Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Flypub at studere ethanol induceret Behavioral Disinhibition og Sensibilisering

Published: May 18, 2020 doi: 10.3791/61123
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Texas at El Paso
* These authors contributed equally

Summary

Den Flypub assay måler den adfærd, at frugtfluen Drosophila melanogaster viser under indflydelse af ethanol. Analysen kan let beherskes af eksperimentatorer på alle niveauer og anvendes til forskellige fordampede stimuli, lette stofmisbrug og afhængighed undersøgelser.

Abstract

Alkoholbrug lidelse (AUD) er fortsat et alvorligt problem i vores samfund. For at udvikle effektive interventioner for afhængighed er det vigtigt at forstå de underliggende neurobiologiske mekanismer, for hvilke der er behov for forskellige eksperimentelle tilgange og modelsystemer. Den vigtigste ingrediens i alkoholholdige drikkevarer er ethanol, som forårsager adaptive ændringer i centralnervesystemet og adfærd ved kronisk indtag. Adfærdsmæssige sensibilisering (dvs. eskalerede svar) især repræsenterer en vigtig adaptive ændring underliggende afhængighed. De fleste ethanol-induceret adfærdsmæssige sensibilisering undersøgelser i dyremodeller er blevet udført på den bevægende aktiverende effekt af ethanol. En fremtrædende effekt af ethanol er adfærdsmæssig disinhibition. Adfærdsmæssige sensibilisering til disinhibition effekt af ethanol, dog, er underrepræsenteret. For at løse dette problem, vi udviklet Flypub assay, der gør det muligt at måle den eskalerede stigning i disinhibited frieri aktiviteter ved tilbagevendende ethanol eksponering i Drosophila melanogaster. Her rapporterer vi den trinvise Flypub-analyse, herunder samling af ethanoleksponeringskamre, opsætning af analysestationen, kriterier for fluepleje og -indsamling, ethanollevering, kvantificering af disinhibited frieri, databehandling og statistisk analyse. Der er også mulighed for fejlfinding af kritiske trin, overvinde begrænsninger og udvide dens nytte til at vurdere yderligere ethanol-induceret adfærd. Den Flypub assay i kombination med kraftfulde genetiske værktøjer i Drosophila melanogaster vil lette opgaven med at opdage den mekanisme, der ligger til grund for ethanol-induceret adfærdsmæssige sensibilisering.

Introduction

Alkohol er en af de lettest tilgængelige og almindeligt forbruges narkotika i verden. Det har et stort potentiale for misbrug og afhængighed; Den mekanisme, der ligger til grund for denne proces, er imidlertid stadig ufuldstændigt forstået. Ethanol inducerer disinhibition, eufori, kognitiv svækkelse, hyperaktivitet, tab af motorisk kontrol og sedation i orme1, bananfluer1,,2,,3, mus4, rotter5 og mennesker6, hvilket indikerer fælles neurobiologiske komponenter, der mægleethanol virkninger fra hvirvelløse dyr til pattedyr, herunder mennesker. Kronisk ethanol indtag forårsager neurale tilpasninger og adfærdsmæssige ændringer, der ligger til grund for AUD. En af tilpasningerne er adfærdsmæssig sensibilisering defineret som augmented response med gentagne erfaringer med ethanol7,8,9 eller andre vanedannende stoffer10,11,12.

I løbet af årtierne har undersøgelserne af ethanol-induceret adfærdssensibilisering (EIBS) fokuseret på den bevægelsesstimulerende virkning, der anvendes som indikator for et euforisk respons7,8,9,13. For eksempel viser rotter eller mus ved gentagen (hver 24, 48 eller 72 h) ethanoladministration den forstærkede bevægelsesaktivitet målt ved ganghastighed8,14,15,16,17,18,19,20,21. På samme måde udviser bananfluerne, der udsættes for den anden eksponering for ethanoldamp 4 timer efter den første eksponering, den forbedrede bevægelsesrespons målt ved ganghastighed samt22. Selv om der ikke foreligger oplysninger om den mekanisme, der ligger til grund for EIBS, til den bevægelsesstimulerende virkning i bananfluer, har undersøgelserne hos rotter og mus afdækket de molekylære og signalerende komponenter (f.eks. dopamin-, glutamat- og GABA-systemerne) samt neurale substrater og kredsløb (f.eks. det ventrale tegmentale område, kerneaccumbener, amygdala og præfrontal cortex), der spiller store roller for EIBS6,9,23.

Disinhibition er en stor effekt af ethanol og fører til manifestation af adfærd, der typisk er begrænset. Den disinhibiting effekt udøves på motoriske, følelsesmæssige, sociale, seksuelle og kognitive funktioner, hvilket kan føre til upassende seksuel adfærd, verbal eller fysisk aggression og impulsive handlinger hos mennesker og dyremodeller24,25,26,27,28,29. Ethanol-induceret disinhibition er blevet undersøgt i dyremodeller for mekanistiske undersøgelser , og de omfatter motorisk impulsivitet og aggression hos gnavere og aber samt fouragering disinhibition i orme6,9,24,28,29,30. Vi har vist, at bananfluer viser disinhibited seksuel adfærd under indflydelse af ethanol31. Specifikt, vilde mænd flyver sjældent ret andre mænd uden ethanol31 og når de gør, kurtisaner aktivt afvise bejle nikker. Under indflydelse af ethanol, dog, mandlige fluer viser mere frieri mod andre mænd og kurtisane udviser mindre afvisning, hvilket resulterer i samlede øget intermale frieri. Især, fluer udvikle adfærdsmæssige sensibilisering til disinhibition effekt ved tilbagevendende ethanol eksponering, der tjener som et unikt system til at studere EIBS31,32.

I denne rapport beskriver vi, hvordan du opsætter, udfører, troubleshooter og analyserer Flypub-analysen og data for at studere ethanol-induceret disinhibition og sensibilisering i frugtfluen Drosophila melanogaster. For at give sin nytte og effektivitet, vi testede wild-type Canton-S (CS; kontrol flyve stamme) sammen med fluer mangelfuld i tyramin β hydroxylase (tβh), der syntetiserer octopamin (OA). OA er en stor neuromodulator i hvirvelløse dyr33,34 og spiller en central rolle i udviklingen af ethanol tolerance i fluer22. Vi rapporterer her for første gang, at OA er vigtig for EIBS.

Protocol

BEMÆRK: Protokolafsnittet beskriver de forberedende, Flypub-analyse- og analysetrin, der omfatter (1) samling af kammeret, (2) fluepleje og -indsamling, (3) opsætning af analysestation, (4) ethanoleksponering, (5) frieriscoring og dataanalyse og (6) statistisk analyse. De vigtigste trin til gennemførelse af Flypub-analysen og -analysen er afbildet i en arbejdsgang (figur 1).

1. Samling af kammeret (Figur 2)

  1. Skær den nederste del af den runde Drosophila flaske ved 25 ml mærket ved hjælp af et barberblad.
  2. Lav et hul med en diameter på 5 mm ved flaskens 50 ml mærke med et varmt loddejern.
    BEMÆRK: Dette er det adgangspunkt, hvor fluerne overføres til kammeret.
  3. Skær et netark i en cirkel med en diameter på 54 mm, så det passer til Drosophila-flasken ved 75 ml-mærket.
  4. Fastgør masken ved flaskens 75 ml mærke med varm lim.
  5. Skær polycarbonat plastfolie i en cirkel, 70 mm i diameter.
  6. Fastgør polycarbonatplastfolien til flasken ved 25 ml mærket (nederste åbne område i trin 1.1) med varm lim.
  7. Tryk ned ved hjælp af vægte for at sikre, at polycarbonatrunden sidder godt fast på bunden.
  8. Vask pubber med ethanol for at fjerne eventuelle lugte og voldsomt skylle dem flere gange under løbende destilleret vand. Ryst pubber kraftigt for at fjerne overskydende vand.
  9. Tør pubberne ved at lægge dem vandret på papirservietter ved stuetemperatur.

2. Flypleje og -afhentning

  1. Hold fluerne på en standard majsmel / agar / sukker / gær mad medium (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/harvardfood.html).
  2. Indsamle en- til to dage gamle mandlige fluer i en gruppe på 33, som repræsenterer et datapunkt, under kuldioxid (CO2)anæstesi. Sørg for at vælge fluer med intakt morfologi og læg dem i et madhætteglas for at komme sig.
    BEMÆRK: To mere eller tre mindre fluer pr. gruppe er tålelige. Adfærd kan være følsomme over for eksperimentelle indstillinger og dermed en samlet flyve nummer pr pub kan være nødvendigt at justeremed en kontrol flyve linje.
    BEMÆRK: Sørg for, at madhætteglasset er lagt ned på siden, så de bestøvede fluer ikke sidder fast på maden.
  3. Hold fluerne i 25 °C-inkubatoren med mindst 50 % relativ luftfugtighed og en 12 timers lys / 12 timers mørk cyklus i 2 dage før eksponering af ethanol.
    BEMÆRK: CO2-clearance er afgørende for at eliminere eventuelle CO 2-inducerede fysiologiske eller adfærdsmæssige virkninger, der kan ændre ethanol-inducerede reaktioner.2
  4. Brug koder til blind flyve genotyper eller behandling betingelser til de eksperimentatorer, der udfører ethanol eksponering og scoring frieri adfærd.
    BEMÆRK: Blindtest hjælper med at eliminere eksperimentel bias.

3. Oprettet analysestation (figur 3A)

  1. Opret en kopistander med en tilknyttet midterarm på en bordplade i et godt ventileret rum.
    BEMÆRK: Kopiholderen er ikke obligatorisk. Enhver midlertidig enhed, der leverer en niveauplatform, er tilstrækkelig.
  2. Klem de to tværarme fast til stativet, med hver arm ca. 18 cm ud fra midten af stativet.
  3. Placer et lysstofrør på hver arm af stativet og et i midten.
  4. Fastgør videooptageren til midterarmen, ca. 38 cm over midten af basen. Dette vil optage pubber fra en top visning.
  5. Dæk bunden af stativet med hvidt papir, som hjælper med at visualisere mørke fluer for at skabe kontrast.
  6. I løbet af dagen for eksponering, tænde lysstofrør og computeren tilsluttet videokameraet, der er knyttet til kopistativet (Figur 3A).
    BEMÆRK: Lysintensiteten 2100-2200 lux giver god kvalitet af indspillet adfærd for scoring. De omgivende lysforhold i laboratoriet er imidlertid tilstrækkelige til at observere ethanolforårsagede frieriaktiviteter.
  7. Klargør de genstande, der skal anvendes til ethanoleksponering, og som er afbildet i figur 3B.
  8. Saml seks rene, samlede pubber til et sæt eksperimenter og mærk dem med koden 1 til 6.
    BEMÆRK: Sørg for at placere de randomiserede koder på fluegenotyper eller behandlingsbetingelser.

4. Eksponering for ethanol (figur 3)

  1. Overfør forsigtigt en gruppe på 33 hanner ind i et Flypub kammer gennem hullet ved 50 ml mærket ved hjælp af en lille tragt.
    BEMÆRK: For at minimere mekanisk belastning af fluerne skal du placere en musemåtte eller et stødringsmateriale under pubben under overførslen.
  2. Dæk hullet med et bånd.
    BEMÆRK: Båndet bruges til at lukke hullet, hvilket forhindrer fluer i at slippe ud af pubben.
  3. Juster pubberne på scenen fra 1 til 6.
  4. Akklimatiser fluerne til kammeret i 10 min (Figur 3D).
  5. Juster kameraindstillingerne, herunder fokus, zoom og lysstyrke, og optag de sidste 5 minutters akklimatisering for at måle et basalt frieriniveau.
    BEMÆRK: For at eliminere blænding genereret af lys refleksion fra en pub, placere lab klude (typisk 4 lag eller mindre end 1 mm tykkelse) i bunden af pubben for at justere vinklen.
  6. Forbered vatrondeller til ethanol levering ved at skære en pude i fire lige kvadranter med ren saks og derefter trimme hjørnerne for at gøre det passer ind i en petriskål under akklimatisering (Figur 3C).
    BEMÆRK: Brug ikke bare hænder til at håndtere vatrondellerne. Brug pincet til at håndtere vatrondeller for at undgå enhver potentiel overførsel af lugte.
  7. Tilføj en vatrondel i hver petriskål.
  8. Der tilsættes 1 ml 95% ethanol til hver vatrondel, sørg for, at ethanolopløsningen fordeles jævnt på hele pudens område.
  9. Dæk med dobbeltlagede laboratorieklude for at undgå hurtig ethanolfordampning.
  10. Placer den lille petriskål, der indeholder ethanol-gennemblødt vatrondel og dobbelt-lag lab klude gennem den nederste åbning af pubben efter akklimatisering.
  11. Juster pubberne på scenen, begynd at optage og samtidig starte en timer.
  12. Optag pubber, der indeholder fluer under ethanol eksponering, indtil fluerne stoppe bejle eller bevæger sig på grund af sedation.
  13. Fjern petriskålen, der indeholder ethanol fra hver pub med en spatel, når over 90% af fluerne er bedøvet.
  14. Overfør forsigtigt fluer tilbage til deres tildelte hætteglas gennem hullet ved 50 ml mærket i pubben.
    BEMÆRK: Placer en tragt oven på madhætteglas for at hjælpe med overførslen. Sørg for at placere bedøvede fluer på siden af madhætteglas for at forhindre dem i at sidde fast i maden.
  15. Rengør pubber med ethanol for at fjerne eventuelle lugte og voldsomt skylle dem flere gange under løbende destilleret vand. Ryst pubber kraftigt for at fjerne overskydende vand.
  16. Tør pubberne ved at lægge dem vandret på papirservietter ved stuetemperatur.
  17. Hold fluerne i 25 °C-inkubatoren med mindst 50 % relativ luftfugtighed og en 12 timers lys / 12 timers mørk cyklus.
  18. Trin4.1-4.17 gentages hver 24.
    BEMÆRK: Skift madhætteglas hver 2- 3 dage for at opretholde sunde fluer.

5. Frieri scoring og data analyse (Figur 4-6)

  1. Åbn de optagede videoer ved hjælp af en medieafspiller (f.eks. VLC), og zoom ind på videoen for tydeligt at observere fluer for at score (Figur 4A).
  2. Fastgør tidskoden til videoen (Figur 4B).
  3. Tæl antallet af mænd, der er involveret i frieri aktiviteter, herunder følgende, ensidig fløj forlængelse, frieri kæde, frieri cirkel, abdominal bøjning og montering for hver 10 s tid blok31 (Figur 5).
  4. Indtast antallet af mænd, der viser frieri for hver 10 s tidsblok i et regneark (Figur 6A).
  5. Brug det maksimale antal bejlende hanner i de tre på hinanden følgende 10 s tidsblokke som et repræsentativt datapunkt (Figur 6B).
  6. Gennemsnittet af 10 på hinanden følgende datapunkter med den højeste værdi (Figur 6C) beregnes, og dette repræsenterer procentdelen af intermandlig frieri pr. pub (figur 6A).

6. Statistisk analyse (supplerende figur 1)

  1. Åbn statistisk analysesoftware (f.eks. minitab 17) og tilføj frieridata i regnearket.
    BEMÆRK: Enhver statistisk analyse software kan bruges.
  2. Hvis du vil bestemme fordelingen af dataene (enten normal eller ikke-normal distribution), skal du gå til fanen Stat, vælge Grundlæggende statistikog klikke på indstillingen Normalitetstest (Supplerende figur 1Ai).
  3. I Variableskal du vælge individuelle kolonner (hver kolonne, der repræsenterer et datasæt af en genotype eller behandling under undersøgelse), vælge Anderson-Darling-testen og klikke på OK (Supplerende figur 1Aii).
    BEMÆRK: Sandsynlighedsområdet Normalitet viser den beregnede P-værdi: Hvis P-værdien er større end 0,05, fordeles dataene normalt. Hvis P-værdien er mindre end 0,05, fordeles dataene ikke normalt (Supplerende figur 1Aiii).
  4. Hvis du vil sammenligne flere grupper, skal du stable kolonnerne for at sammenligne ved at klikke på fanen Data, vælge Stakog derefter Kolonner (Supplerende figur 1Bi).
  5. I vinduet Stakkolonner skal du markere de datakolonner, der skal stables, vælge den stabling, der er udført enten i Nyt regneark eller kolonne i det aktuelle regneark med den næste kolonne, der er angivet til angivelse af sænket skrift (f.eks. datagruppeidentitet; Supplerende figur 1Bii-1Biii).
  6. Klik på fanen Stat, vælg ANOVA-testen, vælg den lineære model generelt, og klik derefter på Tilpas generel lineær model (Supplerende figur 1Ci).
  7. I vinduet Generel lineær model skal du vælge de kolonner, der skal sammenlignes, i feltet Svar, markere kolonnen med sænket skrift i feltet Faktorer og klikke på OK, hvilket fører til de statistiske analyseresultater (Supplerende figur 1Cii-1Ciii).
  8. Hvis du vil sammenligne to grupper med normalt distribuerede data, skal du klikke på fanen Stat, vælge grundlæggende statistikog vælge 2-Eksempel t-test (Supplerende figur 1Di).
  9. I 2-Sample t for vinduet Middelværdi skal du vælge Hver prøve er i sin egen kolonne, fra en rulleliste skal du vælge de to grupper, der skal sammenlignes i felterne Eksempel 1 og Eksempel 2, og derefter klikke på OK, hvilket fører til de statistiske analyseresultater (Supplerende figur 1Dii-1Diii).
  10. For sammenligning af to grupper med ikke-normalt distribuerede data, gå til fanen Stat, skal du vælge Nonparametrics og klik mann-Whitney (supplerende figur 1Ei)
  11. I vinduet Mann-Whitney skal du vælge de to grupper, der skal sammenlignes i felterne Første prøve og Anden Prøve, og derefter klikke på OK, hvilket fører til de statistiske analyseresultater (Supplerende figur 1Eii-1Eiii).
  12. Hvis du vil sammenligne tre eller flere grupper af ikke-normalt distribuerede data, skal du gå til fanen Stat, vælge Nonparametrikog derefter klikke på Kruskal-Wallis-testen (Supplerende figur 1Fi).
  13. I vinduet Kruskal-Wallis skal du vælge de kolonner, der skal sammenlignes i feltet Svar, vælge kolonnen med sænket skrift i feltet Faktor og klikke på OK, hvilket fører til de statistiske analyseresultater (Supplerende figur 1Fii-1Fiii).

Representative Results

Dette afsnit viser resultaterne af et repræsentativt Flypub-eksperiment. Drosophila hanner sjældent ret andre mænd35,36. Under den første ethanoleksponering udviste de vilde type Canton-S (CS)hanner en lille, men ubetydelig stigning i den disinhibited intermale frieri31 (Figur 7A). Cs-hanner viste imidlertid de eskalerede stigninger i den dishæmmede frieriaktivitet i efterfølgende ethanoleksponeringer (ANOVA GLM, CS: R2=0,83, F(5,66) =65,21, p < 0,0001; CS n = 12; Figur 7A), som angiver adfærdsmæssig ebilisering til disinhibition effekt af ethanol. Vi har tidligere vist, at denne type EIBS kræver dopamin og dopaminreceptoren DopEcR i svampeneuronerne31,32.

For at identificere, om yderligere neuromodulatorer er involveret i EIBS, undersøgte vi OA's rolle ved at teste fluerne (tβh; nM18 null allel)37,38 mangler tyramin β hydroxylase, det hastighedsbegrænsende enzym i OA-biosyntesen, og dermed mangelfuld i OA. De tβh hanner i CS genetiske baggrund (en slags gave fra Dr. Andreas Thum, Universitetet i Leipzig, Tyskland) viste sensibiliseret disinhibited frieri svar på dagligethanol eksponeringer (ANOVA GLM, tβh: R2= 0,67, F(5,66) = 27,60, p < 0,0001; n = 12; Figur 7B) men på det reducerede niveau sammenlignet med CS (ANOVA GLM, interaktionseffekt: F =2,50, p <0,034). Efter post hoc-analyse udviste tβh hanner lavere niveauer af intermale frieri ved hver eksponering, der er mest tydelig under den fjerde til sjette ethanoleksponering sammenlignet med CS (tostikprøvet t-test: p < 0,002 i EXP4, p < 0,004 i EXP5, p < 0,021 i EXP6; n = 12; Figur 7C). Tilsammen tyder disse resultater på, at OA kan spille en rolle i EIBS for ethanols disinhibition-effekt. Endnu vigtigere, disse datasæt klart vise nytten og effektiviteten af Flypub assay i at studere ethanol-induceret disinhibition og sensibilisering.

Figure 1
Figur 1: Arbejdsgang for Flypub-analyse. Et arbejdsprocesdiagram, der fremhæver de vigtigste trin til at udføre Flypub-analysen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Flypub kammer materialer og samling. (A) Materialer, der kræves til at bygge en Flypub kammer omfatter (i) varm lim pistol lim stick, (ii) varm lim pistol, (iii) barberblad, (iv) loddejern, (v) lineal, (vi) mesh, (vii) polycarbonat plastfolie, og (viii) rund-bund Drosophila flaske. (B) Schematic repræsentation af Flypub kammer forsamling. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Eksponering af ethanol. (A) En fuldt samlet Flypub station. (B) De materialer, der kræves til ethanoleksponering, omfatter (i) P1000 mikropipette,(ii) tape, (iii) vatrondel, (iv) Petriskål, (v) laboratorieservietter, (vi) små tragt, (vii) timer, (viii) mellemstore tragt, (ix) musemåtte, (x) saks, (xi) 95% ethanol, (xii) pincet og (xiii) spatel. (C) Trin til, hvordan man skærer vatrondeller. (D) Top view billede af pubber justeret på scenen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Videoopsætning til adfærdsmæssig scoring. Vist er den trinvise vejledning på (A), hvordan du zoomer ind på videoen og (B) hvordan man indsætter tidskodefilen i VLC-medieafspilleren til adfærdsmæssig scoring. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Mandlig frieri adfærd. Repræsentative billeder illustrerer Drosophila mandlige frieri adfærd, herunder følgende og ensidig fløj udvidelse til (A) frieri sang, (B) frieri kæde, (C) frieri cirkel (D) abdominal bøjning og (E) montering, der bruges til adfærdsmæssige scoring. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Datainput og -analyse. (A) Antallet af mænd, der er involveret i frieri i hver 10 s tidblok er transskriberet i et regneark. Det højeste antal bejler mænd af tre på hinanden følgende 10 s tidsblokke (grøn pil) bruges som et repræsentativt datapunkt. Gennemsnittet af 10 på hinanden følgende datapunkter (blå eller orange parentes), der har den maksimale værdi, repræsenterer procentdelen af anciennitet mellem mænd pr. pub [orange parentes; MAX (gennemsnit), sort pil]. (B,C) De regnearksformler, der bruges til at beregne det maksimale repræsentative datapunkt og det maksimale gennemsnit på 10 på hinanden følgende repræsentative datapunkter pr. pub. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Ethanol induceret adfærdsmæssig disinhibition og sensibilisering i CS og tβh. (A,B) CS og tβh hannerne udviste sensibiliseret frieri disinhibition med gentagne ethanoleksponeringer (ANOVA GLM, CS: R2=0,83, F(5,66)=65,21, p < 0,0001; tβh: R2=0,67, F(5,66)=27,60, p < 0,0001 n = 12). (C)h Hannerne vistemindre disinhibiteret frieri sammenlignet med CS (n=12). P-værdierne i post hoc-analyserne vises over linjen. Den intermale frieri aktivitet blev analyseret fra de videoer genereret for hver ethanol eksponering. Alle data indberettes som middel ± standardfejl af middelværdien. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: Statistisk analyse. Trinene i Minitab 17 software om, hvordan man udfører (A) Normalitet test, (B) stabling af data, (C) Generel lineær model ANOVA test, (D) To-prøve t-test, (E) Mann-Whitney test og (F) Kruskal-Wallis test. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

I denne rapport har vi beskrevet opsætningen og den detaljerede protokol for Flypub-analysen; en ny metode til at måle, hvordan tilbagevendende ethanol eksponering udløser disinhibited frieri og adfærdsmæssige sensibilisering. Selv om Flypub assay er relativt ligetil, flere trin kræver omhu og opmærksomhed for at sikre pålidelige resultater. For det første skal fluerne til test være fuldt pigmenterede (dvs. fuldt udviklede voksne fluer), sunde og intakte. Deformiteter eller skader især i deres vinger eller ben kan påvirke den mandlige evne til at retten. For det andet er flyvealderen vigtig og skal matches mellem kontrol- og forsøgsgrupper (optimal alder: 3-5 dage gammel ved ethanoleksponering 1). To uger og ældre vilde-type mandlige fluer tendens til at vise de forhøjede niveauer af disinhibited frieri31. Således, ordentlig aldersmatchning af fluer under undersøgelse er afgørende for at undgå variable resultater. For det tredje er fluenummeret pr. pub afgørende (optimalt: 33 pr. pub). De lavere eller højere flyve tal pr pub kan i høj grad skæve frieri score (data ikke vist). For det fjerde skal Flypub-kamrene have samme volumen som vist i figur 2B. Dette sikrer, at fluer modtager ethanol damp synkront og fremkaldte adfærd er konsekvent. For det femte er klar videooptagelse og præcis frieri scoring afgørende. Denne protokol afhænger i høj grad af adfærdsmæssige observationer, så omhyggelig overholdelse af den standardiserede frieri scoring protokol er afgørende for at minimere inkonsekvente resultater. Endelig anbefales det stærkt, at både ethanoleksponering og frieriets scoringstrin udføres blindt, hvor en eksperimentator ikke er klar over fluegenotyper eller eksperimentelle behandlinger, hvorved eksperimentelle bias forhindres.

Den Flypub assay har flere fordele. For det første kan flere grupper af fluer testes og sammenlignes samtidigt. For det andet er det billigt, nemt at setup og let at lære, hvilket gør det meget modtagelige for eksperimentatorer på alle niveauer, herunder elementære gennem high school, bachelor-og kandidatstuderende, postdocs og fakultetsamt undervisning laboratorier med begrænset plads og budgetter. For det tredje kan det bruges til at måle yderligere adfærd såsom disinhibited frieri af kvindelige fluer og den beroligende virkning af ethanol eller andre beroligende midler til at vurdere indledende følsomhed og tolerance udvikling og vedligeholdelse31,32. Sammen er Flypub en alsidig metode til at studere forskellige funktioner i AUD.

Den største begrænsning af Flypub assay er den strenge og besværlige frieri scoring regime. Frieri adfærd under indflydelse af ethanol er meget dynamisk på en måde, at frieri varighed spænder fra mindre end et sekund til mange minutter, og fluer engageret i frieri er temmelig ofte skiftende. Den her præsenterede scoringsordning blev udviklet for at indarbejde denne dynamiske karakter og give ensartede scorer på individuelle ethanoleksponeringer for en given genotype31,32. Som nævnt i protokollen, er frieri aktivitet manuelt scoret, hvilket er tidskrævende. Der er udviklet flere automatiserede scoringsprogrammer for at lette en objektiv adfærdsscreening med høj gennemløb , og som alle er afhængige af individuelle fluers bevægelser og placeringer39,40,41,42,43,44,45. Vi forsøgte også at udvikle en computersoftware til automatisk at tælle frieri aktivitet, men var ude af stand til at opnå konsekvente og pålidelige resultater. Dette kan skyldes det faktum, at adfærdsmæssige scoring omfatter flere frieri skridt (dvs. efter, ensidig fløj forlængelse, abdominal bøjning og montering)35,36,46 af flere fluer på én gang. Selv med denne begrænsning, en eksperimentator med tilstrækkelig uddannelse bør være i stand til at kvantificere ethanol-induceret frieri adfærd med konsistens og nøjagtighed. Ikke desto mindre ville det være en stor hjælp og betydning at vedtage machine learning eller andre avancerede algoritmer som opfølgning.

I lighed med gnavere modeller, har undersøgelserne af ethanol i fluemodellen i vid udstrækning fokuseret på ethanolens bevægelsesstimulerende og beroligende virkninger. Den Flypub assay dog foranstaltninger disinhibited frieri, en form for kognitiv disinhibition, som er roman31,32. Derfor kan Flypub støtte til at belyse de molekylære spillere, cellulære veje og neurale kredsløb samt risikofaktorer (f.eks alder, søvn, kost eller socialt miljø) kritisk for adfærdsmæssige disinhibition og sensibilisering. Vi har tidligere påvist, at der kræves dopaminsignalering for EIBS, hvilket er i overensstemmelse med resultaterne i gnavere modeller og mennesker6,9,31. Også som et proof of concept undersøgte vi tβ h-mutanten, der manglede OA (invertebatmoden af noradrenalin) og fandt ud af, at OA også er vigtig for adfærdsmæssig esibilisering af ethanolens disinhibitioneffekt, selv om dens bidrag er relativt lille i forhold til dopamin31.h Dette resultat står i modsætning til Scholz47's observation af, at de mutantfluer, der er tβh, ikke udviser tydelige svækkelser ved sensibiliseringen af ethanolens bevægelseseffekt47. Dette tyder på særskilte molekylære, cellulære og neurale veje mægle adfærdsmæssige sensibilisering til disinhibition versus bevægelsesmidler. Opfølgende undersøgelser bør yderligere samarbejde denne fristende begreb.

Sammenfattende er Flypub en billig, mangesidet og effektiv metode til at undersøge adfærdsmæssige reaktioner på ethanol, især disinhibition og adfærdsmæssige sensibilisering, der kan bidrage til at fremme vores forståelse af AUD og give indsigt i effektive indgreb for denne kroniske lidelse.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIAAA 1R15AA020996, NIMH R21MH109953, Brain & Behavior Research Foundation NARSAD og NIMHD 2G12MD007592 NMD Cluster tilskud. Vi er også taknemmelige for NIH-finansierede RISE program (NIGMS 5R25GM069621) for at støtte NMD og CMS, UTEP COURI-OVERGÅR program for støtte NMD, NIH-finansierede MARC program (NIGMS 2T34GM008048-31) for at støtte AA, og Dr. Keelung Hong Graduate Fellowship for at støtte EBS. Vi sætter stor pris på UTEP kommunikationsafdeling: Darlene Barajas, Christian Rivera, Karina Moreno, Jose Loya Fernandez og Musik afdeling: Stephen A. Haddad for deres hjælp i videoen og voice-over produktion. Endelig er vi meget taknemmelige for Dr. Andreas Thum for at dele tβh mutant i Canton-S baggrund sammen med kontrol Canton-S fluer; og Jessica Burciaga for hendes værdifulde bidrag til de indledende undersøgelser af octopamin og Han lab medlemmer til diskussion og støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
95 % Ethanol VWR Chemicals BDH1158-4LP
Canton-S - - wild-type strain used as a control
Copy stand with arms Kaiser 205411 model RS 2-XA, with one central arm and two lateral arms; to set up a flypub station
Cotton rounds Swisspers COT-027 to deliver ethanol
Excel Microsoft - to analyze data; any worksheet or spreadsheet software can be used
Fluorescent light bulb Lights of America 7108N maximum (120 V-70 W Max.); to illuminate the flypub station
Microsoft LifeCam software Microsoft - version 3.60; to videotape flypubs
Microsoft LifeCam Studio Microsoft Q2F-00013 1080P HD sensor; to videotape flypubs
Minitab 17 Minitab - version 17; to conduct statistical analysis; any statistical analysis software can be used
Nylon mesh sheet Sefar Nitex - model B0043D1TVY, opaque white, 200 microns mesh; to make a flypub
Petri dishes Falcon 08-757-100A 35 x 10 mm; to deliever ethanol
Plastic funnel - mid size Fisher scientific 10-348A 65 mm diameter and 67 mm height; to transfer sedated flies from a flypub into a food vial
Plastic funnel - small Fisher scientific 07-202-121 4 mm diameter and 46 mm height; to transfer flies from a vial into a flypub
Polycarbonate sheet Lexan - 0.762 mm thickness, clear, 610 x 1220 mm Nominal; to make a flypub
Round-bottom bottle Fisher scientific AS115 polypropylene, 103 mm height, 60 mm diameter and 177 ml capacity; to make a flypub
Soldering iron Weller WES51 to make a hole in a flypub
Time code - - .smi file, a subtitle ticking timecode created in Han lab; to monitor time during courtship scoring; any time subtitles may be used
Tyramine β hydroxylase (tβh) - - mutant fly strain (nM18 null allele)deficient in tβh in the wild-type Canton-S background ; obtained from Dr. Andreas Thum (University of Leipzig, Leipzeig, Germany)
VLC media player VideoLAN - version 3.0.8; any media player can be used to score courtship

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scholz, H. Unraveling the Mechanisms of Behaviors Associated With AUDs Using Flies and Worms. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 43 (11), 2274-2284 (2010).
  2. Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual Review of Neuroscience. 36, 121-138 (2013).
  3. Park, A., Ghezzi, A., Wijesekera, T. P., Atkinson, N. S. Genetics and genomics of alcohol responses in Drosophila. Neuropharmacology. 122, 22-35 (2017).
  4. Kippin, T. E. Adaptations underlying the development of excessive alcohol intake in selectively bred mice. Alcoholism: Clinical Experimental Research. 38 (1), 36-39 (2014).
  5. Bell, R. L., et al. Rat animal models for screening medications to treat alcohol use disorders. Neuropharmacology. 122, 201-243 (2017).
  6. Nona, C. N., Hendershot, C. S., Le, A. D. Behavioural sensitization to alcohol: Bridging the gap between preclinical research and human models. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 173, 15-26 (2018).
  7. Robinson, T. E., Berridge, K. C. The neural basis of drug craving: an incentive-sensitization theory of addiction. Brain Research Reviews. 18 (3), 247-291 (1993).
  8. Masur, J., Boerngen, R. The excitatory component of ethanol in mice: a chronic study. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 13 (6), 777-780 (1980).
  9. Camarini, R., Pautassi, R. M. Behavioral sensitization to ethanol: Neural basis and factors that influence its acquisition and expression. Brain Research Bulletin. 125, 53-78 (2016).
  10. Shuster, L., Yu, G., Bates, A. Sensitization to cocaine stimulation in mice. Psychopharmacology (Berl). 52 (2), 185-191 (1977).
  11. Short, P. H., Shuster, L. Changes in brain norepinephrine associated with sensitization to d-amphetamine. Psychopharmacology (Berl). 48 (1), 59-67 (1976).
  12. Vanderschuren, L. J., Pierce, R. C. Sensitization processes in drug addiction. Current Topics in Behavioral Neurosciences. 3, 179-195 (2010).
  13. Kong, E. C., et al. A pair of dopamine neurons target the D1-like dopamine receptor DopR in the central complex to promote ethanol-stimulated locomotion in Drosophila. Plos One. 5 (4), 9954 (2010).
  14. Broadbent, J., Harless, W. E. Differential effects of GABA(A) and GABA(B) agonists on sensitization to the locomotor stimulant effects of ethanol in DBA/2 J mice. Psychopharmacology (Berl). 141 (2), 197-205 (1999).
  15. Camarini, R., Andreatini, R., Monteiro, M. G. Prolonged treatment with carbamazepine increases the stimulatory effects of ethanol in mice. Alcohol. 12 (4), 305-308 (1995).
  16. Camarini, R., Hodge, C. W. Ethanol preexposure increases ethanol self-administration in C57BL/6J and DBA/2J mice. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 79 (4), 623-632 (2004).
  17. Hoshaw, B. A., Lewis, M. J. Behavioral sensitization to ethanol in rats: evidence from the Sprague-Dawley strain. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 68 (4), 685-690 (2001).
  18. Kawakami, S. E., Quadros, I. M., Takahashi, S., Suchecki, D. Long maternal separation accelerates behavioural sensitization to ethanol in female, but not in male mice. Behavioural Brain Research. 184 (2), 109-116 (2007).
  19. Lessov, C. N., Phillips, T. J. Duration of sensitization to the locomotor stimulant effects of ethanol in mice. Psychopharmacology (Berl). 135 (4), 374-382 (1998).
  20. Melon, L. C., Boehm, S. L. Role of genotype in the development of locomotor sensitization to alcohol in adult and adolescent mice: comparison of the DBA/2J and C57BL/6J inbred mouse strains. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 35 (7), 1351-1360 (2011).
  21. Pastor, R., Aragon, C. M. The role of opioid receptor subtypes in the development of behavioral sensitization to ethanol. Neuropsychopharmacology. 31 (7), 1489-1499 (2006).
  22. Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. Functional ethanol tolerance in Drosophila. Neuron. 28 (1), 261-271 (2000).
  23. Cofresi, R. U., Bartholow, B. D., Piasecki, T. M. Evidence for incentive salience sensitization as a pathway to alcohol use disorder. Neuroscience & Biobehavrioal Reviews. 107, 897-926 (2019).
  24. Topper, S. M., Aguilar, S. C., Topper, V. Y., Elbel, E., Pierce-Shimomura, J. T. Alcohol disinhibition of behaviors in C. elegans. Plos One. (93), 92965 (2014).
  25. Stoner, S. A., George, W. H., Peters, L. M., Norris, J. Liquid courage: alcohol fosters risky sexual decision-making in individuals with sexual fears. AIDS and Behavior. 11 (2), 227-237 (2007).
  26. Marinkovic, K., Halgren, E., Klopp, J., Maltzman, I. Alcohol effects on movement-related potentials: a measure of impulsivity. Journal of Studies on Alcohol and Drugs. 61 (1), 24-31 (2000).
  27. Prause, N., Staley, C., Finn, P. The effects of acute ethanol consumption on sexual response and sexual risk-taking intent. Archives of Sexual Behavior. 40 (2), 373-384 (2011).
  28. Miczek, K. A., DeBold, J. F., Hwa, L. S., Newman, E. L., de Almeida, R. M. Alcohol and violence: neuropeptidergic modulation of monoamine systems. Annals of the New York Academy of Sciences. 1349, 96-118 (2015).
  29. Heinz, A. J., Beck, A., Meyer-Lindenberg, A., Sterzer, P., Heinz, A. Cognitive and neurobiological mechanisms of alcohol-related aggression. Nature Reviews Neuroscience. 12 (7), 400-413 (2011).
  30. Schwandt, M. L., Higley, J. D., Suomi, S. J., Heilig, M., Barr, C. S. Rapid tolerance and locomotor sensitization in ethanol-naive adolescent rhesus macaques. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 32 (7), 1217-1228 (2008).
  31. Lee, H. G., Kim, Y. C., Dunning, J. S., Han, K. A. Recurring ethanol exposure induces disinhibited courtship in Drosophila. Plos One. 3 (1), 1391 (2008).
  32. Aranda, G. P., Hinojos, S. J., Sabandal, P. R., Evans, P. D., Han, K. A. Behavioral Sensitization to the Disinhibition Effect of Ethanol Requires the Dopamine/Ecdysone Receptor in Drosophila. Frontiers in Systems Neuroscience. 11, 56 (2017).
  33. Roeder, T. Octopamine in invertebrates. Progress in Neurobiology. 59 (5), 533-561 (1999).
  34. Gallo, V. P., Accordi, F., Chimenti, C., Civinini, A., Crivellato, E. Catecholaminergic System of Invertebrates: Comparative and Evolutionary Aspects in Comparison With the Octopaminergic System. International Review of Cell Molecular Biology. 322, 363-394 (2016).
  35. Curcillo, P. G., Tompkins, L. The ontogeny of sex appeal in Drosophila melanogaster males. Behavior Genetics. 17 (1), 81-86 (1987).
  36. Spieth, H. T. Courtship behavior in Drosophila. Annual Review of Entomology. 19, 385-405 (1974).
  37. Monastirioti, M., Linn, C. E., White, K. Characterization of Drosophila tyramine beta-hydroxylase gene and isolation of mutant flies lacking octopamine. Journal of Neuroscience. 16 (12), 3900-3911 (1996).
  38. Certel, S. J., Savella, M. G., Schlegel, D. C., Kravitz, E. A. Modulation of Drosophila male behavioral choice. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 104 (11), 4706-4711 (2007).
  39. Kido, A., Ito, K. Mushroom bodies are not required for courtship behavior by normal and sexually mosaic Drosophila. Journal of Neurobiology. 52 (4), 302-311 (2002).
  40. Winbush, A., et al. Identification of gene expression changes associated with long-term memory of courtship rejection in Drosophila males. G3: Genes, Genomes, Genetics (Bethesda). 2 (11), 1437-1445 (2012).
  41. Keleman, K., Kruttner, S., Alenius, M., Dickson, B. J. Function of the Drosophila CPEB protein Orb2 in long-term courtship memory. Nature Neuroscience. 10 (12), 1587-1593 (2007).
  42. Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nature Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
  43. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  44. Reza, M. A., et al. Automated analysis of courtship suppression learning and memory in Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 7 (2), 105-111 (2013).
  45. Schneider, J., Levine, J. D. Automated identification of social interaction criteria in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 10 (10), 20140749 (2014).
  46. Greenspan, R. J., Ferveur, J. F. Courtship in Drosophila. Annual Reviews of Genetics. 34, 205-232 (2000).
  47. Scholz, H. Influence of the biogenic amine tyramine on ethanol-induced behaviors in Drosophila. Journal of Neurobiology. 63 (3), 199-214 (2005).

Tags

Adfærd Ethanol Drosophila melanogaster Frugt flue Adfærdsmæssige sensibilisering Disinhibition Frieri Octopamin Alkohol brug lidelse
Flypub at studere ethanol induceret Behavioral Disinhibition og Sensibilisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Delgado, N. M., Sierra, C. M.,… More

Delgado, N. M., Sierra, C. M., Arzola, A., Saldes, E. B., Han, K. A., Sabandal, P. R. Flypub To Study Ethanol Induced Behavioral Disinhibition and Sensitization. J. Vis. Exp. (159), e61123, doi:10.3791/61123 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter