Summary
Описанный метод экономии времени и пространства для подсчета яйцеклеток и определения скорости вылупления отдельных комаров с использованием 24 пластин культуры тканей, которые могут существенно увеличить масштаб и скорость анализа плодовитости и фертильности.
Abstract
Комары представляют собой значительную проблему общественного здравоохранения в качестве переносчиков различных патогенов. Для тех исследований, которые требуют оценки параметров пригодности комаров, в частности производства яиц и скорости вылупления на индивидуальном уровне, традиционные методы несут существенную нагрузку на исследователей из-за высокой интенсивности труда и требований к лабораторным помещениям. Описанный простой метод, используя 24 хорошо ткани культуры пластины с агарозой в каждой хорошо и цифровой визуализации каждой хорошо, чтобы определить яйца номера и люк ставки на индивидуальном уровне с существенно сокращенным временем и пространством требования.
Introduction
Борьба с комарами для защиты человека от переносных патогенов является важной целью общественного здравоохранения, главным образом из-за отсутствия эффективных вакцин для большинства патогенных микроорганизмов, переносимых комарами. Многие исследования направлены на снижение пригодности комаров в сочетании с полевой применимой стратегиейсокращения популяции 1,2,3. Это включает в себя обширные исследования для создания трансгенных комаров и / или CRISPR / Cas9 нокаут линий. Такие подходы к модификации популяции требуют детальной оценки индивидуальных параметровпригодности 4. Обычные лабораторные методы для оценки пригодности самок комаров включает в себя индивидуальное сдерживание мякотных, сытых кровью самок комаров в 100 млконтейнеров 5, модифицированных 50 мл конических трубок, или трубки для Дрозофила выращивания модифицированных путем предоставления влажных поверхностей с использованием влажного хлопка и фильтра бумажных дисков для овипозиции (т.е. яйцеклетки)1,2,6,7. Такие методы требуют относительно большого пространства (например, 30 см х 30 см х 10 см: W x L x H для до 100 трубок дрозофилы) (рисунок 1), а также манипуляцииотдельными яичными бумагами для подсчета яиц и вылупления личинок, которые могут быть трудоемкими. Эта рукопись представляет собой метод подсчета яиц комаров и определения ставки люков с использованием 24 пластин и агарозы в качестве поверхности овипозиции, чтобы обойти этивопросы 8.
Параллельно Ioshino et al. 9 описалподробный метод использования 12 и 24 пластин хорошо для выполнения подсчета яйцеклеток, полученных от отдельных женщин. Их протокол представляет собой значительное улучшение по сравнению с обычными методами в экономии времени ипространства 9. Тем не менее, протокол они описали продолжает использовать влажную фильтровальную бумагу в качестве поверхности для овипозиции, которая требует раскрытия каждой отдельной бумаги, чтобы получить рассчитывает, как яйца часто находятся под или в складках. Их протокол также не включает использование технологий визуализации или метода подсчета личинок.
Представлено улучшенный метод для выполнения фитнес-анализов на количество яйцеклеток (т.е. плодовитость) и скорость люка (т.е. плодородие), используя агарозу в качестве поверхности овипозиции в формате 24 хорошо ткани культуры пластины для Ae. aegypti, чтоoviposit на влажных поверхностях. Эти пластины были названы "EAgaL" пластины, от Egg, Ага розы,и Lарва. Эти 24 хорошо пластины обеспечивают отдельных комаров с минимальной поверхностью, чтобы отложить яйца, тем самым упрощая и резко сокращая время и усилия, необходимые для подсчета и поддержания яиц и вылупившихся личинок в течение нескольких дней. Пластина EAgaL использует полупрозрачную агарозу для поверхности овипозиции, что устраняет необходимость обработки яичных бумаг и нахождения яиц и личинок при вылуплении; фотографирование каждого хорошо устанавливает долгосрочную архивную запись результатов и отделяет процесс подсчета как во времени, так и в пространстве от процесса воспитания/обработки, где время часто ограничено.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка плиты
- Сверлить отверстия в 24 крышках пластины культуры ткани скважины (4'6 отверстий на скважину) с помощью бытовой дрели с битом 1,6 мм (1/16 дюйма)(рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти отверстия предотвращают конденсации воды от агары накапливаться на крышке, где комары могут откладывать яйца. Стандартный размер женского штамма Ae. aegypti ("Ливерпуль") составляет 3,11 мм размах крыльев. Уменьшение размера отверстий рекомендуется при использовании небольших комаров, чтобы избежать выхода из тарелки. - За день до эксперимента по овипозиции тщательно промойте и промойте пластины и замочите их в отбеливателе 1,5% в течение 30–60 минут при комнатной температуре. Тщательно промыть под бегущей деионизированной водой и высушить их.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс снижает вероятность грибков и бактерий, растущих на агарозе. - Растопить агарозу на 2% в деионизированной воде и сразу же добавить 500 йл расплавленной агарозы в каждой хорошо из 24 пластин хорошо с помощью 1000 МКЛ пипетки (Рисунок 3A,B). Когда агароза начинает остыть и засорять кончик пипетки, разогреть агаросу и использовать новый наконечник пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте прикосновения к стенам колодец с кончиком пипетки, потому что это может оставить кусок агарозы на стене, где самка может отложить яйца, усложняя процесс визуализации и подсчета голосов. - Перед использованием высушите любой конденсат на стенах хорошо на ночь на лабораторной скамейке(рисунок 3C,D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Хронология анализа пластины EAgaL от кормления крови до личинообразной визуализации изображена на рисунке 4, который для колонии комаров (Ae. aegypti "Ливерпуль" поднял под 14 ч света: 10 ч темного светлого цикла, 27 градусов по Цельсию, 80% относительная влажность, 500 личинок в 49,5 см х 29,2 см х 9,5 см лоток с 2 л воды), в условиях насекомых. Рекомендуется, чтобы каждая лаборатория проверить EAgaL пластины с комарами используются, особенно при использовании различных штаммов, различных видов комаров, а также различные протоколы воспитания.
2. Кормление комаров
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно использовать комаров, вырастих в единых условиях для всех групп лечения и контрольных групп, потому что личинородное питание оказывает влияние напараметры пригодности комаров 10,11. Задние личинки в непереполненных условиях с достаточным количеством пищи. Пусть самки комаров выклетывать в присутствии самцов так, чтобы спаривание было обеспечено, и созревать, по крайней мере, 3 дня.
- Удалите любой источник воды и/или сахара у самок комаров по крайней мере за 16 ч до кормления крови, чтобы улучшить кровопокорение.
- Нагрейте циркулятор воды для искусственного кормления при температуре 37 градусов по Цельсию и кормите самок комаров с помощью позвоночных крови, помещенных в искусственные фидерах в течение 15–30мин (рисунок 5A).
- Обезболивать комаров с CO2 или на льду, передать их в стеклянную тарелку на льду, и выбрать те, которые engorged с кровью(рисунок 5B) в контейнер при условии, с 30% сахарозы воды для более чем 72 ч, когда женщины закончить выделение и развитие яйцеклеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если самки обеспечены более низкой концентрацией воды сахарозы, удалите сахарозу воды и любых влажных поверхностей после 48 ч, чтобы предотвратить женщин от ovipositing.
3. Овипозиция
- Примерно за 1 ч до переноса комаров на пластины, добавьте 2–3 капли воды в каждую пластину с помощью переатток.
- По крайней мере 72 ч после кормления крови, нокдаун комаров с CO2 или на льду, передать их в стеклянное блюдо на льду, и индивидуально поместить каждого комара на перевернутой крышкой 24 хорошо пластины на льду (Рисунок 6A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура была применена от Ioshino и др.9. - После того, как все 24 комаров были помещены, накройте крышку перевернутымдном пластины (рисунок 6B), закредите крышку и пластину свежей, новой резинкой и поместите в экологическую камеру (или комнату длявыращивания) (рисунок 6C) до тех пор, пока комары не выздоровеют (10–15 мин)) и поверните пластину вправо вверх(рисунок 6D).
- Разрешить самкам комаровoviposit в течение 24-48 ч и удалить женщин, выпустив их из пластин в большую клетку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если важно следить за отдельными самками, обезболите их, облестив пластины и удалите их по отдельности на льду. Задержка овипозиции и темные выделения, которые мешают подсчету яйцеклеток наблюдались, когда самки были переведены на пластины раньше, чем 72 ч после еды крови (PBM) (Рисунок 7D).
4. Подсчет яиц
- Проверьте каждый колодец из 24 хорошо пластины, так как иногда комары откладывают яйца на стене колодцев и на краю агарозы / пластиковой поверхности, где они трудно решить на фотографиях. Используя влажную кисть краски, переместите яйца, заложенные на стене и краю агарозы, на плоскую поверхность агарозы, чтобы все яйца были в однородной плоскости и не перекрывались друг с другом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Край агарозы, как правило, из фокусной плоскости камеры из-за поверхностного напряжения раствора агарозы. - Используя миппы, удалите сломанные ноги, крылья и другие частицы в колодцах, которые могут помешать визуализации яиц(рисунок 7C).
- Вставьте белую бумагу под пластиной, чтобы увеличить контраст с темными яйцами комаров до изображения с помощью стереомикроскопа иллюминатор (Рисунок 7A).
- Сделайте снимок каждой колодец с помощью компактной цифровой камеры в режиме микроскопа, что позволяет пользователю сосредоточиться на объектах размером до 1 см. Эта возможность позволяет камере быть помещены непосредственно на тарелку для изображения яиц без штатива или стенда(рисунок 7A). Чтобы различать отдельные яйца, уложенные в сгустки, используйте тонкий или супер-тонкий режим для захвата изображений с высоким разрешением, чтобы можно было увидеть детали крупным планом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очистить карту памяти камеры перед использованием, чтобы предотвратить путаницу между новыми и старыми изображениями. - После фотографирования каждого колодец пластины, возьмите изображение всей пластины с этикеткой заказа изображения, чтобы отличить каждую пластину позже(рисунок 7E).
- Добавьте тонкий слой в 5 капель воды (200 мл) с помощью переаттоки для каждой из них, чтобы предотвратить высыхание агарозы и яиц, а также стимулировать развитие эмбриона и вылупление. Обратите внимание на уровень воды в течение первых нескольких часов и проверяйте каждый день, потому что может быть потеря воды из-за поглощения агарозой или испарения. Добавить воду, когда ее уровень слишком низок для личинок, чтобы люк.
ПРИМЕЧАНИЕ: Испарение воды происходит не равномерно как внутри тарелки, так и внутри стопки пластин. Было отмечено, что сушка происходит в следующем порядке: 1) угловые скважины (A1, A6, D1, D6) высыхают быстрее всего; 2) скважины на внешнем краю пластины (A2-A5, B1, B6, C1, C6, D2-D5); и последние 3) скважины внутри. Когда пластины укладываются, верхняя пластина высыхает быстрее всего. - Перенесите изображения на компьютер с ImageJ (Фиджи) и переименуйв файлы для более простой организации, такой как «идентификация пластины» .jpg(рисунок 8A,B).
- Создайте файл электронной таблицы для записи номеров яиц (т.е. плодовитости) и числа личинок и вычислите скорость люка (т.е. плодородие)(рисунок 9E).
- Откройте изображения с помощью ImageJ (Фиджи)12 и используйте инструмент«много тока»для разметки каждого яйца(рисунок 9АЗК); увеличить или увеличить с помощью"з"или "-" ключ, чтобы подсчитать яйца в сгустки. После маркировки всех яиц, дважды нажмите многоо точка значок, чтобы принести вверх количество знаков (Рисунок 9D). Запись результатов в электронной таблице.
5. Оценка фертильности
ПРИМЕЧАНИЕ: Через 2 дня, первые личинки звезды могут начать выкрыскивки в скважинах. Подождите еще 3-5 дней, прежде чем изображения / подсчета, чтобы убедиться, что все жизнеспособные яйца люк.
- Подготовка личиночинок пищи путем смешивания 1/16 столовой ложки (168 мг) молотой рыбной пищи (т.е. нормальная диета личинки комаров) в 20 мл воды и ждет больших твердых частиц, чтобы поселиться (Рисунок 10A 'D). Начните добавлять пищу (супернатант) в колодцы, которые содержат вылупившихся личинок, как только они появляются, потому что они не выживают долго без пищи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избыточное добавление частиц пищи может помешать визуализации и подсчету вылупившихся личинок. - Примерно через 5-8 дней после добавления воды в скважины, охладить пластину, покрывая дробленым льдом в течение 15-20 минут для анестезии личинок.
- Возьмите изображения каждого хорошо, сохраняя пластины на льду, как это было сделано с яйцами. Для изображений личинок, обеспечить темный фон, вставив черный материал под пластиной, чтобы помочь повысить контрастность. После фотографирования каждого колодец пластины, возьмите изображение всей пластины с изображением этикетки порядка различать каждую пластину позже.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения принимаются в то время как пластины находятся на льду, потому что личиноное движение может поставить под угрозу подсчет. Пластины многоразовые; заморозить и удалить комаров и агарозы для очистки для следующего использования. Пластина EAgaL не подходит для выращивания личинок на поздних стадиях. - Откройте изображения с ImageJ (Фиджи) и используйте«многотяжный»инструмент для подсчета, нажав на каждую личинку. В течение 3-5 дней некоторые личинки могут линять, особенно в колодцах с низким количеством личинок. Поэтому, при подсчете, исключите проруби сарая (т.е. exuviae), которые выглядят как личинки только для головы с небольшим количеством тела, или сморщенные личинки(рисунок 10E). Запись результатов в таблице.
6. Выполнить анализ
- Со сбором всех необходимых данных для анализа плодовитости и фертильности, выполнить соответствующий статистический анализ и создать графики с использованием предпочтительного программного обеспечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Комары были введены с dsRNA ориентации кандидата транспортер железа (FeT) или контроль гена (EGFP), крови кормили, и измеряется на плодовитость и плодовитость выход с помощью метода пластины EAgaL, после процедуры, описанной выше.
Комары, в которых выражение FeT замолчали после инъекции dsRNA, продемонстрировали значительное снижение как количества яиц, так и скоростивылупления (рисунок 11AиC). Все контрольные и лечебные комары были помещены в пластины EAgaL после 72 ч PBM. FeT-глушить комаров также выставлены задержки выделения и малых и светлых яиц(рисунок 12A,B). Примеры также можно найти в Цудзимото и др.8.
Рисунок 1: Fly трубки обычно используются для комаров плодовитость / фертильность анализы. (A)Одна трубка с влажным хлопком и круглой фильтровальной бумагой с крышкой губки. (B) 100 трубок в стойке (30 см x 30 см). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Бурение отверстий в крышке 24 хорошо пластины культуры ткани. (A)Бурение в процессе. (B)крышка с отверстиями, которые предотвращают конденсацию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Применение агарозы (2% в воде) в колодцы. (A)Применение агарозы с помощью трубы 1000 йл. Обратите внимание, что наконечник не касается стены колодеца. (B)Пластина, содержащая агарозу на дне. (C)Стена хорошо сразу после агарозы затвердело. Обратите внимание на конденсат на стене. (D)Стена колодеца, когда конденсат испаряется. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Хронология от кормления крови (день 0) до личинонной визуализации (день 10–13). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Искусственное кровопокорие и отбор женщин с ангангами. (A)Кормление крови с помощью искусственной подачи. (B)Отбор женщин на льду. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Перевод самок на пластину EAgaL. (A)Передача анестезированых самок в перевернутую крышку пластины на льду. (B) Затем осторожно поместите перевернутую агарозсодержащую пластину на перевернутуюкрышкуи ( C ) удалите пластину с крышкой, прикрепленной от льда, и держите ее в перевернутом положении до тех пор, пока самки не оправились от анестезии. (D,E) Поверните женскую пластину в восходящее положение. Обратите внимание, что крышка и нижняя часть пластины находятся в резиновой полосе и что нижняя часть помечена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Изображение каждого хорошо после того, как женщины были удалены. (A) Цифровая камера на вершине яйцо-содержащих 24 хорошо пластины для изображений. (B)Типичное изображение колодеца. (C)Хорошо содержащий ногу, которая должна быть удалена. (D)Образец изображения хорошо, в котором женщина была помещена на 48 ч PBM. Обратите внимание на темные знаки выделения, которые могут усложнить подсчет яйцеклеток (стрелки). (E)Вся пластина с изображением этикетки заказа подготовлены после изображения всех скважин пластины. Это помогает распознавать скважины во время анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 8: Переименование изображений для лучшей организации. (A)Изображения отдельных яйцевидных колодцев, включая метку заказа изображений с именами, автоматически присвоенным камерой. (B)Те же изображения, переименованные plateID_wellID.jpg формат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 9: Подсчет яиц с использованием программного обеспечения "Fiji" (ImageJ2). (A) Скриншот программного обеспечения Фиджи, показывающий"многоо пункта"инструмент выделен (бирюзовый квадрат). (B)Хорошо изображение с Фиджи рассчитывать знаки на яйцах. (C)Масштабирование помогает при подсчете больших групп яиц. (D)Двойное нажатие значка инструмента«много тока»на главном окне показывает количество (красный круг). (E)Пример электронной таблицы с формулой расчета скорости люка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 10: Ларвал приготовления диеты и хорошо содержащие личинки и exuviae. (A)Молотая рыбная пища. (B) 20 мл воды в чашке. (C)Смесь молотой рыбной пищи и воды. (D)Еда/вода поселились в течение 15 мин. Возьмите supernatant этой смеси в качестве личинок пищи. (E)Ну с расплавленными личинками; репрезентативные exuviae обозначены стрелками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 11: Подсчитайте данные эксперимента по замалчиваю гену. Комары, вводимые с dsRNA против матора железа (FeT) продемонстрировализначительное сокращение( A ) количество яиц, (B) личинок, и (C) скорость люка по сравнению с контролем (EGFP). Бары показывают среднее ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 12: Репрезентативные изображения скважин, показывающие дополнительные фенотипы в генных заглушеных комарах. dsFeT показал задержку выделения (темно-коричневые отметины) и маленькие, слегка окрашенные яйца. Показаны две репрезентативные скважины для каждого лечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| фут | EAgaL | |
| (1) Подготовка | 20 мин 29,0 сек | 3 мин 49,3 сек |
| (2) F_in | 3 мин 55,0 сек | 1 мин 56,0 сек |
| (3) F_out/E_img | 43 мин 44,3 сек | 15 мин 28,3 сек |
| (4) L_img | 38 мин 03,5 сек | 9 мин 30,5 сек |
Таблица 1: Требования к времени для завершения метода трубки мухи (FT) по сравнению с методом пластины EAgaL. (1) Подготовка: Время, необходимое для места хлопка, залить водой, и вставить фильтр бумажный диск в Drosophila воспитания труб (FT) по сравнению с заливкой агарозы в скважины 24 пластины скважины (EAgaL). (2) F_in: Время, необходимое для места отдельных комаров в выращивании труб (FT) или скважины 24 пластины скважины (EAgaL). (3) F_out/E_img: Время, необходимое для выпуска комаров в большую клетку, удалить, развернуть яичную бумагу, и изображение яйца на бумаге (FT) или освободить комаров в большую клетку и изображение каждого колодец из 24 хорошо пластины (EAgaL). (4) L_img: Время, необходимое для изображения личинок, вылупившихся в небольшом контейнере (FT) или каждый колодец из 24 пластины (EAgaL) после холодной анестезии. В общей сложности 24 трубки были использованы для FT.
| Массовые расходы | |||||
| EAgaL пластины | Fly трубки | ||||
| пункт | цена | количество | пункт | цена | количество |
| 24-хорошо пластины | $45.61 | Дело 50 | Бумажные листы хроматографии | $103.63 | 46 × 57 см 100 листов/ПК |
| агароза | $250.97 | 500 г | Стойки для трубок fly и трубки | $68.45 | 5 лотков по 100 |
| Олимп ТГ-6 | $375.00 | Fly трубки пробки | $66.10 | Дело 200 | |
| Хлопковые шарики | $104.27 | Случай 2000 года | |||
| Итого стартапа | $671.58 | Итого стартапа | $342.45 | ||
| Стоимость единицы (пластина 24-хорошо или 24 трубки) | |||||
| EAgaL пластины | Fly трубки | ||||
| пункт | цена | заметка | пункт | цена | заметка |
| 24-хорошо пластины | $0.91 | оптовая цена/50 | Бумажные листы хроматографии | $0.16 | 641.7 комплекты 24 труб стоимостью (2) |
| Агароза на тарелку | $0.15 | 500 г 1667 пластин (1) | Стойки для трубок fly и трубки | $3.29 | (бык цена/500) × 24 |
| Fly трубки пробки | $7.93 | (оптовая цена/200) × 24 | |||
| Хлопковые шарики | $1.25 | (оптовая цена/2000) × 24 | |||
| Общее количество единиц | $1.06 | Общее количество единиц | $12.63 | ||
Таблица 2: Сравнение затрат между пластиной EAgaL и FT. Вверху: Массовые затраты на запуск (при условии, что дрель и дрель бит может быть предоставлена исследователем). Внизу: Оценочные затраты на одну пластину 24 хорошо (EAgaL пластины) и 24 FT. (1) Предполагая, пластина требует чуть больше, чем просто достаточно для 24 пластины хорошо (12mL), 15 мл 2% и 0,3 г агарозы на тарелку, в общей сложности 500 г агарозы может сделать 1667 пластин. (2) Один лист бумаги может сделать 154 из 38 мм диаметром дисков. С 100 листов, 641,7 (15400/24) наборы из 24 трубок могут быть сделаны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Пластина EAgaL резко сокращает труд, время и пространство для проведения индивидуальных анализов плодовитости и фертильности в Aedes aegypti по сравнению с методом FT. Предварительное сравнение метода FT и пластины EAgaL привело к сокращению времени для всех этапов (техника визуализации была применена к методу FT)(таблица 1). В качестве эталона в таблице 2 представлена оценка стартапа и анализа (одна 24 хорошо пластины EAgaL против 24 FTs).
Есть несколько моментов, чтобы рассмотреть при использовании EAgaL пластин. Первоначальная озабоченность была то, что комары, помещенные в таком небольшом пространстве не может отложить все яйца из-за ограниченного движения. Чтобы определить, если это было так, комары были переданы коллективно в большую клетку с чашкой oviposition выстроились с бумажным полотенцем с водой для дополнительных 48 ч после того как они провели 48 ч в EAgaL пластин. Комары действительно откладывают дополнительные яйца, однако среднее число яиц на одну самку составляет лишь 2,1, что не приводит к какой-либо разнице в результатах какого-либо статистического анализа в большинстве, если не во всех случаях. Эти цифры от более чем 500 комаров испытания (данные не показаны). Тем не менее, это может быть исключительно для Ae. aegypti "Ливерпуль" комаров штамма с условиями, описанными. Каждая лаборатория, возможно, потребуется проверить, является ли это в случае его комаров и условий.
Для визуализации одно изображение камеры, прикрепленное к стереомикроскопу, не охватывает весь колодец даже при самом низком увеличении. Это потребовало получения нескольких изображений на колодец и, в свою очередь, исправления изображений, или отслеживания яиц перекрываются в нескольких изображений же хорошо. Оба подхода серьезно осложнили анализ и значительно увеличили объемы задействованной рабочей силы. Кроме того, из-за характера стереомикроскопа, угол камеры всегда немного влево или вправо от перпендикулярного угла, что делает левую или правую боковую стену блок частью поверхности агарозы.
Загрязнение микроорганизмами, особенно грибами, может быть проблемой во время анализа. Хотя отбеливание может свести к минимуму загрязнение до овипозиции, грибы могут присутствовать в среде насекомых и переноситься самими комарами. В таких случаях поддержание чистоты мест для насекомых может снизить заболеваемость. Лучше всего для каждой лаборатории, чтобы проверить EAgaL пластины для обнаружения любых потенциальных проблем.
Обратите внимание, что метод пластины EAgaL не был разработан для поддержания культур комаров за пределами ранних личинок. Среднее количество личинок на колодец, как правило, составляет более 60, и это не редкость иметь более 100 личинок на колодец. Это создает переполненные условия, которые приводят к задержке в развитии, более низкий уровень окукливания, и очень маленьких взрослых, которые могут поставить под угрозу вниз по течению исследований.
В настоящее время этот метод был протестирован только с Ae. aegypti. Тем не менее, в настоящее время тестируется, чтобы расширить свое применение на другие виды Aedes и даже другие роды комаров, таких как Anopheles и Culex.
Из-за сокращения времени и пространства требования к методу пластины EAgaL, плодовитость и плодородие анализы могут быть увеличены до полу-высокой пропускной способности (т.е. 5-10 пластин или более за эксперимент). Эта особенность метода пластины EAgaL может быть чрезвычайно полезна для оценки важных параметров пригодности комаров для тестирования на инсектициды, оценки стерильности, трансгенеза и исследований редактирования генов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о конфликте интересов для этого исследования.
Acknowledgments
Мы благодарим Техас АЗМ Agrilife исследований насекомых векторных заболеваний Грант программы для финансирования. Мы также благодарим сотрудников лаборатории Адельмана за помощь в разработке этого метода и предложения при составлении рукописи, а также сотрудников лаборатории Кевина Майлза. Мы также благодарим рецензентов и редакторов за помощь в улучшении этой рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm Φ drill bit | alternatively heated nails can be used | ||
| 1000 μL pipette tips (long) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| 24-well tissue culture plate | Thermo Scientific | 930186 | clear, flat-bottom with ringed lid plates |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Compact digital camera | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Computer (Windows, Mac or Linux) | |||
| Deionized water | |||
| Fiji (imageJ) software | download from: https://fiji.sc/ | ||
| Forceps | Dumont | sharp forceps may break mosquito's body | |
| Glass Petri dishes | VWR | ||
| Household bleach | |||
| Household electric drill | |||
| illuminator for stereomicroscope (gooseneck) | |||
| P-1000 pipette | Gilson | ||
| paint brushes | |||
| Rubber bands | |||
| SD card | to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better) | ||
| Spreadsheet software (Microsoft Excel) | Microsoft | Any spreadsheet software works | |
| TetraMin fish food | Tetra | ground with coffee grinder, blender or morter & pestle | |
| Transfer pipetts | VWR | 16011-188 |
References
- Bond, J. G., et al. Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program. PLoS One. 14 (2), 0212520 (2019).
- Fernandes, K. M., et al. Aedes aegypti larvae treated with spinosad produce adults with damaged midgut and reduced fecundity. Chemosphere. 221, 464-470 (2019).
- Inocente, E. A., et al. Insecticidal and Antifeedant Activities of Malagasy Medicinal Plant (Cinnamosma sp.) Extracts and Drimane-Type Sesquiterpenes against Aedes aegypti Mosquitoes. Insects. 10 (11), 373 (2019).
- Marrelli, M. T., Moreira, C. K., Kelly, D., Alphey, L., Jacobs-Lorena, M. Mosquito transgenesis: what is the fitness cost. Trends in Parasitology. 22 (5), 197-202 (2006).
- da Silva Costa, G., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Toward a blood-free diet for Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. , 217 (2019).
- Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti. PeerJ. 3, 938 (2015).
- Gonzales, K. K., et al. The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement, on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 11023 (2018).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of Candidate Iron Transporters From the ZIP/ZnT Gene Families in the Mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Ioshino, R. S., et al. Oviplate: A Convenient and Space-Saving Method to Perform Individual Oviposition Assays in Aedes aegypti. Insects. 9 (3), 103 (2018).
- Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasites & Vectors. 8, 252 (2015).
- Valerio, L., Matilda Collins, C., Lees, R. S., Benedict, M. Q. Benchmarking vector arthropod culture: an example using the African malaria mosquito, Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae). Malaria Journal. 15 (1), 262 (2016).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
