Summary
Descritto è un metodo di risparmio di tempo e spazio per contare le uova e determinare i tassi di schiusa delle singole zanzare utilizzando 24 piastre di coltura tissutale del pozzo, che possono aumentare sostanzialmente la scala e la velocità dei test di fecondità e fertilità.
Abstract
Le zanzare rappresentano un problema significativo di salute pubblica come vettori di vari agenti patogeni. Per quegli studi che richiedono una valutazione dei parametri di fitness delle zanzare, in particolare la produzione di uova e i tassi di schiusa a livello individuale, i metodi convenzionali hanno gravato in modo sostanziale sugli investigatori a causa dell'elevata intensità di lavoro e dei requisiti di spazio di laboratorio. Descritto è un metodo semplice che utilizza 24 piastre di coltura tissutale del pozzo con agarosio in ogni pozzo e imaging digitale di ogni pozzo per determinare il numero di uova e i tassi di schiusa a livello individuale con requisiti di tempo e spazio sostanzialmente ridotti.
Introduction
Il controllo delle zanzare per proteggere gli esseri umani da agenti patogeni trasmesse da vettori è un importante obiettivo di salute pubblica, principalmente a causa della mancanza di vaccini efficaci per la maggior parte degli agenti patogeni trasportati dalle zanzare. Molti studi mirano a ridurre la forma fisica delle zanzare in combinazione con una strategia di riduzione della popolazioneapplicabile sul campo 1,2,3. Ciò include studi approfonditi per creare zanzare transgeniche e / o linee knockout CRISPR / Cas9. Tali approcci di modifica della popolazione richiedono una valutazione dettagliata dei singoli parametri di idoneità4. Le tecniche di laboratorio convenzionali per valutare l'idoneità delle zanzare femminili includono il contenimento individuale di zanzare femminili accoppiate e alimentate a sangue in contenitori da 100 ml5,tubi conici modificati da 50 ml o tubi per l'allevamento di Drosophila modificati fornendo superfici umide utilizzando cotone umido e dischi di carta filtrante per l'ovideposizione (cioè carte d'uovo)1,2,6,7. Tali metodi richiedono uno spazio relativamente grande (ad esempio, 30 cm x 30 cm x 10 cm: W x L x H per un massimo di 100 tubi Drosophila) (Figura 1),e la manipolazione di singole carte uovo per il conteggio di uova e larve da cova, che possono essere laboriose. Questo manoscritto presenta un metodo per contare le uova di zanzara e determinare i tassi di schiusa utilizzando 24 piastre di pozzo e agarosio come superficie di ovideposizione peraggirare questi problemi 8.
Contemporaneamente, Ioshino etal. Il loro protocollo rappresentava un miglioramento significativo rispetto ai metodi convenzionali nel risparmiare tempo espazio 9. Tuttavia, il protocollo che hanno descritto continua a utilizzare carta filtrante bagnata come superficie per l'ovideposizione, che richiede lo spiegamento di ogni singola carta per ottenere conteggi, poiché le uova si trovano spesso sotto o in pieghe. Il loro protocollo inoltre non includeva l'uso di tecnologie di imaging o un metodo per il conteggio larvale.
Presentato è un metodo migliorato per eseguire test di fitness per il numero di uova (cioè fecondità) e il tasso di schiusa (cioè la fertilità) usando l'agarosio come superficie di ovideposizione in un formato di piastra di coltura tissutale di 24 po 'per Ae. aegypti che oviposit su superfici umidi. Queste tavole sono state chiamate piatti "EAgaL", da Egg, Agarose e Larva. Questi 24 piastre di pozzo forniscono alle singole zanzare una superficie minima per deporre le uova, semplificando e riducendo drasticamente il tempo e lo sforzo necessari per contare e mantenere le uova e le larve tratteggiate per alcuni giorni. La piastra EAgaL utilizza agarosio traslucido per la superficie di ovideposizione, che elimina la necessità di maneggiare le carte uovo e trovare le uova e le larve quando schiuse; fotografare ogni pozzo stabilisce una registrazione archiviata a lungo termine dei risultati e separa il processo di conteggio sia nel tempo che nello spazio dal processo di allevamento / movimentazione, dove il tempo è spesso limitato.
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Protocol
1. Preparazione della piastra
- Praticare fori in 24 coperchi di piastre di coltura tissutale bene (4−6 fori per pozzo) utilizzando un trapano domestico con un bit ~1,6 mm (1/16 in)(Figura 2).
NOTA: Questi fori impediscono la condensa dell'acqua dall'agarosio per accumularsi sul coperchio, dove le zanzare possono deporre le uova. La dimensione standard della femmina Ae. aegypti ("Liverpool" strain) è di ~ 3,11 mm di apertura alare. Si consiglia di ridurre le dimensioni dei fori quando si utilizzano zanzare più piccole per evitare la fuga dalla piastra. - Il giorno prima dell'esperimento di ovideposizione, lavare e risciacquare accuratamente le piastre e immergerle in candeggina all'1−5% per 30−60 minuti a temperatura ambiente. Risciacquare accuratamente sotto l'acqua deionizzata corrente e asciugarli.
NOTA: Questo processo riduce la possibilità che funghi e batteri crescono sull'agarosio. - Sciogliere l'agarosio al 2% in acqua deionizzata e aggiungere immediatamente 500 μL dell'agarosio fuso ad ogni pozzo delle 24 piastre del pozzo utilizzando una pipetta da 1.000 μL(Figura 3A,B). Quando l'agarosio inizia a raffreddarsi e ostruire la punta della pipetta, surriscaldare l'agarosio e utilizzare una nuova punta di pipetta.
NOTA: Evitare di toccare le pareti del pozzo con la punta della pipetta perché può lasciare un pezzo di agarosio sul muro dove una femmina può deporre le uova, complicando il processo di imaging e conteggio. - Prima dell'uso, asciugare qualsiasi condensa sulle pareti del pozzo durante la notte su un banco da laboratorio(Figura 3C,D).
NOTA: La sequenza temporale del saggio della piastra EAgaL dall'alimentazione del sangue all'imaging larvale è raffigurata nella figura 4, che è per le zanzare colonia(Ae. aegypti "Liverpool" allevato sotto 14 h di luce:10 h ciclo di luce scura, 27 °C, 80% umidità relativa, 500 larve in un vassoio di 49,5 cm x 29,2 cm x 9,5 cm con 2 L di acqua), in condizioni insetti. Si raccomanda a ciascun laboratorio di testare la piastra EAgaL con le zanzare utilizzate, specialmente quando si utilizzano ceppi diversi, diverse specie di zanzare e diversi protocolli di allevamento.
2. Alimentazione delle zanzare
NOTA: È fondamentale utilizzare zanzare allevate in condizioni uniformi per tutti i gruppi di trattamento e gruppi di controllo, perché la nutrizione larvale ha un impatto sui parametri di fitness delle zanzare10,11. Larve posteriori in condizioni poco affollate con cibo sufficiente. Lascia che le zanzare femminili echino in presenza di maschi in modo che l'accoppiamento sia assicurato e maturi per almeno 3 giorni.
- Rimuovere qualsiasi fonte di acqua e /o zucchero dalle zanzare femminili almeno 16 ore prima dell'alimentazione del sangue al fine di migliorare l'alimentazione del sangue.
- Riscaldare un circolatore d'acqua per l'alimentazione artificiale a 37 °C e nutrire le zanzare femminili utilizzando sangue vertebrato posto in alimentatori artificiali per 15−30 min(Figura 5A).
- Anestetizzare le zanzare con CO2 o sul ghiaccio, trasferirle in un piatto di vetro sul ghiaccio e selezionarne di ornate di sangue (Figura 5B) in un contenitore dotato di acqua di saccarosio al 30% per più di 72 ore, quando le femmine terminano l'escrezione e lo sviluppo delle uova.
NOTA: Se alle femmine viene fornita una concentrazione inferiore di acqua di saccarosio, rimuovere l'acqua di saccarosio e le eventuali superfici umide dopo 48 ore per evitare che le femmine ovipositing.
3. Ovideposizione
- Circa 1 h prima di trasferire le zanzare alle piastre, aggiungere 2−3 gocce (~80−120 μL) di acqua in ogni piastra bene usando una pipetta di trasferimento.
- Almeno 72 ore dopo l'alimentazione del sangue, abbattere le zanzare con CO2 o sul ghiaccio, trasferirle in un piatto di vetro sul ghiaccio e posizionare individualmente ogni zanzara su un coperchio rovesciato del piatto di 24 pozzetti sul ghiaccio(Figura 6A).
NOTA: Questa procedura è stata applicata da Ioshino etal. - Una volta posizionate tutte le 24 zanzare, coprire il coperchio con un fondo piastra rovesciato(Figura 6B),fissare il coperchio e la piastra con un nuovo elastico fresco e posizionare in una camera ambientale (o in una stanza di allevamento)(Figura 6C)fino a quando le zanzare non si riprendono (~ 10−15 min) e ruotano il lato destro della piastra verso l'alto(Figura 6D).
- Lasciare che le zanzare femminili ovoposi per 24−48 h e rimuovere le femmine rilasciandole dai piatti in una grande gabbia.
NOTA: Se è importante tenere traccia delle singole femmine, anestetizzarle raffrezzandole e rimuoverle singolarmente sul ghiaccio. L'ovideposizione ritardata e le escrezioni scure che interferiscono con il conteggio delle uova sono state osservate quando le femmine sono state trasferite nelle piastre prima di 72 ore dopo la farina di sangue (PBM) (Figura 7D).
4. Conteggio delle uova
- Controlla ogni pozzo della piastra del pozzo 24, poiché a volte le zanzare depongono le uova sulla parete dei pozzi e a margine della superficie agarosio / plastica, dove sono difficili da risolvere nelle fotografie. Usando un pennello bagnato, spostare le uova deposte sul muro e sul bordo dell'agarosio sulla superficie piatta dell'agarosio in modo che tutte le uova si trovano su un piano uniforme e non si sovrappongano tra loro.
NOTA: Il bordo dell'agarosio è in genere fuori dal piano focale della fotocamera a causa della tensione superficiale della soluzione di agarosio. - Utilizzando le forcep, rimuovere eventuali gambe rotte, ali e altre particelle nei pozzi che possono interferire con l'imaging delle uova (Figura 7C).
- Inserire carta bianca sotto la piastra per aumentare il contrasto con le uova di zanzara scure prima dell'imaging utilizzando un illuminatore stereomicroscopico (Figura 7A).
- Scatta un'immagine di ogni pozzo utilizzando una fotocamera digitale compatta in modalità microscopio, che consente all'utente di concentrarsi su oggetti fino a 1 cm. Questa capacità consente di posizionare la fotocamera direttamente sulla piastra per immagini le uova senza treppiede o supporto (Figura 7A). Per distinguere le singole uova deposte in ciuffi, utilizzare la modalità fine o super fine per catturare immagini ad alta risoluzione in modo da poter visualizzare i dettagli ravvicinati.
NOTA: cancellare la scheda di memoria della fotocamera prima dell'uso per evitare confusione tra immagini nuove e vecchie. - Dopo aver fotografato ogni pozzo di una lastra, scattare un'immagine dell'intera lastra con un'etichetta dell'ordine di imaging per distinguere ogni lastra in un secondo momento (Figura 7E).
- Aggiungere uno strato sottile ~ 5 gocce d'acqua (~ 200 μL) con una pipetta di trasferimento ad ogni pozzo per evitare che il suo tappo di agarosio e le uova si asciughino e per indurre lo sviluppo e la schiusa dell'embrione. Prestare attenzione ai livelli dell'acqua per le prime ore e controllare ogni giorno, perché potrebbe esserci perdita d'acqua dovuta all'assorbimento da parte dell'agarosio o all'evaporazione. Aggiungere acqua quando il suo livello è troppo basso per far schiudere le larve.
NOTA: L'evaporazione dell'acqua avviene in modo non uniforme sia all'interno di una piastra che all'interno di una pila di piastre. È stato osservato che l'essiccazione avviene nel seguente ordine: 1) i pozzi d'angolo (A1, A6, D1, D6) si asciugano più velocemente; seguito da 2) pozzi sul bordo esterno della piastra (A2-A5, B1, B6, C1, C6, D2-D5); e ultimi 3) pozzi all'interno. Quando le piastre sono impilate, la piastra superiore si asciuga più velocemente. - Trasferire le immagini in un computer con ImageJ (Fiji) e rinominare i file per un'organizzazione più semplice, ad esempio "[ID piastra]_[ID pozzo].jpg" (Figura 8A,B).
- Creare un file di foglio di calcolo per registrare i numeri delle uova (ad esempio, fecondità) e i numeri larvali e calcolare la velocità di tratteggio (cioè la fertilità)(Figura 9E).
- Aprite le immagini con ImageJ (Fiji)12 e usate lo strumento "multi-punto" per contrassegnare ogni uovo (Figura 9A−C); zoom-in o zoom-out usando "+" o "–" tasto per contare le uova in ciuffi. Dopo aver segnato tutte le uova, fare doppio clic sull'icona a più punti per riportare il numero di segni (Figura 9D). Registrare i risultati in un foglio di calcolo.
5. Valutazione della fertilità
NOTA: In 2 giorni, le prime larve instar possono iniziare a precludersi nei pozzi. Attendere altri 3−5 giorni prima dell'imaging/conteggio per assicurarsi che tutte le uova vitali si schiudano.
- Preparare il cibo larvale mescolando 1/16 cucchiaio (~168 mg) di cibo macinato per pesci (cioè una normale dieta larvale di zanzara) in 20 mL di acqua e in attesa che si stabiliscino grandi particelle solide(Figura 10A−D). Inizia ad aggiungere cibo (il supernatante) ai pozzi che contengono larve tratteggiate non appena appaiono, perché non sopravvivono a lungo senza cibo.
NOTA: L'aggiunta eccessiva di particelle alimentari può interferire con l'imaging e il conteggio delle larve tratteggiate. - Circa 5-8 giorni dopo l'aggiunta di acqua ai pozzi, raffreddare il piatto coprendo con ghiaccio schiacciato per 15−20 minuti per anestetizzare le larve.
- Scatta immagini di ogni pozzo mantenendo i piatti sul ghiaccio come è stato fatto con le uova. Per le immagini larvali, fornire uno sfondo scuro inserendo un materiale nero sotto la piastra per aiutare a migliorare il contrasto. Dopo aver fotografato ogni pozzo di una piastra, scatta un'immagine dell'intera piastra con un'etichetta dell'ordine di imaging per distinguere ogni lastra in seguito.
NOTA: Le immagini vengono scattate mentre le piastre sono sul ghiaccio perché il movimento larvale può compromettere il conteggio. Le piastre sono riutilizzabili; congelare e rimuovere le zanzare e l'agarosio per pulire per il prossimo utilizzo. La piastra EAgaL non è adatta per allevare larve a stadi avanzati. - Apri le immagini con ImageJ (Fiji) e usa lo strumento "multi-punto" per contare facendo clic su ogni larva. Nel periodo di 3−5 giorni alcune larve potrebbero essere state fuse, specialmente nei pozzi con un basso numero di larve. Pertanto, durante il conteggio, escludere le cuticole del capannone (cioè le exuviae), che sembrano larve solo per la testa con un po 'di corpo, o larve rimpicciolite(Figura 10E). Registrare i risultati nel foglio di calcolo.
6. Eseguire analisi
- Dopo aver raccolto tutti i dati necessari per l'analisi della fecondità e della fertilità, eseguire analisi statistiche appropriate e creare grafici utilizzando il software preferito.
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Representative Results
Le zanzare sono state iniettate con dsRNA che prende di mira un trasportatore di ferro candidato (FeT) o un gene di controllo (EGFP), alimentato dal sangue e misurato per la fecondità e la produzione di fertilità utilizzando il metodo della piastra EAgaL, seguendo la procedura sopra descritta.
Le zanzare in cui l'espressione fet è stata silenziata a seguito dell'iniezione di dsRNA hanno mostrato una significativa riduzione sia del numero di uova che del tasso di schiusa (Figura 11A−C). Tutte le zanzare di controllo e trattamento sono state posizionate nelle piastre EAgaL dopo 72 h PBM. Le zanzare silenziate dal FeT mostravano anche escrezioni ritardate e uova piccole e di colore chiaro(Figura 12A,B). Esempi di risultati sono disponibili anche in Tsujimoto etal.
Figura 1: Tubi a mosca comunemente usati per i test di fecondità/fertilità delle zanzare. (A) Un unico tubo con cotone umido e carta filtrante circolare con cappuccio in spugna. (B) 100 tubi in un rack (~30 cm x 30 cm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Fori di perforazione in un coperchio di 24 piastre di coltura tissutale del pozzo. (A) Perforazione in corso. (B) Un coperchio con fori che impediscono la condensa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Applicazione dell'agarosio (2% in acqua) nei pozzi. (A) Applicazione dell'agarosio mediante pipetta da 1.000 μL. Si noti che la punta non tocca il muro del pozzo. (B) Una lastra contenente agarosio sul fondo. (C) Parete di un pozzo subito dopo il solidificato dell'agarosio. Si noti la condensa sul muro. (D) Parete di un pozzo quando la condensa evapora. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Cronologia dall'alimentazione del sangue (giorno 0) all'imaging larvale (giorno 10−13). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Alimentazione artificiale del sangue e selezione delle femmine ingoiate. (A) Alimentazione del sangue mediante alimentatore artificiale. (B) Selezione delle femmine ingoiate sul ghiaccio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Trasferimento delle femmine alla piastra EAgaL. (A) Trasferire le femmine anestetizzate in un coperchio di piastra rovesciato sul ghiaccio. (B) Posizionare quindi con cura la piastra invertita contenente agarosio sul coperchio rovesciato e(C)rimuovere la piastra con coperchio attaccato dal ghiaccio e mantenerla in posizione invertita fino a quando le femmine non si sono riprese dall'anestesia. (D,E) Ruotare la piastra contenente femmina verso l'alto. Si noti che il coperchio e la parte inferiore della piastra sono tenuti da un elastico e che la parte inferiore è etichettata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Imaging di ogni pozzo dopo la rimozione delle femmine. (A) Fotocamera digitale sopra una piastra contenente 24 pota di uova per l'imaging. (B) Immagine tipica di un pozzo. (C) Un pozzo contenente una gamba, che deve essere rimosso. (D) Immagine campione di un pozzo in cui una femmina era stata collocata a 48 h PBM. Nota i segni di escrezione scura, che possono complicare il conteggio delle uova (frecce). (E) Intera lastra con un'etichetta dell'ordine di imaging preparata in seguito all'imaging di tutti i pozzi della lastra. Questo aiuta a riconoscere i pozzi durante l'analisi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Rinominare le immagini per una migliore organizzazione. (A) Immagini di singoli pozzi contenenti uova, inclusa un'etichetta dell'ordine dell'immagine con i nomi assegnati automaticamente dalla fotocamera. (B) Le stesse immagini rinominate con plateID_wellID.jpg formato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Conteggio delle uova utilizzando il software "Fiji" (ImageJ2). (A) Screenshot del software Fiji che mostra lo strumento "multi-punto" evidenziato (quadrato turchese). (B) Un'immagine del pozzo con le Figi conta i segni sulle uova. (C) Lo zoom in avanti aiuta quando si contano gruppi di uova più grandi. (D) Facendo doppio clic sull'icona dello strumento "multi-punto" nella finestra principale viene visualizzato il conteggio (cerchio rosso). (E) Esempio di foglio di calcolo con formula di calcolo della velocità tratteggiata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10: Preparazione della dieta larvale e larve ed estruse ben contenenti. (A) Alimenti macinati per pesci. (B)20 mL di acqua in una tazza. (C) Miscela di cibo e acqua macinati di pesce. (D)Cibo/acqua depositati per 15 minuti. Prendi il supernatante di questa miscela come cibo larvale. (E) Bene con larve fuse; le exuviae rappresentative sono indicate da frecce. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 11: Contare i dati di un esperimento di silenziamento genico. Le zanzare iniettate con dsRNA contro il trasportatore di ferro putativo (FeT) hanno mostrato una significativa riduzione del numero di uova (A), del numero larvale (B) e della velocità di schiusa(C) rispetto al controllo (EGFP). Le barre mostrano la ± SD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 12: Immagini rappresentative dei pozzi che mostrano fenotipi aggiuntivi nelle zanzare silenziate geniche. dsFeT ha mostrato escrezione ritardata (segni marrone scuro) e piccole uova leggermente colorate. Vengono mostrati due pozzi rappresentativi per ogni trattamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Ft | EAgaL | |
| (1) Preparazione | 20 min 29,0 sec | 3 min 49,3 sec |
| 2) F_in | 3 min 55,0 sec | 1 min 56,0 sec |
| (3) F_out/E_img | 43 min 44,3 sec | 15 min 28,3 sec |
| (4) L_img | 38 min 03,5 sec | 9 min 30,5 sec |
Tabella 1: Requisiti di tempo per il completamento del metodo del tubo di volo (FT) rispetto al metodo della piastra EAgaL. (1) Preparazione: Tempo necessario per posizionare il cotone, versare acqua e inserire il disco di carta da filtro nei tubi di allevamento Drosophila (FT) rispetto al versamento di agarosio in pozzi di 24 piastre di pozzo (EAgaL). (2) F_in: Tempo necessario per posizionare le singole zanzare in tubi di allevamento (FT) o pozzi della piastra a 24 pozzi (EAgaL). (3) F_out/E_img: Tempo necessario per rilasciare le zanzare in una gabbia più grande, rimuovere, aprire la carta uovo e imageare le uova sulla carta (FT) o rilasciare zanzare in una gabbia più grande e immaginire ogni pozzo della piastra di 24 pozzetto (EAgaL). (4) L_img: Tempo necessario per l'immagine delle larve tratteggiate in un piccolo contenitore (FT) o in ogni pozzo della piastra a 24 pozze (EAgaL) dopo anestesia fredda. Un totale di 24 tubi sono stati utilizzati per FT.
| Costi alla rinfusa | |||||
| Piastra EAgaL | Tubi a mosca | ||||
| articolo | prezzo | quantità | articolo | prezzo | quantità |
| Piastre da 24 pozzi | $45.61 | Caso di 50 | Fogli di carta cromatografica | $103,63 | 46 × 57 cm 100 Fogli/PK |
| agarosio | $250,97 | 500 grammi | Rack per tubi a mosca + tubi | $68.45 | 5 vassoi da 100 |
| Olimpo TG-6 | $375,00 | Spine per tubi di volo | $66.10 | Caso di 200 | |
| Cotone | $104,27 | Caso del 2000 | |||
| Totale avvio | $671,58 | Totale avvio | $342,45 | ||
| Costo unitario (una piastra da 24 potte o 24 tubi) | |||||
| Piastra EAgaL | Tubi a mosca | ||||
| articolo | prezzo | nota | articolo | prezzo | nota |
| una piastra da 24 po' | $0.91 | prezzo alla rinfusa/50 | Fogli di carta cromatografica | $0.16 | 641,7 set di 24 tubi del valore(2) |
| Agarosio per piatto | $0.15 | 500g= 1667 piastre(1) | Rack per tubi a mosca + tubi | $3.29 | (prezzo alla rinfusa/500) × 24 |
| Spine per tubi di volo | $7.93 | (prezzo alla rinfusa/200) × 24 | |||
| Cotone | $1.25 | (prezzo alla rinfusa/2000) × 24 | |||
| Totale unità | $1,06 | Totale unità | $12.63 | ||
Tabella 2: Confronto dei costi tra la piastra EAgaL e FT. Top: I costi alla rinfusa per l'avvio (supponendo che un trapano e una punta di perforazione possano essere forniti da un ricercatore). In basso: Costi stimati per una piastra da 24 pomp pomp po' (piastra EAgaL) e 24 FT. (1) Supponendo che una piastra richieda poco più di quanto sia sufficiente per una piastra di 24 pomp pomp po' (12mL), 15 mL del 2% = 0,3 g di agarosio per piastra, un totale di 500 g di agarosio può fare 1.667 piastre. (2) Un foglio di carta può realizzare dischi da 154 di ~38 mm di diametro. Con 100 fogli, è possibile creare 641,7 (15.400/24) set di 24 tubi.
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Discussion
La piastra EAgaL riduce drasticamente il lavoro, il tempo e lo spazio per condurre test individuali di fecondità e fertilità in Aedes aegypti rispetto al metodo FT. Il confronto preliminare tra il metodo FT e la piastra EAgaL ha comportato tempi più brevi per tutte le fasi (la tecnica di imaging è stata applicata al metodo FT)(tabella 1). Come riferimento, nella tabella 2 sono fornite una stima dei costi di avviamento e di dosaggio (una piastra EAgaL da 24 pozzi contro 24 TT).
Ci sono alcuni punti da considerare quando si utilizzano le piastre EAgaL. Una preoccupazione iniziale era che le zanzare poste in uno spazio così piccolo non potevano deporre tutte le uova a causa del movimento limitato. Per determinare se questo fosse il caso, le zanzare sono state trasferite collettivamente in una gabbia più grande con una tazza di ovideposizione foderata con un tovagliolo di carta con acqua per altre 48 ore dopo aver trascorso 48 ore nei piatti EAgaL. Le zanzare depongono effettivamente uova aggiuntive, ma il numero medio di uova per femmina era solo 2,1, il che non si traducono in alcuna differenza nel risultato di alcuna analisi statistica nella maggior parte, se non in tutti, i casi. Questi numeri provengono da oltre 500 zanzare testate (dati non mostrati). Tuttavia, questo può essere esclusivamente per il ceppo di zanzare Ae. aegypti "Liverpool" con le condizioni descritte. Ogni laboratorio potrebbe dover verificare se questo è il caso delle sue zanzare e condizioni.
Per l'imaging, la singola immagine di una fotocamera collegata a uno stereomicroscopio non copriva un intero pozzo anche all'ingrandimento più basso. Ciò richiedeva l'ottenimento di più immagini per pozzo e, a sua volta, l'applicazione di patch alle immagini o la tenuta traccia delle uova sovrapposte in più immagini dello stesso pozzo. Entrambi gli approcci complicarono gravemente l'analisi e aumentarono significativamente il lavoro coinvolto. Inoltre, a causa della natura di uno stereomicroscopio, l'angolo della fotocamera è sempre leggermente sinistro o destro dall'angolo perpendicolare, il che rende il blocco della parete laterale sinistra o destra una parte della superficie dell'agarosio.
La contaminazione da microrganismi, in particolare funghi, può essere un problema durante il test. Sebbene lo sbiancamento possa ridurre al minimo la contaminazione prima dell'ovideposizione, i funghi possono essere presenti nell'ambiente insettivo e trasportati dalle zanzare stesse. In questi casi, mantenere puliti gli spazi insettici può ridurre l'incidenza. È meglio che ogni laboratorio testi una piastra EAgaL per rilevare potenziali problemi.
Si noti che il metodo della piastra EAgaL non è stato progettato per mantenere le colture di zanzare oltre le prime fasi larvali. Il numero medio di larve per pozzo era in genere superiore a 60, e non è insolito avere più di 100 larve per pozzo. Ciò crea condizioni affollate, che si traducono in un ritardo nello sviluppo, un minore tasso di pupa e adulti molto piccoli, che possono compromettere gli studi a valle.
Attualmente questo metodo è stato testato solo con Ae. aegypti. Tuttavia, è attualmente in fase di test per espandere la sua applicazione ad altre specie di Aedes e persino ad altri generi di zanzare come Anopheles e Culex.
A causa dei requisiti di tempo e spazio ridotti per il metodo della piastra EAgaL, i test di fecondità e fertilità possono essere scalati fino a una velocità effettiva semi-alta (cioè 5-10 piastre o più per esperimento). Questa caratteristica del metodo della piastra EAgaL può essere estremamente utile per valutare gli importanti parametri di fitness delle zanzare per test insetticidi, valutazione della sterilità, transgenesi e studi di editing genico.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse per questo studio.
Acknowledgments
Ringraziamo texas A&M Agrilife Research Insect Vectored Diseases Grant Program per il finanziamento. Ringraziamo anche i membri del laboratorio Adelman per l'aiuto nello sviluppo di questo metodo e suggerimenti durante la stesura del manoscritto, così come i membri del laboratorio Kevin Myles. Ringraziamo anche i recensori e gli editori per il loro aiuto nel migliorare questo manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm Φ drill bit | alternatively heated nails can be used | ||
| 1000 μL pipette tips (long) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| 24-well tissue culture plate | Thermo Scientific | 930186 | clear, flat-bottom with ringed lid plates |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Compact digital camera | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Computer (Windows, Mac or Linux) | |||
| Deionized water | |||
| Fiji (imageJ) software | download from: https://fiji.sc/ | ||
| Forceps | Dumont | sharp forceps may break mosquito's body | |
| Glass Petri dishes | VWR | ||
| Household bleach | |||
| Household electric drill | |||
| illuminator for stereomicroscope (gooseneck) | |||
| P-1000 pipette | Gilson | ||
| paint brushes | |||
| Rubber bands | |||
| SD card | to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better) | ||
| Spreadsheet software (Microsoft Excel) | Microsoft | Any spreadsheet software works | |
| TetraMin fish food | Tetra | ground with coffee grinder, blender or morter & pestle | |
| Transfer pipetts | VWR | 16011-188 |
References
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