Summary
En metod för att leverera neurala stamceller, anpassningsbar för injicering av lösningar eller suspensioner, genom den gemensamma halspulsådern (mus) eller yttre halspulsådern (råtta) efter ischemisk stroke rapporteras. Injicerade celler distribueras i stort sett i hjärnan parenkym och kan upptäckas upp till 30 d efter leverans.
Abstract
Neuralstamcellsterapi (NSC) terapi är en framväxande innovativ behandling för stroke, traumatisk hjärnskada och neurodegenerativa sjukdomar. Jämfört med intrakraniell leverans, intraarteriell administrering av NSCs är mindre invasiv och producerar en mer diffus fördelning av NSCs i hjärnan parenkym. Ytterligare, intra-arteriell leverans tillåter första passagen effekt i hjärnan cirkulationen, minska risken för fångst av celler i perifera organ, såsom lever och mjälte, en komplikation i samband med perifera injektioner. Här beskriver vi metoden, hos både möss och råttor, för leverans av NSCs genom den gemensamma halspulsådern (mus) eller yttre halspulsådern (råtta) till den ensidiga halvklotet efter en ischemisk stroke. Med hjälp av GFP-märkta NSCs, illustrerar vi den utbredda fördelningen uppnås i hela gnagare ipsilateral halvklotet på 1 d, 1 vecka och 4 veckor efter postischemic leverans, med en högre densitet i eller nära ischemisk skada webbplats. Förutom långsiktig överlevnad visar vi tecken på differentiering av GFP-märkta celler vid 4 veckor. Den intraarteriösa leveransmetod som beskrivs här för NSC kan också användas för administrering av terapeutiska föreningar, och har därmed bred tillämplighet på olika CNS skada och modeller sjukdom över flera arter.
Introduction
Stamcellsterapi (SC) har en enorm potential som behandling för neurologiska sjukdomar, inklusive stroke, skallskada och demens1,,2,3,,4,5,6. En effektiv metod för att leverera exogenacs till den sjuka hjärnan är dock fortfarande problematisk2,,6,7,8,9,10,,11,12,13. SCs levereras genom perifera leveransvägar, inklusive intravenös (IV) eller intraperitoneal (IP) injektion, är föremål för första passage filtrering i mikrocirkulationen, särskilt i lungan, lever, mjälte och muskel8,9,13,14, ökar chanserna för ansamling av celler i icke-målområden. Den invasiva intrakningsmetoden resulterar i lokaliserad hjärnvävnadsskada och en mycket begränsad fördelning av SCs nära injektionsstället2,,6,,8,,14,,15,16. Vi har nyligen etablerat en kateter-baserade intra-arteriell injektion metod för att leverera exogena neurala SCs (NSCs), som beskrivs här tillämpas i en gnagare modell av focal ischemisk stroke. Vi inducerar transient (1 h) ischemi-reperfusion skada på ett halvklot med hjälp av en silikon gummibelagd glödtråd att ockludera den vänstra mellersta cerebralartär (MCA) i musen eller råtta17,18,19. I denna modell har vi reproducerbart observerat cirka 75-85% depression av cerebralt blodflöde (CBF) i ensidig halvklot med Laser Doppler eller Laser speckle imaging17,19, vilket ger konsekvent neurologiska underskott17,18,19.
För tidsbesparande ändamål är videon inställd på att spela dubbelt så snabbt och rutinmässiga kirurgiska ingrepp såsom hudberedning och sårstängning med sutur och användning och inställning av den motoriserade sprutpumpen presenteras inte. Metoden för intraarteriell leverans av NSCs visas i samband med den mellersta cerebrala gatan ocklusion (MCAO) modell av experimentell stroke hos gnagare. Därför inkluderar vi den övergående ischemisk stroke förfarande för att senare visa hur den andra operationen, den intraarteriella injektionen, utförs med hjälp av tidigare kirurgiska webbplats på samma djur. Möjligheten att intraarteriell NSC leverans i gnagare stroke modeller visas genom att bedöma fördelningen och överlevnaden av exogena NSCs. Effekten av NSC terapi för att dämpa hjärnan patologi och neurologisk dysfunktion kommer att rapporteras separat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden på djurförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Kentucky, och lämplig försiktighet vidtogs för att minimera stress eller smärta i samband med kirurgi.
1. Beredning av injektionskatetrar och kirurgiska krokar
- Konstruera injektionskatetern (bild 1). Samla in nödvändiga material, inklusive: MRE010, MRE025 och MRE050 slangar, 20 G, 26 G och 27 G injektionsnålar (figur 2A), 600 sandpapper, superlim och tvåkomponents 5-minuters epoxi.
- Skär 20 G och 26 G nålar med 1 cm från nålnavet och polera änden på sandpapper (figur 2B). Spola nålarna med 10 ml dubbeldestillerat vatten för att rengöra nålhålet.
OBS: Två olika utföranden(figur 1) används. Design 1 har en enda kontakt och används för injektion av lösningar eller suspensioner. Design 2 har 20 G och 26 G Luer låskontakter för insprutning av celler (20 G nål) och spolning av den döda volymen (26 G nål) för att säkerställa leverans av hela volymen NSC-innehållande lösning.
- Skär 20 G och 26 G nålar med 1 cm från nålnavet och polera änden på sandpapper (figur 2B). Spola nålarna med 10 ml dubbeldestillerat vatten för att rengöra nålhålet.
- Design 1: Sätt in en 3-4 cm lång MRE010-kateter i en 15 cm lång MRE025-kateter och säkra med superlim.
- Anslut den andra änden av MRE025-röret till ett segment av MRE050-katetern och säkra med superlim. För in en matt 20 G-nål i den återstående änden av MRE050-katetern och fäst med superlim (figur 1).
- Ytterligare förstärka anslutningsplatserna med epoxilim. Denna kateter design är optimal för injektion av reagenser (som kemiska eller läkemedelslösningar eller andra biologiska läkemedel såsom cytokiner).
- Design 2: Sätt in en 3-4 cm lång MRE010-kateter i en 15 cm lång MRE025-kateter och säkra med superlim.
- Anslut den andra änden av MRE025-röret till ett segment av MRE050-katetern och säkra med superlim. Sätt in en matt 20 G nål i den återstående änden av MRE050-katetern och säkra med superlim.
- För in en matt 26 G-nål i MRE050-röret nära spetsen på den första nålen, efter insprutningsflödets riktning, och fäst med superlim (figur 1 och figur 2C). Förstärk båda nålarna och segmentet av MRE050 röret med klar epoxi (figur 2C). Denna konstruktion gör det möjligt att injicera fordonslösning genom nålen 2 (26 G) efter NSC-injektion genom nål 1 (20 G) för att spola in den döda volymen i katetern i hjärncirkulationen, vilket ger en mer exakt kontroll av injektionsvolymer.
- Använd en 20 G nål för NSC-injektion för att minimera skador på NSC, vilket kan påverka lönsamheten negativt.
- Efter konstruktion, spola katetrerna med 10 ml dubbeldestillerat vatten, följt av 70% etanol, och sedan blötdem i 70% etanol över natten.
- Före operationen, ta bort katetrar från 70% etanol och spola med 10 ml steril PBS, och placera dem i en autoklaverad kirurgisk verktygslåda för lagring och transport.
- Beredning av de kirurgiska krokarna
- Skär en 1,5- 2 cm lång nålaxel från en 27 G nål, och polera båda ändarna på sandpapper tills tråkig. Använd sedan en liten hemostatisk klämma för att böja axeln i en krok i ena änden och en ringform i andra änden.
- Sätt i en 10-15 cm lång MRE025-kateter genom ringen och säkra med tydlig kirurgisk tejp (figur 2D). Gör 2 fler krokar med samma metod.
- Blötlägg alla krokar och katetersystem i 70% etanol tills de används.
2. Djurberedning: Leverans, bostäder, miljöanpassning
- Han- och hondjur C57BL/6 möss (10-12 veckor, n=10/time point) och Wistar-råttor (10-12 veckor, n=10) användes i denna studie.
- Hus dem i ett miljökontrollerat djurvivarium med mat och vatten ad libitum.
- Låt dem anpassa sig till miljön minst 1 vecka före strokeoperationen.
OBS: En mus och en råtta dog vid 1 d efter stroke kirurgi och en mus avlivades vid 3 d post-stroke före NSC injektion av humana skäl på grund av svår förlamning.
3. Kultur av mus- och rått neurala stamceller (NSCs)
OBS: NSC isolerades och odlades efter ett etablerat protokoll20.
- Musen
- Isolera wildtype (WT) och GFP-märkta NSC från E18 embryonala cortex från tidsinställd graviditet kvinnliga C57BL/6 möss parat med GFP-positiva hanmöss (B6 ACTb-EGFP). För att identifiera GFP-embryon (+) ska du observera de skördade embryona på ett fluorescensmikroskop med HJÄLP av FITC-kanalen. GFP-embryon (+) ger grön fluorescenssignal medan WT-embryon endast uppvisar svag autofluorescens (figur 3A).
- Råtta
- Isolera NSC från subventricular zonen (SVZ) av unga vuxna WT råttor. Märk dem med DiI strax före injektionen enligt tillverkarens anvisningar21.
- Kulturmus eller råtta NSCs tills de utvecklas till neurospheres, och passage dem när diametern på sfären når runt 100 μm (figur 3B). Använd NSC för injektion mellan passagerna 3 och 5.
- Kontrollera deras stamcellers egenskaper med hjälp av en embryonal stamcellsmarkörpanel (figur 3C).
- På injektionsdagen, samla NSC-sfärer och separera med cellavlossningslösningen, suspendera i kalcium- och magnesiumfri PBS till en koncentration av 107 celler/ml och placera på våt is tills injektionen.
4. Kirurgiskt preparat
- Före operationen, markera en punkt på den kommersiella MCAO-suturen med en silvermarkeringspenna på 9 mm (för mus) eller 15 mm (för råtta) från spetsen för ingreppsreferens för införingslängd. Autoklav de kirurgiska verktygen (sax, pincett) och instrument före varje operation, och värm sterilisera dem i ett glas pärla autoklaver mellan operationer.
- Inducera anestesi hos djur med 5% isofluran via inandning och upprätthålla anestesi med 1-2% isofluran. Utvärdera djupet av anestesi genom observation av allmänna tillstånd (andningsmönster, morrhår rörelse och spontan kroppskorrigering hållning), hornhinnans reflex och svar på tå nypa.
- Lägg djur supine på en värmedyna, och förbereda operationsområdet på djuret genom klippning och skrubbning med betadinlösning följt av 70% etanol. Skydda djurets ögon från torkning genom att applicera oftalmologiska salva (t.ex. konstgjord tårsalva) under operationen.
- Låt kirurger noggrant skrubba händerna med en bakteriocidalsskrubb och bära mask, sterila handskar och en ren labbrock.
5. Mellersta cerebralartär ocklusion (MCAO) stroke kirurgi
OBS: De operationer för att inducera ischemisk stroke på en halvklot av mus eller råtta är likartade genom att en sutur förs in i den inre halspulsådern (ICA) till ocklude blodflödet (figur 4)17,18,19,22. Artären som valts för suturinsättning skiljer sig dock beroende på det tillgängliga operationsutrymme som krävs för den efterföljande stamcellsinjektionen. Råttan har gott om utrymme i den yttre halspulsådern (ECA) segmentet för att tillåta två separata, sekventiella operationer (stroke och NSC injektion), men musen inte, kräver en alternativ strategi. Stroke-inducerad cerebrala blodflödet förändringar, hjärnan infarct storlek och neurologiska underskott har rapporterats som i författarnas tidigare rapporter17,18,19.
- För att framkalla ischemisk stroke, börja både mus och råtta operationer med ett mittlinje snitt på livmoderhalsen området, och isolering av den vänstra gemensamma halspulsådern (CCA), ECA och ICA (Figur 4). Var försiktig så att du inte tänjer på, förskjuter eller klämmer cca-nerven. Eftersom valet av artär och kirurgiska steg är olika därefter, MCAO kirurgi på musen och råtta kommer att beskrivas separat.
- MCAO kirurgi på mus (Figur 4A)
- Placera tre flätade 6-0 nylon suturer under CCA(Figur 4A, steg 1), och gör en tät kirurgisk knut för att ockludera fartyget så långt från bifurkation som möjligt med hjälp av proximala strängen (figur 4A, steg 2). Trimma ner suturändarna.
- Gör en slipknot på den distala sidan av CCA (varning: dra inte åt för hårt eftersom det kommer att släppas i steg 6) och en lös slipknot mellan de två åtdragna knutarna (figur 4A, steg 2).
- Skär ett litet snitt (~ 1/4 - 1/3 av omkretsen) nära den proximala knuten på CCA med mikroscissorer (figur 4A, steg 3), och sätt försiktigt in den kommersiella silikongumminbelagd 7-0 fast nylon sutur (figur 4A, steg 4). Säkra denna sutur med den mellersta strängen, dra åt tillräckligt (figur 4A, steg 5) för att säkerställa inget blodläckage från snittet och ingen rörelse av silikongummibelagd nylonglödtråd genom backflödet från ICA, samtidigt som suturen mot ECA med en mild knuffning av pincetten kan fortsätta.
- Släpp den övre (distala) slipknot (figur 4A, steg 6) och för nylonsuturen in i ICA tills dess spets passerar bifurkationen för 9 mm (med silvermarkören på suturen som referens). Dra åt de övre två slipknots för att säkra suturen och förhindra blodflödet.
- Dra ut glödtråden 1 h senare (figur 4A, steg 7) och ligate CCA med hjälp av den mellersta knuten för att förhindra blödning (Figur 4A, steg 5-7 i omvänd ordning, slutresultatet sett i steg 8). Släpp den övre knuten. Stäng såret med 4-0 kirurgisk sutur.
- MCAO kirurgi på råtta (Figur 4B)
- Placera två flätade 6-0 nylon suturer under ECA (figur 4B, steg 1), och gör en tät knut i den distala änden så långt som möjligt (figur 4B, steg 2).
- Placera kärlklämmorna på ICA och CCA för att ockludera det arteriella blodflödet (figur 4B, steg 3). En slipknot kan användas som ett alternativ för ett kärlklipp.
- Gör ett litet snitt på revisionsrätten med mikroscissorer (figur 4B,steg 3-4), sätt in ett kommersiellt silikongummibelagt 6-0 nylonglödtråd (figur 4B, steg 5) och säkra ordentligt med en slipknot på ECA.
- Släpp kärlklämman på ICA, för glödtråden in i ICA tills silvermarkeringen (15 mm) når bifurkationen (figur 4B,steg 6) och fäst sedan suturen med den 2:a knuten på ECA (figur 4B, steg 6).nd
- Efter 1 h ischemi, dra tillbaka denna glödtråd och ligate snittet för att förhindra blödning (Figur 4B, steg 7), ta bort kärlklämman från CCA (slutresultatet i steg 8) och stäng såret med 4-0 kirurgisk sutur.
6. Återhämtning
- Efter stroke kirurgi, placera djur på en värmedyna tills de helt återfå medvetandet.
- Ge analgesi via subkutan injektion. Återlämna djur till sina hemburar med tillgång till vatten och mat ad libitum.
7. Injektion inom arteriell
- Tvätta hela katetern med 70% etanol och blötlägg över natten tills den används. Precis före injektionen, anslut Luer-låset på nålen med en steril spruta och tvätta hela lumensidan av katetersystemet med 10 ml steril PBS.
- Tidsfönster och förberedelse för NSC-injektion
OBS: Baserat på erfarenhet och rapporter från andra forskargrupper är tidpunkten för NSC-injektion avgörande för överlevnaden för både försökspersoner och exogena NSC. I vår pilotstudie ledde injektion av NSCs vid tidiga tidpunkter (inom de första 6 h efter reperfusion) till högre dödlighet. Således testade vi senare injektion tidpunkter och fastställt tidsfönstret mellan 2 d (48 h) till 3 d (72 h) efter stroke är säker och acceptabelt för djur, och är effektivt för att uppnå intraparenchymal distribution av NSCs. Resultat presenteras häri är från djur som mottagits NSC injektion på 3 d efter skada.- Ställ in injektionshastigheten för sprutpumpen till 20 μL/min för möss och 50 μL/min för råttor. Överdriven hastighet eller varaktighet av injektionen kan resultera i systemisk volym överbelastning, som möss är mer sårbara än råttor.
- I korthet, vid 3 d efter stroke kirurgi, söva djuren med isofluran och lägga dem supine på en värmedyna.
- Öppna livmoderhalssåret igen och exponera revisionsrätten, ICA och CCA igen (figur 5, steg 1). Som i stroke operationer, bestämma injektionsvägen baserat på arten. Använd CCA för NSC injektion i musen, och ECA för råttan23.
- Injektion inom arteriellt genom CCA i musen
- Placera två 6-0 flätade nylon suturer under CCA. Skapa en lös slipknot med var och en av dem mellan bifurkation och nedre knutar från föregående stroke kirurgi (Figur 5, steg 2).
- Dra åt den övre slipknoten och gör sedan ett litet snitt ovanför den nedre knuten (figur 5, steg 3). För in en MRE010-kateter genom snittet (figur 5, steg 4) och fäst den med den mellersta knuten utan att blockera insprutningsflödet (figur 5, steg 5). Återflöde av blod ska synas i katetern när den övre knuten frigörs och kateterns position justeras.
- Placera en kärlklämma på ECA, injicera 1 x 106 GFP-NSC genom katetern vid 20 μl/min i 5 min med en sprutpump, följt av en jämnhöjd med 50-100 μl PBS med samma hastighet.
- Efter injektionen, ligate CCA ovanför snittet med den övre slipknuten och dra tillbaka MRE010-katetern (figur 5, steg 6). Dra åt och trimma den mellersta knuten och den övre knuten. Ta bort kärlklämman från ECA. Se den slutliga bilden i figur 5, steg 7.
- Stäng såret med 4-0 kirurgisk sutur.
- Efter att ha tillhandahållit tillräcklig återhämtning på en värmedyna och subkutan smärtstillande injektion, återsända djuren till sin hembur.
- Intraarteriell injektion genom revisionsrätten hos råtta
- Tillfälligt ockludera revisionsrätten och CCA med kärlklämmor (figur 5, steg 2).
- Gör ett litet snitt på eca:s proximala sida (figur 5, steg 3), sätt in JORDterern MRE010 och fäst med en knut (figur 5, steg 4).
- Ta bort båda kärlklämmorna, injicera 5 x 106 NSC i 100 μl PBS vid 50 μl/min i 2 min, följt av en jämnhöjd med 50-100 μl PBS(figur 5,steg 5) med samma hastighet, med hjälp av en motoriserad sprutpump.
- Efter injektionen, ockludera CCA och ECA med kärlklämmor igen och ligate ECA på proximala sidan av det andra snittet efter tillbakadragande av injektionkatetern (figur 5, steg 6).
- Ta bort de två kärlklämmorna (figur 5, steg 7) och stäng såret med 4-0 kirurgisk sutur.
- Efter att ha tillhandahållit tillräcklig återhämtning på en värmedyna och subkutan smärtstillande injektion, återsända djuren till sin hembur.
- Histologiska analysen
- Samla hjärnor från möss och råttor som fick ischemisk stroke följt av injektion av NSC eller fordonslösning efter dödshjälp och intracardiac perfusion med 4% paraformaldehyd vid 1 d (mus och råtta), 7 d (mus) och 30 d (mus) efter injektion. Var och en av dessa fyra grupper bestod av 5 NSC och 5 fordon injiceras djur.
- Fixa hjärnor över natten och cryopreserve i 30% sackaros för 3 d.
- Bädda in hjärnorna i OCT, skiva på 40 μm tjocklek, och undersöka fördelningen av NSCs efter immunstainning med cellspecifika markörer, inklusive gliafikorillary surt protein (GFAP, astrocyter), Tuj1 (mogna nervceller), och doublecortin (DCX, omogna nervceller).
OBS: På grund av bristen på en råtta stam som uttrycker GFP, vi utnyttjade DiI, en övergående fluorescerande etikett, för råtta NSCs, som tillåter endast relativt kortsiktig observation. NSC-fördelningen undersöktes därför endast vid 1 d efter stroke hos råttor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GFP-märkta NSC upptäcktes lätt i den ischemiska hjärnan, mestadels i den ensidiga halvklotet, särskilt i penumbra och längs skada fälgen (Figur 6). Examinator var single-blinded under bildframställning och analys.
Till exempel, vid 1 d efter injektion, NSCs upptäcktes inom musen hippocampus. En delmängd av NSCs visade co-uttryck för omogna neuron markör DCX i dentate gyrus även vid denna tidiga tidpunkt (Figur 6A).
Vid 10 d efter stroke (7 d efter NSC injektion), exogena GFP-NSCs observerades vid den högsta densiteten vid kanten av skada (vattendelare område) i striatum och cortex (Figur 6B). Det är anmärkningsvärt att med 7 d efter injektion många av GFP-NSCs också uttryckt DCX (visas av blå cirklar), som anger deras neuronala öde. Jämfört med djur som fick injektion av fordonslösning ökade NSC-injektionen också DCX-färgning (röd) på det ipsilaterala halvklotet.
Vid 30 d efter injektion, NSCs upptäcktes fortfarande i den skadade cortex, och en del av dem visade uttryck för gliamarkör GFAP (Figur 6C) eller mogna neuronal markör Tuj1 (Figur 6D), som anger potentialen för exogena NSCs att skilja sig i antingen en glia eller neuronal öde, och överleva upp till 1 månad i den skadade hjärnan.
Figur 1: Schematiska konstruktioner av injektionkatetrar. Vi introducerar två utföranden, Design 1 för sammansatt lösningsinjektion och design 2 för cellinjektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Beredning av kateter för NSC-injektion och kirurgiska krokar. (A)Material för kateterkonstruktion: MRE010, MRE025 och MRE050 katetrar vid 3 cm, ~10-15 cm respektive 3 cm längder. (B) Skär av nålspetsar och polera tills du är matt. (C)Anslut varje segment och säkra med superlim, och bädda sedan in både nål Luer lås och MRE050 segment i epoxi för förbättring. (D)Gör kirurgisk krok med 27 G nålaxel och MRE025 kateter. Skala bar: 5 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Odling av GFP (+) neurala stamceller. (A)Identifiera GFP-embryon (+) med fluorescensmikroskop med FITC-kanalen. (B)Isolera och odla när NSCs tills de bildar neurosfärer. Skalstång: 100 μm.(C)Undersök neurosfäregenskaper med hjälp av en stamcellsmarkörpanel. Skala bar: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Schematiska bilder av steg-för-steg mellersta cerebralartär ocklusion (MCAO) stroke kirurgi på mus eller råtta. Se videon för detaljerad kirurgisk operation. ICA, inre halspulsådern; Revisionsrätten, yttre halspulsådern; CCA, vanlig halspulsådern. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Schematiska bilder av injektion inom arteriell neural stamceller (NSC) i mus eller råtta. Se videon för detaljerad kirurgisk operation. ICA, inre halspulsådern; Revisionsrätten, yttre halspulsådern; CCA, vanlig halspulsådern. Den gröna pilen indikerar flödesriktning under injektionen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Fördelning, överlevnad och differentiering av neurala stamceller (NSCs) i den ischemiska hjärnan. (A)Detektion av GFP (+) NSC inom hippocampus dentate gyrus vid 1 d efter injektion. Stamceller fluorescerar grönt; dubbelkorrering (DCX) immunfärgning som visas i rött. Den vita pilen anger en GFP -NSC med DCX-uttryck. (B)Schematisk karta över GFP-celler (+) celler och DCX-märkta celler vid 10 d efter ischemi-reperfusion (I-R) i simulerade kontroller (ingen injektion) och fordon (I-R) eller NSC (I-R + NSC) injicerade möss. Topografin av den ischemiska förolämpningen skildras i den sista schematiska, där ljusare och mörkare orange representerar det område som är föremål för ischemisk utmaning och den nekrotiska kärnan, respektive. Det blå bandet anger "vattendelare" område. De grå rektanglarna visar de platser där bilder för(C) och (D) togs. (C,D) Exogena NSCs kan skilja till en glia öde (GFAP, C) eller en neuronal öde (Tuj1, D) med 30 d efter leverans. Inga signifikanta signaler observerades i FITC-kanalen (GFP) i de strokedjur som fick injektionsinjektion (fordon i C och D),medan överlevande GFP-NSC-enheter visualiserades och colocaliserades i NSC(NSC) medan de överlevande GFP-NSC-koncentrationerna visualiserades och colocaliserades med GFAP(C)eller Tuj1(D)i färgning. Pilar indikerar överlagring av 2 kanaler. Skala bar: 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stamcellsterapi för neurologiska sjukdomar är fortfarande i ett tidigt utforskande skede. En viktig fråga är att det inte finns någon etablerad metod för tillräcklig leverans av SCs eller NSCs i hjärnan.
Även om exogena SCs/NSCs kan detekteras i hjärnan efter intravenös (IV), intraperitoneal (IP) eller intraparenchymal/intracerebral injektion, har varje leverans tillvägagångssätt nackdelar. Den detekterbara populationen i hjärnan uppskattas vara mycket låg med perifer injektion (IV eller IP), vilket endast motsvarar en liten del av de celler som injiceras eller infunderas. Intracerebrala injektion ger en mycket fokal fördelning, och kan direkt framkalla hjärnskada2,,6,,7,,8,,9,,10,,11,12,13. Därför testade vi genomförbarheten av intraarteriell injektion som en alternativ metod för NSC leverans efter ischemisk stroke. Denna metod levererar NSCs genom ensiella cerebral perfusion efter en stroke förolämpning. Om injiceras tidigt efter stroke, exogena NSCs kan passera störd blod - hjärnbarriären (BBB), uppnå en bred fördelning i hela hjärnan. En fördel med intraarteriell injektion är att den använder en första passage effekt inom CNS, maximera potentialen för exogena NSCs att bosätta sig i hjärnan, i motsats till perifera leveransvägar där cellerna först passerar genom den rika mikrocirkulationen av filtrering organ såsom lungan och levern.
Den intraarteriella metoden som beskrivs här är mångsidig, och kan anpassas för att rymma olika typer av leveransparadigm och skade- eller sjukdomsmodeller. Även om endast en intraarteriell injektion utförs i den aktuella studien kan MRE025-katetern anslutas till en mikroport som är inbäddad subkutant, genom vilken djur kan få repetitiva intraarteriösa injektioner12. Dessutom, med den enklare, enda lumen design, denna injektionsmetod kan användas för leverans av reagenser i lösning12,23. Om leverans av flera therapeutics krävs, den dubbla lumen design kan användas för att leverera en första lösning samtidigt eller sekventiellt med ett andra läkemedel eller förening. För tillämpningar på gnagare modeller av neurodegeneration eller traumatisk hjärnskada, där det inte finns något behov av den första stroke kirurgi, kirurgi för installation av injektion katetern i musen kan utföras på ECA (samma protokoll som för råtta, lämpligt justera injektionsvolymen och hastighet i steg 7.4 för möss), för att undvika potentiella störningar av cerebralt blodflöde genom CCA.
Flera nackdelar och potentiella negativa konsekvenser av denna intraarteriella injektion bör övervägas. Djur får en andra operation, som medför potential för komplikationer relaterade till anestesi eller kirurgi. Cerebralt blodflöde genom den ensidiga CCA störs, om än övergående (mindre än några minuter), vilket kan framkalla en annan övergående episod av mild depression av CBF. Dessutom är BBB-störningar eller öppning avgörande för intraarteriell NSC-leverans, vilket begränsar det terapeutiska fönstret. I pilotstudien upptäcktes nästan inga GFP (+) NSCs i naiva hjärnan efter intraarteriell injektion. Men om motivet kan tolerera läkemedel som kan transiently öppna BBB, såsom hög osmolalitet mannitol eller saltlösning, Detta kan användas för att skapa ett övergående fönster BBB öppning för NSC injektion vid senare tidpunkter. I preliminära studier fann vi att intraarteriell injektion inom de första 6 h efter stroke resulterade i högre dödlighet än observerats med stroke ensam. Detta kan vara relaterade till en andra invasiv kirurgi efter en relativt kort period av återhämtning efter den första operationen. Alternativt, efter ischemisk förolämpning, kan den skadade cerebrovasculature har en högre tendens att tygla som svar på ytterligare stimuli, såsom införandet av katetern, ytterligare vätskebelastning, eller fastsättning av exogena NSCs till den ljushaltiga väggen efter injektion. En annan rimlig oro när det gäller NSC leverans efter stroke är att NSCs kan bilda emboli som ytterligare occlude eller störa microvessels. I samförstånd med tidigare rapporter8,16,24, fann vi inte betydande bevis för GFP (+) emboli i microvasculature, även om vi hittade GFP (+) NSCs i perivascular utrymme (Virchow-Robin utrymme) i de första dagarna efter injektion. Efter att vi optimerat tidsfönstret för injektion, fanns det ingen skillnad i komplikation eller dödlighet mellan stroke grupper som fick fordon eller NSC injektion i den aktuella studien. Därför är korrekt utformad intraarteriell NSC injektion en säker och effektiv metod för NSC behandling inriktning neurologiska sjukdomar.
För att uppnå framgångsrik NSC injektion och förbättra djurresultat, flera aspekter bör hanteras med försiktighet under stroke kirurgi eller NSC injektion. Allmänt kirurgiskt stöd och vård, såsom skydd av hornhinna och underhåll av kärntemperaturen, bör praktiseras. Här introducerar vi några potentiella komplikationer av denna specifika kirurgi och vägledning för att minimera deras förekomst.
Det kan finnas stress på vagusnerven. Under operationen ska vagusnerven inte sträckas, krossas, synas eller stimuleras. Tillfällig stimulering av vagusnerven kan framkalla arytmier som bradykardi, hjärtstillestånd, eller till och med död.
Felaktig placering eller åtdragning av sutur, eller felplacering eller glidning av ett kärlklämma kan resultera i arteriell blödning från den proximala änden av CCA (från hjärtminutvolym) eller distala änden genom Circle of Willis. Vid varje steg, se till att kärlklämman eller knutar är placerade på rätt sätt för att ockludera blodflödet. Om blödning inträffar, försök att återställa rätt placering av knut- eller kärlklämmor. Om synfältet är suddigt med blod, sätt spetsen på en steril bomullspinne på CCA och håll med tryck för att stoppa blodflödet. Hemoglobin från blödning kommer att underlätta stängningen av snittet på artären. Efter blödningen slutar, dra åt knuten eller placera kärlklämman på rätt plats, rengör blodet i synfältet och fortsätt operationen.
Det kan finnas skador eller komplikationer från kateter insättning. Trimma MRE010-spetsen i 45° vinkel, så att den enkelt kan komma in i det lilla snittet på artären, utan att framkalla någon kärlskada. I sällsynta fall kan en överslipad spets tränga in i artären eller komma in i utrymmet mellan källarmembranet och tunica externa. För att undvika dessa skador, gör en lämplig storlek snitt på artären. Vi rekommenderar en storlek på 1/4-1/3 omkretsen av artären, som är tillräckligt stor för att möjliggöra inträde av kateter spets, men behåller tillräckligt med styrka i kärlväggen för att linda utanför katetern. För stort snitt kan leda till att artären rivs vid snittplatsen. Styr försiktigt MRE010 kateterspetsen för att komma in i snittet. Tvinga inte kateterspetsens inträde eller kateterns framåtskridande. Vid behov kan vassa pincett användas för att lyfta snittets kant. För fram katetern med låg vinkel i förhållande till artären så att katetern och artären är nästan parallella.
Det finns också potentiella injektion-relaterade komplikationer. En vanlig komplikation från intraarteriell injektion är överdriven volym lastning, vilket kan leda till akut hjärt överbelastning och lungödem. Snabba injektionshastigheter kan förstärka dessa risker och orsaka skador på kärlväggen8. Därför bör både hastighet och total volym kontrolleras noggrant. Vi rekommenderar 20 μL/min som i allmänhet säkert för möss när de används under en kort period som 5 minuter. Om symtom på volymöverbelastning noteras, såsom snabb, ytlig andedräkt, rosa bubblor från nares, eller dysfori-liknande avvikande rörelse, injektionen bör stoppas eller avbrytas, och djuren får återhämta sig. En annan möjlig komplikation är bildandet av NSC emboli i cerebrovaskulära systemet. Suspensionslösningen bör inte innehålla kalcium eller magnesium, som är kända för att främja cellaggregering. För att minska risken för inducerande emboli bör single cell suspensions av NSC undersökas under mikroskop strax före injektion för att bekräfta frånvaron av cellkluster. Om cellkluster finns, titrera med en steril 1 mL pipet tills encellig suspension uppnås.
Denna studie fastställer genomförbarheten av intraarteriell leverans strategi för möss och råttor, och avslöjar flera viktiga funktioner i denna intraarterial injektion av NSCs i samband med ischemisk stroke. I jämförelse med den relativt focal fördelningen av NSCs överlevande i hjärnan parenkym vanligtvis rapporteras med intra-cerebral injektion1,7,9,11,15,16, observerade vi en diffus fördelning i hela den ensiella halvklotet, inklusive cortex, hippocampus och striatum. Således, intraarteriell leverans är väl lämpad inte bara för stroke, men också för flera skador typer eller sjukdomar som innebär diffusa hjärnskador. Vid fastställandet av MCAO hittades den högsta koncentrationen av NSC längs kanten av skadeområdet. Den ökade densiteten av exogena NSC i penumbrazonen kan bero på ökad leverans till denna region via säkerhetsflöde från återupprättad blodperfusion och öppnande av BBB samt migration av NSC mot det skadade området. Även om IV leverans av SCs kan resultera i en diffus fördelning, antalet celler som når hjärnan uppskattas vara en liten del av den totala levereras, delvis på grund av filtrering av perifera organ8,13. Baserat på en tidigare studie på hjärnan metastasering12, intra-arteriell injiceras luciferas-märktA D122 tumörceller drog fördel av den första passagen effekt att bosätta sig i cerebral vaskulature och utveckla ögonbevarande platser i hjärnan snarare än perifera organ. Cerebrala ögonbevarande platser på grund av att exogena tumör celler upptäcktes i hjärnan ensiella till injektionen så tidigt som 1 vecka efter injektion med hjälp av en IVIS bildbehandling system för att upptäcka bioluminescerande signal genom intakt skalle och hårbotten. Däremot var självlysande signaler (som anger tumör börda är associerad med exogena tumör celler) från perifera organ, såsom lever, lunga och muskler, inte upptäcks förrän 3-4 veckor efter intra-arteriell injektion. Därför förväntar vi oss, i ett liknande scenario, intraarteriell NSC leverans kommer också att dra nytta av den första passagen effekt i cerebral cirkulation att kraftigt öka lokaliseringen till hjärnan jämfört med perifera organ.
Även om direkt intracerebrala injektion kan användas för att leverera ett stort antal celler till den skadade hjärnan, leder tillvägagångssättet cellulära skador eller blödning på grund av nålpenetration av parenkymet som utlöser lokaliserad neuroinflammation, potentiellt äventyrar överlevnad och integration av de nylevererade cellerna14,15,16,25,26. Den intraarteriella metoden för NSC leverans är fördelaktigt eftersom det undviker denna lokaliserade hjärnskador och neuro, och stöder långsiktig överlevnad NSCs3,8,9,14,24. Vi observerade överlevnad och differentiering av injicerade GPF-NSCs i den skadade hjärnan vid tidpunkter upp till 30 d efter injektion. Även om vi hittade NSCs som hade differentierats till mogna nervceller och astrocyter, detaljerade studier krävs för att bestämma den relativa fördelningen av olika celltyper som genereras från GFP-NSCs och de proportioner som överlever i den kroniska postinjury perioden. Ännu viktigare, om överlevande, exogena NSCs kan interagera med konstituerande hjärnceller för att återuppbygga cerebrala nätverket och ändra neurologisk funktion är fortfarande oklart och bör undersökas.
Sammantaget introducerar vi en intraarteriell leveransmetod för att leverera NSCs i den ischemiska hjärnan, visar långsiktig överlevnad i ischemiska halvklotet och differentiering i neuronala och gliaala celltyper. Den intraarteriella leveransmetoden är anpassningsbar för många arter och flera modeller av CNS skada och sjukdom och kan användas för leverans av andra celltyper eller enstaka eller flera terapeutiska föreningar eller biologiska ämnen, vilket ger bred nytta för neurovetenskap samhället.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av följande: AHA Award 14SDG20480186 för LC, Ämnesinnovation team av Shanxi University of Chinese Medicine 2019-QN07 för BZ, och Kentucky Spinal Cord and Head Injury Research Trust grant 14-12A för KES och LC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305175 | preparation of injection catheter |
| 26 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305111 | preparation of injection catheter |
| 27 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305136 | preparation of injection catheter |
| 4-0 NFS-2 suture with needle | Henry Schein Animal Health | 56905 | surgery |
| 6-0 nylon suture | Teleflex/Braintree Scientific | 104-s | surgery |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7922 | cell detachment solution |
| blade | Bard-Parker | 10 | surgery |
| Buprenorphine-SR Lab | ZooPharm | Buprenorphine-SR Lab® | analgesia (0.6-1 mg/kg over 3 d) |
| Calcium/magnisum free PBS | VWR | 02-0119-0500 | NSC dissociation |
| DCX antibody | Millipore | AB2253 | immunostaining |
| GFAP antibody | Invitrogen | 180063 | immunostaining |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 50562-1 | surgery |
| MCAO filament for mouse | Doccol | 702223PK5Re | surgery |
| MCAO filament for rat | Doccol | 503334PK5Re | surgery |
| MRE010 catheter | Braintree Scientific | MRE010 | preparation of injection catheter |
| MRE025 catheter | Braintree Scientific | MRE025 | preparation of injection catheter |
| MRE050 catheter | Braintree Scientific | MRE050 | preparation of injection catheter |
| Nu-Tears Ointment | NuLife Pharmaceuticals | Nu-Tears Ointment | eye care during surgery |
| S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Angled | Fine Science Tools | 00649-11 | surgery |
| S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Straight | Fine Science Tools | 00632-11 | surgery |
| Superglue | Pacer Technology | 15187 | preparation of injection catheter |
| syringe pump | Kent Scientific | GenieTouch | surgery |
| Tuj1 antibody | Millipore | MAb1637 | immunostaining |
| two-component 5 minute epoxy | Devcon | 20445 | preparation of injection catheter |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | surgery |
| vascular clamps | Fine Science Tools | 00400-03 | surgery |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axio Imager 2 | microscopy |
References
- Wang, Y. Stroke research in 2017: surgical progress and stem-cell advances. The Lancet. Neurology. 17, 2-3 (2018).
- Bliss, T., Guzman, R., Daadi, M., Steinberg, G. K. Cell transplantation therapy for stroke. Stroke. 38, 817-826 (2007).
- Boese, A. C., Le, Q. E., Pham, D., Hamblin, M. H., Lee, J. P. Neural stem cell therapy for subacute and chronic ischemic stroke. Stem Cell Research & Therapy. 9, 154 (2018).
- Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. Customized Brain Cells for Stroke Patients Using Pluripotent Stem Cells. Stroke. 49, 1091-1098 (2018).
- Savitz, S. I. Are Stem Cells the Next Generation of Stroke Therapeutics. Stroke. 49, 1056-1057 (2018).
- Wechsler, L. R., Bates, D., Stroemer, P., Andrews-Zwilling, Y. S., Aizman, I. Cell Therapy for Chronic Stroke. Stroke. 49, 1066-1074 (2018).
- Muir, K. W. Clinical trial design for stem cell therapies in stroke: What have we learned. Neurochemistry International. 106, 108-113 (2017).
- Guzman, R., Janowski, M., Walczak, P. Intra-Arterial Delivery of Cell Therapies for Stroke. Stroke. 49, 1075-1082 (2018).
- Misra, V., Lal, A., El Khoury, R., Chen, P. R., Savitz, S. I. Intra-arterial delivery of cell therapies for stroke. Stem Cells and Development. 21, 1007-1015 (2012).
- Argibay, B., et al. Intraarterial route increases the risk of cerebral lesions after mesenchymal cell administration in animal model of ischemia. Scientific Reports. 7, 40758 (2017).
- Kelly, S., et al. Transplanted human fetal neural stem cells survive, migrate, and differentiate in ischemic rat cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11839-11844 (2004).
- Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research. Journal of Neuroscience Research. 87, 1718-1727 (2009).
- Fischer, U. M., et al. Pulmonary passage is a major obstacle for intravenous stem cell delivery: the pulmonary first-pass effect. Stem Cells and Development. 18, 683-692 (2009).
- Misra, V., Ritchie, M. M., Stone, L. L., Low, W. C., Janardhan, V. Stem cell therapy in ischemic stroke: role of IV and intra-arterial therapy. Neurology. 79, 207-212 (2012).
- Muir, K. W., Sinden, J., Miljan, E., Dunn, L. Intracranial delivery of stem cells. Translational Stroke Research. 2, 266-271 (2011).
- Boltze, J., et al. The Dark Side of the Force - Constraints and Complications of Cell Therapies for Stroke. Frontiers in Neurology. 6, 155 (2015).
- Huang, C., et al. Noninvasive noncontact speckle contrast diffuse correlation tomography of cerebral blood flow in rats. Neuroimage. 198, 160-169 (2019).
- Wong, J. K., et al. Attenuation of Cerebral Ischemic Injury in Smad1 Deficient Mice. PLoS One. 10, 0136967 (2015).
- Zhang, B., et al. Deficiency of telomerase activity aggravates the blood-brain barrier disruption and neuroinflammatory responses in a model of experimental stroke. Journal of Neuroscience Research. 88, 2859-2868 (2010).
- Walker, T. L., Yasuda, T., Adams, D. J., Bartlett, P. F. The doublecortin-expressing population in the developing and adult brain contains multipotential precursors in addition to neuronal-lineage cells. The Journal of Neuroscience. 27, 3734-3742 (2007).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3, 20130001 (2013).
- Bertrand, L., Dygert, L., Toborek, M. Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Chua, J. Y., et al. Intra-arterial injection of neural stem cells using a microneedle technique does not cause microembolic strokes. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, 1263-1271 (2011).
- Potts, M. B., Silvestrini, M. T., Lim, D. A. Devices for cell transplantation into the central nervous system: Design considerations and emerging technologies. Surgical Neurology International. 4, 22-30 (2013).
- Duma, C., et al. Human intracerebroventricular (ICV) injection of autologous, non-engineered, adipose-derived stromal vascular fraction (ADSVF) for neurodegenerative disorders: results of a 3-year phase 1 study of 113 injections in 31 patients. Molecular Biology Reports. 46, 5257-5272 (2019).
