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Behavior

Flypub zur Untersuchung von Ethanol induzierte Verhaltenshemmung und Sensibilisierung

Published: May 18, 2020 doi: 10.3791/61123
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Texas at El Paso
* These authors contributed equally

Summary

Der Flypub-Assay misst das Verhalten, das die Fruchtfliege Drosophila melanogaster unter dem Einfluss von Ethanol zeigt. Der Assay kann leicht von Experimentatoren auf allen Ebenen gemeistert und auf verschiedene verdampfte Reize angewendet werden, was Substanzmissbrauch und Suchtstudien erleichtert.

Abstract

Alkoholkonsumstörung (AUD) bleibt ein ernstes Problem in unserer Gesellschaft. Um wirksame Maßnahmen gegen suchtwirksam zu entwickeln, ist es wichtig, die zugrunde liegenden neurobiologischen Mechanismen zu verstehen, für die verschiedene experimentelle Ansätze und Modellsysteme erforderlich sind. Der Hauptbestandteil alkoholischer Getränke ist Ethanol, das adaptive Veränderungen im zentralen Nervensystem und Verhalten bei chronischer Einnahme verursacht. Insbesondere die Verhaltenssensibilisierung (d.h. eskalierte Reaktionen) stellt eine zentrale adaptive Veränderung dar, die der Sucht zugrunde liegt. Die meisten Ethanol-induzierten Verhaltenssensibilisierungsstudien in Tiermodellen wurden über die lokomotorische aktivierungswirkung von Ethanol durchgeführt. Eine prominente Wirkung von Ethanol ist die Verhaltenshemmung. Die Verhaltenssensibilisierung für die hemmungslose Wirkung von Ethanol ist jedoch unterrepräsentiert. Um dieses Problem anzugehen, haben wir den Flypub-Assay entwickelt, der es ermöglicht, den eskalierten Anstieg der hemmungslosen Balzaktivitäten bei wiederkehrender Ethanol-Exposition bei Drosophila melanogasterzu messen. Hier berichten wir über den schrittweisen Flypub-Assay inklusive Montage von Ethanol-Expositionskammern, Einrichtung der Assay-Station, Kriterien für Fliegenpflege und -abholung, Ethanollieferung, Quantifizierung von hemmungslosen Balzaktivitäten, Datenverarbeitung und statistische Auswertung. Außerdem werden bereitgestellt, wie Sie kritische Schritte beheben, Einschränkungen überwinden und ihren Nutzen erweitern können, um zusätzliche Ethanol-induzierte Verhaltensweisen zu bewerten. Der Flypub-Assay in Kombination mit leistungsstarken genetischen Werkzeugen in Drosophila melanogaster wird die Aufgabe erleichtern, den Mechanismus zu entdecken, der ethanolinduzierter Verhaltenssensibilisierung zugrunde liegt.

Introduction

Alkohol ist eines der am leichtesten erhältlichen und am häufigsten konsumierten Drogen der Welt. Es hat ein hohes Potenzial für Missbrauch und Sucht; der diesem Prozess zugrunde liegende Mechanismus bleibt jedoch unvollständig verstanden. Ethanol induziert Hemmung, Euphorie, kognitive Beeinträchtigung, Hyperaktivität, Verlust der motorischen Kontrolle und Sedierung bei Würmern1, Fruchtfliegen1,2,3, Mäuse4, Ratten5 und Menschen6, was auf häufige neurobiologische Komponenten, die Ethanol Auswirkungen von wirbellosen Tieren auf Säugetiere einschließlich Menschen vermitteln. Chronische Ethanolaufnahme verursacht neuronale Anpassungen und Verhaltensänderungen, die AUD zugrunde liegen. Eine der Anpassungen ist die Verhaltenssensibilisierung definiert als die erweiterte Reaktion mit wiederholten Erfahrungen von Ethanol7,8,9 oder anderen Suchtmitteln10,11,12.

Im Laufe der Jahrzehnte konzentrierten sich die Studien zur Ethanol-induzierten Verhaltenssensibilisierung (EIBS) auf die motorisch stimulierende Wirkung, die als Proxy für eine euphorischeReaktion7,8,9,13verwendet wird. Zum Beispiel zeigen Ratten oder Mäuse bei wiederholter (alle 24, 48 oder 72 h) Ethanol-Verabreichung die erhöhte Bewegungsaktivität, gemessen mit Gehgeschwindigkeit8,,14,,15,16,,17,,18,,19,,20,21. In ähnlicher Weise weisen die Fruchtfliegen, die der zweiten Exposition gegenüber Ethanoldampf 4 h nach der ersten Exposition ausgesetzt sind, die verbesserte Reaktion des Bewegungsapparates auf22. Während keine Informationen über den Mechanismus vorliegen, der der EIBS der motorisierenden Wirkung bei Fruchtfliegen zugrunde liegt, haben die Studien an Ratten und Mäusen die molekularen und signalisierenden Komponenten (z. B. Dopamin-, Glutamat- und GABA-Systeme) sowie neuronale Substrate und Schaltkreise (z. B. ventrale Tegmental-Bereich, Nucleus accumbens, Amygdala und präfrontale Kortex) aufgedeckt, die eine wichtige Rolle für EIBS6,,,23spielen.9

Hemmung ist eine wichtige Wirkung von Ethanol und führt zur Manifestation von Verhaltensweisen, die in der Regel eingeschränkt sind. Die hemmende Wirkung wird auf motorische, emotionale, soziale, sexuelle und kognitive Funktionen ausgeübt, die zu unangemessenem Sexualverhalten, verbaler oder körperlicher Aggression und impulsiven Handlungen bei Menschen und Tiermodellen24,25,26,27,28,29führen können. Ethanol-induzierte Hemmung wurde in Tiermodellen für mechanistische Studien untersucht und sie umfassen motorische Impulsivität und Aggression bei Nagetieren und Affen sowie Die Forenseisierung hemmungslos in Würmern6,9,24,28,29,30. Wir haben gezeigt, dass Fruchtfliegen hemmungsloses Sexualverhalten unter dem Einfluss von Ethanol31zeigen. Insbesondere, Wildtyp Männchen Fliegen selten Gericht andere Männchen ohne Ethanol31 und wenn sie es tun, Höfliche aktiv ablehnen höflichMännchen. Unter dem Einfluss von Ethanol zeigen männliche Fliegen jedoch mehr Höflichkeit gegenüber anderen Männchen und Höflichkeiten zeigen weniger Ablehnung, was zu einer insgesamt verbesserten intermalen Balz führt. Insbesondere entwickeln Fliegen eine Verhaltenssensibilisierung für die Hemmungswirkung bei wiederkehrender Ethanol-Exposition, die als einzigartiges System zur Untersuchung von EIBS31,32dient.

In diesem Bericht beschreiben wir, wie man den Flypub-Assay und die Daten einrichtet, durchführt, behebt und analysiert, um ethanolinduzierte Hemmung und Sensibilisierung in der Fruchtfliege Drosophila melanogasterzu untersuchen. Um seine Nützlichkeit und Wirksamkeit zu gewährleisten, testeten wir den Wildtyp Canton-S (CS; Kontrollfliegenstamm) zusammen mit den Fliegen mit einem Mangel an Tyramin-Hydroxylase (t'h), die Oktopamin (OA) synthetisiert. OA ist ein wichtiger Neuromodulator bei wirbellosen Tieren33,34 und spielt eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung von Ethanoltoleranz bei Fliegen22. Wir berichten hier zum ersten Mal, dass OA für die EIBS wichtig ist.

Protocol

HINWEIS: Der Protokollabschnitt beschreibt die vorbereitenden, Flypub-Assay- und Analyseschritte, die (1) die Montage der Kammer, (2) Die Flugpflege und -sammlung, (3) den Aufbau einer Assaystation, (4) die Ethanol-Exposition, (5) die Bewertung und Datenanalyse der Balz und die Datenanalyse sowie (6) statistische Analysen umfassen. Die wichtigsten Schritte für die Durchführung des Flypub-Assays und der Analyse werden in einem Workflow dargestellt (Abbildung 1).

1. Montage der Kammer (Abbildung 2)

  1. Schneiden Sie den unteren Teil der runden Drosophila-Flasche an der 25 ml-Marke mit einer Rasierklinge ab.
  2. Machen Sie ein Loch mit einem Durchmesser von 5 mm l an der 50 ml-Marke der Flasche mit einem heißen Lötkolben.
    HINWEIS: Dies ist der Zugangspunkt, an dem die Fliegen in die Kammer übertragen werden.
  3. Schneiden Sie ein Netzblech in einen Kreis mit einem Durchmesser von 54 mm, um in die Drosophila-Flasche bei der 75-ml-Marke zu passen.
  4. Sichern Sie das Netz an der 75 ml-Marke der Flasche mit Heißkleber.
  5. Schneiden Sie die Polycarbonat-Kunststofffolie in einen Kreis mit einem Durchmesser von 70 mm.
  6. Befestigen Sie die Polycarbonat-Kunststofffolie mit Heißkleber an der Flasche an der 25 ml-Marke (untere offene Fläche in Schritt 1.1).
  7. Druck nach unten mit Gewichten, um sicherzustellen, dass die Polycarbonat-Runde fest am Boden befestigt ist.
  8. Waschen Sie die Kneipen mit Ethanol, um gerüche zu entfernen und spülen Sie sie mehrmals unter fließendem destilliertem Wasser. Schütteln Sie die Kneipen kräftig, um überschüssiges Wasser zu entfernen.
  9. Trocknen Sie die Kneipen, indem Sie sie horizontal auf Papiertücher bei Raumtemperatur legen.

2. Fliegenpflege und Abholung

  1. Halten Sie die Fliegen auf einem Standard-Maismehl/Agar/Zucker/Hefe-Lebensmittelmedium (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/harvardfood.html).
  2. Sammeln Sie ein- bis zwei Tage alte männliche Fliegen in eine Gruppe von 33, die einen Datenpunkt darstellen, unter Kohlendioxid(CO2) Anästhesie. Achten Sie darauf, die Fliegen mit intakter Morphologie auszuwählen und sie in eine Lebensmittelflasche zu legen, um sich zu erholen.
    HINWEIS: Zwei mehr oder drei weniger Fliegen pro Gruppe sind erträglich. Verhaltensweisen können empfindlich auf experimentelle Einstellungen reagieren, so dass eine Gesamtflugnummer pro Pub möglicherweise mit einer Steuerfliegenlinie angepasst werden muss.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Lebensmittelflasche auf der Seite gelegt ist, damit die anästhesierten Fliegen nicht an der Nahrung hängen bleiben.
  3. Halten Sie die Fliegen im 25 °C Inkubator mit mindestens 50% relativer Luftfeuchtigkeit und einem 12 h hellen / 12 h dunklen Zyklus für 2 Tage vor der Ethanol-Exposition.
    HINWEIS: DieCO2-Clearance ist entscheidend, umCO2-induziertephysiologische oder Verhaltenseffekte zu beseitigen, die Ethanol-induzierte Reaktionen verändern können.
  4. Verwenden Sie Codes, um Blindfliegengenotypen oder Behandlungsbedingungen für die Experimentatoren zu verwenden, die Ethanol-Exposition durchführen und Balzverhalten erzielen.
    HINWEIS: Blindtests helfen, experimentelle Verzerrungen zu beseitigen.

3. Assay-Station eingerichtet (Abbildung 3A)

  1. Richten Sie einen Kopierständer mit einem befestigten Mittelarm auf einer Tischplatte in einem gut belüfteten Raum ein.
    HINWEIS: Der Kopierständer ist nicht obligatorisch. Jedes Staginggerät, das eine Ebeneplattform bereitstellt, ist ausreichend.
  2. Klemmen Sie die beiden seitlichen Arme an den Ständer, wobei jeder Arm ca. 18 cm von der Mitte des Ständers entfernt ist.
  3. Platzieren Sie ein fluoreszierendes Licht auf jedem Arm des Ständers und eines in der Mitte.
  4. Befestigen Sie den Videorecorder am Mittelarm, ca. 38 cm über der Mitte der Basis. Dadurch werden die Pubs von einer Top-Ansicht aus aufzeichnen.
  5. Bedecken Sie die Basis des Ständers mit weißem Papier, das hilft, dunkle Fliegen zu visualisieren, um Kontrast zu erzeugen.
  6. Schalten Sie während des Belichtungstages die Leuchtstofflampen und den Computer ein, der mit der Videokamera verbunden ist, die an den Kopierständer angeschlossen ist (Abbildung 3A).
    HINWEIS: Die Lichtintensität 2100-2200 Lux bietet eine gute Qualität der aufgezeichneten Verhaltensweisen für die Bewertung. Die Umgebungsbeleuchtung im Labor reicht jedoch aus, um ethanolinduzierte Balzaktivitäten zu beobachten.
  7. Bereiten Sie die Artikel vor, die für die Ethanolexposition verwendet werden sollen, wie in Abbildung 3Bdargestellt.
  8. Sammeln Sie sechs saubere, zusammengebaute Pubs für eine Reihe von Experimenten und beschriften Sie sie mit dem Code 1 bis 6.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie die randomisierten Codes auf Fliegengenotypen oder Behandlungsbedingungen platzieren.

4. Ethanol-Exposition (Abbildung 3)

  1. Übertragen Sie eine Gruppe von 33 Männchen vorsichtig mit einem kleinen Trichter durch das Loch bei der 50-ml-Marke in eine Flypub-Kammer.
    HINWEIS: Um die mechanische Beanspruchung der Fliegen zu minimieren, legen Sie während des Transfers ein Mauspad oder ein beliebiges Dämpfungsmaterial unter die Kneipe.
  2. Bedecken Sie das Loch mit einem Klebeband.
    HINWEIS: Das Band wird verwendet, um das Loch zu schließen, wodurch verhindert wird, dass Fliegen aus der Kneipe entkommen.
  3. Richten Sie die Kneipen auf der Bühne von 1 bis 6 aus.
  4. Akklimatisieren Sie die Fliegen in die Kammer für 10 min (Abbildung 3D).
  5. Passen Sie die Kameraeinstellungen einschließlich Fokus, Zoom und Helligkeit an, und zeichnen Sie die letzten 5 min akklimatisieren, um eine basale Balzstufe zu messen.
    HINWEIS: Um Blendung durch Lichtreflexion aus einer Kneipe zu vermeiden, legen Sie Labortücher (in der Regel 4 Schichten oder weniger als 1 mm Dicke) an der Unterseite der Kneipe, um den Winkel einzustellen.
  6. Bereiten Sie Baumwollpads für die Ethanol-Lieferung vor, indem Sie ein Pad mit einer sauberen Schere in vier gleiche Quadranten schneiden und dann die Ecken trimmen, damit es während der Akklimatisierung in eine Petrischale passt (Abbildung 3C).
    HINWEIS: Verwenden Sie keine bloßen Hände, um die Wattepads zu handhaben. Verwenden Sie Zangen, um die Wattepads zu behandeln, um eine mögliche Übertragung von Gerüchen zu vermeiden.
  7. Fügen Sie jedem Petri-Gericht ein Wattepad hinzu.
  8. Fügen Sie 1 ml 95% Ethanol zu jedem Wattepad hinzu, stellen Sie sicher, dass die Ethanollösung gleichmäßig auf die gesamte Fläche des Pads verteilt wird.
  9. Abdeckung mit zweilagigen Labortüchern, um eine schnelle Ethanolverdunstung zu vermeiden.
  10. Legen Sie die kleine Petrischale mit dem ethanolgetränkten Wattepad und das doppellagige Labor wischt sich nach der Akklimatisierung durch die untere Öffnung der Kneipe.
  11. Richten Sie die Pubs auf der Bühne aus, beginnen Sie mit der Aufnahme und starten Sie gleichzeitig einen Timer.
  12. Zeichnen Sie die Pubs auf, die Fliegen während der Ethanol-Exposition enthalten, bis die Fliegen aufhören zu hofieren oder sich aufgrund von Sedierung zu bewegen.
  13. Entfernen Sie die Petrischale, die Ethanol enthält, aus jeder Kneipe mit einem Spachtel, wenn über 90% der Fliegen sediert sind.
  14. Übertragen Sie sanft Fliegt zurück zu ihren zugewiesenen Fläschchen durch das Loch an der 50-ml-Marke in der Kneipe.
    HINWEIS: Legen Sie einen Trichter auf Lebensmittelfläschchen, um bei der Übertragung zu helfen. Achten Sie darauf, sedierte Fliegen auf der Seite der Lebensmittelfläschchen zu platzieren, um zu verhindern, dass sie in der Nahrung stecken bleiben.
  15. Reinigen Sie die Kneipen mit Ethanol, um Gerüche zu entfernen und spülen Sie sie mehrmals unter fließendem destilliertem Wasser. Schütteln Sie die Kneipen kräftig, um überschüssiges Wasser zu entfernen.
  16. Trocknen Sie die Kneipen, indem Sie sie horizontal auf Papiertücher bei Raumtemperatur legen.
  17. Halten Sie die Fliegen im 25 °C Inkubator mit mindestens 50% relativer Luftfeuchtigkeit und einem 12 h Hellen / 12 h dunklen Zyklus.
  18. Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.17 alle 24 h für sechs aufeinanderfolgende Tage und stellen Sie sicher, dass die Ethanol-Exposition zur gleichen Zeit des Tages durchgeführt wird, um zirkadiane Effekte zu vermeiden.
    HINWEIS: Wechseln Sie Lebensmittelfläschchen alle 2 – 3 Tage, um gesunde Fliegen zu erhalten.

5. Courtship-Scoring und Datenanalyse(Abbildung 4-6)

  1. Öffnen Sie die aufgenommenen Videos mit einem Media Player (z. B. VLC) und zoomen Sie das Video, um Fliegen deutlich zu beobachten, um zu punkten (Abbildung 4A).
  2. Fügen Sie den Zeitcode an das Video an (Abbildung 4B).
  3. Zählen Sie die Anzahl der Männer, die in der Balz Aktivitäten einschließlich der folgenden, einseitige Flügelverlängerung, Balzkette, Balz kreis, Bauchbiegen und Montage für jeden 10 s Zeitblock31 (Abbildung 5) beschäftigt.
  4. Geben Sie die Anzahl der Männchen, die die Balz für jeden 10 s Zeitblock anzeigen, in ein Arbeitsblatt ein (Abbildung 6A).
  5. Verwenden Sie die maximale Anzahl der höflichen Männchen in den drei aufeinanderfolgenden 10 s Zeitblöcken als repräsentativen Datenpunkt (Abbildung 6B).
  6. Berechnen Sie den Durchschnitt von 10 aufeinanderfolgenden Datenpunkten mit dem höchsten Wert (Abbildung 6C) und dies stellt den Prozentsatz der intermalen Balz pro Kneipe dar (Abbildung 6A).

6. Statistische Analyse (ergänzende Abbildung 1)

  1. Öffnen Sie eine Software für die statistische Analyse (z. B. Minitab 17) und fügen Sie dem Arbeitsblatt Platzdaten hinzu.
    HINWEIS: Jede statistische Analysesoftware kann verwendet werden.
  2. Um die Verteilung der Daten (normal oder nicht normal) zu bestimmen, gehen Sie auf die Registerkarte Stat, wählen Sie Basisstatistikaus, und klicken Sie auf die Option Normalitätstest (Ergänzende Abbildung 1Ai).
  3. Wählen Sie unter Variableeinzelne Spalten aus (jede Spalte, die einen Datensatz eines Genotyps oder einer untersuchten Behandlung darstellt), wählen Sie den Anderson-Darling-Test aus, und klicken Sie auf OK (Ergänzende Abbildung 1Aii).
    HINWEIS: Das Normalitätswahrscheinlichkeitsdiagramm zeigt den berechneten P-Wert an: Wenn der P-Wert größer als 0,05 ist, werden die Daten normal verteilt. Wenn der P-Wert kleiner als 0,05 ist, sind die Daten nicht normal verteilt (Zusatzabbildung 1Aiii).
  4. Um mehrere Gruppen zu vergleichen, stapeln Sie die zu vergleichenden Spalten, indem Sie auf die Registerkarte Daten klicken, stapelnund dann Spalten (Ergänzende Abbildung 1Bi) auswählen.
  5. Wählen Sie im Fenster Stapelspalten die zu stapelnden Datenspalten aus, wählen Sie die Stapelung aus, die entweder im neuen Arbeitsblatt oder in der Spalte des aktuellen Arbeitsblatts durchgeführt wird, wobei die nächste Spalte für die Bezeichnung "Subskript" (z. B. Datengruppenidentität; Ergänzende Abbildung 1Bii-1Biii).
  6. Klicken Sie auf die Registerkarte Stat, wählen Sie den ANOVA-Test aus, wählen Sie das allgemeine lineare Modell aus, und klicken Sie dann auf das allgemeine lineare Modell anpassen (Ergänzende Abbildung 1Ci).
  7. Wählen Sie im Fenster Allgemeines lineares Modell die zu vergleichenden Spalten im Feld Antworten aus, wählen Sie die Spalte mit Subskript im Feld Faktoren aus, und klicken Sie auf OK, was zu den statistischen Analyseergebnissen führt (Ergänzende Abbildung 1Cii-1Ciii).
  8. Um zwei Gruppen mit normal verteilten Daten zu vergleichen, klicken Sie auf die Registerkarte Stat, wählen Sie die Basisstatistikaus, und wählen Sie den 2-Sample t-test (Ergänzende Abbildung 1Di).
  9. Wählen Sie im Fenster 2-Sample t für das Fenster Mittelwert aus,wählen Sie Jede Stichprobe in einer eigenen Spalte aus, wählen Sie aus einem Dropdown-Feld die beiden Zuvergleichsgruppen in den Feldern Beispiel 1 und Beispiel 2 aus, und klicken Sie dann auf OK, was zu den statistischen Analyseergebnissen führt (Supplemental Figure 1Dii-1Diii).
  10. Zum Vergleich zweier Gruppen mit nicht normal verteilten Daten gehen Sie auf die Registerkarte Stat, wählen Sie Nonparametrics und klicken Sie auf Mann-Whitney (Ergänzende Abbildung 1Ei)
  11. Wählen Sie im Mann-Whitney-Fenster die beiden Zuvergleichsgruppen in den Feldern Erste Stichprobe und Zweite Stichprobe aus, und klicken Sie dann auf OK, was zu den statistischen Analyseergebnissen führt (Ergänzende Abbildung 1Eii-1Eiii).
  12. Zum Vergleich von drei oder mehr Gruppen nicht normal verteilter Daten gehen Sie auf die Registerkarte Stat, wählen Sie Nonparametricsaus, und klicken Sie dann auf den Kruskal-Wallis-Test (Ergänzende Abbildung 1Fi).
  13. Wählen Sie im Kruskal-Wallis-Fenster die zu vergleichenden Spalten im Feld Antwort aus, wählen Sie die Spalte mit Subskript im Feld Faktor aus und klicken Sie auf OK, was zu den statistischen Analyseergebnissen führt (Zusatzabbildung 1Fii-1Fiii).

Representative Results

Dieser Abschnitt zeigt die Ergebnisse eines repräsentativen Flypub-Experiments. Drosophila Männchen hofiert selten andere Männchen35,36. Während der ersten Ethanol-Exposition wiesen die Wilden vom Typ Canton-S (CS) einen kleinen, aber unbedeutenden Anstieg der hemmungslosen intermännlichen Balz31 (Abbildung 7A) auf. CS-Männchen zeigten jedoch den eskalierten Anstieg der hemmungslosen Balzaktivität bei nachfolgenden Ethanol-Expositionen (ANOVA GLM, CS: R2=0,83, F(5,66) =65,21, p < 0,0001; n = 12; Abbildung 7A), die auf eine Verhaltenssensibilisierung für die Hemmungswirkung von Ethanol hinweist. Wir haben bereits gezeigt, dass diese Art von EIBS Dopamin und den Dopaminrezeptor DopEcR in den Pilzneuronen31,32erfordert.

Um festzustellen, ob zusätzliche Neuromodulatoren an EIBS beteiligt sind, untersuchten wir die Rolle von OA, indem wir die Fliegen (th; nM18 Nullallele)37,38 ohne Tyramin-Hydroxylase, das ratenbegrenzende Enzym in der OA-Biosynthese, untersuchten, wodurch oA mangelhaft ist. Die tt-h-Männchen im CS-Genhintergrund (ein freundliches Geschenk von Dr. Andreas Thum, Universität Leipzig, Deutschland) zeigten die sensibilisierte hemmungslose Balzreaktion bei täglichen Ethanol-Expositionen (ANOVA GLM, t'h: R2=0,67, F(5,66) =27,60, p < 0,0001;h n = 12; Abbildung 7B) aber auf der reduzierten Ebene im Vergleich zu CS (ANOVA GLM, Wechselwirkungseffekt: F =2,50, p <0,034). Bei der Post-hoc-Analyse wiesen die Männer bei jeder Exposition niedrigere Niveaus der intermalen Balz auf, die bei der vierten bis sechsten Ethanol-Exposition im Vergleich zu CS am deutlichsten zu erkennen war (Zwei-Probe-t-Test: p < 0,002 in EXP4, p < 0,004 in EXP5, p < 0,021 in EXP6; th n = 12; Abbildung 7C). Zusammen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass OA bei der HEmmungswirkung von Ethanol eine Rolle bei der EIBS spielen könnte. Noch wichtiger ist, dass diese Datensätze deutlich den Nutzen und die Wirksamkeit des Flypub-Assays bei der Untersuchung von Ethanol-induzierter Hemmung und Sensibilisierung zeigen.

Figure 1
Abbildung 1: Flypub-Assay-Workflow. Ein Workflowdiagramm, in dem die wichtigsten Schritte für die Durchführung des Flypub-Assays hervorgehoben werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Flypub Kammermaterialien und Montage. (A) Materialien, die für den Bau einer Flypub-Kammer erforderlich sind (i) Heißklebepistole Kleber Stick, (ii) Heißklebepistole, (iii) Rasierklinge, (iv) Lötkolben, (v) Lineal, (vi) Mesh, (vii) Polycarbonat Kunststoffplatte, und (viii) rund-Boden Drosophila Flasche. (B) Schematische Darstellung der Flypub-Kammerbaugruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Ethanol-Exposition. (A) Eine komplett montierte Flypub-Station. (B) Materialien, die für die Ethanol-Exposition benötigt werden, sind (i) P1000 Micropipette, (ii) Tape, (iii) Cotton pad, (iv) Petrischale, (v) Labortücher, (vi) kleiner Trichter, (vii) Timer, (viii) Mittelklasse-Trichter, (ix) Mauspad, (x) Schere, (xi) 95% Ethanol, (xii) Zangen und (xiii) Spatula. (C) Schritte zum Schneiden von Wattepads. (D) Top-Ansicht Bild der Pubs auf der Bühne ausgerichtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Video-Setup für Verhaltensbewertung. Gezeigt wird die Schritt-für-Schritt-Anleitung auf (A), wie sie auf das Video zoomt und (B) wie Sie die Timecode-Datei in den VLC-Mediaplayer einfügen, um die Verhaltensbewertung zu erzielen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Männliches Balzverhalten. Repräsentative Bilder veranschaulichen die Drosophila männlichen Balz Verhalten einschließlich der folgenden und einseitigen FlügelVerlängerung für (A) Balz Song, (B) Balzkette, (C) Balz kreis (D) Bauchbiegen und (E) Montage, die für Verhaltensbewertung verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Dateneingabe und -analyse. (A) Die Anzahl der Männer, die in jedem 10 s Zeitblock in der Balz beschäftigt sind, wird in ein Arbeitsblatt transkribiert. Die höchste Anzahl von hofierenden Männchen von drei aufeinanderfolgenden 10 s Zeitblöcken (grüner Pfeil) wird als repräsentativer Datenpunkt verwendet. Der Durchschnitt von 10 aufeinander folgenden Datenpunkten (blaue oder orange Klammer) mit dem Maximalwert stellt den Prozentsatz der männlich-männlichen Balz pro Kneipe [orange Klammer; MAX (Durchschnitt), schwarzer Pfeil]. (B,C) Die Arbeitsblattformeln, die zur Berechnung des maximalen repräsentativen Datenpunkts und des maximalen Durchschnitts von 10 aufeinanderfolgenden repräsentativen Datenpunkten pro Pub verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Ethanol-induzierte Verhaltenshemmung und Sensibilisierung bei CS und th. (A,B) Die CS- undt-h-Männchen zeigten eine sensibilisierte Balzhemmung bei wiederholten Ethanol-Expositionen (ANOVA GLM, CS: R2=0,83, F(5,66)=65,21, p < 0,0001; t th: R2=0,67, F(5,66)=27,60, p < 0,0001; n = 12). (C) Die tt-h-Männchen zeigten im Vergleich zu CS (n=12) eine weniger hemmungslose Balz.h Die p-Werte der Post-hoc-Analysen werden über der Zeile angezeigt. Die intermale Balzaktivität wurde anhand der Videos analysiert, die für jede Ethanol-Exposition generiert wurden. Alle Daten werden als Mittel -Standardfehler des Mittelwerts gemeldet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Statistische Analyse. Die Schritte in der Minitab 17 Software, wie man den (A) Normalitätstest, (B) Stapeln der Daten, (C) Allgemeines lineares Modell ANOVA test, (D) Zwei-Probe-t-Test, (E) Mann-Whitney-Test und (F) Kruskal-Wallis-Test durchführt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

In diesem Bericht haben wir die Einrichtung und das detaillierte Protokoll des Flypub-Assays beschrieben; eine neuartige Methode, um zu messen, wie wiederkehrende Ethanol-Exposition hemmungslose Balz und Verhaltenssensibilisierung auslöst. Obwohl der Flypub-Assay relativ einfach ist, erfordern mehrere Schritte Sorgfalt und Aufmerksamkeit, um zuverlässige Ergebnisse zu gewährleisten. Erstens müssen die Fliegen für die Prüfung vollständig pigmentiert (d. h. voll entwickelte erwachsene Fliegen), gesund und intakt sein. Missbildungen oder Schäden vor allem in ihren Flügeln oder Beinen können die Fähigkeit des Mannes beeinflussen, zu hofen. Zweitens ist das Fliegenalter wichtig und muss zwischen Kontroll- und Versuchsgruppen abgeglichen werden (optimales Alter: 3-5 Tage alt bei Ethanol-Exposition 1). Zwei Wochen und ältere wilde männliche Fliegen neigen dazu, die erhöhten Niveaus der hemmungslosen Balz31anzuzeigen. Daher ist eine ordnungsgemäße Altersanpassung der untersuchten Fliegen unerlässlich, um variable Ergebnisse zu vermeiden. Drittens ist die Flugnummer pro Kneipe entscheidend (optimal: 33 pro Kneipe). Die niedrigeren oder höheren Flugzahlen pro Kneipe können die Platzzahlen stark verzerren (Daten werden nicht angezeigt). Viertens müssen die Flypub-Kammern identische Volumina haben, wie in Abbildung 2Bdargestellt. Dadurch wird sichergestellt, dass Fliegen Ethanoldampf synchron erhalten und die ausgelösten Verhaltensweisen konsistent sind. Fünftens sind eine klare Videoaufzeichnung und eine präzise Balzbewertung unerlässlich. Dieses Protokoll hängt stark von Verhaltensbeobachtungen ab, daher ist die sorgfältige Einhaltung des standardisierten Courtship-Scoring-Protokolls von grundlegender Bedeutung, um inkonsistente Ergebnisse zu minimieren. Schließlich wird dringend empfohlen, sowohl die Ethanol-Exposition als auch die Balz-Scoring-Schritte blind durchzuführen, wenn ein Experimentator keine Kenntnis von Fliegengenotypen oder experimentellen Behandlungen hat, wodurch experimentelle Verzerrungen verhindert werden.

Der Flypub-Assay hat mehrere Vorteile. Erstens können mehrere Gruppen von Fliegen gleichzeitig getestet und verglichen werden. Zweitens ist es kostengünstig, einfach einzurichten und leicht zu erlernen, so dass es sehr zugänglich für Experimentatoren auf allen Ebenen, einschließlich Grundschüler, Bachelor- und Graduiertenstudenten, Postdocs und Fakultät sowie Lehrlabore mit begrenztem Platz und Budgets. Drittens kann es genutzt werden, um zusätzliche Verhaltensweisen wie hemmungslose Balz von weiblichen Fliegen und die beruhigende Wirkung von Ethanol oder anderen Beruhigungsmitteln zu messen, um die anfängliche Empfindlichkeit und Toleranzentwicklung und -erhaltung zu bewerten31,32. Zusammen ist der Flypub eine vielseitige Methode, um verschiedene Eigenschaften von AUD zu studieren.

Die Hauptbeschränkung des Flypub-Assays ist das rigorose und mühsame Balz-Scoring-Regime. Das Balzverhalten unter dem Einfluss von Ethanol ist in einer Weise hochdynamisch, dass die Balzdauer von weniger als einer Sekunde bis zu vielen Minuten reicht und sich die fliegenden Fliegen, die in der Balz beschäftigt sind, eher häufig ändern. Das hier vorgestellte Bewertungsregime wurde entwickelt, um diese dynamische Natur zu integrieren und konsistente Werte für einzelne Ethanol-Expositionen für einen bestimmten Genotyp31,32zu liefern. Wie im Protokoll erwähnt, wird die Balzaktivität manuell bewertet, was zeitaufwändig ist. Mehrere automatisierte Scoring-Programme wurden entwickelt, um unvoreingenommene High-Throughput-Verhaltensscreening zu ermöglichen und alle verlassen sich auf einzelne Fliegen Bewegungen und Positionen39,40,41,42,43,44,45. Wir haben auch versucht, eine Computersoftware zu entwickeln, um die Balztätigkeit automatisch zu zählen, konnten aber keine konsistenten und zuverlässigen Ergebnisse erzielen. Dies könnte auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass Verhaltensbewertung mehrere Balzschritte umfasst (d.h. nach einseitiger Flügelverlängerung, Bauchbiegung und -montage)35,36,46 von mehreren Fliegen auf einmal. Selbst mit dieser Einschränkung sollte ein Experimentator mit entsprechender Ausbildung in der Lage sein, das ethanolinduzierte Balzverhalten mit Konsistenz und Genauigkeit zu quantifizieren. Dennoch wäre es von großer Hilfe und Wichtigkeit, maschinelles Lernen oder andere fortgeschrittene Algorithmen als Follow-up zu übernehmen.

Ähnlich wie bei Nagetiermodellen konzentrierten sich die Studien über Ethanol im Fliegenmodell weitgehend auf die stimulierende und beruhigende Wirkung des Ethanols. Der Flypub-Assay misst jedoch hemmungslose Balz, eine Art kognitive Hemmung, die neu ist31,32. Daher kann der Flypub helfen, die molekularen Akteure, zellulären Bahnen und neuronalen Schaltkreise sowie die Risikofaktoren (z. B. Alter, Schlaf, Ernährung oder soziale Umgebung) zu klären, die für Verhaltenshemmung und Sensibilisierung entscheidend sind. Wir haben bereits gezeigt, dass Dopamin-Signalisierung für EIBS erforderlich ist, was den Ergebnissen in Nagetiermodellen und menschlichen Probanden6,9,31entspricht. Auch als Beweis des Konzepts untersuchten wir die th Mutante ohne OA (das wirbellose Gegenstück von Noradrenalin) und fanden heraus, dass OA auch wichtig für die Verhaltenssensibilisierung für die Hemmungswirkung des Ethanols ist, obwohl sein Beitrag im Vergleich zu Dopamin31relativ gering ist. Diese Feststellung steht im Gegensatz zu der Feststellung von Scholz47, dass diet h mutierten Fliegen keine offensichtlichen Beeinträchtigungen in der Sensibilisierung für die bewegungsmotorische Aktivierungswirkung des Ethanols aufweisen47. Dies deutet auf ausgeprägte molekulare, zelluläre und neuronale Bahnen hin, die eine Verhaltenssensibilisierung für die Hemmung versus die motorische Aktivierung vermitteln. Folgestudien sollten diesen verlockenden Begriff weiter zusammenarbeiten.

Zusammenfassend ist der Flypub eine kostengünstige, facettenreiche und effektive Methode, um die Verhaltensreaktionen auf Ethanol zu untersuchen, insbesondere Hemmung und Verhaltenssensibilisierung, die dazu beitragen kann, unser Verständnis von AUD zu fördern und Einblicke in wirksame Interventionen für diese chronische Erkrankung zu geben.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von den NiaAA 1R15AA020996, NIMH R21MH109953, Brain & Behavior Research Foundation NARSAD und NIMHD 2G12MD007592 NMD Cluster Grants unterstützt. Wir danken auch dem NIH-finanzierten RISE-Programm (NIGMS 5R25GM069621) für die Unterstützung von NMD und CMS, dem UTEP COURI-SURPASS-Programm zur Unterstützung von NMD, dem NIH-finanzierten MARC-Programm (NIGMS 2T34GM008048-31) für die Unterstützung von AA und dem Dr. Keelung Hong Graduate Fellowship zur Unterstützung von EBS. Wir schätzen die UTEP-Kommunikationsabteilung sehr: Darlene Barajas, Christian Rivera, Karina Moreno, Jose Loya Fernandez und die Musikabteilung: Stephen A. Haddad für ihre Hilfe bei der Video- und Voice-over-Produktion. Schließlich sind wir Dr. Andreas Thum sehr dankbar, dass er die th Mutante im Kanton-S-Hintergrund mit der Kontrolle Canton-S-Fliegen geteilt hat; und Jessica Burciaga für ihren wertvollen Beitrag zu den ersten Studien über Oktopamin und die Han-Labormitglieder zur Diskussion und Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
95 % Ethanol VWR Chemicals BDH1158-4LP
Canton-S - - wild-type strain used as a control
Copy stand with arms Kaiser 205411 model RS 2-XA, with one central arm and two lateral arms; to set up a flypub station
Cotton rounds Swisspers COT-027 to deliver ethanol
Excel Microsoft - to analyze data; any worksheet or spreadsheet software can be used
Fluorescent light bulb Lights of America 7108N maximum (120 V-70 W Max.); to illuminate the flypub station
Microsoft LifeCam software Microsoft - version 3.60; to videotape flypubs
Microsoft LifeCam Studio Microsoft Q2F-00013 1080P HD sensor; to videotape flypubs
Minitab 17 Minitab - version 17; to conduct statistical analysis; any statistical analysis software can be used
Nylon mesh sheet Sefar Nitex - model B0043D1TVY, opaque white, 200 microns mesh; to make a flypub
Petri dishes Falcon 08-757-100A 35 x 10 mm; to deliever ethanol
Plastic funnel - mid size Fisher scientific 10-348A 65 mm diameter and 67 mm height; to transfer sedated flies from a flypub into a food vial
Plastic funnel - small Fisher scientific 07-202-121 4 mm diameter and 46 mm height; to transfer flies from a vial into a flypub
Polycarbonate sheet Lexan - 0.762 mm thickness, clear, 610 x 1220 mm Nominal; to make a flypub
Round-bottom bottle Fisher scientific AS115 polypropylene, 103 mm height, 60 mm diameter and 177 ml capacity; to make a flypub
Soldering iron Weller WES51 to make a hole in a flypub
Time code - - .smi file, a subtitle ticking timecode created in Han lab; to monitor time during courtship scoring; any time subtitles may be used
Tyramine β hydroxylase (tβh) - - mutant fly strain (nM18 null allele)deficient in tβh in the wild-type Canton-S background ; obtained from Dr. Andreas Thum (University of Leipzig, Leipzeig, Germany)
VLC media player VideoLAN - version 3.0.8; any media player can be used to score courtship

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Verhalten Ausgabe 159 Ethanol Drosophila melanogaster Fruchtfliege Verhaltenssensibilisierung Hemmung Balz Octamamin Alkoholkonsumstörung
Flypub zur Untersuchung von Ethanol induzierte Verhaltenshemmung und Sensibilisierung
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Delgado, N. M., Sierra, C. M.,… More

Delgado, N. M., Sierra, C. M., Arzola, A., Saldes, E. B., Han, K. A., Sabandal, P. R. Flypub To Study Ethanol Induced Behavioral Disinhibition and Sensitization. J. Vis. Exp. (159), e61123, doi:10.3791/61123 (2020).

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