Summary
Анализ Flypub измеряет поведение, которое плодовая муха Drosophila melanogaster отображает под влиянием этанола. Анализ может быть легко освоен экспериментаторами на всех уровнях и применен к различным испаряемым стимулам, облегчая злоупотребление психоактивными веществами и исследования наркомании.
Abstract
Расстройство употребления алкоголя (AUD) остается серьезной проблемой в нашем обществе. Для разработки эффективных мероприятий по борьбе с наркоманией важно понимать основные нейробиологические механизмы, для которых необходимы различные экспериментальные подходы и модельные системы. Основным ингредиентом алкогольных напитков является этанол, который вызывает адаптивные изменения в центральной нервной системе и поведении при хроническом уходе. Поведенческая сенсибилизация (т.е. эскалация ответов), в частности, представляет собой ключевое адаптивное изменение, лежащее в основе зависимости. Большинство этанол индуцированных поведенческих исследований сенсибилизации в животных моделях были проведены на локомотив активации эффект этанола. Заметным эффектом этанола является поведенческая расторможенности. Однако поведенческая чувствительность к эффекту расторможенности этанола недопредставлена. Для решения этой проблемы, мы разработали Flypub запрос, который позволяет измерения эскалации увеличение раскованных ухаживания деятельности при повторяющихся воздействия этанола в Drosophila melanogaster. Здесь мы сообщаем о поэтапном анализе Flypub, включая сборку камер воздействия этанола, установку станции анализа, критерии ухода и сбора лет, доставку этанола, количественную оценку раскованных ухаживаний, обработку данных и статистический анализ. Также предусмотрено, как устранить критические шаги, преодолеть ограничения и расширить свою полезность для оценки дополнительных поведения, вызванного этанолом. Анализ Flypub в сочетании с мощными генетическими инструментами в Drosophila melanogaster облегчит задачу открытия механизма, лежащего в основе этанола индуцированной поведенческой сенсибилизации.
Introduction
Алкоголь является одним из наиболее легко доступных и широко потребляемых наркотиков в мире. Он имеет высокий потенциал для неправильного использования и наркомании; однако механизм, лежащий в основе этого процесса, остается неполно изученным. Этанол вызывает расторможенности, эйфории, когнитивных нарушений, гиперактивности, потери двигательного контроля и седативные у червей1, плодовых мушек1,2,3, мышей4, крыс5 и людей6, с указанием общих нейробиологических компонентов, опосредующих эффекты этанола от беспозвоночных для млекопитающих, включая людей. Хроническое потребление этанола вызывает нейроадаптации и поведенческие изменения, которые лежат в основе AUD. Одной из адаптаций является поведенческая сенсибилизация определяется как дополненная реакция с повторным опытом этанола7,8,,9 или других вызывающих привыкание веществ10,,11,12.
На протяжении десятилетий, исследования по этанолу индуцированной поведенческой сенсибилизации (EIBS) были сосредоточены на локомотивно-стимулирующий эффект, который используется в качестве прокси для эйфории ответ7,8,9,13. Например, крысы или мыши при повторном (каждые 24, 48 или 72 ч) введение этанола отображают увеличенную активность локомотиводвигателя, измеряемую скоростью ходьбы8,,14,,15,,16,,17,18,,19,,20,21. Аналогичным образом, плодовые мушки подвергаются второму воздействию этанола пара 4 ч после первого воздействия экспонат расширенной реакции локомотива, как измеряется скорость ходьбы, а22. Хотя нет никакой информации о механизме, лежащем в основе ЕИБС для локомотивно-стимулирующего эффекта у плодовых мушек, исследования на крысах и мышах обнаружили молекулярные и сигнальные компоненты (например, дофамин, глутамат и ГАМК систем), а также нервные субстраты и цепи (например, вентральная тегментальная область, ядро accumbens, миндалина и префронтальной коры), которые играют важную роль для EIBS6,9,23.
Расторможенности является основным эффектом этанола и приводит к проявлению поведения, которые, как правило, ограничены. Расгибающий эффект оказывается на двигательные, эмоциональные, социальные, сексуальные и когнитивные функции, что может привести к ненадлежащему сексуальному поведению, словесной или физической агрессии и импульсивным действиям у людей и животных24,,25,26,27,28,29. Этанол индуцированной дистормоции была исследована в животных моделях для механистических исследований, и они включают в себя импульсивность двигателя и агрессии у грызунов и обезьян, а также кормления расторможенности у червей6,9,24,28,29,30. Мы показали, что плодовые мушки показывают раскованное сексуальное поведение под воздействием этанола31. В частности, дикие самцы мух редко ухаживают за другими самцами без этанола31, а когда это делают, ухаживания за самцами активно отвергают ухаживания за самцами. Под влиянием этанола, однако, самцы мух показывают больше ухаживания по отношению к другим мужчинам и ухаживания мету проявляют меньше отторжения, в результате чего общее расширение межмужских ухаживаний. Примечательно, что мухи развивают поведенческую сенсибилизацию эффекта расторможенности при повторном воздействии этанола, который служит уникальной системой для изучения EIBS31,32.
В этом докладе, мы описываем, как настроить, выполнить, устранить неполадки и анализировать анализ Flypub и данные для изучения этанола индуцированной дисторбинции и сенсибилизации в плодовой мухи Drosophila меланогастер. Чтобы обеспечить его полезность и эффективность, мы протестировали дикий тип Canton-S (CS;контроль штамма мух) вместе с мухами, не достающих тирамин и гидроксилазу (тХ), который синтезирует осьтопамин (ОА). ОА является основным нейромодулятором у беспозвоночных33,34 и играет ключевую роль в развитии толерантности к этанолу у мух22. Мы впервые сообщаем здесь, что ОА имеет важное значение для ЕИБС.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: В разделе протокола подробно описаны подготовительные, Flypub анализ и анализ шагов, которые включают (1) сборку камеры, (2) уход за мухой и сбор, (3) установка станции анализа, (4) воздействие этанола, (5) оценка ухаживаний и анализ данных, и (6) статистический анализ. Ключевые шаги для проведения анализа и анализа Flypub изображены в рабочем процессе(рисунок 1).
1. Собрание палаты(рисунок 2)
- Отрежьте нижнюю часть круглой бутылки Drosophila на отметке 25 мл с помощью лезвия бритвы.
- Сделайте отверстие диаметром 5 мм на отметке 50 мл бутылки с помощью горячего паяльника.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это точка доступа, где мухи будут переданы в камеру. - Разрежьте сеточный лист в круг, диаметром 54 мм, чтобы поместиться в бутылку Drosophila на отметке 75 мл.
- Защищайте сетку на отметке 75 мл бутылки с помощью горячего клея.
- Разрежьте поликарбонатный пластиковый лист на круг диаметром 70 мм.
- Прикрепите поликарбонатный пластиковый лист к бутылке на отметке 25 мл (нижняя открытая область, сделанная в шаге 1.1) с помощью горячего клея.
- Давление вниз с помощью весов, чтобы гарантировать, что поликарбонат раунд прочно прикреплен к нижней.
- Вымойте пабы с этанолом, чтобы удалить любые запахи и обильно промыть их несколько раз под работает дистиллированной воды. Встряхните пабы энергично, чтобы удалить избыток воды.
- Сухие пабы, укладывая их горизонтально на бумажные полотенца при комнатной температуре.
2. Fly уход и сбор
- Поддержание мух на стандартной кукурузной муки / агар / сахар / дрожжевой пищевой среды (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/harvardfood.html).
- Соберите один-два дня старый мужчина летит в группу из 33, которые представляют собой одну точку данных, под углекислым газом (CO2) анестезии. Убедитесь в том, чтобы выбрать мух с нетронутыми морфологии и положить их в пищевой флакон, чтобы восстановить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Еще два или три меньше мух и меньше в группе являются допустимыми. Поведение может быть чувствительным к экспериментальным настройкам, таким образом, общее количество мух в пабе, возможно, потребуется скорректировать с помощью линии управления мухой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что пищевой флакон заложен на стороне, чтобы обезболевшие мухи не застревают в пищу. - Держите мух в инкубаторе 25 градусов по Цельсию с относительной влажностью не менее 50% и 12 ч свет / 12 ч темный цикл в течение 2 дней до воздействия этанола.
ПРИМЕЧАНИЕ: CO2 зазор имеет решающее значение для устранения любых CO2индуцированных физиологических или поведенческих эффектов, которые могут изменить этанол индуцированных ответов. - Используйте коды, чтобы слепой летать генотипов или условий лечения для экспериментаторов проведения воздействия этанола и забил ухаживания поведения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слепые тесты помогают устранить экспериментальную предвзятость.
3. Установка станции «Ассай»(рисунок 3A)
- Навяждийте копию стенда с прикрепленной центральной рукой на столешницы в хорошо проветриваемый зал.
ПРИМЕЧАНИЕ: Копия стенда не является обязательным. Достаточно любого постановочного устройства, обеспечивающего платформу уровня. - Зажим двух боковых рук к стенду, с каждой рукой примерно 18 см из центра стенда.
- Поместите флуоресцентный свет на каждую руку стенда и один в середине.
- Прикрепите видеорегистратор к центральной руке, примерно на 38 см над центром основания. Это будет записывать пабы с верхнего вида.
- Обложка основания стенда с белой бумагой, которая помогает визуализировать темного цвета мух для создания контраста.
- В течение дня экспозиции включите флуоресцентные лампы и компьютер, подключенный к видеокамере, которая прикреплена к копировальной стойке(рисунок 3A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность света 2100-2200 люкс обеспечивает хорошее качество записанного поведения для скоринга. Тем не менее, условия освещения окружающего освещения в лаборатории достаточны для наблюдения за деятельностью ухаживаний, вызванных этанолом. - Подготовьте предметы, которые будут использоваться для воздействия этанола, изображенного на рисунке 3B.
- Соберите шесть чистых, собранных пабов для набора экспериментов и пометьте их кодом с 1 по 6.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы разместить рандомизированные коды на летать генотипов или условий лечения.
4. Воздействие этанола(рисунок 3)
- Аккуратно перенесите группу из 33 самцов в камеру Flypub через отверстие на отметке 50 мл с помощью небольшой воронки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму механический стресс для мух, поместите коврик для мыши или любой амортизируя материал под паб во время передачи. - Закройте отверстие лентой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лента используется, чтобы закрыть отверстие, предотвращая мух от побега из паба. - Выровнять пабы на сцене от 1 до 6.
- Акклиматизировать мух в камеру в течение 10 мин (Рисунок 3D).
- Отрегулируйте настройки камеры, включая фокус, зум и яркость, и запишите последние 5 минут акклиматизации для измерения базального уровня ухаживания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы устранить блики, генерируемые светоотражающими из паба, поместите лабораторные салфетки (обычно 4 слоя или толщиной менее 1 мм) в нижней части паба, чтобы отрегулировать угол. - Подготовка ватные палочки для доставки этанола путем разрезания площадку на четыре равных квадранты с чистыми ножницами, а затем обрезать углы, чтобы сделать его вписываться в чашку Петри во время акклиматизации (Рисунок 3C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте голыми руками для обработки ватных тампонов. Используйте щипцы для обработки ватных тампонов, чтобы избежать любой потенциальной передачи запахов. - Добавьте ватный тампон в каждое блюдо Петри.
- Добавьте 1 мл 95% этанола к каждой ватной палочке, убедитесь, что раствор этанола будет равномерно распределен по всей площади площадки.
- Обложка с двухслойными лабораторными салфетками, чтобы избежать быстрого испарения этанола.
- Поместите небольшое блюдо Петри, содержащее пропитанную этанолом ватную палочку и двухслойные лабораторные салфетки через нижнее отверстие паба после акклиматизации.
- Выровняйте пабы на сцене, начните запись и одновременно запустите таймер.
- Запишите пабы, содержащие мух во время воздействия этанола, пока мухи не прекратят ухаживать или двигаться из-за успокоительного.
- Удалите чашку Петри, содержащую этанол из каждого паба с помощью шпателя, когда более 90% мух находятся в седативных.
- Аккуратно передача летит обратно в назначенные флаконы через отверстие на отметке 50 мл в пабе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите воронку поверх пищевых флаконов, чтобы помочь в передаче. Убедитесь в том, чтобы поместить успокоительные мухи на стороне пищевых флаконов, чтобы предотвратить их от застрять в пище. - Очистите пабы с этанолом, чтобы удалить любые запахи и обильно промыть их несколько раз под работает дистиллированной воды. Встряхните пабы энергично, чтобы удалить избыток воды.
- Сухие пабы, укладывая их горизонтально на бумажные полотенца при комнатной температуре.
- Держите мух в инкубаторе 25 градусов по Цельсию с относительной влажностью не менее 50% и 12 ч свет / 12 ч темный цикл.
- Повторите шаги 4.1-4.17 каждые 24 ч в течение шести дней подряд и убедитесь, что провести воздействие этанола в то же время дня, чтобы избежать каких-либо циркадных эффектов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение пищевых флаконов каждые 2 - 3 дня для поддержания здоровых мух.
5. Уход скоринга и анализа данных (Рисунок 4-6)
- Откройте записанные видео с помощью медиаплеера (например, VLC) и увеличить в видео, чтобы четко наблюдать мух, чтобы забить(Рисунок 4A).
- Прикрепите код времени к видео(Рисунок 4B).
- Подсчитайте количество мужчин, участвующих в ухаживания деятельности, включаяследующие,одностороннее расширение крыла, ухаживания цепи, ухаживания круг, брюшной изгиб и монтаж на каждые 10 с временной блок31 ( Рисунок 5 ).
- Введите число мужчин, отображающих ухаживания за каждые 10 s временной блок в листе(рисунок 6A).
- Используйте максимальное количество ухаживаний мужчин в трех последовательных 10 с временных блоков в качестве репрезентативной точки данных(рисунок 6B).
- Рассчитайте среднее значение 10 последовательных точек данных, имеющих наивысшее значение(рисунок 6C),и это представляет собой процент межмужских ухаживаний за пабом(рисунок 6A).
6. Статистический анализ (Дополнительный рисунок 1)
- Открытое программное обеспечение для статистического анализа (например, Minitab 17) и добавление данных о ухаживаниях в листе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Любое программное обеспечение статистического анализа может быть использовано. - Чтобы определить распределение данных (нормальное или ненормальное распределение), перейдите на вкладку Stat, выберите Базовую статистикуи нажмите на опцию Normality Test (Дополнительная цифра 1Ai).
- В Переменный, выберите отдельные столбцы (каждый столбец, представляющий набор данных генотипа или лечения в исследовании), выбрать тест Андерсон-Дарлинг, и нажмите OK (Дополнительный рисунок 1Aii).
ПРИМЕЧАНИЕ: Участок вероятности нормальности покажет вычисленное P-Значение: если P-значение больше чем 0.05, то данные нормально распределены. Если Значение P-значение меньше 0,05, данные не обычно распределены(Дополнительная диаграмма 1Aiii). - Для сравнения нескольких групп, стек столбцы для сравнения, нажав на вкладку данных, выберите стек, а затем столбцы (Дополнительный рисунок 1Bi).
- В окне столбцов стека выберите столбцы данных, которые будут уложены, выберите укладку, выполненную в новом листе, либо в столбце текущего листа со следующей колонкой, предназначенной для обозначения подскрипта (например, идентификация группы данных; Дополнительная рисунок 1Бии-1Biii).
- Нажмите на вкладку Stat, выберите тест ANOVA, выберите общую линейную модель, а затем нажмите Fit General Linear Model (Дополнительная цифра 1Ci).
- В окне общей линейной модели выберите столбцы, которые будут сравниваться в поле Ответы, выберите столбец с подпиской в поле Факторы и нажмите OK, что приводит к результатам статистического анализа(Дополнительная цифра 1Cii-1Ciii).
- Для сравнения двух групп с обычно распределенными данными нажмите на вкладку Stat, выберите Базовую статистикуи выберите2-Образец t-test (Дополнительная цифра 1Di).
- В 2-образец т для среднего окна, выберите Каждый образец находится в своей собственной колонке, из окна выпадения, выберите две группы для сравнения в образце 1 и образца 2 коробки, а затем нажмите OK, что приводит к результатам статистического анализа (Дополнительная цифра 1Dii-1Diii).
- Для сравнения двух групп с ненормально распределенными данными, перейдите на вкладку Stat, выберите Nonparametrics и нажмите Mann-Whitney (Дополнительная диаграмма 1Ei)
- В окне Манн-Уитни, выберите две группы для сравнения в первом образце и втором образце коробки, а затем нажмите OK, что приводит к результатам статистического анализа (Дополнительный рисунок 1Eii-1Eiii).
- Для сравнения трех или более групп ненормально распределенных данных, перейдите на вкладку Stat, выберите Nonparametrics, а затем нажмите на тест Kruskal-Wallis (Дополнительная диаграмма 1Fi).
- В окне Kruskal-Wallis выберите столбцы для сопоставления в поле ответа, выберите столбец с подпиской в поле Фактора и нажмите OK, что приводит к результатам статистического анализа(Дополнительная цифра 1Fii-1Fiii).
Representative Results
В этом разделе показаны результаты репрезентативного эксперимента Flypub. Дрозофилы мужчины редко суд других мужчин35,36. Во время первого воздействия этанола, дикий тип Canton-S (CS) мужчины продемонстрировали небольшое, но незначительное увеличение в раскованный межгольной ухаживания31 (Рисунок 7A). Тем не менее, CS мужчины показали эскалацию увеличения в раскованный ухаживания деятельности в последующих воздействия этанола (ANOVA GLM, CS: R20,83, F(5,66) 65,21, р-эт-л; 0,0001; p n No 12; Рисунок 7A), который указывает на поведенческую сенсибилизацию к эффекту расторможенности этанола. Мы ранее показали, что этот тип EIBS требует допамина и рецептора допамина DopEcR в грибных нейронов31,32.
Чтобы определить, участвуют ли дополнительные нейромодуляторы в EIBS, мы исследовали роль ОА, проверяя мух(тч; nM18 null allele)37,38 не хватает тирамин и гидроксилаза, скорость ограничения фермента в биосинтезе ОА, таким образом, дефицит в ОА. Самцы тх в генетическом фоне CS (добрый подарок от д-ра Андреаса Тума, Лейпцигский университет, Германия) продемонстрировали сенсибилизированную реакцию на раскованное ухаживание при ежедневном воздействии этанола (ANOVA GLM, тзч:R 2No0.67, F(5,66) p n No 12; Рисунок 7B) но на пониженном уровне по сравнению с CS (ANOVAGLM, эффект взаимодействия: F 2.50, стр. 0,034). После специального анализа, тч мужчины выставлены более низкие уровни межмужских ухаживания при каждой экспозиции, что наиболее очевидно в течение четвертого по шестой воздействия этанола по сравнению с CS (Двухобразный t-тест: р злт; 0,002 в EXP4, р-эт-л; 0,004 в EXP5, р-л; 0,021 в EXP6; p n No 12; Рисунок 7С). В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что ОА может играть определенную роль в ЕИБС в эффекте расторможенности этанола. Что еще более важно, эти наборы данных ясно демонстрируют полезность и эффективность анализа Flypub в изучении этанола индуцированной дистормоции и сенсибилизации.
Рисунок 1: Процесс ассеис Ассеса Flypub. Диаграмма рабочего процесса, подчеркивающая ключевые шаги для проведения асссея Flypub. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Камеры материалов и сборки Flypub. ()Материалы, необходимые для создания камеры Flypub включают (i) горячий клей пистолет клей палку, (ii) горячий клей пистолет, (iii) лезвие бритвы, (iv) паяльник железа, (v) правитель, (vi) сетки, (vii) поликарбонат ный пластиковый лист, и ( (viii) круглый дно Drosophila бутылка. (B) Схематическое представление собрания камеры Flypub. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Воздействие этанола. (A) Полностью собранная станция Flypub. (B) Материалы, необходимые для воздействия этанола включают (i) P1000 микропайпет,(ii)лента, (iii) ватная палочка, (iv) Чашка Петри, (v) лабораторные салфетки,(vi)небольшая воронка,(vii) таймер,(viii) среднеразмерная воронка,(ix) коврик для мыши,(x)ножницы,(xi)95% этанол,(xii)силовые и( (C) Шаги о том, как сократить ватные палочки. (D) Вид сверху изображение пабов выровнены на сцене. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Видеоустановка для поведенческого скоринга. Показан шаг за шагом руководство по (A) как увеличить на видео и (B) как вставить файл тайм-код в медиаплеер VLC для поведенческих скоринга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Мужское поведение ухаживания. Представитель изображения иллюстрируют Drosophila мужской ухаживания поведения, включая следующие и одностороннее расширение крыла для (A) ухаживания песни, (B) ухаживания цепи, (C) ухаживания круг (D) брюшной изгиб и (( E) монтаж, которые используются для поведенческих скоринга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Ввод и анализ данных. (A) Количество мужчин, участвующих в ухаживания в каждые 10 с временной блок транскрибируется в листе. Наибольшее число ухаживающих мужчин из трех последовательных 10 временных блоков (зеленая стрелка) используется в качестве репрезентативной точки данных. В среднем 10 последовательных точек данных (синяя или оранжевая кронштейн), имеющих максимальное значение, представляют собой процент межмужских ухаживаний за пабом «оранжевый кронштейн»; MAX (средний), черная стрелка. (B, C) Формулы листа, используемые для расчета максимальной репрезентативной точки данных и максимального среднего показателя в 10 последовательных репрезентативных точек данных на паб. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Этанол индуцированной поведенческой расторможенности и сенсибилизации в CS и тх. (A, B) Самцы CS и t'hпродемонстрировали сенсибилизированную расторможенность ухаживаний с повторными воздействиями этанола (ANOVA GLM, CS: R2,0,83, F(5,66)65,21, стр. h тч: R20,67, F(5,66)27,60, р-н злт; 0,0001; n No 12). (C) ТЗч мужчины показали менее раскованный ухаживания по сравнению с CS (n '12). Значения p пост-специальных анализов показаны выше строки. Межмужские ухаживания деятельность была проанализирована из видео, созданных для каждого воздействия этанола. Все данные сообщаются как средства и стандартная ошибка среднего. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная цифра 1: Статистический анализ. Шаги в программном обеспечении Minitab 17 о том, как выполнитьтестна нормальность , (B) укладка данных, (C) Общая линейная модель ANOVA тест, (D) Два образца t-тест, (E) Манн-Уитни тест и (F) Kruskal-Wallis тест. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
В этом докладе мы описали настройку и подробный протокол ассссы Flypub; новый метод для измерения того, как повторяющиеся воздействия этанола вызывает раскованный ухаживания и поведенческой сенсибилизации. Хотя результаты опроса Flypub относительно просты, несколько этапов требуют заботы и внимания для обеспечения надежных результатов. Во-первых, мухи для тестирования должны быть полностью пигментированы (т.е. полностью развитые взрослые мухи), здоровые и нетронутые. Деформации или повреждения, особенно в их крылья или ноги могут повлиять на способность мужчины к суду. Во-вторых, возраст мух и должен быть сопоставлен между контрольных и экспериментальных групп (оптимальный возраст: 3-5 дней при воздействии этанола 1). Две недели и старше дикого типа мужчин мух, как правило, отображают повышенные уровни раскованный ухаживания31. Таким образом, надлежащее возрастное соответствие мух, наисное, необходимо, чтобы избежать переменных результатов. В-третьих, номер мухи в пабе имеет жизненно важное значение (оптимальный: 33 за паб). Нижние или более высокие номера мух и мух в пабе могут сильно исказить оценки ухаживаний (данные не показаны). В-четвертых, камеры Flypub должны иметь одинаковые объемы, как показано на рисунке 2B. Это гарантирует, что мухи получают пара этанола синхронно и вызываемых поведения являются последовательными. В-пятых, четкая видеозапись и точный подсчет ухаживаний имеют важное значение. Этот протокол в значительной степени зависит от поведенческих наблюдений, поэтому тщательное соблюдение стандартизированного протокола оценки ухаживаний имеет основополагающее значение для минимизации несовместимых результатов. Наконец, настоятельно рекомендуется, чтобы как воздействие этанола и ухаживания скоринга шаги выполняются вслепую, где экспериментатор не знает о летать генотипов или экспериментальных методов лечения, тем самым предотвращая экспериментальные предубеждения.
В ассе Flypub есть несколько преимуществ. Во-первых, несколько групп мух могут быть проверены и сравнены одновременно. Во-вторых, это недорогой, простой в установке и легко учиться, что делает его весьма поддается экспериментаторов на всех уровнях, включая начальную школу, студентов и аспирантов, postdocs и факультета, а также учебные лаборатории с ограниченным пространством и бюджетов. В-третьих, он может быть использован для измерения дополнительных поведений, таких как раскованный ухаживания женщин мух и седативное действие этанола или других седативных средства для оценки первоначальной чувствительности и толерантности развития и поддержания31,32. Вместе, Flypub является универсальным методом для изучения различных особенностей AUD.
Основным ограничением анализ Flypub является строгий и трудоемкий ухаживания скоринга режима. Поведение ухаживания под влиянием этанола является весьма динамичным таким образом, что продолжительность ухаживания колеблется от менее одной секунды до многих минут, и мухи, участвующие в ухаживания довольно часто меняется. Режим скоринга, представленный здесь, был разработан для учета этой динамичной природы и обеспечения последовательных баллов по отдельным воздействиям этанола для данного генотипа31,32. Как отмечается в протоколе, ухаживания деятельности вручную забил, что занимает много времени. Несколько автоматизированных программ скоринга были разработаны для облегчения беспристрастного высокой пропускной стиды поведенческого скрининга и все из которых полагаются на движения отдельных мух и места39,40,41,42,43,44,45. Мы также пытались разработать компьютерное программное обеспечение для автоматического подсчета ухаживания деятельности, но не смог получить последовательные и надежные результаты. Это может быть связано с тем, что поведенческий скоринг включает в себя несколько ухаживания шаги (т.е., после, одностороннее расширение крыла, брюшной изгиб и монтаж)35,36,46 из нескольких мух одновременно. Даже с этим ограничением, экспериментатор с адекватной подготовки должны быть в состоянии количественно этанола индуцированных ухаживания поведения с последовательностью и точностью. Тем не менее, было бы очень важно принять машинное обучение или другие передовые алгоритмы в качестве последующей деятельности.
Как и модели грызунов, исследования на этанол в модели мухи в значительной степени сосредоточены на локомоторно этанола стимулирующих и седативных эффектов. Flypub асссе, однако, меры раскованный ухаживания, тип когнитивной расторможенности, которая является роман31,32. Таким образом, Flypub может помочь выяснить молекулярных игроков, клеточных путей и нейронных цепей, а также факторы риска (например, возраст, сон, диета или социальная среда) критически для поведенческого расторможенности и сенсибилизации. Ранее мы показали, что дофамин сигнализации требуется для EIBS, который в соответствии с выводами в моделях грызунов и человеческих субъектов6,9,31. Кроме того, в качестве доказательства концепции, мы рассмотрели тйх мутант не хватает ОА (беспозвоночных аналог норадреналина) и обнаружили, что ОА также имеет важное значение для поведенческой сенсибилизации в эффект расторможенности этанола, хотя его вклад относительно мал по сравнению с допамина31. Этот вывод в отличие от наблюдения Scholz47, что тч мутант мухней не проявляют никаких очевидных нарушений в сенсибилизации локомоторного эффекта этанола47. Это предполагает различные молекулярные, клеточные и нервные пути, опосредовающие поведенческую сенсибилизацию к расторможенности против локомотивной активации. Последующие исследования должны в дальнейшем сотрудничать с этим дразнящий понятие.
Таким образом, Flypub является недорогим, многогранным и эффективным методом для исследования поведенческих реакций на этанол, в частности, расторможенность и поведенческая сенсибилизация, которые могут помочь продвинуть наше понимание AUD и обеспечить понимание эффективных мероприятий для этого хронического расстройства.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIAAA 1R15AA020996, NIMH R21MH109953, Фонд исследований мозга и поведения NARSAD, и NIMHD 2G12MD007592 NMD Кластер грантов. Мы также признательны финансируемой NIH программе RISE (NIGMS 5R25GM069621) за поддержку NMD и CMS, программе UTEP COURI-SURPASS для поддержки NMD, финансируемой NIH программой MARC (NIGMS 2T34GM008048-31) для поддержки AA, и Dr. Keelung Graduate Hong Fellowship для поддержки ЭБС. Мы высоко ценим отдел коммуникаций UTEP: Дарлин Барахас, Кристиан Ривера, Карина Морено, Хосе Лойя Фернандес и музыкальный отдел: Стивен А. Хаддад за помощь в видео и закадровый продюссер. Наконец, мы очень благодарны доктору Андреасу Тхуму за то, что он поделилсямутантом в Кантоне-С вместе с управляемым мухами Кантона-С; и Джессика Burciaga за ее ценный вклад в первоначальные исследования на осьминога и Хан членов лаборатории для обсуждения и поддержки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 95 % Ethanol | VWR Chemicals | BDH1158-4LP | |
| Canton-S | - | - | wild-type strain used as a control |
| Copy stand with arms | Kaiser | 205411 | model RS 2-XA, with one central arm and two lateral arms; to set up a flypub station |
| Cotton rounds | Swisspers | COT-027 | to deliver ethanol |
| Excel | Microsoft | - | to analyze data; any worksheet or spreadsheet software can be used |
| Fluorescent light bulb | Lights of America | 7108N | maximum (120 V-70 W Max.); to illuminate the flypub station |
| Microsoft LifeCam software | Microsoft | - | version 3.60; to videotape flypubs |
| Microsoft LifeCam Studio | Microsoft | Q2F-00013 | 1080P HD sensor; to videotape flypubs |
| Minitab 17 | Minitab | - | version 17; to conduct statistical analysis; any statistical analysis software can be used |
| Nylon mesh sheet | Sefar Nitex | - | model B0043D1TVY, opaque white, 200 microns mesh; to make a flypub |
| Petri dishes | Falcon | 08-757-100A | 35 x 10 mm; to deliever ethanol |
| Plastic funnel - mid size | Fisher scientific | 10-348A | 65 mm diameter and 67 mm height; to transfer sedated flies from a flypub into a food vial |
| Plastic funnel - small | Fisher scientific | 07-202-121 | 4 mm diameter and 46 mm height; to transfer flies from a vial into a flypub |
| Polycarbonate sheet | Lexan | - | 0.762 mm thickness, clear, 610 x 1220 mm Nominal; to make a flypub |
| Round-bottom bottle | Fisher scientific | AS115 | polypropylene, 103 mm height, 60 mm diameter and 177 ml capacity; to make a flypub |
| Soldering iron | Weller | WES51 | to make a hole in a flypub |
| Time code | - | - | .smi file, a subtitle ticking timecode created in Han lab; to monitor time during courtship scoring; any time subtitles may be used |
| Tyramine β hydroxylase (tβh) | - | - | mutant fly strain (nM18 null allele)deficient in tβh in the wild-type Canton-S background ; obtained from Dr. Andreas Thum (University of Leipzig, Leipzeig, Germany) |
| VLC media player | VideoLAN | - | version 3.0.8; any media player can be used to score courtship |
References
- Scholz, H. Unraveling the Mechanisms of Behaviors Associated With AUDs Using Flies and Worms. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 43 (11), 2274-2284 (2010).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual Review of Neuroscience. 36, 121-138 (2013).
- Park, A., Ghezzi, A., Wijesekera, T. P., Atkinson, N. S. Genetics and genomics of alcohol responses in Drosophila. Neuropharmacology. 122, 22-35 (2017).
- Kippin, T. E. Adaptations underlying the development of excessive alcohol intake in selectively bred mice. Alcoholism: Clinical Experimental Research. 38 (1), 36-39 (2014).
- Bell, R. L., et al. Rat animal models for screening medications to treat alcohol use disorders. Neuropharmacology. 122, 201-243 (2017).
- Nona, C. N., Hendershot, C. S., Le, A. D. Behavioural sensitization to alcohol: Bridging the gap between preclinical research and human models. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 173, 15-26 (2018).
- Robinson, T. E., Berridge, K. C. The neural basis of drug craving: an incentive-sensitization theory of addiction. Brain Research Reviews. 18 (3), 247-291 (1993).
- Masur, J., Boerngen, R. The excitatory component of ethanol in mice: a chronic study. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 13 (6), 777-780 (1980).
- Camarini, R., Pautassi, R. M. Behavioral sensitization to ethanol: Neural basis and factors that influence its acquisition and expression. Brain Research Bulletin. 125, 53-78 (2016).
- Shuster, L., Yu, G., Bates, A. Sensitization to cocaine stimulation in mice. Psychopharmacology (Berl). 52 (2), 185-191 (1977).
- Short, P. H., Shuster, L. Changes in brain norepinephrine associated with sensitization to d-amphetamine. Psychopharmacology (Berl). 48 (1), 59-67 (1976).
- Vanderschuren, L. J., Pierce, R. C. Sensitization processes in drug addiction. Current Topics in Behavioral Neurosciences. 3, 179-195 (2010).
- Kong, E. C., et al. A pair of dopamine neurons target the D1-like dopamine receptor DopR in the central complex to promote ethanol-stimulated locomotion in Drosophila. Plos One. 5 (4), 9954 (2010).
- Broadbent, J., Harless, W. E. Differential effects of GABA(A) and GABA(B) agonists on sensitization to the locomotor stimulant effects of ethanol in DBA/2 J mice. Psychopharmacology (Berl). 141 (2), 197-205 (1999).
- Camarini, R., Andreatini, R., Monteiro, M. G. Prolonged treatment with carbamazepine increases the stimulatory effects of ethanol in mice. Alcohol. 12 (4), 305-308 (1995).
- Camarini, R., Hodge, C. W. Ethanol preexposure increases ethanol self-administration in C57BL/6J and DBA/2J mice. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 79 (4), 623-632 (2004).
- Hoshaw, B. A., Lewis, M. J. Behavioral sensitization to ethanol in rats: evidence from the Sprague-Dawley strain. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 68 (4), 685-690 (2001).
- Kawakami, S. E., Quadros, I. M., Takahashi, S., Suchecki, D. Long maternal separation accelerates behavioural sensitization to ethanol in female, but not in male mice. Behavioural Brain Research. 184 (2), 109-116 (2007).
- Lessov, C. N., Phillips, T. J. Duration of sensitization to the locomotor stimulant effects of ethanol in mice. Psychopharmacology (Berl). 135 (4), 374-382 (1998).
- Melon, L. C., Boehm, S. L. Role of genotype in the development of locomotor sensitization to alcohol in adult and adolescent mice: comparison of the DBA/2J and C57BL/6J inbred mouse strains. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 35 (7), 1351-1360 (2011).
- Pastor, R., Aragon, C. M. The role of opioid receptor subtypes in the development of behavioral sensitization to ethanol. Neuropsychopharmacology. 31 (7), 1489-1499 (2006).
- Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. Functional ethanol tolerance in Drosophila. Neuron. 28 (1), 261-271 (2000).
- Cofresi, R. U., Bartholow, B. D., Piasecki, T. M. Evidence for incentive salience sensitization as a pathway to alcohol use disorder. Neuroscience & Biobehavrioal Reviews. 107, 897-926 (2019).
- Topper, S. M., Aguilar, S. C., Topper, V. Y., Elbel, E., Pierce-Shimomura, J. T. Alcohol disinhibition of behaviors in C. elegans. Plos One. (93), 92965 (2014).
- Stoner, S. A., George, W. H., Peters, L. M., Norris, J. Liquid courage: alcohol fosters risky sexual decision-making in individuals with sexual fears. AIDS and Behavior. 11 (2), 227-237 (2007).
- Marinkovic, K., Halgren, E., Klopp, J., Maltzman, I. Alcohol effects on movement-related potentials: a measure of impulsivity. Journal of Studies on Alcohol and Drugs. 61 (1), 24-31 (2000).
- Prause, N., Staley, C., Finn, P. The effects of acute ethanol consumption on sexual response and sexual risk-taking intent. Archives of Sexual Behavior. 40 (2), 373-384 (2011).
- Miczek, K. A., DeBold, J. F., Hwa, L. S., Newman, E. L., de Almeida, R. M. Alcohol and violence: neuropeptidergic modulation of monoamine systems. Annals of the New York Academy of Sciences. 1349, 96-118 (2015).
- Heinz, A. J., Beck, A., Meyer-Lindenberg, A., Sterzer, P., Heinz, A. Cognitive and neurobiological mechanisms of alcohol-related aggression. Nature Reviews Neuroscience. 12 (7), 400-413 (2011).
- Schwandt, M. L., Higley, J. D., Suomi, S. J., Heilig, M., Barr, C. S. Rapid tolerance and locomotor sensitization in ethanol-naive adolescent rhesus macaques. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 32 (7), 1217-1228 (2008).
- Lee, H. G., Kim, Y. C., Dunning, J. S., Han, K. A. Recurring ethanol exposure induces disinhibited courtship in Drosophila. Plos One. 3 (1), 1391 (2008).
- Aranda, G. P., Hinojos, S. J., Sabandal, P. R., Evans, P. D., Han, K. A. Behavioral Sensitization to the Disinhibition Effect of Ethanol Requires the Dopamine/Ecdysone Receptor in Drosophila. Frontiers in Systems Neuroscience. 11, 56 (2017).
- Roeder, T. Octopamine in invertebrates. Progress in Neurobiology. 59 (5), 533-561 (1999).
- Gallo, V. P., Accordi, F., Chimenti, C., Civinini, A., Crivellato, E. Catecholaminergic System of Invertebrates: Comparative and Evolutionary Aspects in Comparison With the Octopaminergic System. International Review of Cell Molecular Biology. 322, 363-394 (2016).
- Curcillo, P. G., Tompkins, L. The ontogeny of sex appeal in Drosophila melanogaster males. Behavior Genetics. 17 (1), 81-86 (1987).
- Spieth, H. T. Courtship behavior in Drosophila. Annual Review of Entomology. 19, 385-405 (1974).
- Monastirioti, M., Linn, C. E., White, K. Characterization of Drosophila tyramine beta-hydroxylase gene and isolation of mutant flies lacking octopamine. Journal of Neuroscience. 16 (12), 3900-3911 (1996).
- Certel, S. J., Savella, M. G., Schlegel, D. C., Kravitz, E. A. Modulation of Drosophila male behavioral choice. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 104 (11), 4706-4711 (2007).
- Kido, A., Ito, K. Mushroom bodies are not required for courtship behavior by normal and sexually mosaic Drosophila. Journal of Neurobiology. 52 (4), 302-311 (2002).
- Winbush, A., et al. Identification of gene expression changes associated with long-term memory of courtship rejection in Drosophila males. G3: Genes, Genomes, Genetics (Bethesda). 2 (11), 1437-1445 (2012).
- Keleman, K., Kruttner, S., Alenius, M., Dickson, B. J. Function of the Drosophila CPEB protein Orb2 in long-term courtship memory. Nature Neuroscience. 10 (12), 1587-1593 (2007).
- Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nature Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Reza, M. A., et al. Automated analysis of courtship suppression learning and memory in Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 7 (2), 105-111 (2013).
- Schneider, J., Levine, J. D. Automated identification of social interaction criteria in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 10 (10), 20140749 (2014).
- Greenspan, R. J., Ferveur, J. F. Courtship in Drosophila. Annual Reviews of Genetics. 34, 205-232 (2000).
- Scholz, H. Influence of the biogenic amine tyramine on ethanol-induced behaviors in Drosophila. Journal of Neurobiology. 63 (3), 199-214 (2005).
