Summary
En metode for å levere nevrale stamceller, tilpasningsdyktig for sprøyteløsninger eller suspensjoner, gjennom den vanlige halspulsåren (mus) eller ekstern halspulsåren (rotte) etter iskemisk slag er rapportert. Injiserte celler distribueres bredt gjennom hele hjernen parenchyma og kan oppdages opp til 30 d etter levering.
Abstract
Neural stamcelle (NSC) terapi er en nyskapende behandling for hjerneslag, traumatisk hjerneskade og nevrodegenerative lidelser. Sammenlignet med intrakraniell levering er intraarteriell administrering av NSCer mindre invasiv og gir en mer diffus fordeling av NSCer i hjerneparenchyma. Videre, intra-arteriell levering tillater første-pass effekt i hjernen sirkulasjon, redusere potensialet for fangst av celler i perifere organer, som lever og milt, en komplikasjon forbundet med perifere injeksjoner. Her beskriver vi metodikken, både i mus og rotter, for levering av NSCer gjennom den vanlige halspulsåren (mus) eller ekstern halspulsåren (rotte) til den ipsilaterale halvkule etter et iskemisk slag. Ved hjelp av GFP-merkede NSCer illustrerer vi den utbredte fordelingen oppnådd gjennom gnager ipsilateral halvkule ved 1 d, 1 uke og 4 uker etter postischemic levering, med en høyere tetthet i eller i nærheten av iskemisk skadested. I tillegg til langsiktig overlevelse viser vi tegn på differensiering av GFP-merkede celler ved 4 uker. Den intraarterielle leveringstilnærmingen som er beskrevet her for NSCer, kan også brukes til administrering av terapeutiske forbindelser, og har dermed bred anvendelighet til varierte CNS-skade- og sykdomsmodeller på tvers av flere arter.
Introduction
Stamcellebehandling (SC) har et enormt potensial som behandling for nevrologiske sykdommer, inkludert hjerneslag, hodetraumer og demens1,,2,,3,,4,,5,6. En effektiv metode for å levere eksogene SCer til den syke hjernen er imidlertid fortsatt problematisk2,,6,7,8,9,10,11,12,13. SCer levert gjennom perifere leveringsruter, inkludert intravenøs (IV) eller intraperitoneal (IP) injeksjon, er gjenstand for førstepassfiltrering i mikrosirkulasjonen, spesielt i lunge-, lever-, milt- og muskel8,,9,,13,14,noe som øker sjansene for akkumulering av celler i ikke-målområder. Den invasive intracerebral injeksjon metoden resulterer i lokaliserte hjernevev skade og en svært begrenset fordeling av SCs nær injeksjonsstedet2,,6,8,14,15,16. Vi har nylig etablert en kateterbasert intraarteriell injeksjonsmetode for å levere eksogene nevrale SCer (NSCer), som er beskrevet her brukt i en gnagermodell av fokal iskemisk slag. Vi induserer forbigående (1 h) iskemi-reperfusjonsskade på en halvkule ved hjelp av en silikongummibelagt filament for å okkludere venstre midtre cerebral arterie (MCA) i musen eller rotte17,18,19. I denne modellen har vi reprodusert observert ca 75-85% depresjon av cerebral blodstrøm (CBF) i ipsilateral halvkule med Laser Doppler eller Laser speckle imaging17,19, noe som gir konsekvent nevrologiske underskudd17,18,19.
For tidsbesparende formål er videoen satt til å spille med dobbelt så høy hastighet og rutinemessige kirurgiske prosedyrer som hudforberedelse og sårlukking med sutur og bruk og oppsett av den motoriserte sprøytepumpen, presenteres ikke. Metoden for intraarteriell levering av NSCer er demonstrert i sammenheng med den midterste cerebrale arterieklusjonsmodellen (MCAO) av eksperimentelt slag hos gnagere. Derfor inkluderer vi den forbigående iskemiske slagprosedyren for senere å demonstrere hvordan den andre operasjonen, den intraarteriske injeksjonen, utføres ved hjelp av det forrige kirurgiske stedet på samme dyr. Muligheten for intraarteriell NSC-levering i gnagerslagmodeller demonstreres ved å vurdere fordelingen og overlevelsen av eksogene NSCer. Effekten av NSC-behandling for å dempe hjernepatologi og nevrologisk dysfunksjon vil bli rapportert separat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrene for dyrefag ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Kentucky, og passende forsiktighet ble tatt for å minimere stress eller smerte forbundet med kirurgi.
1. Tilberedning av injeksjonskateter og kirurgiske kroker
- Konstruere injeksjonskateteret (figur 1). Samle nødvendige materialer, inkludert: MRE010, MRE025 og MRE050 rør, 20 G, 26 G og 27 G injeksjon nåler (Figur 2A),600 grus sandpapir, superlim og to-komponent 5-minutters epoxy.
- Kapp 20 G og 26 G kanyler ved 1 cm fra nålenavet og poler enden på sandpapir (figur 2B). Skyll kanylene med 10 ml dobbelt destillert vann for å rengjøre nåleboret.
MERK: To forskjellige design (figur 1) brukes. Design 1 har en enkelt kontakt og brukes til injeksjon av løsninger eller suspensjoner. Design 2 har 20 G og 26 G Luer låsekontakter for injeksjon av celler (20 G nål) og spyling av det døde volumet (26 G nål) for å sikre levering av hele volumet av NSC-inneholdende oppløsning.
- Kapp 20 G og 26 G kanyler ved 1 cm fra nålenavet og poler enden på sandpapir (figur 2B). Skyll kanylene med 10 ml dobbelt destillert vann for å rengjøre nåleboret.
- Design 1: Sett inn et 3-4 cm langt MRE010-kateter i et 15 cm langt MRE025-kateter og fest med superlim.
- Koble den andre enden av MRE025-røret til et segment av MRE050-kateteret, og fest med superlim. Sett en sløv 20 G kanyle inn i den gjenværende enden av MRE050-kateteret og fest med superlim (figur 1).
- Ytterligere forsterke tilkoblingsstedene med epoksylim. Denne kateterdesignen er optimal for injeksjon av reagenser (som kjemiske eller legemiddelløsninger eller andre biologer som cytokiner).
- Design 2: Sett inn et 3-4 cm langt MRE010-kateter i et 15 cm langt MRE025-kateter og fest med superlim.
- Koble den andre enden av MRE025-røret til et segment av MRE050-kateteret, og fest med superlim. Sett en sløv 20 G kanyle inn i resten av enden av MRE050-kateteret og fest med superlim.
- Sett en sløv 26 G kanyle inn i MRE050-røret nær spissen av den første nålen, følg injeksjonsstrømmen, og fest med superlim (figur 1 og figur 2C). Forsterke både nåler og segmentet av MRE050 rør med klar epoksy (Figur 2C). Denne designen gjør det mulig å sprøyte inn kjøretøyets oppløsning gjennom nål 2 (26 G) etter NSC-injeksjon gjennom nål 1 (20 G) for å skylle det døde volumet i kateteret i hjernesirkulasjonen, og oppnå mer presis kontroll av injeksjonsvolumer.
- Bruk en 20 G kanyle for NSC injeksjon for å minimere skade på NSCs, som kan påvirke levedyktigheten negativt.
- Etter bygging, skyll katetrene med 10 ml dobbelt destillert vann, etterfulgt av 70% etanol, og deretter suge dem i 70% etanol over natten.
- Før operasjonen, fjern katetrene fra 70% etanol og skyll med 10 ml steril PBS, og plasser dem i en autoklavet kirurgisk verktøykasse for lagring og transport.
- Utarbeidelse av kirurgiske kroker
- Klipp en 1,5- 2 cm lang nåleaksel fra en 27 G nål, og poler begge ender på sandpapir til kjedelig. Bruk deretter en liten hemostatisk klemme til å bøye akselen i en krok i den ene enden og en ringform i den andre enden.
- Sett inn et 10-15 cm langt MRE025 kateter gjennom ringen og fest med klar kirurgisk tape (Figur 2D). Lag 2 kroker til ved hjelp av samme metode.
- Bløtlegg alle kroker og katetersystemer i 70% etanol til bruk.
2. Dyreforberedelse: Levering, bolig, miljøtilpasning
- Mus fra hann og hunn (10-12 uker, n=10/tidspunkt) og Wistar-rotter (10-12 uker, n=10) ble brukt i denne studien.
- Hus dem i et miljøkontrollert dyr vivarium med mat og vann ad libitum.
- La dem tilpasse seg miljøet minst 1 uke før slagoperasjonen.
MERK: En mus og en rotte døde ved 1 d etter slagkirurgi og en mus ble eutanisert ved 3 d post-stroke før NSC injeksjon av humane grunner på grunn av alvorlig lammelse.
3. Kultur av mus og rotte nevrale stamceller (NSCs)
MERK: NSCer ble isolert og kultivert etter en etablert protokoll20.
- Mus (mus)
- Isoler wildtype (WT) og GFP-merkede NSCer fra E18 embryonale cortex fra tidsavsatte kvinnelige C57BL/6 mus parret med GFP-positive hannmus (B6 ACTb-EGFP). For å identifisere GFP (+) embryoer, observere høstede embryoer på et fluorescensmikroskop ved hjelp av FITC-kanalen. GFP (+) embryoer gir grønt fluorescenssignal, mens WT-embryoer bare viser svak autofluorescens (figur 3A).
- Rotte (andre)
- Isoler NSCer fra subventrikulær sone (SVZ) av unge voksne WT rotter. Merk dem med DiI like før injeksjon etter produsentensanvisninger 21.
- Kultur mus eller rotte NSCs til de utvikler seg til neurospheres, og passerer dem når diameteren av sfæren når rundt 100 μm (Figur 3B). Bruk NSCs til injeksjon mellom passasjene 3 og 5.
- Kontroller stamcelleetalene ved hjelp av et embryonisk stamcellemarkørpanel (Figur 3C).
- På injeksjonsdagen samler du NSC-kuler og tar avstand fra celleløsningen, suspenderes i kalsium- og magnesiumfrie PBS til en konsentrasjon på 107 celler/ml, og plasser på våtis til injeksjon.
4. Kirurgisk forberedelse
- Før operasjonen, merk en prikk på den kommersielle MCAO-suturen med en sølvmarkørpenn på 9 mm (for mus) eller 15 mm (for rotte) fra spissen for in-surgery referanse av innsettingslengde. Autoklaver de kirurgiske verktøyene (saks, tang) og instrumenter før hver operasjon, og varme sterilisere dem i en glass perle sterilisator mellom operasjoner.
- Induser anestesi hos dyr med 5% isofluran via innånding og opprettholde anestesi med 1-2% isofluran. Evaluer dybden av anestesi gjennom observasjon av generelle forhold (pustemønster, whisker bevegelse, og spontan kroppskorreksjon holdning), hornhinnerefleks og respons på tåklemme.
- Legg dyr liggende på en varmepute, og forberede operasjonsstedet på dyret ved å klippe og skrubbe med betadinløsning etterfulgt av 70% etanol. Beskytt dyrets øyne mot tørking ved å bruke oftalmologisk salve (f.eks. kunstig tåresalve) under operasjonen.
- Få kirurger grundig skrubbe hendene med en bakteriedrepende skrubb og bruk en maske, sterile hansker og en ren lab frakk.
5. Midtre cerebral arterie okklusjon (MCAO) hjerneslag kirurgi
MERK: Operasjonene for å indusere iskemisk slag på en halvkule av mus eller rotte er like ved at en sutur innføres i den indre halspulsåren (ICA) for å okkludere blodstrømmen (figur 4)17,18,19,22. Arterien som er valgt for suturinnsetting, varierer imidlertid basert på tilgjengelig operasjonsplass som kreves for den påfølgende stamcelleinjeksjonen. Rotten har god plass i det eksterne halspulsåren (ECA) segmentet for å tillate to separate, sekvensielle operasjoner (hjerneslag og NSC injeksjon), men musen ikke, krever en alternativ tilnærming. Hjerneslaginduserte cerebrale blodstrømendringer, hjerneinfarkt størrelse og nevrologiske underskudd har blitt rapportert som i forfatternes tidligere rapporter17,18,19.
- For å indusere iskemisk slag, start både mus og rotte operasjoner med et mellomtone snitt på livmorhalsområdet, og isolering av venstre felles halspulsåren (CCA), ECA og ICA (Figur 4). Vær forsiktig med å ikke strekke, fortrenge eller klemme CCA eller vagus nerve. Siden valg av arterie og kirurgiske trinn er forskjellige etterpå, mcao kirurgi på musen og rotte vil bli beskrevet separat.
- MCAO kirurgi på musen (Figur 4A)
- Plasser tre flettede 6-0 nylonsyturer under CCA (Figur 4A, trinn 1), og gjør en stram kirurgisk knute for å okkludere fartøyet så langt fra bifurcation som mulig ved hjelp av den proksimale strengen (Figur 4A, trinn 2). Trim ned suturendene.
- Lag en slipknot på den distale siden av CCA (forsiktig: ikke stram for mye som det vil bli utgitt i trinn 6) og en løs slipknot mellom de to stramme knutene (Figur 4A, trinn 2).
- Klipp et lite snitt (~ 1/4 - 1/3 av omkretsen) nær den proksimale knuten på CCA med mikroscissors (Figur 4A, trinn 3), og sett forsiktig inn den kommersielle silikongummibelagte 7-0 solid nylon sutur (Figur 4A, trinn 4). Fest denne suturen med den midterste strengen, stramme tilstrekkelig(Figur 4A, trinn 5) for å sikre ingen blodlekkasje fra snittet og ingen bevegelse av silikongummibelagt nylonfilament ved tilbakestrømningen fra ICA, samtidig som det tillater fremstøting av suturen mot ECA med et forsiktig trykk av pinsettene.
- Slipp den øvre (distale) slipknoten (figur 4A, trinn 6) og før nylonsyturen inn i ICA til spissen passerer bifurcation i 9 mm (ved hjelp av sølvmarkøren på suturen som referanse). Stram de to øvre slipknotene for å feste suturen og forhindre blodtilstrømning.
- Trekk ut filamentet 1 timer senere (Figur 4A,trinn 7) og ligate CCA ved hjelp av den midterste knuten for å forhindre blødning (Figur 4A, trinn 5-7 i omvendt rekkefølge, endelige resultater som vist i trinn 8). Slipp den øvre knuten. Lukk såret med 4-0 kirurgisk sutur.
- MCAO-operasjon på rotte (figur 4B)
- Plasser to flettede 6-0 nylonsyturer under ECA (Figur 4B,trinn 1), og lag en stram knute i den distale enden så langt som mulig (Figur 4B, trinn 2).
- Plasser karklips på ICA og CCA for å okkludere arteriell blodstrøm (figur 4B,trinn 3). En slipknot kan brukes som et alternativ for en fartøyklips.
- Lag et lite snitt på ECA med mikroscissors (Figur 4B, trinn 3-4), sett inn en kommersiell silikongummi belagt 6-0 nylonfilament (Figur 4B, trinn 5), og fest riktig med en slipknot på ECA.
- Slipp karklemmen på ICA, før filamentet inn i ICA til sølvmarkøren (15 mm) når bifurcation (Figur 4B, trinn 6), og fest deretter suturen med 2nd knute på ECA (Figur 4B, trinn 6).
- Etter 1 t iskemi, trekk denne filament og ligate snittet for å hindre blødning (Figur 4B, trinn 7), fjerne karklemmen fra CCA (endelig resultat som i trinn 8), og lukk såret med 4-0 kirurgisk sutur.
6. Gjenoppretting
- Etter slagkirurgi, plasser dyr på en varmepute til de fullt ut gjenvinne bevisstheten.
- Gi analgesi via subkutan injeksjon. Returner dyr til deres hjem bur med tilgang til vann og mat annonse libitum.
7. Intraarteriell injeksjon
- Vask hele kateteret med 70% etanol og suge over natten til bruk. Rett før injeksjonen, koble Luer-låsen på kanylen med en steril sprøyte, og vask hele lumensiden av katetersystemet med 10 ml steril PBS.
- Tidsvindu og forberedelse til NSC injeksjon
MERK: Basert på erfaringer og rapporter fra andre forskningsteam, er tidspunktet for NSC-injeksjon avgjørende for overlevelse av både og eksogene NSCer. I vår pilotstudie førte injeksjon av NSCer ved tidlige tidspunkter (i løpet av de første 6 timer etter reperfusjon) til høyere dødelighet. Dermed testet vi senere injeksjonstidspunkter og bestemte tidsvinduet mellom 2 d (48 h) til 3 d (72 h) etter hjerneslag er trygt og utholdelig for dyr, og er effektiv i å oppnå intraparenchymal fordeling av NSCs. Resultatene som presenteres her er fra dyr mottatt NSC injeksjon på 3 d etter skade.- Sett sprøytepumpeinjeksjonshastigheten til 20 μL/min for mus og 50 μL/min for rotter. Overdreven hastighet eller varighet av injeksjonen kan resultere i systemisk volumoverbelastning, som mus er mer sårbare enn rotter.
- Kort sagt, ved 3 d etter hjerneslag kirurgi, bedøve dyrene med isofluran og legg dem liggende på en varmepute.
- Åpne livmorhalssåret igjen og utsett ECA, ICA og CCA igjen (figur 5, trinn 1). Som i slagoperasjoner, bestemme injeksjonsveien basert på arten. Bruk CCA for NSC injeksjon i musen, og ECA for rotte23.
- Intraarteriell injeksjon gjennom CCA i mus
- Plasser to 6-0 flettede nylonsyturer under CCA. Lag en løs slipknot med hver av dem mellom bifurcation og nedre knuter fra forrige slagkirurgi (Figur 5, trinn 2).
- Stram den øvre slipknot og deretter lage et lite snitt over den nedre knuten (Figur 5, trinn 3). Sett inn et MRE010-kateter gjennom snittet (figur 5,trinn 4) og fest med den midterste knuten uten å blokkere injeksjonsstrømmen (figur 5, trinn 5). Tilbakestrømning av blod skal være synlig i kateteret når du slipper den øvre knuten og justere kateterstillingen.
- Plasser et karklips på ECA, injiser 1 x 106 GFP-NSCer gjennom dette kateteret ved 20 μL/min i 5 min med en sprøytepumpe, etterfulgt av en spyling med 50-100 μL PBS med samme hastighet.
- Etter injeksjon, ligate CCA over snittet med den øvre slip knuten og trekke MRE010 kateteret (Figur 5,trinn 6). Stram og trim den midterste knuten og den øvre knuten. Fjern karklemmen fra ECA. Se det endelige bildet i Figur 5, trinn 7.
- Lukk såret med 4-0 kirurgisk sutur.
- Etter å ha gitt tilstrekkelig utvinning på en varmepute og subkutan smertestillende injeksjon, returnere dyr til deres hjem bur.
- Intraarteriell injeksjon gjennom ECA hos rotte
- Okkluder ECA og CCA midlertidig med fartøyklips (Figur 5, trinn 2).
- Lag et lite snitt på den proksimale siden av ECA (Figur 5, trinn 3), sett inn MRE010-kateteret og fest med en knute (figur 5, trinn 4).
- Fjern begge karklemmene, injiser 5 x 106 NSCer i 100 μL PBS ved 50 μL/min i 2 min, etterfulgt av en flush med 50-100 μL PBS (Figur 5, trinn 5) i samme hastighet, ved hjelp av en motorisert sprøytepumpe.
- Etter injeksjon, okkluder CCA og ECA med karklips igjen og ligate ECA på den proksimale siden av det andre snittet etter tilbaketrekking av injeksjonskateteret (figur 5, trinn 6).
- Fjern de to karklemmene (Figur 5,trinn 7) og lukk såret med 4-0 kirurgisk sutur.
- Etter å ha gitt tilstrekkelig utvinning på en varmepute og subkutan smertestillende injeksjon, returnere dyr til deres hjem bur.
- Histologisk analyse
- Samle hjerner fra mus og rotter som fikk iskemisk slag etterfulgt av injeksjon av NSCs eller kjøretøy løsning etter eutanasi og intracardiac perfusjon med 4% paraformaldehyd ved 1 d (mus og rotte), 7 d (mus) og 30 d (mus) etter injeksjon. Hver av disse fire gruppene besto av 5 NSC og 5 kjøretøyinjiserte dyr.
- Fiks hjernen over natten og kryopreserve i 30% sukrose i 3 d.
- Bygg hjernen inn i OCT, skjær ved 40 μm tykkelse, og undersøk fordelingen av NSCer etter immunos oppnåelse med cellespesifikke markører, inkludert glial fibrillary surt protein (GFAP, astrocytter), Tuj1 (modne nevroner) og dobbeltkorin (DCX, umodne nevroner).
MERK: På grunn av mangelen på en rottestamme som uttrykker GFP, benyttet vi DiI, en forbigående fluorescerende etikett, for rotte NSCer, som bare tillater relativt kortsiktig observasjon. Derfor ble NSC-distribusjon bare undersøkt ved 1 d etter slag hos rotter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GFP-merkede NSCer ble lett oppdaget i den iskemiske hjernen, for det meste i den ipsilaterale halvkule, spesielt i penumbra og langs skadekanten (figur 6). Sensoren ble single-blindet under bildebehandling og analyse.
For eksempel, ved 1 d etter injeksjon, ble NSCs oppdaget i musen hippocampus. En undergruppe av NSCer viste co-uttrykk for den umodne neuron markør DCX i dentate gyrus selv på dette tidlige tidspunktet (Figur 6A).
Ved 10 d etter slag (7 d etter NSC injeksjon), eksogene GFP-NSCer ble observert på høyeste tetthet ved kanten av skade (vannskille område) i striatum og cortex (Figur 6B). Det er bemerkelsesverdig at ved 7 d etter injeksjon mange av GFP-NSCs også uttrykt DCX (vist av blå sirkler), indikerer deres nevronale skjebne. Sammenlignet med dyr som fikk injeksjon av kjøretøyoppløsning, økte NSC-injeksjonen også DCX-farging (rød) i ipsilateral halvkule.
Ved 30 d etter injeksjon, NSCs ble fortsatt oppdaget i den skadde cortex, og en del av dem viste uttrykk for glial markør GFAP (Figur 6C) eller modne neuronal markør Tuj1 (Figur 6D), indikerer potensialet for eksogene NSCs å differensiere inn enten en glial eller nevronal skjebne, og overleve opptil 1 måned i den skadede hjernen.
Figur 1: Skjematiske design av injeksjonskaetre. Vi introduserer to design, Design 1 for sammensatt løsning injeksjon og Design 2 for celle injeksjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Tilberedning av kateter for NSC-injeksjon og kirurgiske kroker. (A) Materialer for kateterkonstruksjon: HENHOLDSVIS MRE010, MRE025 og MRE050 ved 3 cm, ~10-15 cm og 3 cm lengder. KlippBav nåletipsene og poler til de er kjedelige. (C) Koble til hvert segment og fest med superlim, og legg deretter inn begge nål Luer låser og MRE050 segmentet i epoksy for ekstrautstyr. (D) Lag kirurgisk krok med 27 G nåleaksel og MRE025 kateter. Skala bar: 5 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kultur av GFP (+) nevrale stamceller. (A) Identifiser GFP (+) embryoer med fluorescensmikroskop ved hjelp av FITC-kanalen. (B)Isolere og kultur kortikale NSCer til de danner neurospheres. Skala bar: 100 μm. (C) Undersøk neurosphere egenskaper ved hjelp av en stamcelle markør panel. Skala bar: 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Skjematiske bilder av trinnvis middelmær arterie okklusjon (MCAO) hjerneslag kirurgi på mus eller rotte. Se videoen for detaljert kirurgisk drift. ICA, intern halspulsåren; ECA, ekstern halspulsåren; CCA, vanlig halspulsåren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Skjematiske bilder av intraarteriell nevrale stamcelle (NSC) injeksjon i mus eller rotte. Se videoen for detaljert kirurgisk drift. ICA, intern halspulsåren; ECA, ekstern halspulsåren; CCA, vanlig halspulsåren. Den grønne pilen indikerer strømningsretning under injeksjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Fordeling, overlevelse og differensiering av nevrale stamceller (NSCer) i iskemisk hjerne. (A) Påvisning av GFP (+) NSCer i hippocampal dentate gyrus ved 1 d etter injeksjon. Stamceller fluoresce grønn; dobbelcortin (DCX) immunostainer vist i rødt. Den hvite pilen angir en GFP (+) NSC med DCX-uttrykk. (B) Skjematisk kart over GFP (+) celler og DCX-merkede celler ved 10 d etter Iskemi-Reperfusion (I-R) i sham-kontroller (ingen injeksjon) og kjøretøy (I-R) eller NSC (I-R + NSC) injiserte mus. Topografien til den iskemiske fornærmelsen er avbildet i den siste skjematiske, hvor lysere og mørkere oransje representerer området som er gjenstand for iskemisk utfordring og nekrotisk kjerne, henholdsvis. Det blå båndet indikerer "vannskillet" -området. De grå rektanglene viser stedene der bilder for (C) og (D) ble tatt. - Jeghar ikke noe valg. Eksogene NSCer kan skille seg inn i en glial skjebne (GFAP, C) eller en nevronal skjebne (Tuj1, D) med 30 d etter levering. Det ble ikke observert signifikante signaler i FITC(GFP)-kanalen hos slagdyrene som fikk kjøretøyinjeksjon (kjøretøy i C og D), mens i NSC-injiserte mus ble gjenlevende GFP-NSCer visualisert og kolokalert med GFAP (C) eller Tuj1 (D) flekker. Piler angir overlegg av 2 kanaler. Skala bar: 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stamcellebehandling for nevrologiske sykdommer er fortsatt på et tidlig utforskende stadium. Et stort problem er at det ikke finnes noen etablert metode for tilstrekkelig levering av SCer eller NSCer i hjernen.
Selv om eksogene SCer/NSCer kan påvises i hjernen etter intravenøs (IV), intraperitoneal (IP) eller intraparenchymal/intracerebral injeksjon, har hver leveringstilnærming ulemper. Den påvisbare populasjonen i hjernen anslås å være svært lav med perifer injeksjon (IV eller IP), som representerer bare en liten brøkdel av cellene injisert eller infundert. Intracerebral injeksjon gir en svært fokal fordeling, og kan direkte indusere hjerneskade2,6,7,8,9,10,11,12,13. Derfor testet vi muligheten for intraarteriell injeksjon som en alternativ metode for NSC-levering etter iskemisk slag. Denne metoden leverer NSCs gjennom ipsilateral cerebral perfusjon etter en slagfornærmelse. Hvis injisert tidlig etter hjerneslag, eksogene NSCs kan krysse forstyrret blod-hjerne barriere (BBB), oppnå en bred fordeling i hele hjernen. En fordel med intraarteriell injeksjon er at den benytter en første-pass effekt i CNS, maksimere potensialet for eksogene NSCer å bosette seg i hjernen, i motsetning til perifere leveringsruter der cellene først passerer gjennom den rike mikrosirkulasjonen av filtrering organer som lunge og lever.
Den intra-arterielle tilnærmingen som er beskrevet her er allsidig, og kan tilpasses for å imøtekomme ulike typer leveringsparadigmer og skade- eller sykdomsmodeller. Selv om i den nåværende studien bare utføres en intraarteriell injeksjon, kan MRE025-kateteret kobles til en mikroport som er innebygd subkutøst, der dyr kan motta repeterende intraarterielle injeksjoner12. Videre, med enklere, enkelt lumen design, kan denne injeksjonsmetoden brukes til levering av reagenser i løsning12,,23. Hvis levering av flere terapeutiske midler er nødvendig, kan dual lumen design brukes til å levere en innledende løsning samtidig eller sekvensielt med et annet stoff eller sammensatt. For applikasjoner til gnagermodeller av nevrodegenerasjon eller traumatisk hjerneskade, hvor det ikke er behov for første slagkirurgi, kan kirurgi for installasjon av injeksjonskateteret i musen utføres på ECA (samme protokoll som for rotte, som hensiktsmessig justerer injeksjonsvolumet og hastigheten i trinn 7.4 for mus), for å unngå potensiell forstyrrelse av cerebral blodstrøm gjennom CCA.
Flere ulemper og potensielle negative konsekvenser av denne intraarterielle injeksjon bør vurderes. Dyr får en ny operasjon, som bærer potensialet for komplikasjoner knyttet til anestesi eller kirurgi. Cerebral blodstrøm gjennom ipsilateral CCA er forstyrret, om enn forbigående (mindre enn noen få minutter), som kan indusere en annen forbigående episode av mild depresjon av CBF. I tillegg er BBB-forstyrrelse eller åpning avgjørende for intraarteriell NSC-levering, som begrenser det terapeutiske vinduet. I pilotstudien ble nesten ingen GFP (+) NSCer påvist i naiv hjerne etter intraarteriell injeksjon. Men hvis motivet kan tolerere medisiner som kan midlertidig åpne BBB, for eksempel høy osmolalitet mannitol eller saltvann, dette kan brukes til å lage et forbigående vindu av BBB åpning for NSC injeksjon på senere tidspunkt. I foreløpige studier fant vi at intraarteriell injeksjon innen de første 6 timer etter hjerneslag resulterte i høyere dødelighet enn observert med hjerneslag alene. Dette kan være relatert til en annen invasiv kirurgi etter en relativt kort periode med utvinning etter den første operasjonen. Alternativt, etter iskemisk fornærmelse, kan den skadede cerebrovasculaturen ha en høyere tendens til å begrense som svar på eventuelle ekstra stimuli, for eksempel innføring av kateteret, ekstra væskebelastning eller vedlegg av eksogene NSCer til luminalveggen etter injeksjon. En annen rimelig bekymring om NSC levering etter hjerneslag er at NSCs kan danne emboli som ytterligere okkludering eller forstyrre mikrofartøy. I samsvar med tidligere rapporter8,16,24, fant vi ikke betydelige bevis for GFP (+) emboli i mikrovaskulaturen, selv om vi fant GFP (+) NSCs i det perivascular plass (Virchow-Robin plass) i de tidlige dager etter injeksjon. Etter at vi optimaliserte tidsvinduet for injeksjon, var det ingen forskjell i komplikasjoner eller dødelighet mellom slaggrupper som fikk kjøretøy eller NSC injeksjon i den nåværende studien. Derfor er riktig utformet intraarteriell NSC injeksjon en sikker og effektiv metode for NSC-behandling rettet mot nevrologiske sykdommer.
For å oppnå vellykket NSC injeksjon og forbedre dyr utfall, flere aspekter bør håndteres med forsiktighet under hjerneslag kirurgi eller NSC injeksjon. Generell kirurgisk støtte og omsorg, som beskyttelse av hornhinnen og vedlikehold av kjernetemperatur, bør praktiseres. Her presenterer vi noen potensielle komplikasjoner av denne spesifikke operasjonen og veiledning for å minimere deres forekomst.
Det kan være stress på vagusnerven. Under operasjonen bør vagusnerven ikke strekkes, knuses, ligated eller stimuleres. Tilfeldig stimulering av vagusnerven kan indusere arytmi som bradykardi, hjertestans eller til og med død.
Feil plassering eller stramming av sutur, eller feilplassering eller glidning av et karklips kan føre til arteriell blødning fra den proksimale enden av CCA (fra hjerteutgang) eller distal ende gjennom Circle of Willis. På hvert trinn må du sørge for at karklemmen eller knutene plasseres riktig for å okkludere blodstrømmen. Hvis blødning oppstår, prøv å gjenopprette riktig plassering av knute eller fartøyklips. Hvis det visuelle feltet er uskarpt med blod, legg spissen av en steril bomullspinne på CCA og hold med trykk for å stoppe blodstrømmen. Hemoglobin fra blødning vil lette lukking av snittet på arterien. Etter at blødningen stopper, stram knuten eller plasser karklemmen på riktig sted, rengjør blodet i det visuelle feltet og fortsett operasjonen.
Det kan være skader eller komplikasjoner fra kateterinnsetting. Trim MRE010-spissen i en 45° vinkel, slik at den enkelt kan komme inn i det lille snittet på arterien, uten å indusere noen fartøyskade. I sjeldne tilfeller kan en overslipt spiss trenge inn i arterien eller komme inn i rommet mellom kjellermembranen og tunikaeksterna. For å unngå disse skadene, gjør et riktig størrelse snitt på arterien. Vi anbefaler en størrelse på 1/4-1/3 omkretsen av arterien, som er stor nok til å tillate oppføring av kateterspiss, men beholder nok styrke i karveggen til å pakke utenfor kateteret. For stort snitt kan føre til rive av arterien på snittstedet. Før FORSIKTIG MRE010 kateterspissen for å komme inn i snittet. Ikke tving kateterspissen eller fremføringen av kateteret. Om nødvendig kan skarpe tang brukes til å løfte kanten av snittet. Før kateteret med lav vinkel i forhold til arterien slik at kateteret og arterien er nesten parallelle.
Det er også potensielle injeksjonsrelaterte komplikasjoner. En vanlig komplikasjon fra intraarteriell injeksjon er overdreven volumbelastning, noe som kan føre til akutt hjerteoverbelastning og lungeødem. Raske injeksjonshastigheter kan forsterke disse risikoene og forårsake skade på karveggen8. Dermed bør både hastighet og totalt volum kontrolleres nøye. Vi anbefaler 20 μL/min som generelt trygt for mus når de brukes over en kort periode, for eksempel 5 minutter. Hvis symptomer på volumoverbelastning er notert, for eksempel rask, grunt pust, rosa bobler fra nares, eller dysfori-lignende avvikende bevegelse, bør injeksjonen stoppes eller avbrytes, og dyrene får lov til å gjenopprette. En annen mulig komplikasjon er dannelsen av NSC emboli i cerebrovaskulært system. Suspensjonsoppløsningen skal ikke inneholde kalsium eller magnesium, som er kjent for å fremme celleaggregasjon. For å redusere sjansene for å indusere emboli, bør enkeltcellesuspensjoner av NSCer undersøkes under mikroskop like før injeksjon for å bekrefte fravær av celleklynger. Hvis celleklynger er tilstede, titrer med en steril 1 ml pipet til enkeltcelleopphengsjern oppnås.
Denne studien fastslår gjennomførbarheten av intraarteriell levering tilnærming for mus og rotter, og avslører flere viktige egenskaper ved denne intra-arteriell injeksjon av NSCs i sammenheng med iskemisk slag. Sammenlignet med den relativt fokale fordelingen av NSCer som overlevde i hjerneparenchyma vanligvis rapportert med intra-cerebral injeksjon1,7,9,11,15,16, observerte vi en diffus fordeling gjennom den ipsilaterale halvkule, inkludert cortex, hippocampus og striatum. Dermed er intraarteriell levering godt egnet ikke bare til hjerneslag, men også til flere skadetyper eller sykdommer som involverer diffus hjerneskade. I innstillingen av MCAO ble den høyeste konsentrasjonen av NSCer funnet langs kanten av skadestedet. Den økte tettheten av eksogene NSCer i penumbrasonen kan skyldes økt levering til denne regionen via sikkerhetsstrøm fra reetablert blodperfusjon og åpning av BBB samt migrering av NSCer mot det skadede området. Selv om IV levering av SCer kan resultere i en diffus fordeling, er antall celler som når hjernen anslått til å være en liten brøkdel av den totale leverte, delvis på grunn av filtrering av perifere organer8,13. Basert på en tidligere studie på hjernemetastase12, intraarteriell injisert luciferase-merket D122 tumorceller tok fordel av første-pass effekten å slå seg ned i cerebral vaskulatur og utvikle metastatiske steder i hjernen i stedet for perifere organer. Cerebrale metastatiske steder på grunn av eksogene tumorceller ble oppdaget i hjernen ipsilateral til injeksjonen så tidlig som 1 uke etter injeksjon ved hjelp av et IVIS imaging system for å oppdage bioluminescerende signal gjennom intakt skallen og hodebunnen. I motsetning ble selvlysende signaler (som indikerer tumorbyrde forbundet med eksogene tumorceller) fra perifere organer, som lever, lunge og muskel, ikke oppdaget før 3-4 uker etter intraarteriell injeksjon. Derfor forventer vi, i et lignende scenario, intra-arteriell NSC levering vil også dra nytte av første pass effekt i cerebral sirkulasjon for å øke lokalisering til hjernen i forhold til perifere organer.
Selv om direkte intracerebral injeksjon kan brukes til å levere et stort antall celler til den skadede hjernen, resulterer tilnærmingen i cellulær skade eller blødning på grunn av nålpenetrasjon av parenchyma som utløser lokalisert neuroinflammation, potensielt kompromitterende overlevelse og integrering av de nyleverte cellene14,15,16,25,26. Den intraarterielle tilnærmingen for NSC-levering er en fordel ved at den unngår denne lokaliserte hjerneskaden og nevroflammasjonen, og støtter langsiktig overlevelse av NSCs3,,8,,9,,14,24. Vi observerte overlevelse og differensiering av injiserte GPF-NSCer i den skadede hjernen på tidspunkt opptil 30 d etter injeksjon. Selv om vi fant NSCs som hadde differensiert til modne nevroner og astrocytter, er det nødvendig med detaljerte studier for å bestemme den relative fordelingen av ulike celletyper generert fra GFP-NSCs og proporsjonene som overlever inn i kronisk etterjuryperiode. Enda viktigere, om overlevende, eksogene NSCer kan samhandle med konstituerende hjerneceller for å gjenoppbygge hjernenettverket og endre nevrologisk funksjon er fortsatt uklart og bør utforskes.
Samlet introduserer vi en intraarteriell leveringsmetode for å levere NSCer inn i iskemisk hjerne, som viser langsiktig overlevelse i den iskemiske halvkule og differensiering i nevronale og glialcelletyper. Den intra-arterielle leveringstilnærmingen kan tilpasses for mange arter og flere modeller av CNS-skade og sykdom og kan brukes til levering av andre celletyper eller enkelt eller flere terapeutiske forbindelser eller biologer, noe som gir bred nytte for nevrovitenskapssamfunnet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av følgende: AHA Award 14SDG20480186 for LC, Subject innovation team of Shanxi University of Chinese Medicine 2019-QN07 for BZ, og Kentucky Spinal Cord og Head Injury Research Trust grant 14-12A for KES og LC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305175 | preparation of injection catheter |
| 26 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305111 | preparation of injection catheter |
| 27 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305136 | preparation of injection catheter |
| 4-0 NFS-2 suture with needle | Henry Schein Animal Health | 56905 | surgery |
| 6-0 nylon suture | Teleflex/Braintree Scientific | 104-s | surgery |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7922 | cell detachment solution |
| blade | Bard-Parker | 10 | surgery |
| Buprenorphine-SR Lab | ZooPharm | Buprenorphine-SR Lab® | analgesia (0.6-1 mg/kg over 3 d) |
| Calcium/magnisum free PBS | VWR | 02-0119-0500 | NSC dissociation |
| DCX antibody | Millipore | AB2253 | immunostaining |
| GFAP antibody | Invitrogen | 180063 | immunostaining |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 50562-1 | surgery |
| MCAO filament for mouse | Doccol | 702223PK5Re | surgery |
| MCAO filament for rat | Doccol | 503334PK5Re | surgery |
| MRE010 catheter | Braintree Scientific | MRE010 | preparation of injection catheter |
| MRE025 catheter | Braintree Scientific | MRE025 | preparation of injection catheter |
| MRE050 catheter | Braintree Scientific | MRE050 | preparation of injection catheter |
| Nu-Tears Ointment | NuLife Pharmaceuticals | Nu-Tears Ointment | eye care during surgery |
| S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Angled | Fine Science Tools | 00649-11 | surgery |
| S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Straight | Fine Science Tools | 00632-11 | surgery |
| Superglue | Pacer Technology | 15187 | preparation of injection catheter |
| syringe pump | Kent Scientific | GenieTouch | surgery |
| Tuj1 antibody | Millipore | MAb1637 | immunostaining |
| two-component 5 minute epoxy | Devcon | 20445 | preparation of injection catheter |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | surgery |
| vascular clamps | Fine Science Tools | 00400-03 | surgery |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axio Imager 2 | microscopy |
References
- Wang, Y. Stroke research in 2017: surgical progress and stem-cell advances. The Lancet. Neurology. 17, 2-3 (2018).
- Bliss, T., Guzman, R., Daadi, M., Steinberg, G. K. Cell transplantation therapy for stroke. Stroke. 38, 817-826 (2007).
- Boese, A. C., Le, Q. E., Pham, D., Hamblin, M. H., Lee, J. P. Neural stem cell therapy for subacute and chronic ischemic stroke. Stem Cell Research & Therapy. 9, 154 (2018).
- Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. Customized Brain Cells for Stroke Patients Using Pluripotent Stem Cells. Stroke. 49, 1091-1098 (2018).
- Savitz, S. I. Are Stem Cells the Next Generation of Stroke Therapeutics. Stroke. 49, 1056-1057 (2018).
- Wechsler, L. R., Bates, D., Stroemer, P., Andrews-Zwilling, Y. S., Aizman, I. Cell Therapy for Chronic Stroke. Stroke. 49, 1066-1074 (2018).
- Muir, K. W. Clinical trial design for stem cell therapies in stroke: What have we learned. Neurochemistry International. 106, 108-113 (2017).
- Guzman, R., Janowski, M., Walczak, P. Intra-Arterial Delivery of Cell Therapies for Stroke. Stroke. 49, 1075-1082 (2018).
- Misra, V., Lal, A., El Khoury, R., Chen, P. R., Savitz, S. I. Intra-arterial delivery of cell therapies for stroke. Stem Cells and Development. 21, 1007-1015 (2012).
- Argibay, B., et al. Intraarterial route increases the risk of cerebral lesions after mesenchymal cell administration in animal model of ischemia. Scientific Reports. 7, 40758 (2017).
- Kelly, S., et al. Transplanted human fetal neural stem cells survive, migrate, and differentiate in ischemic rat cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11839-11844 (2004).
- Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research. Journal of Neuroscience Research. 87, 1718-1727 (2009).
- Fischer, U. M., et al. Pulmonary passage is a major obstacle for intravenous stem cell delivery: the pulmonary first-pass effect. Stem Cells and Development. 18, 683-692 (2009).
- Misra, V., Ritchie, M. M., Stone, L. L., Low, W. C., Janardhan, V. Stem cell therapy in ischemic stroke: role of IV and intra-arterial therapy. Neurology. 79, 207-212 (2012).
- Muir, K. W., Sinden, J., Miljan, E., Dunn, L.
- Boltze, J., et al. The Dark Side of the Force - Constraints and Complications of Cell Therapies for Stroke. Frontiers in Neurology. 6, 155 (2015).
- Huang, C., et al. Noninvasive noncontact speckle contrast diffuse correlation tomography of cerebral blood flow in rats. Neuroimage. 198, 160-169 (2019).
- Wong, J. K., et al. Attenuation of Cerebral Ischemic Injury in Smad1 Deficient Mice. PLoS One. 10, 0136967 (2015).
- Zhang, B., et al. Deficiency of telomerase activity aggravates the blood-brain barrier disruption and neuroinflammatory responses in a model of experimental stroke. Journal of Neuroscience Research. 88, 2859-2868 (2010).
- Walker, T. L., Yasuda, T., Adams, D. J., Bartlett, P. F. The doublecortin-expressing population in the developing and adult brain contains multipotential precursors in addition to neuronal-lineage cells. The Journal of Neuroscience. 27, 3734-3742 (2007).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3, 20130001 (2013).
- Bertrand, L., Dygert, L., Toborek, M. Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Chua, J. Y., et al. Intra-arterial injection of neural stem cells using a microneedle technique does not cause microembolic strokes. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, 1263-1271 (2011).
- Potts, M. B., Silvestrini, M. T., Lim, D. A. Devices for cell transplantation into the central nervous system: Design considerations and emerging technologies. Surgical Neurology International. 4, 22-30 (2013).
- Duma, C., et al. Human intracerebroventricular (ICV) injection of autologous, non-engineered, adipose-derived stromal vascular fraction (ADSVF) for neurodegenerative disorders: results of a 3-year phase 1 study of 113 injections in 31 patients. Molecular Biology Reports. 46, 5257-5272 (2019).
