Summary
Miljømæssige allergener såsom husstøvmider (HDM) indeholder ofte mikrobielle stoffer, der aktiverer medfødte immunreaktioner for at regulere allergisk inflammation. Den protokol, der præsenteres her, viser identifikationen af dsRNA-arter i HDM-allergener og karakterisering af deres immunogene aktiviteter i modulerende eosinofil lungebetændelse.
Abstract
Miljømæssige allergener såsom husstøvmider (HDM) er ofte i komplekse former, der indeholder både allergiske proteiner, der driver afvigende type 2-reaktioner og mikrobielle stoffer, der fremkalder medfødte immunresponser. Disse allergen-associerede mikrobielle komponenter spiller en vigtig rolle i reguleringen af udviklingen af type 2 inflammatoriske tilstande såsom allergisk astma. De underliggende mekanismer er dog stort set udefinerede. Den protokol, der præsenteres her, bestemmer de strukturelle egenskaber og in vivo-aktiviteten af allergenrelateret immunostimulerende RNA. Specifikt undersøges almindelige allergener for tilstedeværelsen af dobbeltstrengede RNA-arter (dsRNA), der kan stimulere IFN-reaktioner i lungerne og begrænse udviklingen af svær lungeeosinofili i en musemodel af HDM-induceret allergisk astma. Her har vi medtaget følgende tre analyser: Dot blot for at vise dsRNA-strukturerne i total RNA isoleret fra allergener, herunder HDM-arter, RT-qPCR til måling af aktiviteterne i HDM RNA i interferonstimulerende gener (ISGs) udtryk i muselunger og FACS-analyse for at bestemme virkningerne af HDM RNA på antallet af eosinofile i bal og lunge.
Introduction
På grundlag af den hygiejnehypotese , der oprindeligt blev foreslået af Strachan1, kan udsættelse for mikrobiel miljøfaktorer såsom endotoxin beskytte mod udviklingen af allergiske lidelser2,3. Under mikrobielle infektioner, fx virusinfektioner, udløser den medfødte immundetektion af udenlandske nukleinsyrer (RNA/DNA) værtsforsvarsrespons4,,5,6. Det er dog fortsat uvist, om der findes og prævalenser af immungene nukleinsyrer såsom lange dobbeltstrengede RNA-arter (dsRNA) i husstøvmider (HDM) eller andre insektalrogener. Denne protokol er designet til at afgøre, om HDM eller insekt- og ikke-insektallergener indeholder lange dsRNA-arter, der kan aktivere en beskyttende immunrespons for at modvirke udviklingen af alvorlig eosinofil lungebetændelse i en musemodel af allergisk astma. Her tilbyder vi tre enkle og hurtige metoder til at evaluere de strukturelle determinanter i HDM total RNA, som er nødvendige for at regulere allergeninduceret eosinofil lungebetændelse.
Slimhinden immunsystemet er den største immunorgan i kroppen og fungerer som den første linje i vært forsvar mod både mikrobielle infektioner og allergiske fornærmelser7,8. Den lange dsRNA, replikation mellemliggende af mange vira, er kendt for at fungere som en patogen-associeret molekylære mønster (PAMP) til potent stimulere medfødte reaktioner via Toll som receptor 3 (TLR3) at fremkalde udtryk for interferon stimulerede gener (ISGs)9,10,,11,,12,13,14. Vi har for nylig vist, at HDM total RNA indeholdt dsRNA-strukturer, som upregulated udtrykket af ISGs og reduceret svær eosinofil lungebetændelse, når det administreres via intratracheal instillation i en murine model af allergisk astma induceret af HDMekstrakter 15. Sværhedsgraden af lungebetændelse bestemmes ved at analysere immuncelletyperne i bronskoalveolær lavage (BAL) og lungevæv via flowcytometri16,17,18,19,20.
Denne protokol omfatter tre analyser: 1) hurtig påvisning af dsRNA-strukturer med RNA-punkt blot ved hjælp af et monoklonalt museantistof J2, som specifikt binder sig til dsRNA (≥40bp) på en sekvensuafhængig måde; 2) hurtig evaluering af in vivo-virkninger af immunstimulerende RNA i muselunger ved at måle induktion af ISG'er ved hjælp af RT-qPCR; 3) nøjagtig kvantificering af eosinofile i BAL og lunge i forbindelse med HDM-induceret lungebetændelse ved hjælp af flow cytometri analyse.
Ovenstående analyser kan bruges til at studere ikke kun allergiske lungesygdomme, men også respiratoriske bakterielle og virale infektioner. For eksempel kan det DSRNA-specifikke J2-antistof også anvendes til andre formål såsom immunoaffinitetkromatografi, immunhistokemi, enzymbundet immunosorbensanalyse (ELISA) og immunstaining21,22,23. Desuden kan flere anvendelser neden for BAL væske indsamling anvendes til kvantificering opløselige indhold såsom cytokiner og chemokines ved hjælp af ELISA, og transskriptionel profilering af celler i luftvejene (f.eks alveolær makrofager). Selv om der er en række protokoller til rådighed i litteraturen til at evaluere lungesygdomme, de fleste af disse protokoller fokuserer ofte på målet validering. De procedurer, der er beskrevet her, kan anvendes til at identificere komponenter i miljømæssige allergener, der er vigtige for at regulere udviklingen af allergiske sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimentelle procedurer, der er beskrevet her, blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee of University of Texas Health San Antonio.
1. Dot blot for at vise tilstedeværelsen af dsRNA-strukturer i HDM total RNA
- Total RNA-isolering fra allergener, insekter og ikke-insekt allergener
- Sæt HDM, insekter eller ikke-insektdyr indsamlet i live eller fremstillet kommercielt i 50 ml rør, og hurtigt fryse med flydende-N2. Derefter opbevares ved -70 °C for efterfølgende total RNA-isolering.
BEMÆRK: I dette eksperiment blev HDM, insekt og ikke-insektdyr udvalgt, fordi de er kendt for at være almindelige kilder til allergener. Endvidere er det fortsat uklart, om deres RNA'er fungerer immunstimulerende. - En korrekt mængde (svarende til 100 μL i volumen eller derunder) af HDM, insekter eller ikke-insektdyr, der opbevares ved -70 °C, overføres til et 2 ml rør indeholdende perler (1,4 mm keramiske kugler), og derefter fryses rør i en væske-N2 beholder i ~10 min.
- For den samlede RNA-isolation tilsættes 1 ml guanidinium thiocyanatbaseret RNA-isolationsreagens24 til hvert rør, og der derefter brydes insekt- og ikke-insektløse små dyr med en højenergicelleforstyrrende stoffer ved den maksimale hastighed i 45 s og chill på is. Gentag dette trin to gange.
- Opløsningen overføres fra trin 1.1.3 til et nyt 1,5 ml rør, og der tilsættes 200 μL chloroform til hvert rør og vortex. Centrifugerør ved 14.000 x g i 14 min ved 4 °C.
- Når centrifugeringen er afsluttet, overføres den øvre vandige fase (200 μL) til et nyt 1,5 ml rør indeholdende 500 μL isopropanol til bundfald af RNA-pellet. Forstyr ikke interfasen. Det anbefalede volumenforhold for den øvre fase versus isopropanol er forholdet 1:2.5.
- Der blandes med skånsom vortexing, derefter centrifugerør ved 14.000 x g i 14 min ved 4 °C.
- Supernatanten aspireres med forsigtighed, og vask derefter RNA-pellet med 500 μL 75% ethanol og centrifuge ved 7.500 x g i 10 min ved 4 °C. Fjern al væske med forsigtighed, lufttørrer pelleten, og opløsning af RNA-pelleten med 20-50 μL RNase-fri H2O.
- RNA-koncentrationen måles med et spektrofotometer ved hjælp af følgende parametre:
- Åbn den tilknyttede software, og vælg den type nukleinsyrer, der skal måles. Skift eksempeltypen til RNA.
- Blindmålingen udføres med 1-2 μL RNase-fri H2O. Tør den RNase-fri H2O af. Nu er instrumentet klar til målingen.
- Der indlæss 1-2 μL af RNA-prøven, og RNA-koncentrationen (μg/μL) måles.
BEMÆRK: Forholdet mellem absorbansen ved 260 og 280 nm (A260/280) ved ~2,0 (1,9-2,2) accepteres generelt som "ren" for RNA. Hvis de ikke behandles med det samme, opbevares RNA-prøverne ved -70 °C, og rna'et holdes intakte, hvis de ikke behandles med det samme.
- Sæt HDM, insekter eller ikke-insektdyr indsamlet i live eller fremstillet kommercielt i 50 ml rør, og hurtigt fryse med flydende-N2. Derefter opbevares ved -70 °C for efterfølgende total RNA-isolering.
- Påvisning af dsRNA-struktur i det samlede RNA ved hjælp af dsRNA-specifikt J2-antistof
- Der fremstilles to 20 μL RNA-prøver (200 ng/μL). Den ene med behandling med RNase-III (1 μL for 1 μg RNA, inkuber ved 37 °C i 60 min) og den anden uden behandling med RNase-III.
BEMÆRK: RNase III anvendes her til specifikt at nedbryde dsRNA, men ikke enkeltstrenget RNA25. - Brug en blyant til at tegne gitre, hvor RNA-prøver vil blive slettet på membranen.
- Spot 2 μL af rna-prøvens 200 NG/μL på den positivt ladede nylonmembran.
- Kryds sammenkæd prøverne til membranen ved 1.200 mikrojoule x 100 i en UV-krydslinker. Trin 1.2.3 og 1.2.4 gentages to gange mere på prøvestedet. Dette vil resultere i i alt 0,8 μg pr. blot.
BEMÆRK: Der må ikke anbringes mere end 2 μL RNA-prøve på membranen ad gangen. - Bloker ikke-specifik binding med 5% mælk i TBS-T i 1 time med omrystning ved stuetemperatur. Blokeringsopløsningen fjernes fra trin 1.2.5, og antidim-dsRNA J2-antistoffet fjernes ved 1:1.000-fortyndingen i 1 % mælk i TBS-T og inkuberes natten over med omrystning ved 4 °C.
- Membranen vaskes med TBS-T i 5 minutter, og dette trin gentages i 3 gange. Tilsæt det sekundære antistof (alkalisk fosfatase-konjugeret Anti-Mouse IgG fortyndet i 1% mælk 1:5,000) og inkuberes i 1 time på en shaker ved stuetemperatur. Membranen vaskes med TBS-T i 5 minutter, og dette trin gentages i 3x.
- Substratet (BCIP/NBT) tilsættes og inkuberes i 5-15 min., indtil et ønsket signal er synligt.
- Stop reaktionen ved at skylle membranen med dDH2O.
- Tør membranen på vævspapir og tag et fotografi med en smartphone (et repræsentativt resultat er vist i figur 1).
- Der fremstilles to 20 μL RNA-prøver (200 ng/μL). Den ene med behandling med RNase-III (1 μL for 1 μg RNA, inkuber ved 37 °C i 60 min) og den anden uden behandling med RNase-III.
2. RT-qPCR til at måle HDM total RNA's evne til at stimulere lunge ISGs-ekspression
- RNA-isolering fra mus lungevæv
BEMÆRK: Mus (hun, 8-12 uger gamle, C57BL/6J) blev opretholdt under specifikke patogenfrie forhold.- Skærbedømme dyret kortvarigt med isofluran og administreres via intratrakal instillation med 5 μg (fortyndet i 80 μL PBS) af HDM RNAs behandlet med eller uden RNase III.
- Efter 16-18 h efter HDM RNA-behandling2 ofres musen ved CO 2-inhalation i et par minutter. Derefter placere musen på en platform og pin lemmer med nåle.
- Desinficere musen med 70% ethanol derefter skære huden fra maven til halsen med en steriliseret saks.
- Fastgør huden med nåle og skær ribbenene for at eksponere lungerne. Fjern hele lungerne og vask dem med kolde PBS. Lungerne anbringes på vævspapir og punktafgifter et lille stykke af hver lunge-lap i et 2 ml rør indeholdende perler (200-300 μL i volumen, 1,4 mm keramiske kugler).
BEMÆRK: Formålet med at bruge keramiske perler er at male hele lungevæv - Lungeprøverne fryses ved at anbringe rørene i en væske-N2 beholder i ~10 min.
- Der tilsættes 500 μL guanidinium thiocyanatbaseret RNA-isolationsreagens til hvert rør, og lungevævet brydes med en homogeniser til 45 s. Chill på is mellem hvert trin. Gentag dette trin to gange.
- Følg trinene 1.1.4- 1.1.7 for lung RNA-isolering.
- Lufttørres pelletet og RNA-pelleten opløses med den korrekte mængde RNase-fri H2O (~20-30 μL).
- RNA-koncentrationen måles som beskrevet i trin 1.1.8.
- RT-qPCR til at bestemme HDM RNA's evne til at stimulere lungegenekspression.
- Ved hjælp af 100 ng/μL RNA udvundet af lungevæv som skabelon skal cDNA-syntesen udføres i henhold til den refererede protokol26.
- Opret en RT-qPCR-reaktion ved 10 μL/brønd for en 384-brøndsplade ved hjælp af cDNA, der er genereret ovenfor, og de genspecifikke primerpar (tabel 1 og tabel 2).
- Luk brøndene tæt med en gennemsigtig klæbefilm og vortex pladen i 30 s. Drej pladen til 1.000 x g for 30 s for at indsamle prøver i bunden af brøndene.
- Læg pladen på en RT-qPCR-maskine, og begynd at køre RT-qPCR-reaktionen ved hjælp af den termiske cykelr protocol (tabel 3).
- Eksporter resultaterne til en regnearksfil, eller analyser dataene ved hjælp af den software, der leveres af fremstillingen, når programmet er afsluttet (et repræsentativt resultat vises i figur 2).
3. FACS-analyse til bestemmelse af virkningerne af HDM RNA på infiltration af eosinofile i BAL og lunge
- BAL væske kollektion til FACS analyse
- Euthanize mus (hun, 8-12 uger gamle, C57BL/6J), der blev behandlet med HDM allergen ekstrakter (i henhold til det eksperimentelle design vist i figur 3B) ved CO2 indånding.
- Placer musen på en platform og pin lemmer med nåle.
- Desinficere musen med 70% ethanol. Brug en saks til at skære huden fra det øverste område af maven til halsen.
- Forsigtigt, trække spytkirtlerne og sternohyoid muskel omhyggeligt fra hinanden ved hjælp af pincet til at udsætte luftrøret. Placer en nylonstreng (~10 cm) under luftrøret ved hjælp af pincet.
- Lav et snit i luftrøret (~ 2 mm under strubehovedet) lige nok til at indsætte en kanyle. Skær ikke gennem luftrøret. Knude strengen omkring luftrør og kanyle.
- Læg sprøjten med 1 ml PBS+EDTA og fastgør den til enden af kanylen. 1 ml PBS+EDTA indsprøjtes i lungerne, og opsug opløsningen fuldstændigt. Tag sprøjten forsigtigt ud af kanylen, og overfør opløsningen til et 15 ml rør på is.
- Genindlæs sprøjten med den friske PBS+EDTA, og gentag dette trin 2x.
- Centrifuger røret med den samlede BAL, der er fremstillet i trin 3.1.7, til at pelletere cellerne ved 500 x g i 7 min ved 4 °C. Optag volumen af BAL væske derefter overføre supernatant til to 1,5 ml rør uden at forstyrre pellet.
BEMÆRK: BAL's supernatant kan opbevares ved -70 °C til fremtidig analyse, f.eks. - Hvis der er RBC til stede i pellet på grund af alvorlig lungebetændelse, efter fjernelse af supernatant, tilsættes 500 μL RBC lysis buffer og bland godt ved resuspension. Opløsningen overføres til et nyt 1,5 ml rør og centrifugeres i 7 min ved en hastighed på 500 x g ved 4 °C.
- Supernatanten fjernes, og pelletet tages op igen i 150 μL FACS-buffer.
- 150 μL af prøven opgravet overføres til 96 brøndpladen, og pladen centrifugeres i 7 minutter ved en hastighed på 500 x g ved 4 °C.
- Hurtigt, vende pladen på vævspapir til at indsamle de celler, der bor i bunden af brøndene.
- Cellerne plettes med antistoffer i FACS-bufferen ved tilstedeværelse af 2,4 G2 blokerende antistof (2,5 μg / 100 μL). Opkænk pladen ved stuetemperatur i 30 minutter på et mørkt sted.
- Efter farvning centrifugeres pladen til pellet cellerne ved 500 x g i 7 min ved 4 °C.
- Fjern farvningsopløsningen ved at vende pladen på silkepapir og derefter vaske ved at resuspending med 100 μL FACS buffer. Derefter centrifugeres pladen igen ved 500 x g i 7 min ved 4 °C, og FACS-bufferen fjernes ved at vende pladen på silkepapir.
- Resuspendprøver i 150 μL FACS-buffer og overfør prøver til FACS-rørene, der indeholder 350 μL FACS-buffer. Der tilsættes 25 μL tælleperler til hver prøve. Prøverne er nu klar til flowcytometrianalyse.
BEMÆRK: Forskellige celletyper i BAL-væske blev mærket med antistoffer som angivet. Optælling perler blev tilføjet før FACS køre. Flow cytometri data blev analyseret ved hjælp af en kommercielt tilgængelig software. Se figur 3 og tabel 4 for gating-strategi.
- Lungevævsfordøjelse til FACS-analysen
- Følg trin 3.1.1 - 3.1.3.
- Skær huden fra maven til halsen med en steriliseret saks. Fastgør huden med nåle og skær ribbenene for at eksponere lungerne.
- Fjern hele lungerne og vask dem med kolde PBS. Prøverne anbringes i det 1,5 ml røret, der indeholder 50 μL lungefordøjelsesopløsning.
- Hakke lungevævet i små stykker med en buet saks. Overfør lungevævet til en 6-brøndsplade, og tilsæt derefter 8 ml lungefordøjelsesopløsning. Pladen anbringes på en shaker i 37 °C inkubator i 45 min.
- Efter inkubationen anvendes toppen af 1,5 ml rør til at male lungevævet. En 70 μm-sier anbringes på en ny 6-brøndsplade, og prøven påføres gennem 0,22 μm-filter.
- Den filtrerede opløsning overføres til et 15 ml rør, hvorefter rørene centrifugeres ved 500 x g i 7 min ved 4 °C. Opsug supernatanten og opslæmm pellet'en i 1 ml RBC lysis-buffer og lad den stå på is i 3 min.
- Prøven overføres til 1,5 ml og centrifugeres ved 500 x g i 7 min ved 4 °C. Gentag 2x
- Lungecellerne 2x vaskes med 1 ml FACS-buffer. Opsug supernatanten og opsug pelletpenten i 1 ml FACS-buffer, og 100 μL af prøven overføres derefter til 96 brøndpladen.
- Pladen centrifugeres i 7 min ved en hastighed på 500 x g ved 4 °C. Følg de trin, der er beskrevet i BAL-væskesamlingen, til FACS-analyse (3.1.13 til 3.1.16) for at plette cellerne i fordøjede lungevævsprøver.
BEMÆRK: Eosinofile i lungerne blev mærket med antistoffer som angivet, derefter blandet med tælle perler til yderligere FACS analyse. Flow cytometri data blev analyseret ved hjælp af tilhørende software. Se figur 3 for evaluering af HDM RNA-induceret immunrespons.
4. Statistisk analyse
- Udfør statistisk analyse ved hjælp af en kommercielt tilgængelig software.
- Bestem p p-værdierne ved ikke-parret tosidet student t-test til sammenligning af to grupper.
- Beregn det absolutte antal eosinofile baseret på referenceperler (øverste panel) ved hjælp af formlen
- P-værdierne bestemmes ved tovejs ANOVA og Sidaks multiple sammenligningstest til sammenligning af mere end to grupper.
- Anse en p-værdi, der er mindre end 0,05, for at være statistisk signifikant. P-værdierne angives på parceller som *p <0,05, **p<0,01, ***p<0,001 og ****p<0.0001.
BEMÆRK: Alle bufferopskrifter findes i tabel 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tilstedeværelsen af lange dsRNA-strukturer i HDM, insekter og ikke-insekt små dyr blev undersøgt ved dot blot ved hjælp af et dsRNA-specifikt musemonoklonalt antistof J2 (≥ 40bp). RNase III blev brugt til at fordøje dsRNA i 12-15 bp dsRNA-fragmenter, som ikke kunne spores af J2 (figur 1).
HDM total RNA's evne til at stimulere et medfødt immunrespons i muselunger på en dosisafhængig måde blev analyseret af RT-qPCR (Figur 2,øvre). RNase III-behandlingen afskaffede immunstæmulatoraktiviteten af HDM total RNA, hvilket indikerer, at dsRNA-strukturer i HDM total RNA er afgørende for medfødte immunaktivitet i lungerne (figur 2, lavere).
De hæmmende virkninger af HDM total RNA på udviklingen af en alvorlig type 2-lungebetændelse blev evalueret med FACS-analysen (Figur 3A). I denne undersøgelse blev den eosinofile lungebetændelse fremkaldt af HDM-ekstrakter, som blev behandlet med eller uden RNase III som afbildet i det eksperimentelle design (Figur 3B). Behandling med RNase III blev anvendt til at fjerne lange dsRNA-arter fra HDM-ekstrakter. Som forventet resulterede nedbrydningen af lange dsRNA-arter i alvorlig type 2-lungebetændelse, hvilket afspejles af det øgede antal eosinofile i BAL og lungerne. Især er antallet af eosinofile i den samlede HDM RNA-behandlede gruppe sammenligneligt med den gruppe, der blev behandlet med det originale HDM-ekstrakt, som endogent indeholder de lange dsRNA-arter (Figur 3B).
Figur 1: Påvisning af dsRNA-strukturerne i HDM RNAs ved dsRNA-specifik J2 Ab ved hjælp af dot blot. Total RNA fra forskellige aeroallergener herunder Dermatophagoides farinae (D.f.) og Dermatophagoides pteronyssinus (D.p.sletted) på en nylonmembran til påvisning af dsRNA (venstre panel). HDM (D.f. og D.p.) RNA blev venstre ubehandlet (-), behandlet med RNase III (dsRNA-specifik nuklease) og RNase T1 (ssRNA-specifik nuklease) (højre panel). Dette tal er genoptrykt fra She et al.15. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Induktion af ISG mRNA-ekspression efter total RNA fra HDM (D.f.) blev målt ved RT-PCR. Når HDM RNA blev leveret i muselunger, var det i stand til at stimulere ISG'ernes ekspression på en dosisafhængig måde (øvre panel). RNase III behandling eliminerede immunstimulerende aktivitet af HDM RNA (lavere panel). Dette tal er genoptrykt fra She et al.15. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Karakterisering af specifikke celletyper i luftvejene og evaluering af BAL-væske og lungeeosinofile. (A) Gating strategi, der anvendes til at identificere celler inddrives fra BAL væske blev plettet for celleoverflade markører som angivet. (B) Administration af HDM (D.f.) RNA ved 5 μg/mouse (blå bjælke) versus kontrol mus lunge RNA (rød bar). HDM (D.f.) RNA, men ikke dsRNA-forarmet HDM-ekstrakt reducerede antallet af eosinofile i både luftveje og lunger hos dyr behandlet med HDM-ekstrakt. Dette tal er genoptrykt fra She et al.15. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Musepritere | Sekvens (fremadvendt, 5'→3') | |
| RPL19 delte et misg begrænte | AAATCGCCAATGCCAACTC; TCTTCCCTATGCCCATATGC |
|
| IL1β | TCTATACCTCCTGTGTAATG; GCTTGTGCTCTGCTTGTG |
|
| IFIT3 (IFIT3) | TGGCCTACATAAAGCACCTAGATGG; CGCAAACTTTTGGCAAACTTGTCT |
|
| ISG15 | GAGCTAGAGCCTGCAGCAAT; TTCTGGGCAATCTGCTTCTTTT |
|
| Mx1 (Mx1) | TCTGAGGAGAGCCAGACGAT; ACTCTGGTCCCCAATGACAG |
|
| OASL2 (OASL2) | GGATGCCTGAGAGAATCG; TCGCCTGCTTTCGAAACTG |
|
| TNFα (TNFα) | CCTCCCTCTCATCAGTTCTATGG; GGCTACAGGCTTGTCACTCG |
|
Tabel 1: RT-qPCR-primere.
| Reagenser | Volumen (10 μl) | |
| Universal SYBR Grøn supermix (2x) | 5 μl | |
| Frem- og bakprimer (5 μM) | 1 μl | |
| cDNA-skabelon | 0,4 μl | |
| DNase- og RNase-fri H2O | 3,6 μl | |
Tabel 2: Master mix setup for RT-qPCR.
| Trin | Temperatur | Tidspunkt |
| Trin 1 | 95 oC | 3 minutter |
| Trin 2 | 95 oC | 10 sekunder |
| Trin 3 | 55 oC | 30 sekunder |
| Trin 4 | Gå til trin 2 (Gentag 2-3 for 39 cyklusser) | |
| Trin 5 (smeltkurve) | 55 oC til 95 oC | 0,5 oC, intervaller (holdtid er 5 sekunder) |
Tabel 3: Program til kørsel af RT-qPCR.
| 1. Opret et plot bestående af fremad (FSC) og side scatter (SSC). |
| 2. Opret et lille plot til at tælle perler (FSC lav, FITC høj). |
| 3. Opret et plot til kun gate for levende celler, mens eksklusive døde celler ved hjælp af BV510 farvestof. |
| 4. Levende celler kan derefter adskilles i CD11c høj og CD11c lave populationer. |
| 5. Fra CD11c høj befolkning gate for makrofager (SiglecF høj MHCII lav) og DC 'er (SiglecF lav, MHCII høj). |
| 6. Fra CD11c lav port til T-celler (CD3/19 høj, MHCII lav) og B-celler (CD3/19 høj, MHCII høj). |
| 7. Fra CD11c lav CD3/19null cellepopulation, gate for neutrofiler (CD11b høj, Ly-6G høj) og Eosinofile (CD11b høj, Ly-6G lav, SiglecF høj). |
| 8. For gating strategi Eosinophils i lungevæv, bruge disse markører aftere undtagen døde celler ved hjælp af BV510 farvestof (CD45, SiglecF, CD11C). |
Tabel 4: FACS kører
| Tbs: |
| 20 mm Tris-HCl |
| 150 mm NaCl |
| pH 7,5 |
| TBS-T: |
| 0,05% Tween-20 i TBS |
| Blokering af buffer |
| 5% fedtfri mælk fortyndet i TBS-T |
| Antistoffortynding Buffer |
| 1% fedtfri mælk fortyndet i TBS-T |
| PBS+EDTA |
| 1x PBS + 0,1 mM EDTA |
| FACS-buffer |
| 2% Føtal Kalv Serum (FCS) i 1x PBS |
| Cellemedium i alt |
| RPMI 1640, 1X Glutamax, 10% FCS, 50 μM 2-mercaptoethanol og Penicillin-Streptomycin. |
| Lungefordøjelsesopløsning |
| Cellemedie i alt plus Liberase (50 μg/ml) og DNase I (1 μg/ml) |
Tabel 5: Opskrifter på buffere og opløsning
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nuværende protokol beskriver, hvordan man vurderer de immunstimulerende egenskaber af allergen-associerede mikrobielle RNA og deres indvirkning på udviklingen af eosinofil lungebetændelse i en musemodel af allergisk astma. Selv om lange dsRNA'er er kendt som replikationsmellemprodukter af mange vira, der potent kan aktivere interferonresponser i pattedyrceller, har deres tilstedeværelse i HDM-allergener været ukendt indtil vores seneste arbejde15. Kombinationen af RNA-dot blot, RT-qPCR og FACS analyse præsenteret i dette manuskript kan være et godt eksempel til dissekere medfødte komponenter såsom dsRNA arter i miljømæssige allergener, der er kritisk involveret i reguleringen af allergen-induceret eosinofil inflammation.
I denne protokol er RNA-dot blot blevet anvendt til at detektere tilstedeværelsen af dsRNA-strukturer i naturlige allergener ved hjælp af et monoklonalt museantistof J2, som specifikt binder sig til dsRNA (≥40bp) uafhængig af sekvens. Denne metode er yderst pålidelig, fordi J2-antistof stadig kan genkende dsRNA-prøver, der er forbehandlet med RNase T1 (enkeltstrenget RNA-specifik endonuklease), men ikke prøver, der er forbehandlet med RNase III (en dsRNA-specifik endonuclease). Det er dog værd at påpege, at en meget anvendt syntetisk analog af dsRNA, Polyinosinik:polycytidylsyre [Poly(I:C)], er blevet rapporteret til fortrinsvis binde sig til en anden anti-dsRNA monoklonal antistof K1, i stedet for J221,22,23. Det frarådes derfor at anvende J2-antistof til påvisning af poly(I:C).
Celletypeanalyse på prøver indsamlet fra BAL eller lungevæv er nyttig til vurdering af udviklingen af allergisk lungebetændelse. Selvom BAL-proceduren er en almindelig teknik, kan resultaterne variere mellem forskningslaboratorier. Talrige faktorer kan forårsage disse variationer såsom mængden af bronchoalveolar lavage indsamlet. Det ideelle volumen af BAL inddrives fra en 8-12 uger gamle mus er ~ 3 ml19. En anden faktor, der kan bidrage til den manglende reproducerbarhed er, hvor dybt kateteret skal indsættes i luftrøret (~ 0,5 cm er optimal), fordi dybere indsættelse af kateterne kan forårsage skade på luftrøret. Derudover bør forskerne også overveje andre faktorer såsom mus's alder, stamme og køn, da disse faktorer i høj grad kan påvirke eksperimentresultaterne27,28,29.
Her leverer vi en teknisk protokol til at karakterisere immunmodulerende virkninger af HDM RNA in vitro og in vivo ved hjælp af RNA-dot blot, RT-qPCR og FACS analyse af BAL og lungevæv. Korrekt praksis kan sikre en vellykket reproducerbarhed af resultater, der opnås ved udførelsen af disse teknikker. For eksempel, forsøge at undgå forurening af RNases, når du udfører RNA prn blot. Centrifugeringshastigheden bør også justeres korrekt, da den unødvendige højere centrifugeringshastighed kan kompromittere cellernes levedygtighed. Endelig bør celler, der anvendes til FACS-analysen, fastgøres, hvis de ikke analyseres samme dag.
Da medfødte immunitet spiller en central rolle i vært forsvar og inflammation2,3, de teknikker og metoder, der er beskrevet i dette papir vil være meget nyttigt for at studere immunmodulerende rolle andre medfødte immunkomponenter såsom mikrobielle DNA i naturlige allergener i udviklingen af type 2 inflammation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Ms Karla Gorena for teknisk bistand i flow cytometri. L.S. støttes af China Scholarship Council og Hunan Provincial Innovation Foundation for Postgraduate (CX201713068). H.H.A. er støttet af Institut for Kliniske Laboratorievidenskaber, College of Applied Medical Sciences, Jouf University, Sakaka, Saudi-Arabien. X.D.L. støttes af UT Health San Antonio School of Medicine Startup Fund og Max og Minnei Voelcker Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.40 µm Falcon Cell Strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 1 mL syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| 15 mL Tube | TH.Geyer | 7696702 | |
| 50 mL Tube | TH.Geyer | 7696705 | |
| 70% ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
| ACK-RBC lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Amersham Hybond-N+ Membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
| Ant | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Antibody dilution buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70) | BD Bioscience | 560456 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418) | BioLegend | 117317 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3) | eBioscience | 15-0193-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11) | Invitrogen | 15-0031-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | 103130 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506 | Invitrogen | 65-0866-14 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate | Promega | S3721 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 11-5931-82 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2) | eBioscience | 47-5321-80 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440) | BD Pharmingen | 552126 | 1 to 200 dilution |
| BCIP/NBT substrate | Thermo Fisher Scientific | PI34042 | |
| Blocking Buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Cannual, 20G X 1.5” | CADENCE SCIENCE | 9920 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories | 1855485 | |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cockroach | Greer Laboratories | B26 | |
| Counting beads | Thermo Fisher Scientific | 01-1234-42 | |
| D. farinae | Greer Laboratories | B81 | |
| D. pteronyssinus | Greer Laboratories | B82 | |
| Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate | Thomas Scientific | 1156F03 | |
| Digital Dry Bath - Four Blocks | Universal Medical, Inc. | BSH1004 | |
| Earthworm | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6511 | |
| FACS buffer | (see recipe in Table 5) | ||
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL | STEMCELLTM TECHNOLOGIES | 38056 | |
| Flow cytometer (BD FACS Celesta) | BD Biosciences | ||
| Fly | Greer Laboratories | B8 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| HT-DNA | Sigma | D6898 | |
| In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2) | Bio X Cell | BE0307 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708891 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | sc-363629Rx | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | BP2618500 | |
| J2 anti-dsRNA monoclonal antibody | SCICONS | 10010200 | |
| Lung digestion solution | (see recipe in Table 5) | ||
| Lysing Matrix D | MP Biomedicals | 116913050-CF | |
| Lysing Matrix D, 2 mL tube | MP Biomedicals | SKU:116913100 | |
| Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J) | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 30120.094 | |
| Microscope | Olympus | CK30 | |
| Mini-BeadBeater | Homogenizers | SKU:BS:607 | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec | 607 | |
| Mosquito | Greer Laboratories | B55 | |
| NanoDrop 2000C | Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply | TSCND2000C | |
| Needle, 21 G x 1 1/2 in | BD Biosciences | 305167 | |
| Non-fat milk | Bio-Rad Laboratories | 1706404 | |
| Nylon string | Dynarex | 3243 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| RNase III | Thermo Fisher Scientific | AM2290 | |
| RNase T1 | Thermo Fisher Scientific | AM2283 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-6802 | |
| Shaker or Small laboratory mixer | Boekel Scientific | 201100 | |
| SPHERO AccuCount Fluorescent | Spherotech | ACFP-70-5 | 1 to 10 dilution |
| Spider | San Antonio | Note: Locally collected | |
| TBS | (see recipe in Table 5) | ||
| TBS-T | (see recipe in Table 5) | ||
| Total cell medium | (see recipe in Table 5) | ||
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| UV Stratalinker 2400 UV | LabX | 20447 | |
| Wasp | San Antonio | Note: Locally collected |
References
- Strachan, D. P. Hay fever, hygiene, and household size. BMJ. 299, 1259-1260 (1989).
- Schuijs, M. J., et al. Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells. Science. 349, 1106-1110 (2015).
- Stein, M. M., et al. Innate Immunity and Asthma Risk in Amish and Hutterite Farm Children. New England Journal of Medicine. 375, 411-421 (2016).
- Roers, A., Hiller, B., Hornung, V. Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System. Immunity. 44, 739-754 (2016).
- Schlee, M., Hartmann, G. Discriminating self from non-self in nucleic acid sensing. Nature Reviews Immunology. 16, 566-580 (2016).
- Wu, J., Chen, Z. J. Innate immune sensing and signaling of cytosolic nucleic acids. Annual Reviews Immunology. 32, 461-488 (2014).
- O'Hara, A. M., Shanahan, F. The gut flora as a forgotten organ. EMBO Reports. 7 (7), 688-693 (2006).
- Focused Meeting 2018: Microbes and Mucosal Surfaces. , Microbiology Society. Available from: https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html (2018).
- Weber, F., et al. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 5059-5064 (2006).
- Barral, P. M., et al. Functions of the cytoplasmic RNA sensors RIG-I and MDA-5: Key regulators of innate immunity. Pharmacology and Therapeutics. 124, 219-234 (2009).
- Netea, M. G., et al. From the Th1/Th2 paradigm towards a Toll-like receptor/T-helper bias. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 3991-3996 (2005).
- McNally, B., et al. Intranasal administration of dsRNA analog poly(I:C) induces interferon-alpha receptor-dependent accumulation of antigen experienced T cells in the airways. PLoS One. 7, 51351 (2012).
- Seya, T., Takeda, Y., Matsumoto, M. Tumor vaccines with dsRNA adjuvant ARNAX induces antigen-specific tumor shrinkage without cytokinemia. Oncoimmunology. 5, 1043506 (2016).
- Toussi, D. N., Massari, P. Immune Adjuvant Effect of molecularly defined Toll-Like Receptor Ligands. Vaccines (Basel). 2, 323-353 (2014).
- She, L., et al. Immune Sensing of Aeroallergen-Associated Double-Stranded RNA Triggers an IFN Response and Modulates Type 2 Lung Inflammation. Journal of Immunology. 203, 2520-2531 (2019).
- Fujimoto, Y., et al. Pulmonary inflammation and cytokine dynamics of bronchoalveolar lavage fluid from a mouse model of bronchial asthma during A(H1N1)pdm09 influenza infection. Science Reports. 7, 9128 (2017).
- Yao, Y., et al. Induction of Autonomous Memory Alveolar Macrophages Requires T Cell Help and Is Critical to Trained Immunity. Cell. 175, 1634-1650 (2018).
- Dua, K., Shukla, S. D., Hansbro, P. M. Aspiration techniques for bronchoalveolar lavage in translational respiratory research: Paving the way to develop novel therapeutic moieties. Journal of Biological Methods. 4, 73 (2017).
- Van Hoecke, L., et al. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
- Salahuddin, S., et al. Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment. Journal of Visualized Experiments. (148), e59427 (2019).
- Hungary (SCICONS). "Antibodies - J2." Antibodies - Monoclonal Anti-DsRNA J2 and Anti-DsRNA K1. English and Scientific Consulting Kft. , Available from: scicons.eu/en/antibodies/j2/ (2020).
- Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-Stranded RNA Is Detected by Immunofluorescence Analysis in RNA and DNA Virus Infections, Including Those by Negative-Stranded RNA Viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
- Monsion, B., et al. Efficient Detection of Long dsRNA in Vitro and in Vivo Using the dsRNA Binding Domain from FHV B2 Protein. Front Plant Sci. 9, 70 (2018).
- TRIzol Reagent Literature. RNA Isolation with TRIzol (Invitrogen) and Qiagen RNAeasy. Invitrogen Life Technologies. , Available from: http://www.ocg.cancer.gov/sites/default/files/RNA_Trizol_NBL.pdf (2020).
- ShortCut RNase III Digestion Protocol (M0245). New England Biolabs. , Available from: www.neb.com/protocols/0001/01/01/shortcut-rnase-iii-digestion-protocol-m0245 (2020).
- IScript cDNA Synthesis Kit Technical Manual. , Available from: www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4106228.pdf (2020).
- Redente, E. F., et al. Age and sex dimorphisms contribute to the severity of bleomycin-induced lung injury and fibrosis. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 301, 510-518 (2011).
- Card, J. W., et al. Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 177, 621-630 (2006).
- Gueders, M. M., et al. Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production. Inflammation Research. 58, 845-854 (2009).
