Summary
We presenteren een protocol voor de isolatie van endocardiale en coronaire endotheelcellen uit rattenharten door sequentiële weefselvertering in een spijsverteringsbuffer, celverzameling uit terugkerende centrifugecycli en celzuivering met behulp van antiratten-CD31 microbeads.
Abstract
Het is aangetoond dat endocardiale endotheelcellen (EECs) en coronaire endotheelcellen (CECs) verschillen in oorsprong, ontwikkeling, markers en functies. Bijgevolg spelen deze twee celpopulaties een unieke rol bij hartziekten. De huidige studies met geïsoleerde endotheelcellen onderzoeken celpopulaties die bestaan uit zowel EER's als LMOE's. Dit protocol schetst een methode om deze twee celpopulaties onafhankelijk te isoleren voor celspecifieke karakterisering. Na het verzamelen van de linker en rechter ventriculaire vrije wand, endotheelcellen van het buitenoppervlak en het binnenoppervlak worden afzonderlijk bevrijd met behulp van een spijsvertering buffer oplossing. De sequentiële vertering van het buitenoppervlak en de binnenste endocardiale laag behielden de scheiding van de twee endotheelcelpopulaties. De afzonderlijke isolatie van EER's en LMOE's wordt verder gecontroleerd door de identificatie van voor elke populatie specifieke merkers. Op basis van eerder gepubliceerde single cell RNA profilering in het muishart, de Npr3, Hapln1, en Cdh11 gen expressie is uniek voor EECs; terwijl Fabp4, Mgllen Cd36 genexpressie uniek is voor CEC's. qPCR-gegevens toonden verrijkte expressie van deze kenmerkende merkers in hun respectieve monsters aan, wat wijst op een succesvolle ISOLATIE van de EEG en de CEC, alsmede het behoud van het celfenotype, waardoor verdere celspecifieke functionele analyse mogelijk is.
Introduction
Dit artikel bevat een gedetailleerd protocol (gewijzigd van Gladka et al.1) voor de dissectie en daaropvolgende isolatie van endocardiale endotheelcellen (EECs) en coronaire endotheelcellen (CECs) uit rattenharten. De mogelijkheid om deze celpopulaties onafhankelijk te onderzoeken zou het mogelijk maken om celtypespecifieke mechanismen te verkennen die ten grondslag liggen aan een verscheidenheid aan hartziekten die als potentiële therapeutische doelen kunnen dienen. Een succesvolle methode voor het onafhankelijk verzamelen van deze celpopulaties moet echter nog worden gepubliceerd.
De LOF's verschillen van EER's wat betreft hun oorsprong, markers en functies tijdens hartontwikkeling en ziekte1,,2,3,4,5,6,7. EE's komen voort uit het ventrale oppervlak van het hartmesoderm3. Ze ontstaan uit Flk1+ voorlopercellen in reactie op VEGF en HIF signalering en vormen de binnenste laag van de drie afzonderlijke gebieden van het ontwikkelende hart: het atrium, de ventrikel en de sinusvenosus3,6. Genetische afstammingstracering suggereert dat de pluripotente endocardiale cellen van de sinus venosus veneuze cellen afleiden, die migreren naar de subepicardiale laag3. Vervolgens onderscheidt de subepicardiale laag zich in kransslagaders en aders, waaronder CEC's, die over de perifere ventriculaire vrije wand3,4blijven. Deze endocardiale endotheel route wordt gereguleerd door VEGFC, ELA / APJ, en SOX17 signalering3,4,6,8,9. Het ventriculaire endocardium ontleent de minder CEC's van het interventriculaire septum door een onbekend mechanisme3. Vervolgens wordt gelokaliseerde differentiatie tussen EER's en LOF's voorgesteld door markeringen die specifiek zijn voor deze twee celpopulaties, waaronder Mgll, Fabp4 en Cd36-expressie in LMOE' s, of Npr3, Cdh11 en Hapln1-expressie in EER3,5,10.
EER's en LMOE's spelen verschillende rollen in de hartfunctie. Endocardial aan mesenchymale overgang, klepvorming, kamerrijping, uitstroomkanaalverordening, en atrioventriculaire kanaalontwikkeling zijn afhankelijk van EECs6. Als alternatief, CEC's bijdragen aan vasomotorische toon en ontsteking van kransslagaders11. Deze verschillen in functie resulteren in geïndividualiseerde rollen in ziekteontwikkeling4,12. Er zijn bijvoorbeeld aanwijzingen dat slecht functionerende EES's kunnen leiden tot aangeboren klepziekte6, noncompaction myocardium6, atrioventriculair septaal effect6, endocardiale fibroelastose13, hypoplastisch linkerhartsyndroom13, ventriculaire hypoplasie13, en cardiale hypertrofie12. Op dezelfde manier hebben studies aangetoond dat abnormale CEC's bijdragen aan coronaire hartziekte14 en trombose11.
Succesvolle isolatie van EER's en LMOE's is noodzakelijk om uitgebreide kennis van deze twee celpopulaties te bereiken, die zowel in de onderzoeks- als in de klinische omgeving kunnen worden gebruikt. Het bepalen van de groei- en differentiatiefactoren van deze celpopulaties zou een referentie zijn voor de differentiatie van endotheelsubtypes van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs). Verder is volledige identificatie van de verschillen in de ontwikkeling, regulering en functie van EER's en LMOE's van vitaal belang voor het begrijpen van de genomische en epigenomische factoren die verantwoordelijk zijn voor talrijke hartziekten op een celtype-specifieke manier. Dit artikel schetst stappen voor de succesvolle verzameling van EER's en LMOE's onafhankelijk, en biedt bewijs van scheiding door de genexpressie niveaus van celtype-specifieke markers te beoordelen.
Protocol
Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door het Administratief Panel on Laboratory Animal Care (APLAC31608) van Stanford University.
1. Voorbereiding van buffers
- Bereid de vergistingsbuffer voor met behulp van de reagentia in tabel 1.
- Bereid de DNase I voorraadoplossing voor: Los DNase I op in RNase-vrij water voor een voorraadoplossing van 2.000 eenheden/mL (1 mg/mL). Aliquot en bewaar de voorraadoplossing op -20 °C.
- Bereid de liberase oplossing voor: Los liberase op met RNase-vrij water voor een voorraadoplossing van 5 mg/mL. Draai het op een rolbank bij 4 °C gedurende 30 min. Aliquot en bewaar de voorraadoplossing op -20 °C.
- Bereid de sorteerbuffer voor door 0,5 M ethylenediaminetetraazijnzuur (EDTA) en 10% runderserumalbumine (BSA) voorraadoplossing met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) te verdunnen voor een eindconcentratie van 2 mM EDTA en 0,5% van BSA.
2. Hartcollectie
OPMERKING: Zes Sprague Dawley ratten met een gewicht van 50-100 g werden gebruikt in dit protocol. Er werd geen genderverschil waargenomen.
- Euthanaseer de rat met CO2 en plaats hem in een supine positie op een ontleedplatform. Pin de ledematen naar beneden en steriliseren zowel de buik en borst met 70% ethanol.
- Open de buik met een schaar en steek een 21 G naald in het gedeelte van de achterste vena cava gelegen achter de darmen. Trek de spuitzuiger terug, haal het bloed uit de ader totdat de lever lichter van kleur lijkt en er geen bloed meer kan worden ingetrokken, wat wijst op voldoende bloedverwijdering.
- Met behulp van een schaar, open de borst zorgvuldig om te voorkomen dat beschadiging van de long en het hart. Til de aorta boog / atrium met de tangen en snijd de aorta, longslagader, longaders, en vena cava te bevrijden en het hart te verwijderen.
- Was het hart met 50 mL koude 1x Hanks' balanced salt solution (HBSS) buffer 3x om overmatig bloed te verwijderen.
- Verwijder onder een microdissectiemicroscoop de rechter ventriculaire vrije wand in een 5 mL-buis met dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) (Figuur 1A,B).
- Leg het hart op zijn vlakkere, achterste gezicht om de linker- en rechterkant te identificeren.
- Zoek de longslagader, de meest voorste van de aderen en slagaders vertakking van de bovenkant van het hart en snijd door de longslagader naar de rechter ventriculaire kamer. Op het voorste gezicht van het hart, snijd langs het septum tot het bereiken van de top. Doorgaan met het snijden van de top van de achterste kant van het hart langs het septum tot de longslagader en de rechter ventriculaire kamer knooppunt punt (Figuur 1A).
- Vanaf de longslagader en rechter ventriculaire knooppunt, snijd zowel de voorste en achterste kant van het hart loodrecht op de vorige dissectie en uit de buurt van het septum, totdat de rechter ventriculaire vrije muur is bevrijd van de rest van het hart (Figuur 1B).
- Verwijder onder de microdissectiemicroscoop de linker ventriculaire vrije wand in een 5 mL-buis met DMEM (Figuur 1C,D).
- Zoek de aorta, vertakking van de bovenkant van het hart achter de longslagader, en herhaal de methode beschreven in stap 2.5 af te snijden van de linker ventriculaire vrije muur.
3. EEG-spijsvertering
- Plaats zowel rechts als links ventriculaire vrije wandweefsels in een 60 cm cultuurschaal met het binnenoppervlak plat liggen, naar beneden gericht (Figuur 2).
OPMERKING: Het binnenoppervlak is het binnenvlak van de licht holle vorm van ventrikel zoals afgebeeld in figuur 2A,C. - Voeg 0,5–1 mL van de spijsvertering buffer aan de schotel, het plaatsen van de punt van de pipet direct onder het weefsel. Ga door tot alleen het binnenoppervlak is ondergedompeld.
- Incubeer de schotel in een 5% CO2,37 °C incubator gedurende 5 min.
- Voeg EG medium aan de cultuur schotel om de spijsvertering te stoppen.
OPMERKING: Houd de hoeveelheid vergistingsbuffer tot EG-medium als 1:5-verhouding. - Gebruik een pipet van 1 mL om het binnenoppervlak van de ventrikels met EG-medium te spoelen en breng de afvloeiing over in een 50 mL-opvangbuis door middel van een zeef van 40 mm (figuur 2E). Houd de collecties op ijs voor downstream zuivering.
4. CEC-spijsvertering
- Snijd langs het buitenoppervlak van de linker ventrikel zonder verontreiniging van de binnenste laag (Figuur 2B,D) en plaats elk in een aparte 5 mL buis met 1 mL van de spijsvertering buffer.
OPMERKING: De linker ventrikel kan worden geïdentificeerd als de dikkere ventrikel, en het buitenoppervlak kan worden bepaald als de buitenkant van de licht holle ventrikel. - Met behulp van dissectie schaar, gehakt de ventriculaire wand in kleine, 1 mm3 stukken.
- Incubeer de buis in een 37 °C waterbad gedurende ongeveer 15-20 min. Vortex elke 2-3 min.
- Pipetteer 4 mL EG-medium in de 5 mL buis om de spijsvertering te beëindigen.
- Breng de oplossing met een 5 mL serologische pipet in een buis van 50 mL door middel van een 40 mm zeef (Figuur 2E). Houd de collecties op ijs voor downstream zuivering.
5. Celverzameling
- Centrifugeer de buizen op 300 x g gedurende 10 min bij kamertemperatuur (RT) en zuig vervolgens de supernatant aan.
- Als de pellet rood lijkt, de pellet opnieuw opschorten in 1-2 mL van 1x rode bloedcellen (RBC) lysing buffer (Figuur 2F).
OPMERKING: Als er geen RBCs zijn, gaat u verder met stap 6. - Incubeer de buizen in een waterbad van 37 °C gedurende 5 min.
- Pipetteer 10 mL PBS in de 50 mL buizen om de lysis te stoppen.
- Centrifugeer de buizen op 300 x g gedurende 10 min bij RT en zuig vervolgens de supernatant aan.
6. EG-sortering
- Voeg 90 μL sorteerbuffer en 10 μL anti-CD31 PE-antilichaam toe aan de 50 mL-buizen.
- Draai de buizen en broed ze vervolgens 10 min uit in een koelkast van 4 °C.
- Voeg 10 mL sorteerbuffer toe aan de buizen, meng grondig en centrifugeer vervolgens op 300 x g voor 10 min bij RT.
- Zuig de supernatant aan en stouw de pellet opnieuw in 80 μL sorteerbuffer en 20 μL anti-PE microbeads.
- Draai de buizen en broed bij 4 °C gedurende 15 min.
- Was de cellen door 10 mL sorteerbuffer in de buizen toe te voegen, meng grondig en centrifugeer ze vervolgens op 300 x g voor 10 min bij RT.
- Zuig de supernatant aan en stouw de pellet opnieuw in 500 μL sorteerbuffer.
- Plaats een kolom met superparamagnetische bollen in een magnetische afscheider en spoel de kolom af met 3 mL sorteerbuffer.
- Nadat de kolom "stroomstop" is, pipettt500 μL van de celsuspensie in de kolommen en was de kolommen vervolgens met sorteerbuffer. Herhaal de was 3x, elk met 3 mL sorteerbuffer(figuur 2G).
- Verwijder de kolommen uit de separator en plaats ze op een nieuwe 15 mL-inzamelbuis.
- Voeg met een pipet 5 mL EG-medium toe aan de kolommen en stuw de oplossing door een kolomzuiger te gebruiken.
- Centrifugeer de opvangbuizen op 300 x g gedurende 10 min bij RT en zuig vervolgens de supernatant aan.
- Haal het RNA uit de celpellets van de EEG- en CEC-monsters met behulp van een kit, volgens de instructies van de fabrikant. Een minimum van 500 ng RNA kan worden verkregen.
OPMERKING: Na RNA-extractie kan het monster worden opgeslagen bij -80 °C. - Reverse transcriberen 500 ng van RNA om cDNA te krijgen met behulp van een willekeurige primer en een kit, volgens de instructies van de fabrikant.
- Voer kwantitatieve PCR uit voor de validatie van endocardiale en endotheelpopulaties (figuur 2H). Primersequenties worden vermeld in tabel 2.
- Voeg 5 μL EEC of CEC cDNA (1 ng/μL) toe aan de putten van een 384 qPCR plaat. Voeg de EEG of CEC cDNA in voldoende putten, zodat er drie putten per aantal primers.
- Meng 6 μL van 2x qPCR SYBR groene buffer met 0,5 μL van elke 10 μM primer, inclusief zowel vooruit als achteruit primers, en voeg ze toe in een enkele put die overeenkomt met elk kandidaat-gen.
- Sluit de plaat af met plastic folie en centrifugeer 1 min bij 300 x g bij RT.
- Plaats de plaat in een qPCR-machine en start het programma op 95 °C gedurende 3 minuten, gevolgd door 95 °C voor 15 s, en vervolgens 55 °C voor 60 s. Herhaal de volgende twee stappen gedurende 45 cycli.
Representative Results
Het proces van isolatie van de EEG en de CEC wordt beschreven in figuur 2. De succesvolle isolatie van EER's en LMOE's werd bepaald door de aanwezigheid van pan-endotheelcelmarkers te beoordelen, evenals die welke verschillen hebben voor de twee subtypepopulaties. Zoals voorspeld, qPCR bleek βdat ten opzichte vanβ-actine, EECs uitgedrukt hogere niveaus van endocardialmarkers Npr3, Hapln1, en Cdh11 in vergelijking met CECs (figuur 3A). Evenzo drukten DEC's hogere niveaus van coronaire markers Fabp4, Mgllen Cd36 uit in vergelijking met EER's (figuur 3B). Bovendien drukten zowel EEC's als LMOE het pan-EC-markergen Cdh5uit , met iets hogere niveaus in CEC (figuur 3C).
Figuur 1: Diagram van hartdissectie. (A) Eerste snede gemaakt om de rechter ventrikel vrije muur te scheiden van het septum. (B) Tweede snede gemaakt om de rechter ventrikel volledig te bevrijden. (C) Eerste snede gemaakt om de linker ventrikel vrije muur te scheiden van het septum. (D) Tweede snede gemaakt om de linker ventrikel volledig te bevrijden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Diagram van de opzet van de spijsvertering van de LMOE's en EER's en de volgende regeling voor celsortering. (A) Binnenstevrije ventriculaire wand en (B) buitenste ventriculaire vrije wand werden (C) ondergedompeld in de spijsvertering buffer of (D) verteerd in de spijsvertering buffer respectievelijk. (E) Inzameling en filtratie van celoplossingen gevolgd door (F) rode bloedcellen (RBC) lysis en (G) magnetisch geactiveerde celsortering (MACS) met behulp van het CD31-antilichaam. h) Gezuiverde EC's werden verwerkt voor genexpressieverificatie met behulp van qPCR. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: qPCR-gegevens die de isolatie van LOF's en EER's verifiëren. aA) De genexpressieniveaus van de EEG-markeringen Npr3, Cdh11en Hapln1 in EER's en LOF's werden gekwantificeerd door real-time PCR. bB) De genexpressieniveaus van de CEC-markers Mgll, Fabp4en Cd36 in EER's en LOF's werden gekwantificeerd door real-time PCR. (C) De pan-EC marker Cdh5 werd gekwantificeerd in EER's en LOF door real-time PCR. (n = 3 in elke groep). De balken vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01 vs. EEG, ongepaarde t-test. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Tabel 1. Spijsverteringsbuffer (1,5 ml) | |||
| Stock Con. | Laatste con. | Volume | |
| Liberase TM | 5 mg/ml | 0,5 mg/ml | 150 ul |
| Dnase I | 1 mg/ml | 20 ug/ml | 30 ul |
| HEPES HEPES | 1 M | 10 mM | 15 ul |
| DMEM (DMEM) | - | - | 1305 ul |
Tabel 1: Recept voor de spijsverteringsbuffer.
| Tabel 2. Primersequenties | ||
| Naam van het gen | Doorsturen | Omgekeerde |
| Npr3 (Npr3) | TCCTTGCAAATCATGGCCTA | GGAATCTTCCCGCAGCTCTC |
| Cdh11 | GTGAATGGGACTGGGACTGG | GTAATTTCTGGGGCCCTTGC |
| Hapln1 (Hapln1) | CCAGCTAAGTGGGACTCGAAG | GGGCCATTTTTCAGCTTGGATG |
| Mgll Mgll | CCCGGGGCCCAAAGAC | GAAGATGAGGGCCTTGGGTG |
| Fabp4 Fabp4 | AGAAGTGGGAGTTGGCTTCG | ACTCTCTGACCGGATGAGA |
| Cd36 | GCAAAACGACTGCAGGTCAA | CCCGGTCACTTGGTTTTCTGA |
| Cdh5 | CCATTGAGACAGACCCCGAC | TGTGGAGTGTGCTGG |
| B-actin | TCTGTGTGGATTGGTGGCTC | CGGACTCATCGTACTCCTGC |
Tabel 2: Primersequenties
Discussion
LOF's en EER's verschillen in oorsprong, markers en functies, en kunnen dus een unieke rol spelen in ontwikkeling en ziekte. De bestaande protocollen voor endotheliale celisolatie zijn beperkt tot macrovasculaire weefsels, waardoor de verzameling eer's worden verwaarloosd, waardoor de studie van CEC- en EEG-specifieke functies wordt beperkt. Het is van essentieel belang deze twee populaties onafhankelijk te isoleren en te bestuderen, aangezien deze kennis een referentie zou zijn voor de differentiatie van iPSC's in LMOE's en EER's voor toekomstige studies en het onderzoek van deze celpopulaties op mogelijke therapeutische doelen voor verschillende hartziekten zou vergemakkelijken. Dit nieuwe protocol schetst een methode voor de isolatie van EER's van het binnenoppervlak en LC's van de buitenzijde van de ventriculaire vrije wand van volwassen ratten.
Het is van cruciaal belang om de timing voor elke stap zeer nauwkeurig in dit protocol te controleren. Omdat het aantal EECs zeer beperkt is in rattenhartweefsel, hebben we de spijsverteringstijd van de binnenste laag van het hart geminimaliseerd om cellulaire schade te voorkomen en nog belangrijker, CEC-besmetting. Onmiddellijke toevoeging van de EG-medium oplossing om de enzymatische reactie te beëindigen is ook zeer belangrijk voor het behoud van een hoge levensvatbaarheid van de cel. Een rode pellet na celverzameling suggereert de aanwezigheid van een groot aantal RBC's. Afhankelijk van de hoeveelheid RBC-verontreiniging kan 1-2 mL rbc-lysisbuffer worden toegevoegd om de RBC's te degraderen. Incubatie moet zorgvuldig worden getimed om aanzienlijke schade aan de cellen te voorkomen, en PBS wordt onmiddellijk toegevoegd om de reactie te beëindigen. Met behulp van het huidige protocol konden we 105 EER's isoleren van zes rattenharten. Deze cellen kunnen worden gezaaid op een cel kweek schotel voor verdere uitbreiding en karakterisering.
Bij de voorbereiding van het weefsel voor vrije wandverzameling, werd het hart gewassen met HBSS om de meerderheid van de resterende RBCs te verwijderen. HBSS is het aanbevolen medium vanwege zijn heldere verschijning, waardoor de visualisatie van bloedcellen mogelijk is, in tegenstelling tot DMED met fenolrood. De samenstelling van de spijsverteringsbuffer zorgt voor voldoende bevrijding van endotheelcellen, waar liberase digestie enzym strips het weefsel van de blootgestelde cellen, DNase I elimineert DNA uit de dode cellen ter bevordering van celloslating die kunnen worden geremd door lijm kwaliteit DNA,waar liberase spijsvertering saldi de pH, en DMEM is een gewijzigd basaal medium met een hogere concentratie van aminozuren en vitaminen voor een betere cel onderhoud en bevat het calcium dat nodig is om de liberase te activeren.
Volgens de eencellige RNA sequencing (scRNA-seq) verkregen uit zowel menselijke15 en muis hart10, verschillende markers toegeschreven aan specifieke EG-populaties werden gemeld. We selecteerden enkele van de meest verrijkte genen om de zuiverheid van geïsoleerde EECs (d.w.z. Npr3, Cdh11en Hapln1) en EECs (d.w.z. Mgll, Fabp4en Cd36)te onderzoeken. Ten opzichte van β-Actin, Npr3, Cdh11en Hapln1 vertoonden de markers een verhoogde expressie in EER's in vergelijking met LMOE's. Ook de expressie van Mgll, Fabp4en Cd36 markers was groter in LMOE's in vergelijking met EER's. De uniek uitgedrukte markeringen voor elk monster zijn in overeenstemming met de markers die kenmerkend zijn voor respectievelijk EER's en LMOE,wat duidt op een succesvolle isolatie.
Het huidige protocol kan echter niet uitsluiten dat kruisbesmetting tussen de twee EG-populaties tijdens de isolatie, zelfs met zorgvuldig gecontroleerde sequentiële vertering. Daarom kunnen sommige celoppervlaktemarkeringen worden aangebracht voor verdere zuivering. Zo labelt NPR3 over het algemeen het endocardium10, terwijl APJ een meerderheid van de LMOE's16kan traceren . Omdat deze twee markers worden uitgedrukt op het celoppervlak, kunnen ze worden gebruikt voor fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS), en antilichamen die worden gebruikt om verschillende EG-populaties verder te zuiveren. Bovendien kunnen menselijke15- en muis10-hartscRNA-seq de verrijking van10 Npr3 in EER's bevestigen en kan Cd36 mogelijk worden gebruikt voor CEC-zuivering.
Tot slot schetst het gepresenteerde protocol de onafhankelijke isolatie van EER's en LMOE's uit het rattenhart. De uitgebreide identificatie van cellulaire eigenschappen, ingeschakeld door celisolatie, kan worden gebruikt voor belangrijke downstream-toepassingen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs zeer waarderen Dr Lingli Wang voor haar hulp met het dier protocol, en het ministerie van Kindergeneeskunde op Stanford voor ondersteuning van de infrastructuur. Dit werk werd ondersteund door NIH/NHLBI K99 HL135258 (naar M.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | 1M |
| 15ml Tubes | Eppendorf | 0030122151 | |
| 50ml Tubes | Nunc | 339652 | |
| 5ml Tubes | Eppendorf | 30119401 | |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Anti-CD31 PE | Miltenyi Biotec | 130-115-505 | |
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | 10% |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-rad | 1855485 | For qPCR |
| DNAse I | Worthington | LK 003172 | 1 mg/mL in water |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 10313021 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | EC Medium |
| Ethylendiaminetetraacetic Acid (EDTA) | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) X1 | Gibco | 14025092 | |
| Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white | Bio-rad | HSP3805 | For qPCR |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| Liberase TM | Sigma Aldrich | 5401119001 | 5 mg/mL |
| MACS LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | For EC isolation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | For EC isolation |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-rad | MSB1001 | For qPCR |
| Narrow Pattern Forceps | F.S.T | 11002-12 | For heart harvest |
| Nylon Sterile Strainer | Falcon | 352340 | 40 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) X1 | Gibco | 1001023 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | For qPCR |
| Quick-RNA Microprep Kit | Zymo Research | R1050 | For RNA extraction |
| S&T Forceps - SuperGrip Tips | F.S.T | 00632-11 | For heart harvest |
| Strabismus Scissors - Tungsten Carbide | F.S.T | 14574-11 | For heart harvest |
| Vannas Spring Scissors - Microserrated | F.S.T | 15007-08 | For heart harvest |
References
- Gladka, M. M., et al. Single-Cell Sequencing of the Healthy and Diseased Heart Reveals Cytoskeleton-Associated Protein 4 as a New Modulator of Fibroblasts Activation. Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).
- Koren, C. W., Sveinbjornsson, B., Smedsrod, B. Isolation and culture of endocardial endothelial cells from Atlantic salmon (Salmo salar) and Atlantic cod (Gadus morhua). Cell and Tissue Research. 290 (1), 89-99 (1997).
- Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Li, Y., Lui, K. O., Zhou, B. Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases. Nature Reviews in Cardiology. 15 (8), 445-456 (2018).
- Zhang, H., Lui, K. O., Zhou, B. Endocardial Cell Plasticity in Cardiac Development, Diseases and Regeneration. Circulation Research. 122 (5), 774-789 (2018).
- Yu, S. Y., et al. Isolation and characterization of human coronary artery-derived endothelial cells in vivo from patients undergoing percutaneous coronary interventions. Journal of Vascular Research. 46 (5), 487-494 (2009).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
- Kamimura, T., Yamagishi, T., Nakajima, Y. Avian coronary endothelium is a mosaic of sinus venosus- and ventricle-derived endothelial cells in a region-specific manner. Development, Growth and Differentiation. 60 (2), 97-111 (2018).
- Zhang, H., et al. Endocardium Minimally Contributes to Coronary Endothelium in the Embryonic Ventricular Free Walls. Circulation Research. 118 (12), 1880-1893 (2016).
- Kinlay, S., Libby, P., Ganz, P. Endothelial function and coronary artery disease. Current Opinion in Lipidology. 12 (4), 383-389 (2001).
- Jacques, D., Bkaily, G. Endocardial endothelial cell hypertrophy takes place during the development of hereditary cardiomyopathy. Molecular and Cell Biochemistry. 453 (1-2), 157-161 (2019).
- Grossfeld, P., Nie, S., Lin, L., Wang, L., Anderson, R. H. Hypoplastic Left Heart Syndrome: A New Paradigm for an Old Disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 6 (1), (2019).
- Li, Y., et al. Down-regulated RGS5 by genetic variants impairs endothelial cell function and contributes to coronary artery disease. Cardiovascular Research. , (2019).
- Miao, Y., et al. Single-Cell RNA-Seq Reveals Endocardial Defect in Hypoplastic Left Heart Syndrome. bioRxiv. , (2019).
- Chen, H. I., et al. The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis. Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).
