotypic and transcriptional response to selection for alcohol sensitivity in Drosophila melanogaster. Genome Biology. 8 (10), 231 (2007).
  21. Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: Translational potential of systems genetics. Genetics. 83, 733-745 (2009).
  22. Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33 (10), 1794-1805 (2009).
  23. Sandhu, S., Kollah, A. P., Lewellyn, L., Chan, R. F., Grotewiel, M. An inexpensive, scalable behavioral assay for measuring ethanol sedation sensitivity and rapid tolerance in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (98), e52676 (2015).
  24. Urizar, N. L., Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. Drosophila homer is required in a small set of neurons including the ellipsoid body for normal ethanol sensitivity and tolerance. The Journal of Neuroscience. 27 (17), 4541-4551 (2007).
  25. Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T., Heberlein, U. High-resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 22 (24), 11035-11044 (2002).
  26. Cohan, F. M., Hoffmann, A. A. Genetic divergence under uniform selection. II. Different responses to selection for knockdown resistance to ethanol among Drosophila melanogaster populations and their replicate lines. Genetics. 114 (1), 145-164 (1986).
  27. Pohl, J. B., et al. Circadian genes differentially affect tolerance to ethanol in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 37 (11), 1862-1871 (2013).
  28. Huang, W., et al. Epistasis dominates the genetic architecture of Drosophila quantitative traits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 15553-15559 (2012).
  29. Ehrenreich, I. M., et al. Dissection of genetically complex traits with extremely large pools of yeast segregants. Nature. 464 (7291), 1039-1042 (2010).
  30. Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. The road less traveled: From genotype to phenotype in flies and humans. Mammalian Genome. 29, 5-23 (2018).

Tags

Adfærd adfærd genetik ethanol model organisme screening Drosophila Genetiske Reference Panel
High-Throughput metode til måling af alkohol sedation Tid af individuelle <em>Drosophila melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sass, T. N., MacPherson, R. A.,… More

Sass, T. N., MacPherson, R. A., Mackay, T. F. C., Anholt, R. R. H. High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (158), e61108, doi:10.3791/61108 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter