Summary
De Flypub test meet het gedrag dat de fruitvlieg Drosophila melanogaster toont onder invloed van ethanol. De test kan gemakkelijk worden beheerst door onderzoekers op alle niveaus en toegepast op verschillende verdampte stimuli, het vergemakkelijken van drugsmisbruik en verslavingsstudies.
Abstract
Alcoholgebruik stoornis (AUD) blijft een ernstig probleem in onze samenleving. Om effectieve interventies voor verslaving te ontwikkelen, is het belangrijk om de onderliggende neurobiologische mechanismen te begrijpen, waarvoor diverse experimentele benaderingen en modelsystemen nodig zijn. Het belangrijkste ingrediënt van alcoholische dranken is ethanol, die adaptieve veranderingen in het centrale zenuwstelsel en gedrag bij chronische inname veroorzaakt. Met name gedragssensibilisatie (d.w.z. geëscaleerde reacties) vertegenwoordigt een belangrijke adaptieve verandering die ten grondslag ligt aan verslaving. De meeste ethanol-geïnduceerde gedragssensibilisatie studies in dierlijke modellen zijn uitgevoerd op de motorische activerende werking van ethanol. Een prominent effect van ethanol is gedragsontremming. Gedragssensibilisatie van het disinhibitie-effect van ethanol is echter ondervertegenwoordigd. Om dit probleem aan te pakken, ontwikkelden we de Flypub-test die het mogelijk maakt de geëscaleerde toename van ontremde verkeringsactiviteiten te meten bij terugkerende blootstelling aan ethanol in Drosophila melanogaster. Hier rapporteren we de stapsgewijze Flypub-test, inclusief assemblage van ethanolblootstellingskamers, de installatie van het teststation, criteria voor vliegverzorging en -inzameling, ethanollevering, kwantificering van ontremde verkeringsactiviteiten, gegevensverwerking en statistische analyse. Ook zijn hoe kritieke stappen op te lossen, beperkingen te overwinnen en het nut ervan uit te breiden om extra ethanol-geïnduceerde gedragtebeoordelen. De Flypub-test in combinatie met krachtige genetische hulpmiddelen in Drosophila melanogaster zal de taak vergemakkelijken om het mechanisme te ontdekken dat ten grondslag ligt aan ethanol-geïnduceerde gedragssensibilisatie.
Introduction
Alcohol is een van de meest direct beschikbare en op grote schaal geconsumeerde drugs in de wereld. Het heeft een hoog potentieel voor misbruik en verslaving; het mechanisme dat aan dit proces ten grondslag ligt, blijft echter onvolledig begrepen. Ethanol induceert disinhibitie, euforie, cognitieve stoornissen, hyperactiviteit, verlies van motorische controle en sedatie bij wormen1, fruitvliegjes1,2,3, muizen4, ratten5 en mensen6, wat wijst op gemeenschappelijke neurobiologische componenten bemiddelen ethanol effecten van ongewervelde dieren aan zoogdieren met inbegrip van de mens. Chronische ethanol inname veroorzaakt neurale aanpassingen en gedragsmatige wijzigingen die ten grondslag liggen aan AUD. Een van de aanpassingen is gedragssensibilisatie gedefinieerd als de verhoogde respons met herhaalde ervaringen van ethanol7,,8,9 of andere verslavende stoffen10,11,12.
In de loop der decennia hebben de studies over ethanol-geïnduceerde gedragssensibilisatie (EIBS) zich gericht op het motorisch stimulerende effect, dat wordt gebruikt als een proxy voor een euforische respons7,8,9,13. Bijvoorbeeld, ratten of muizen bij herhaalde (elke 24, 48 of 72 uur) ethanol toediening tonen de verhoogde motorische activiteit zoals gemeten door loopsnelheid8,14,15,16,17,18,19,20,21. Evenzo vertonen de fruitvliegjes die na de eerste blootstelling aan de tweede blootstelling aan ethanoldamp werden blootgesteld, de verbeterde motorische respons, gemeten aan de loopsnelheid, ook22. Hoewel er geen informatie beschikbaar is over het mechanisme dat aan eibs ten grondslag ligt aan het motorisch stimulerende effect bij fruitvliegjes, hebben de studies bij ratten en muizen de moleculaire en signaalcomponenten (bijvoorbeeld de dopamine-, glutamaat- en GABA-systemen) en neurale substraten en circuits (bijvoorbeeld het ventrale tegmentale gebied, nucleus accumbens, amygdala en prefrontale cortex) blootgelegd die een belangrijke rol spelen voor EIBS6,9,23.
Disinhibitie is een belangrijk effect van ethanol en leidt tot manifestatie van gedragingen die meestal beperkt zijn. Het ontremmende effect wordt uitgeoefend op motorische, emotionele, sociale, seksuele en cognitieve functies, die kunnen leiden tot ongepast seksueel gedrag, verbale of fysieke agressie en impulsieve handelingen bij mensen en dierlijke modellen24,25,26,27,28,29. Ethanol-geïnduceerde disinhibitie is onderzocht in diermodellen voor mechanistische studies en ze omvatten motorische impulsiviteit en agressie bij knaagdieren en apen, evenals foeragerende disinhibitie bij wormen6,9,24,28,29,30. We hebben aangetoond dat fruitvliegjes ongeremd seksueel gedrag vertonen onder invloed van ethanol31. Specifiek, wild-type mannetjes vliegen zelden hof andere mannen zonder ethanol31 en wanneer ze dat doen, hovenen actief verwerpen hofmaken mannen. Onder invloed van ethanol, echter, mannelijke vliegen tonen meer verkering in de richting van andere mannen en hoveling vertonen minder afwijzing, wat resulteert in de algehele verbeterde intermale verkering. Met name vliegen ontwikkelen gedragssensibilisatie voor het disinhibitie-effect bij terugkerende blootstelling aan ethanol, wat dient als een uniek systeem om EIBS31,32te bestuderen .
In dit rapport beschrijven we hoe het opzetten, uitvoeren, oplossen en analyseren van de Flypub-test en gegevens om ethanol-geïnduceerde disinhibitie en sensibilisatie in de fruitvlieg Drosophila melanogasterte bestuderen. Om het nut en de effectiviteit te bieden, hebben we de wild-type Canton-S (CS; controle vlieg stam) samen met de vliegen tekort aan tyramine β hydroxylase (tβh) dat octopamine (OA) synthetiseert getest. OA is een belangrijke neuromodulator bij ongewervelde dieren33,34 en speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van ethanoltolerantie bij vliegen22. Wij melden hier voor het eerst dat OA belangrijk is voor EIBS.
Protocol
OPMERKING: De protocolsectie beschrijft de voorbereidende, Flypub-test- en analysestappen die (1) montage van de kamer omvatten, (2) vliegverzorging en -verzameling, (3) installatie van teststations, (4) blootstelling aan ethanol, (5) verrekening en gegevensanalyse, en (6) statistische analyse. De belangrijkste stappen voor het uitvoeren van de Flypub-test en -analyse worden weergegeven in een workflow (figuur 1).
1. Vergadering van de kamer (Figuur 2)
- Snijd het onderste gedeelte van de ronde Drosophila fles af op de 25 mL markering met behulp van een scheermesje.
- Maak een gat met een diameter van 5 mm op het 50 mL-teken van de fles met behulp van een heet soldeerijzer.
LET OP: Dit is het toegangspunt waar de vliegen naar de kamer worden overgebracht. - Snijd een gaasvel in een cirkel met een diameter van 54 mm om in de Drosophila-fles te passen bij de 75 mL-markering.
- Zet het gaas vast op het 75 mL-teken van de fles met behulp van hete lijm.
- Snijd de polycarbonaat kunststof plaat in een cirkel, 70 mm in diameter.
- Bevestig de polycarbonaat plastic vel aan de fles op de 25 mL merk (onderste open ruimte gemaakt in stap 1.1) met behulp van hete lijm.
- Druk naar beneden met behulp van gewichten om ervoor te zorgen dat de polycarbonaat ronde stevig is bevestigd aan de bodem.
- Was de pubs met ethanol om eventuele geuren te verwijderen en overvloedig spoelen ze meerdere malen onder stromend gedestilleerd water. Schud de pubs krachtig om overtollig water te verwijderen.
- Droog de pubs door ze horizontaal op papieren handdoeken bij kamertemperatuur neer te leggen.
2. Vliegverzorging en -inzameling
- Onderhoud de vliegen op een standaard maïsmeel / agar / suiker / gist voedsel medium (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/harvardfood.html).
- Verzamel een- tot twee dagen oude mannelijke vliegen in een groep van 33, die een datapunt vertegenwoordigen, onder kooldioxide (CO2)anesthesie. Zorg ervoor dat de vliegen met intacte morfologie te selecteren en zet ze in een voedselflesje te herstellen.
LET OP: Twee vliegen minder per groep zijn aanvaardbaar. Gedrag kan gevoelig zijn voor experimentele instellingen dus een totaal vliegaantal per pub kan nodig zijn om te worden aangepast met een controle vlieglijn.
LET OP: Zorg ervoor dat het voedselflesje aan de zijkant is neergelegd, zodat de verdoofde vliegen niet vast komen te zitten aan het voedsel. - Houd de vliegen in de 25 °C incubator met ten minste 50% relatieve vochtigheid en een 12 uur licht / 12 uur donkere cyclus gedurende 2 dagen voorafgaand aan de blootstelling aan ethanol.
OPMERKING: CO2-klaring is essentieel om eventuele DOOR CO2-geïnduceerdefysiologische of gedragseffecten te elimineren die ethanol-geïnduceerde reacties kunnen veranderen. - Gebruik codes om genotypen of behandelingsomstandigheden te verblinden voor de onderzoekers die ethanolblootstelling uitvoeren en verkeringsgedrag scoren.
OPMERKING: Blinde tests helpen experimentele bias te elimineren.
3. Assay station opgezet (Figuur 3A)
- Zet een kopieerstandaard op met een bijgevoegde middenarm op een bankblad in een goed geventileerde ruimte.
LET OP: De kopieerstandaard is niet verplicht. Elk staging-apparaat dat een levelplatform biedt, is voldoende. - Klem de twee zijarmen naar de standaard, met elke arm ongeveer 18 cm uit het midden van de standaard.
- Plaats een fluorescerend licht op elke arm van de standaard en een in het midden.
- Bevestig de videorecorder aan de middelste arm, ongeveer 38 cm boven het midden van de basis. Dit zal de pubs van een hoogste mening registreren.
- Bedek de basis van de standaard met wit papier, waarmee donkergekleurde vliegen worden gevisualiseerd om contrast te creëren.
- Schakel tijdens de dag van belichting de tl-lampen in en de computer die is aangesloten op de videocamera die is bevestigd aan de kopieerstandaard (figuur 3A).
OPMERKING: De lichtintensiteit 2100-2200 lux biedt een goede kwaliteit van het geregistreerde gedrag om te scoren. De omgevingslichtomstandigheden in het laboratorium zijn echter voldoende om ethanol-geïnduceerde verkeringsactiviteiten in acht te nemen. - Bereid de items voor die moeten worden gebruikt voor blootstelling aan ethanol afgebeeld in figuur 3B.
- Verzamel zes schone, geassembleerde pubs voor een reeks experimenten en label ze met de code 1 tot en met 6.
LET OP: Zorg ervoor dat u de gerandomiseerde codes op vlieggenotypen of behandelingsvoorwaarden plaatst.
4. Blootstelling aan ethanol (figuur 3)
- Breng voorzichtig een groep van 33 mannetjes in een Flypub-kamer door het gat op de 50 mL-markering met behulp van een kleine trechter.
OPMERKING: Om mechanische belasting voor de vliegen te minimaliseren, plaatst u tijdens de overdracht een muismat of een dempingsmateriaal onder de pub. - Bedek het gat met een tape.
OPMERKING: De tape wordt gebruikt om het gat te dichten, waardoor vliegen niet uit de pub kunnen ontsnappen. - Lijn de pubs op het podium van 1 tot 6.
- Acclimatiseren de vliegen naar de kamer voor 10 min (Figuur 3D).
- Pas de camera-instellingen inclusief de scherpstelling, zoom en helderheid aan en neem de laatste 5 min acclimatisatie op om een basale verkeringsniveau te meten.
OPMERKING: Om verblinding te elimineren die wordt gegenereerd door lichtreflectie van een pub, plaatst u laboratoriumdoekjes (meestal 4 lagen of minder dan 1 mm dikte) aan de onderkant van de pub om de hoek aan te passen. - Bereid wattenschijfjes voor ethanol levering door het snijden van een pad in vier gelijke kwadranten met een schone schaar en vervolgens trim de hoeken om het te laten passen in een petrischaaltje tijdens de acclimatisatie (Figuur 3C).
LET OP: Gebruik geen blote handen om de wattenschijfjes te hanteren. Gebruik tangen om de wattenschijfjes te behandelen om elke mogelijke overdracht van geuren te voorkomen. - Voeg een wattenschijfje toe aan elk petrischaaltje.
- Voeg 1 mL van 95% ethanol aan elke wattenschijfje, zorg ervoor dat ethanol oplossing gelijkmatig worden verdeeld over het gehele gebied van het pad.
- Dek af met dubbelgelaagde labdoekjes om snelle ethanolverdamping te voorkomen.
- Plaats de kleine petrischaal met de ethanol doordrenkte wattenschijfje en de dubbelgelaagde labdoekjes door de onderste opening van de pub na acclimatisatie.
- Lijn de pubs op het podium uit, begin met opnemen en start tegelijkertijd een timer.
- Record de pubs met vliegen tijdens de blootstelling aan ethanol totdat de vliegen stoppen met het hof maken of bewegen als gevolg van sedatie.
- Verwijder de petrischaal met ethanol uit elke pub met een spatel wanneer meer dan 90% van de vliegen worden verdoofd.
- Voorzichtig transfer vliegt terug naar hun toegewezen flesjes door het gat op de 50 mL merk in de pub.
LET OP: Plaats een trechter bovenop voedselflesjes om te helpen bij de overdracht. Zorg ervoor dat u verdoofde vliegen aan de zijkant van de voedselflesjes om te voorkomen dat ze vast komen te zitten in het voedsel. - Reinig de pubs met ethanol om eventuele geuren te verwijderen en overvloedig spoelen ze meerdere malen onder stromend gedestilleerd water. Schud de pubs krachtig om overtollig water te verwijderen.
- Droog de pubs door ze horizontaal op papieren handdoeken bij kamertemperatuur neer te leggen.
- Houd de vliegen in de 25 °C incubator met ten minste 50% relatieve vochtigheid en een 12 uur licht / 12 uur donkere cyclus.
- Herhaal de stappen 4.1-4.17 elke 24 uur gedurende zes opeenvolgende dagen en zorg ervoor dat de blootstelling aan ethanol op hetzelfde moment van de dag uit te voeren om eventuele circadiane effecten te voorkomen.
LET OP: Verander elke 2 – 3 dagen voedselflesjes om gezonde vliegen te behouden.
5. Vergoedscore en data-analyse (figuur 4-6)
- Open de opgenomen video's met behulp van een mediaspeler (bijvoorbeeld VLC) en zoom in op de video om vliegen duidelijk te observeren om te scoren (Figuur 4A).
- Voeg de tijdcode toe aan de video(figuur 4B).
- Tel het aantal mannen dat zich bezighoudt met verkeringactiviteiten, waaronder volgende, eenzijdige vleugelverlenging, verkeringsketting, verkeringscirkel, buikbuiging en montage voor elk 10-s-blok31 (Figuur 5).
- Voer het aantal mannen dat verkering weergeeft voor elk 10-s-tijdblok in een werkblad in (figuur 6A).
- Gebruik het maximale aantal mannen die het hof maken in de drie opeenvolgende 10-tijdblokken als representatief gegevenspunt (figuur 6B).
- Bereken het gemiddelde van 10 opeenvolgende gegevenspunten met de hoogste waarde (figuur 6C) en dit vertegenwoordigt het percentage intermale verkering per pub (figuur 6A).
6. Statistische analyse (aanvullend figuur 1)
- Open statistische analysesoftware (bijvoorbeeld Minitab 17) en voeg verkeringsgegevens toe aan het werkblad.
OPMERKING: Elke statistische analysesoftware kan worden gebruikt. - Als u de verdeling van de gegevens wilt bepalen (normale of niet-normale verdeling), gaat u naar het tabblad Stat, selecteert u Basisstatistiekenen klikt u op de optie Normaliteitstest (aanvullende figuur 1Ai).
- Selecteer in Variabeleafzonderlijke kolommen (elke kolom die een gegevensset van een genotype of behandeling in studie vertegenwoordigt), kies de Anderson-Darling-test en klik op OK (aanvullende figuur 1Aii).
OPMERKING: In de kansplot normaliteit wordt de berekende P-waarde weergegeven: als de P-waarde groter is dan 0,05, worden de gegevens normaal gesproken gedistribueerd. Als de P-waarde lager is dan 0,05, worden de gegevens niet normaal verspreid(aanvullend figuur 1Aiii). - Voor het vergelijken van meerdere groepen stapelt u de kolommen die u wilt vergelijken door op het tabblad Gegevens te klikken, Selecteer Stapelen vervolgens Kolommen (Aanvullend figuur 1Bi).
- Selecteer in het venster Kolommen stapelen de gegevenskolommen die moeten worden gestapeld, selecteer de stapeling in Nieuw werkblad of Kolom van huidig werkblad met de volgende kolom die is aangewezen om subscript aan te geven (bijvoorbeeld de identiteit van de gegevensgroep; Aanvullend figuur 1Bii-1Biii).
- Klik op het tabblad Stat, selecteer de ANOVA-test, selecteer het algemene lineaire model en klik vervolgens op het Algemene lineaire model (Aanvullend figuur 1Ci).
- Selecteer in het venster Algemeen lineair model de kolommen die moeten worden vergeleken in het vak Antwoorden, selecteer de kolom met subscript in het vak Factoren en klik op OK, wat leidt tot de statistische analyseresultaten(Aanvullend figuur 1Cii-1Ciii).
- Voor vergelijking van twee groepen met normaal gedistribueerde gegevens klikt u op het tabblad Stat, selecteert u de basisstatistiekenen selecteert u det-test van 2 -voorbeeld (Aanvullende figuur 1Di).
- Selecteer In de vakken 2-Sample t voor het venster Gemiddelde selecteert u Elk voorbeeld in een eigen kolom,selecteerin een vervolgkeuzevak de twee groepen die u wilt vergelijken in de vakken Voorbeeld 1 en Voorbeeld 2 en klik vervolgens op OK, wat leidt tot de statistische analyseresultaten(Aanvullend figuur 1Dii-1Diii).
- Voor vergelijking van twee groepen met niet-normaal gedistribueerde gegevens gaat u naar het tabblad Stat, selecteert u Nonparametrics en klikt u op Mann-Whitney (aanvullende figuur 1Ei)
- Selecteer in het venster Mann-Whitney de twee groepen die u wilt vergelijken in de vakvakken Eerste steekproef en Tweede steekproef en klik vervolgens op OK, wat leidt tot de statistische analyseresultaten(Aanvullend figuur 1Eii-1Eiii).
- Voor vergelijking van drie of meer groepen niet-normaal verspreide gegevens, ga naar het tabblad Stat, selecteer Nonparametricsen klik vervolgens op de Kruskal-Wallis-test (Aanvullend figuur 1Fi).
- Selecteer in het venster Kruskal-Wallis de kolommen die u wilt vergelijken in het vak Respons, selecteer de kolom met subscript in het vak Factor en klik op OK, wat leidt tot de statistische analyseresultaten(Aanvullend figuur 1Fii-1Fiii).
Representative Results
Deze sectie toont de resultaten van een representatief Flypub-experiment. Drosophila mannetjes zelden hof andere mannen35,36. Tijdens de eerste blootstelling aan ethanol vertoonden de mannetjes van het wilde type Canton-S (CS)een kleine maar onbeduidende toename van de ongeremde intermale verkering31 (Figuur 7A). Echter, CS mannen toonden de geëscaleerde toename van de ongeremde verkering activiteit in de daaropvolgende blootstelling aan ethanol (ANOVA GLM, CS: R2=0,83, F(5,66) =65,21, p < 0,0001; n = 12; Figuur 7A), wat duidt op gedragssensibilisatie voor het disinhibitie-effect van ethanol. We hebben eerder aangetoond dat dit type EIBS dopamine en de dopaminereceptor DopEcR in de paddestoelneuronen31,32.
Om vast te stellen of er bij EIBS aanvullende neuromodulatoren betrokken zijn, onderzochten we de rol van OA door de vliegen te testen(tβh; nM18 null allel)37,38 zonder tyramine β hydroxylase, het tariefbeperkende enzym in de OA-biosynthese, dus een tekort aan OA. De tβh mannetjes in de cs genetische achtergrond (een vriendelijk geschenk van Dr. Andreas Thum, Universiteit van Leipzig , Duitsland) vertoonden de gesensibiliseerde ontremde verkeringsreactie op dagelijkse ethanolblootstellingen (ANOVA GLM, tβh: R2=0.67, F(5,66) =27.60, p < 0.0001; n = 12; Figuur 7B) maar op het verlaagde niveau in vergelijking met CS (ANOVAGLM, interactie-effect: F =2,50, p <0,034). Na een post-hocanalyse vertoonden de mannetjes van de βh bij elke blootstelling lagere niveaus van intermale verkering die het duidelijkst zichtbaar is tijdens de vierde tot en met de zesde blootstelling aan ethanol in vergelijking met CS (Two-sample t-test: p < 0,002 in EXP4, p < 0,004 in EXP5, p < 0,021 in EXP6; n = 12; Figuur 7C). Samen wijzen deze resultaten erop dat OA een rol kan spelen in EIBS voor het disinhibitie-effect van ethanol. Wat nog belangrijker is, deze gegevenssets tonen duidelijk het nut en de doeltreffendheid van de Flypub-test aan bij het bestuderen van ethanol-geïnduceerde disinhibitie en sensibilisatie.
Figuur 1: Flypub test workflow. Een werkstroomdiagram met de belangrijkste stappen voor het uitvoeren van de Flypub-test. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Flypub kamermaterialen en montage. (A) Materialen die nodig zijn om een Flypub kamer te bouwen omvatten (i) hete lijm pistool lijm stok, (ii) hete lijm pistool, (iii) scheermesje, (iv) soldeerbout, (v) liniaal, (vi) mesh, (vii) polycarbonaat plastic vel, en (viii) ronde bodem Drosophila fles. (B) Schematische vertegenwoordiging van de Flypub kamer vergadering. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Blootstelling aan ethanol. (A) Een volledig geassembleerd Flypub station. b)Materialen die nodig zijn voor blootstelling aan ethanol omvatten (i) P1000 micropipet,(ii) tape,iii) wattenschijfje,iv) Petrischaal, (v) laboratoriumdoekjes, (vi) kleine trechter, (vii) timer,( viii) mid-size trechter,( ix) muismat, x ) schaar, (xi) 95% ethanol, (xii) tangen en (xiii) spatel.x (C) Stappen over het snijden van wattenschijfjes. (D) Top view beeld van de pubs uitgelijnd op het podium. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Video-setup voor gedragsscores. Getoond is de stapsgewijze handleiding over (A) hoe in te zoomen op de video en (B) hoe het tijdcodebestand in te voegen in de VLC mediaplayer voor gedragsscore. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Mannelijk verkeringsgedrag. Representatieve beelden illustreren de Drosophila mannelijke verkering gedrag met inbegrip van volgende en eenzijdige vleugel uitbreiding voor (A) verkering lied, (B) verkering keten, (C) verkering cirkel (D) buikbuigen en (E) montage die worden gebruikt voor gedrags-scoring. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Gegevensinvoer en -analyse. (A) Het aantal mannen die zich bezighouden met verkering in elke 10 s time block wordt omgezet in een werkblad. Het hoogste aantal mannen van drie opeenvolgende 10-tijdblokken (groene pijl) wordt gebruikt als representatief gegevenspunt. Het gemiddelde van 10 opeenvolgende gegevenspunten (blauwe of oranje beugel) met de maximale waarde vertegenwoordigt het percentage intermannelijke verkering per pub [oranje beugel; MAX (gemiddeld), zwarte pijl]. (B,C) De werkbladformules die worden gebruikt om het maximale representatieve gegevenspunt en het maximale gemiddelde van 10 opeenvolgende representatieve gegevenspunten per pub te berekenen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: Ethanol geïnduceerde gedragsontremming en sensibilisatie in CS en tβh. (A,B) De CS en tβh mannetjes vertoonden sensibiliseerde verkeringsontremming met herhaalde blootstelling aan ethanol (ANOVA GLM, CS: R2=0,83, F(5,66)=65.21, p < 0,0001; tβh: R2=0,67, F(5,66)=27,60, p < 0,0001; n = 12). (C) De tβh mannetjes vertoonden minder ontremde verkering in vergelijking met CS (n =12). De p-waarden van de post-hocanalyses worden boven de streep weergegeven. De intermale verkering activiteit werd geanalyseerd uit de video's gegenereerd voor elke blootstelling aan ethanol. Alle gegevens worden gerapporteerd als middel ± standaardfout van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 1: Statistische analyse. De stappen in de Minitab 17-software over het uitvoeren van de (A) Normaliteitstest, (B) stapelen van de gegevens, (C) Algemeen lineair model ANOVA-test, (D) Twee-steekproef t-test, (E) Mann-Whitney test en (F) Kruskal-Wallis test. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
In dit rapport hebben we de opzet en het gedetailleerde protocol van de Flypub-test beschreven; een nieuwe methode om te meten hoe terugkerende blootstelling aan ethanol leidt tot ongeremde verkering en gedragssensibilisatie. Hoewel de Flypub-test relatief eenvoudig is, vereisen verschillende stappen zorg en aandacht om betrouwbare resultaten te garanderen. Ten eerste moeten de vliegen voor het testen volledig gepigmenteerd zijn (d.w.z. volledig ontwikkelde volwassen vliegen), gezond en intact. Misvormingen of schade vooral in hun vleugels of benen kan invloed hebben op het vermogen van de man om de rechter. Ten tweede is de vliegleeftijd belangrijk en moet deze worden afgestemd op controle- en experimentele groepen (optimale leeftijd: 3-5 dagen oud bij blootstelling aan ethanol 1). Twee weken en oudere wilde mannelijke vliegen hebben de neiging om de verhoogde niveaus van ongeremde verkering31weer te geven. Zo is een goede leeftijdsmatching van vliegen in studie essentieel om variabele resultaten te voorkomen. Ten derde is het vliegnummer per kroeg van vitaal belang (optimaal: 33 per kroeg). De lagere of hogere vliegnummers per pub kunnen de verkeringsscores sterk scheeftrekken (gegevens die niet worden weergegeven). Ten vierde moeten de Flypub-kamers identieke volumes hebben, zoals geïllustreerd in figuur 2B. Dit zorgt ervoor dat vliegen ethanoldamp synchroon ontvangen en dat het ontlokte gedrag consistent is. Ten vijfde zijn duidelijke video-opname en nauwkeurige verkeringsscore essentieel. Dit protocol is sterk afhankelijk van gedragsobservaties, dus nauwgezette naleving van het gestandaardiseerde verkeringsscoreprotocol is van fundamenteel belang om inconsistente resultaten te minimaliseren. Ten slotte wordt ten zeerste aanbevolen dat zowel de blootstelling aan ethanol als de verkeringsscorestappen blindelings worden uitgevoerd, waarbij een experimentator zich niet bewust is van vlieggenotypen of experimentele behandelingen, waardoor experimentele vooringenomenheid wordt voorkomen.
De Flypub test heeft meerdere voordelen. Ten eerste kunnen meerdere groepen vliegen tegelijkertijd worden getest en vergeleken. Ten tweede, het is goedkoop, eenvoudig in te stellen en gemakkelijk te leren, waardoor het zeer toegankelijk voor onderzoekers op alle niveaus, waaronder elementaire door middel van de middelbare school, undergraduate en graduate studenten, postdocs en faculteit, alsmede onderwijs laboratoria met beperkte ruimte en budgetten. Ten derde kan het worden gebruikt om extra gedrag ingekracht te zijn, zoals ongeremde verkering van vrouwelijke vliegen en het kalmerende effect van ethanol of andere kalmerende middelen om de initiële gevoeligheid en tolerantieontwikkeling en -onderhoud te beoordelen31,32. Samen is de Flypub een veelzijdige methode om diverse functies van AUD te bestuderen.
De belangrijkste beperking van de Flypub test is de strenge en moeizame verkering scoren regime. Het verkeringsgedrag onder invloed van ethanol is hoogst dynamisch op een manier dat de verkeringsduur van minder dan één seconde aan vele notulen varieert en de vliegen die in verkering worden bezet eerder vaak veranderen. Het hier gepresenteerde scoreregime werd ontwikkeld om deze dynamische aard op te nemen en consistente scores te leveren op individuele blootstelling aan ethanol voor een bepaald genotype31,32. Zoals opgemerkt in het protocol, wordt de verkeringsactiviteit handmatig gescoord, wat tijdrovend is. Verschillende geautomatiseerde scoringsprogramma's zijn ontwikkeld om onbevooroordeelde high-throughput gedragsscreening te vergemakkelijken en die allemaal afhankelijk zijn van individuele vliegbewegingen en locaties39,40,41,42,43,44,45. We hebben ook geprobeerd om een computersoftware te ontwikkelen om automatisch de verkeringsactiviteit te tellen, maar was niet in staat om consistente en betrouwbare resultaten te verkrijgen. Dit kan te wijten zijn aan het feit dat gedragsscores meerdere verkeringsstappen omvat (d.w.z. na, eenzijdige vleugelverlenging, buikbuigen en montage)35,36,46 van meerdere vliegen tegelijk. Zelfs met deze beperking moet een experimentator met adequate training in staat zijn om het door ethanol geïnduceerde verkeringsgedrag met consistentie en nauwkeurigheid te kwantificeren. Toch zou het van groot belang zijn om machine learning of andere geavanceerde algoritmen als vervolg te gebruiken.
Net als bij knaagdiermodellen hebben de studies over ethanol in het vliegmodel zich grotendeels gericht op de motorischstimulerende en kalmerende effecten van de ethanol. De Flypub-test meet echter ongeremde verkering, een vorm van cognitieve disinhibitie die nieuw is31,32. Daarom kan de Flypub helpen om de moleculaire spelers, cellulaire paden en neurale circuits te verduidelijken, evenals de risicofactoren (bijvoorbeeld leeftijd, slaap, dieet of sociale omgeving) die cruciaal zijn voor gedragsontremming en sensibilisatie. We hebben eerder aangetoond dat dopamine signalering nodig is voor EIBS, die in overeenstemming is met de bevindingen in knaagdiermodellen en menselijke proefpersonen6,9,31. Ook als een proof of concept, onderzochten we de tβh mutant ontbreekt OA (de ongewervelde tegenhanger van noradrenaline) en vonden dat OA is ook belangrijk voor gedragssensibilisatie van de ethanol disinhibitie effect, hoewel de bijdrage ervan is relatief klein in vergelijking met die van dopamine31. Deze bevinding staat in tegenstelling tot de waarneming van Scholz47 dat de tβh mutantvliegen geen duidelijke beperkingen vertonen bij de sensibilisatie van het bewegingsactiverende effect van de ethanol47. Dit suggereert verschillende moleculaire, cellulaire en neurale trajecten bemiddelen gedragssensibilisatie aan de disinhibitie versus motorische activering. Vervolgstudies moeten dit prikkelende idee verder samenwerken.
Samengevat, de Flypub is een goedkope, veelzijdige en effectieve methode om de gedragsreacties op ethanol te onderzoeken, met name disinhibitie en gedragssensibilisatie, die kunnen helpen ons begrip van AUD te bevorderen en inzicht te geven in effectieve interventies voor deze chronische aandoening.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de NIAAA 1R15AA020996, NIMH R21MH109953, Brain & Behavior Research Foundation NARSAD en NIMHD 2G12MD007592 NMD Cluster subsidies. We zijn ook dankbaar voor het door NIH gefinancierde RISE-programma (NIGMS 5R25GM069621) voor de ondersteuning van NMD en CMS, het UTEP COURI-SURPASS-programma voor de ondersteuning van NMD, het door NIH gefinancierde MARC-programma (NIGMS 2T34GM008048-31) voor het ondersteunen van AA en de Dr. Keelung Graduate Hong Fellowship voor het ondersteunen van EBS. We waarderen de communicatieafdeling van UTEP enorm: Darlene Barajas, Christian Rivera, Karina Moreno, Jose Loya Fernandez en de afdeling Muziek: Stephen A. Haddad voor hun hulp bij de video- en voice-overproductie. Tot slot zijn we Dr. Andreas Thum erg dankbaar voor het delen van de tβh mutant in de Canton-S achtergrond samen met de controle Canton-S vliegen; en Jessica Burciaga voor haar waardevolle bijdrage aan de eerste studies over octopamine en de Han lab leden voor discussie en ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 95 % Ethanol | VWR Chemicals | BDH1158-4LP | |
| Canton-S | - | - | wild-type strain used as a control |
| Copy stand with arms | Kaiser | 205411 | model RS 2-XA, with one central arm and two lateral arms; to set up a flypub station |
| Cotton rounds | Swisspers | COT-027 | to deliver ethanol |
| Excel | Microsoft | - | to analyze data; any worksheet or spreadsheet software can be used |
| Fluorescent light bulb | Lights of America | 7108N | maximum (120 V-70 W Max.); to illuminate the flypub station |
| Microsoft LifeCam software | Microsoft | - | version 3.60; to videotape flypubs |
| Microsoft LifeCam Studio | Microsoft | Q2F-00013 | 1080P HD sensor; to videotape flypubs |
| Minitab 17 | Minitab | - | version 17; to conduct statistical analysis; any statistical analysis software can be used |
| Nylon mesh sheet | Sefar Nitex | - | model B0043D1TVY, opaque white, 200 microns mesh; to make a flypub |
| Petri dishes | Falcon | 08-757-100A | 35 x 10 mm; to deliever ethanol |
| Plastic funnel - mid size | Fisher scientific | 10-348A | 65 mm diameter and 67 mm height; to transfer sedated flies from a flypub into a food vial |
| Plastic funnel - small | Fisher scientific | 07-202-121 | 4 mm diameter and 46 mm height; to transfer flies from a vial into a flypub |
| Polycarbonate sheet | Lexan | - | 0.762 mm thickness, clear, 610 x 1220 mm Nominal; to make a flypub |
| Round-bottom bottle | Fisher scientific | AS115 | polypropylene, 103 mm height, 60 mm diameter and 177 ml capacity; to make a flypub |
| Soldering iron | Weller | WES51 | to make a hole in a flypub |
| Time code | - | - | .smi file, a subtitle ticking timecode created in Han lab; to monitor time during courtship scoring; any time subtitles may be used |
| Tyramine β hydroxylase (tβh) | - | - | mutant fly strain (nM18 null allele)deficient in tβh in the wild-type Canton-S background ; obtained from Dr. Andreas Thum (University of Leipzig, Leipzeig, Germany) |
| VLC media player | VideoLAN | - | version 3.0.8; any media player can be used to score courtship |
References
- Scholz, H. Unraveling the Mechanisms of Behaviors Associated With AUDs Using Flies and Worms. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 43 (11), 2274-2284 (2010).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual Review of Neuroscience. 36, 121-138 (2013).
- Park, A., Ghezzi, A., Wijesekera, T. P., Atkinson, N. S. Genetics and genomics of alcohol responses in Drosophila. Neuropharmacology. 122, 22-35 (2017).
- Kippin, T. E. Adaptations underlying the development of excessive alcohol intake in selectively bred mice. Alcoholism: Clinical Experimental Research. 38 (1), 36-39 (2014).
- Bell, R. L., et al. Rat animal models for screening medications to treat alcohol use disorders. Neuropharmacology. 122, 201-243 (2017).
- Nona, C. N., Hendershot, C. S., Le, A. D. Behavioural sensitization to alcohol: Bridging the gap between preclinical research and human models. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 173, 15-26 (2018).
- Robinson, T. E., Berridge, K. C. The neural basis of drug craving: an incentive-sensitization theory of addiction. Brain Research Reviews. 18 (3), 247-291 (1993).
- Masur, J., Boerngen, R. The excitatory component of ethanol in mice: a chronic study. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 13 (6), 777-780 (1980).
- Camarini, R., Pautassi, R. M. Behavioral sensitization to ethanol: Neural basis and factors that influence its acquisition and expression. Brain Research Bulletin. 125, 53-78 (2016).
- Shuster, L., Yu, G., Bates, A. Sensitization to cocaine stimulation in mice. Psychopharmacology (Berl). 52 (2), 185-191 (1977).
- Short, P. H., Shuster, L. Changes in brain norepinephrine associated with sensitization to d-amphetamine. Psychopharmacology (Berl). 48 (1), 59-67 (1976).
- Vanderschuren, L. J., Pierce, R. C. Sensitization processes in drug addiction. Current Topics in Behavioral Neurosciences. 3, 179-195 (2010).
- Kong, E. C., et al. A pair of dopamine neurons target the D1-like dopamine receptor DopR in the central complex to promote ethanol-stimulated locomotion in Drosophila. Plos One. 5 (4), 9954 (2010).
- Broadbent, J., Harless, W. E. Differential effects of GABA(A) and GABA(B) agonists on sensitization to the locomotor stimulant effects of ethanol in DBA/2 J mice. Psychopharmacology (Berl). 141 (2), 197-205 (1999).
- Camarini, R., Andreatini, R., Monteiro, M. G. Prolonged treatment with carbamazepine increases the stimulatory effects of ethanol in mice. Alcohol. 12 (4), 305-308 (1995).
- Camarini, R., Hodge, C. W. Ethanol preexposure increases ethanol self-administration in C57BL/6J and DBA/2J mice. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 79 (4), 623-632 (2004).
- Hoshaw, B. A., Lewis, M. J. Behavioral sensitization to ethanol in rats: evidence from the Sprague-Dawley strain. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 68 (4), 685-690 (2001).
- Kawakami, S. E., Quadros, I. M., Takahashi, S., Suchecki, D. Long maternal separation accelerates behavioural sensitization to ethanol in female, but not in male mice. Behavioural Brain Research. 184 (2), 109-116 (2007).
- Lessov, C. N., Phillips, T. J. Duration of sensitization to the locomotor stimulant effects of ethanol in mice. Psychopharmacology (Berl). 135 (4), 374-382 (1998).
- Melon, L. C., Boehm, S. L. Role of genotype in the development of locomotor sensitization to alcohol in adult and adolescent mice: comparison of the DBA/2J and C57BL/6J inbred mouse strains. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 35 (7), 1351-1360 (2011).
- Pastor, R., Aragon, C. M. The role of opioid receptor subtypes in the development of behavioral sensitization to ethanol. Neuropsychopharmacology. 31 (7), 1489-1499 (2006).
- Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. Functional ethanol tolerance in Drosophila. Neuron. 28 (1), 261-271 (2000).
- Cofresi, R. U., Bartholow, B. D., Piasecki, T. M. Evidence for incentive salience sensitization as a pathway to alcohol use disorder. Neuroscience & Biobehavrioal Reviews. 107, 897-926 (2019).
- Topper, S. M., Aguilar, S. C., Topper, V. Y., Elbel, E., Pierce-Shimomura, J. T. Alcohol disinhibition of behaviors in C. elegans. Plos One. (93), 92965 (2014).
- Stoner, S. A., George, W. H., Peters, L. M., Norris, J. Liquid courage: alcohol fosters risky sexual decision-making in individuals with sexual fears. AIDS and Behavior. 11 (2), 227-237 (2007).
- Marinkovic, K., Halgren, E., Klopp, J., Maltzman, I. Alcohol effects on movement-related potentials: a measure of impulsivity. Journal of Studies on Alcohol and Drugs. 61 (1), 24-31 (2000).
- Prause, N., Staley, C., Finn, P. The effects of acute ethanol consumption on sexual response and sexual risk-taking intent. Archives of Sexual Behavior. 40 (2), 373-384 (2011).
- Miczek, K. A., DeBold, J. F., Hwa, L. S., Newman, E. L., de Almeida, R. M. Alcohol and violence: neuropeptidergic modulation of monoamine systems. Annals of the New York Academy of Sciences. 1349, 96-118 (2015).
- Heinz, A. J., Beck, A., Meyer-Lindenberg, A., Sterzer, P., Heinz, A. Cognitive and neurobiological mechanisms of alcohol-related aggression. Nature Reviews Neuroscience. 12 (7), 400-413 (2011).
- Schwandt, M. L., Higley, J. D., Suomi, S. J., Heilig, M., Barr, C. S. Rapid tolerance and locomotor sensitization in ethanol-naive adolescent rhesus macaques. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 32 (7), 1217-1228 (2008).
- Lee, H. G., Kim, Y. C., Dunning, J. S., Han, K. A. Recurring ethanol exposure induces disinhibited courtship in Drosophila. Plos One. 3 (1), 1391 (2008).
- Aranda, G. P., Hinojos, S. J., Sabandal, P. R., Evans, P. D., Han, K. A. Behavioral Sensitization to the Disinhibition Effect of Ethanol Requires the Dopamine/Ecdysone Receptor in Drosophila. Frontiers in Systems Neuroscience. 11, 56 (2017).
- Roeder, T. Octopamine in invertebrates. Progress in Neurobiology. 59 (5), 533-561 (1999).
- Gallo, V. P., Accordi, F., Chimenti, C., Civinini, A., Crivellato, E. Catecholaminergic System of Invertebrates: Comparative and Evolutionary Aspects in Comparison With the Octopaminergic System. International Review of Cell Molecular Biology. 322, 363-394 (2016).
- Curcillo, P. G., Tompkins, L. The ontogeny of sex appeal in Drosophila melanogaster males. Behavior Genetics. 17 (1), 81-86 (1987).
- Spieth, H. T. Courtship behavior in Drosophila. Annual Review of Entomology. 19, 385-405 (1974).
- Monastirioti, M., Linn, C. E., White, K. Characterization of Drosophila tyramine beta-hydroxylase gene and isolation of mutant flies lacking octopamine. Journal of Neuroscience. 16 (12), 3900-3911 (1996).
- Certel, S. J., Savella, M. G., Schlegel, D. C., Kravitz, E. A. Modulation of Drosophila male behavioral choice. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 104 (11), 4706-4711 (2007).
- Kido, A., Ito, K. Mushroom bodies are not required for courtship behavior by normal and sexually mosaic Drosophila. Journal of Neurobiology. 52 (4), 302-311 (2002).
- Winbush, A., et al. Identification of gene expression changes associated with long-term memory of courtship rejection in Drosophila males. G3: Genes, Genomes, Genetics (Bethesda). 2 (11), 1437-1445 (2012).
- Keleman, K., Kruttner, S., Alenius, M., Dickson, B. J. Function of the Drosophila CPEB protein Orb2 in long-term courtship memory. Nature Neuroscience. 10 (12), 1587-1593 (2007).
- Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nature Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Reza, M. A., et al. Automated analysis of courtship suppression learning and memory in Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 7 (2), 105-111 (2013).
- Schneider, J., Levine, J. D. Automated identification of social interaction criteria in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 10 (10), 20140749 (2014).
- Greenspan, R. J., Ferveur, J. F. Courtship in Drosophila. Annual Reviews of Genetics. 34, 205-232 (2000).
- Scholz, H. Influence of the biogenic amine tyramine on ethanol-induced behaviors in Drosophila. Journal of Neurobiology. 63 (3), 199-214 (2005).
